CN117126872A - 提升虾青素产量的解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高虾青素产量的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括将解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)内源的3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG1转入产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌DN21的染色体中，获得虾青素产量提高的解脂耶氏酵母基因工程菌。所述方法还包括进一步将解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)内源的过氧化氢酶基因CAT敲除，得到过氧化氢敏感型解脂耶氏酵母菌株；以及对获得的基因工程菌进行一轮或多轮过氧化氢介导的连续适应性进化，然后筛选高产菌株。本发明得到的产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌的虾青素的产量相比出发菌株得到了显著的提高，并且经过连续传代培养后稳定性良好，能够用于大规模的商业化生产。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，是关于一种提升虾青素产量的解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方法。
背景技术
虾青素(Astaxanthin)是一种红色的天然四萜化合物，分子式为C40H52O4，化学名称为3,3-二羟基-4,4-二酮基-β,β-胡萝卜素。作为一种脂溶性化合物，虾青素在体外极易溶于有机溶剂。而在体内，由于其疏水性，虾青素往往储存在富含脂质的质膜或脂质体上。作为抗氧化能力最强的天然抗氧化剂之一，虾青素被广泛地应用于饲料、食品、化妆品和制药等行业。
目前获取虾青素的方法包括天然提取、化学合成以及异源生物合成。一些微藻、细菌和酵母等生物具有天然合成虾青素的能力，可以从中直接提取虾青素。然而，由于提取成本较高，对培养环境要求严格等因素，使生物提取法难以被大规模应用。目前市场上超过95％的虾青素都是通过化学合成法得到的。相较于天然虾青素，合成的虾青素更易获得。然而，该方法得到的虾青素的安全性令人担忧，因此其使用受到了严格的限制。随着合成生物学的迅速发展，异源生物合成虾青素成为了目前的热点之一。通过将异源的虾青素合成途径引入微生物宿主，可以获得高安全性、高活性的虾青素。
解脂耶氏酵母是一种油脂酵母，可以为虾青素提供充足的储存空间以及前体代谢物。该菌株具有广泛的底物利用能力，也是公认的安全性菌株。但迄今为止，利用解脂耶氏酵母生产虾青素的报道均为通过分子改造提高合成虾青素的能力，且普遍产量较低。因此亟须开发新的方法来提升解脂耶氏酵母菌株中的虾青素的产量。
发明内容
针对现有技术中只有通过分子改造提升解脂耶氏酵母对虾青素的生产、且普遍产量较低的实际情况，本发明致力于提供一种能够提升解脂耶氏酵母菌株中虾青素产量的方法，以解决现有技术中的不足。
为实现上述目的，本发明的第一个方面，提供了一种提高虾青素产量的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，所述方法包括将解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG1转入产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌DN21的染色体中，获得虾青素产量提高的解脂耶氏酵母基因工程菌，其中：
所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG1的序列的NCBI登录号为GB:XM_503558.1。
根据本发明的优选实施例，所述方法还包括进一步将解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)内源的过氧化氢酶基因CAT敲除，得到过氧化氢敏感型解脂耶氏酵母菌株，其中：
所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)内源的过氧化氢酶基因CAT的序列的NCBI登录号为GB:XP_506075.1。
进一步的，所述过氧化氢酶基因CAT的敲除是以过氧化氢酶基因CAT的左右臂基因片段通过同源重组交换的方式取代解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)染色体中的过氧化氢酶基因CAT，所述过氧化氢酶基因CAT的左右臂基因片段的核苷酸序列分别如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示。
根据另一个优选实施例，所述方法还包括对获得的基因工程菌进行一轮或多轮过氧化氢介导的连续适应性进化，然后筛选高产菌株。优选的，所述过氧化氢介导的连续适应性进化包括三轮。
根据本发明，所述三轮过氧化氢介导的连续适应性进化是将菌株短暂培养在适宜浓度的过氧化氢水溶液中，随后正常培养以恢复菌株生长，具体如下：
第一轮：在菌液中加入100mmol/L的过氧化氢水溶液，培养1小时，用PBS缓冲液洗涤后恢复正常培养23小时，重复该过程30次；
第二轮：在菌液中加入800mmol/L的过氧化氢水溶液，培养1小时，用PBS缓冲液洗涤后恢复正常培养23小时，重复该过程20次；
第三轮：在菌液中加入2000mmol/L的过氧化氢水溶液，培养1小时，用PBS缓冲液洗涤后恢复正常培养23小时，重复该过程20次。
本发明的第二个方面，提供了一种解脂耶氏酵母基因工程菌，所述基因工程菌是通过将解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG1转入产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌DN21的染色体中而获得，其中：所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG1的序列的NCBI登录号为GB:XM_503558.1。
本发明的第三个方面，提供了一种解脂耶氏酵母基因工程菌，通过进一步将上述的基因工程菌内源的过氧化氢酶基因CAT敲除而获得，其中：所述过氧化氢酶基因CAT的序列的NCBI登录号为GB:XP_506075.1。
进一步的，所述过氧化氢酶基因CAT的敲除是以过氧化氢酶基因CAT的左右臂基因片段通过同源重组交换的方式取代解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)染色体中的过氧化氢酶基因CAT，所述过氧化氢酶基因CAT的左右臂基因片段的核苷酸序列分别如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示。
本发明的第四个方面，提供了一种解脂耶氏酵母基因工程菌，通过对上述的基因工程菌进一步进行一轮或多轮过氧化氢介导的连续适应性进化，然后筛选高产菌株而获得。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明的方法构建得到的产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌的虾青素的产量相比出发菌株得到了显著的提高，在摇瓶水平最高产量可达到150mg/L。
2、本发明的方法构建得到的产虾青素的解脂耶氏酵母基工程菌，经过连续传代培养后稳定性良好，能够用于大规模的商业化生产，所得的类胡萝卜素能够被安全地利用，产业化应用前景良好。
附图说明
图1为解脂耶氏酵母异源生物合成虾青素的代谢途径。
图2显示了解脂耶氏酵母菌株内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG1转入解脂耶氏酵母菌株DN21后得到的菌株FJ-1的虾青素产量。
图3显示了在解脂耶氏酵母菌株FJ-1中敲除过氧化氢酶基因CAT后得到的菌株FJ-2的虾青素产量。
图4显示了对菌株FJ-2进行30轮过氧化氢介导的连续适应性进化后得到的工程菌株的虾青素产量，其中产量最高的菌株为FJ-5。
图5显示了对菌株FJ-5进行20轮过氧化氢介导的连续适应性进化后得到的工程菌株的虾青素产量，其中产量最高的菌株为FJ-6。
图6显示了对菌株FJ-6进行20轮过氧化氢介导的连续适应性进化后得到的工程菌株的虾青素产量，其中产量最高的菌株为FJ-7。
图7显示了工程菌株FJ-7经过20轮传代后，虾青素产量的稳定性实验结果。
具体实施方式
下面结合附图，以具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应理解，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的范围。
本申请的发明人在充分研究解脂耶氏酵母的异源生物合成虾青素的代谢途径(图1)以及虾青素的抗氧化特性的基础上，通过转入解脂耶氏酵母菌株内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG1提高了解脂耶氏酵母菌株的虾青素产量。并通过敲除解脂耶氏酵母菌株的过氧化氢酶基因CAT获得了过氧化氢敏感型解脂耶氏酵母菌株。对此菌株进行了70代的过氧化氢介导的连续适应性进化传代，得到了高产虾青素的解脂耶氏酵母工程菌株。
以下实施例中的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)采用DN21作为出发菌株，菌株DN21的获得参见申请号为202210058092.3的中国发明专利申请。
以下实施例中所使用的质粒：pTAs_ku70_HUH、pHR_D17_hrGFP、pHR_D17_HMG1、pTAs_POX5_HUH、pTAs_POX5_HMG1和pTAs_CAT_HUH，参照Schwartz,C.,Shabbir-Hussain,M.,Frogue,K.,Blenner,M.,Wheeldon,I.2017.Standardized markerless geneintegration for pathway engineering in Yarrowia lipolytica.ACS Synth Biol,6(3),402-409所记载的方法制备得到。
实施例1：构建菌株FJ-1
步骤1：将解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)来源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG1基因序列(NCBI中登录号为GB:XM_503558.1)分别通过酶切位点NheI和PteI构建到质粒pHR_D17_hrGFP中，得到质粒pHR_D17_HMG1。
步骤2：将步骤1中所得的质粒pHR_D17_HMG1通过酶切位点SmiI获得的带有HMG1基因的片段转入解脂耶氏酵母DN21中，获得重组菌株FJ-1。
其中，转化使用试剂盒Frozen EZ Yeast Transformation IITM(购自ZymoResearch)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
得到的工程菌FJ-1经细胞培养后，提取酵母基因组，并经PCR及测序的方法验证为正确。
实施例2：测定菌株产虾青素的产量
将实施例1得到的虾青素生产菌株FJ-1接种于2mL YPD培养基中培养24小时，然后以初始OD600为0.01的接种量接种于新的50mL YPD培养基中继续培养。
其中，所述YPD培养基由2％葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母提取物组成，余量为水，所述百分比为质量百分比。
发酵培养4天后，在菌液中依次加入DMSO和丙酮进行虾青素的提取，并使用0.22μm有机相尼龙针式滤器过滤，之后利用高效液相色谱仪C18反相色谱柱对提取的虾青素进行定性和定量分析，检测的结果见图2。
由图2的结果可知，将解脂耶氏酵母菌株内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG1转入解脂耶氏酵母菌株DN21后，构建得到的菌株FJ-1的产虾青素能力提升，产量达到了38mg/L，约为出发菌株DN21的2倍。
实施例3：构建菌株FJ-2
步骤1：将解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)来源的过氧化氢酶基因CAT基因序列左右臂的片段(核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示)分别通过酶切位点SmiI、HindⅢ和EcoRⅠ构建到质粒pTAs_ku70_HUH中，得到质粒pTAs-_CAT_HUH。
步骤2：将步骤1中所得的质粒pTAs_CAT_HUH通过酶切位点SmiI获得的带有CAT基因左右臂的片段转入解脂耶氏酵母FJ-1中，通过同源重组交换的方式实现CAT基因的敲除，获得重组菌株FJ-2。
其中，转化使用试剂盒Frozen EZ Yeast Transformation IITM(购自ZymoResearch)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
得到的工程菌FJ-2经细胞培养后，提取酵母基因组，并经PCR及测序的方法验证为正确。
实施例4：测定菌株产虾青素的产量
将实施例3得到的虾青素高产菌株FJ-2接种于2mL YPD培养基中培养24小时，然后以初始OD600为0.01的接种量接种于新的50mL YPD培养基中继续培养。培养条件与实施例2相同。
发酵培养4天后，在菌液中依次加入DMSO和丙酮进行虾青素的提取，并使用0.22μm有机相尼龙针式滤器过滤，之后利用高效液相色谱仪C18反相色谱柱对提取的虾青素进行定性和定量分析，检测的结果见图3。
由图3的结果可知，将菌株FJ-1中的CAT基因敲除后，并未影响其产量。菌株FJ-2的虾青素产量为35mg/L，与菌株FJ-1相似。
实施例5：过氧化氢介导的连续适应性进化
步骤1：将实施例3得到的菌株FJ-2接种于2mL YPD培养基中培养24小时，然后以初始OD600为0.01的接种量接种于深孔板中继续培养，培养24小时后在不同孔中添加不同浓度的过氧化氢，同时以不添加过氧化氢的菌液作为对照。
发酵4天后，测定菌株OD，选择菌株OD600降低为对照的一半的过氧化氢浓度100mmol/L(不考虑过氧化氢的分解)作为后续连续适应性进化中使用的过氧化氢浓度。
步骤2：将实施例3得到的菌株FJ-2接种于2mL YPD培养基中培养24小时，然后以初始OD600为0.01的接种量接种于新的25mL YPD培养基中继续培养。
步骤3：发酵23小时后，在500μL菌液中加入100mmol/L过氧化氢水溶液(不考虑过氧化氢的分解)，培养1小时，用PBS缓冲液洗涤菌体后转接到新的25mL YPD培养基中继续培养约23小时。
步骤4：将步骤3重复30次，将所得的菌液涂布于YPD培养基平板上培养，从平板上通过颜色筛选得到20个颜色较红的解脂耶氏酵母菌株。
步骤5：将步骤4筛选出的20个解脂耶氏酵母菌株根据实施例2的方法发酵培养4天，并进行虾青素的提取，对提取的虾青素进行定性和定量分析，检测的结果见图4。
由图4的结果可知，通过30代的过氧化氢介导的连续适应性进化传代所得到的20个解脂耶氏酵母菌株中，虾青素产量均有提升。将产量最高的1号菌株命名为FJ-5，虾青素产量达到了109mg/L，约为菌株FJ-2的3倍。
步骤6：将菌株FJ-5根据步骤1的方法测定后续连续适应性进化中使用的过氧化氢浓度为800mmol/L(不考虑过氧化氢的分解)。根据步骤2、3的方法对菌株FJ-5进行过氧化氢介导的连续适应性进化，重复该步骤20次。根据步骤4、5的方法对菌株进行筛选以及虾青素产量测定，检测的结果见图5。
由图5的结果可知，通过20代的过氧化氢介导的连续适应性进化传代所得到的20个解脂耶氏酵母菌株中，19个菌株的虾青素产量有所提升。将产量最高的13号菌株命名为FJ-6，虾青素产量达到了150mg/L，约为菌株FJ-5的1.3倍。
步骤7：根据步骤6的方法对菌株FJ-6测定后续连续适应性进化中使用的过氧化氢浓度(2000mmol/L(不考虑过氧化氢的分解))以及过氧化氢介导的连续适应性进化，并对菌株进行筛选以及虾青素产量测定，检测的结果见图6。
由图6的结果可知，通过20代的过氧化氢介导的连续适应性进化传代所得到的20个解脂耶氏酵母菌株中，只有1个菌株的虾青素产量有所提升。将该菌株命名为FJ-7，虾青素产量达到了159mg/L，约为菌株FJ-6的1倍。
实施例6：构建的工程菌株FJ-7的稳定性实验
菌株传代的方法为：将实施例5得到的虾青素高产菌株FJ-7接种于2mL YPD培养基中培养，24h后在YPD固体培养基中划线，48h后重新挑取工程菌株FJ-7的单菌落接种于2mLYPD培养基中培养。
将如上方法得到传代20轮的FJ-7菌株以及实施例5得到的菌株FJ-7均接种于2mLYPD培养基中培养，培养条件与实施例2相同。
发酵培养4天后，在菌液中依次加入DMSO和丙酮进行虾青素的提取，并使用0.22μm有机相尼龙针式滤器过滤，之后利用高效液相色谱仪C18反相色谱柱对提取的虾青素进行定性和定量分析，结果如图7所示，可知本发明得到的工程菌株FJ-7传代后表现稳定，虾青素产量维持在150mg/L左右，约为菌株FJ-2的4倍。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
浙江赫凯生物科技有限公司
<120> 提升虾青素产量的解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方法
<130> 221090
<141> 2022-05-18
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1000
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 1
tgtactttat tgcgcgtggg gaaggttcag gctgttttct gttttctggg cttttgacgt 60
ttggaccgcg gctcaaagac gagaaaaggg acgtccgtcc tcgctctaac acgttgaaac 120
gcttttttct tagtctacat tgacatgctt gctgtctcat gcattcggca caaagaatct 180
gtaggaagta acgattgggg ggaaaccagc ttcaacaaga cacgagtgag ttcgcggacc 240
ctttctccac cgctggatta tcttatttgc agctgtaaca ggttgtcgtg ggtagttctg 300
tctgtctcag gctgtagata tagtcgatca tgacaaacgc tgcaaggcta ttggctgtga 360
ccccgggttt tcccctccca acaagaactt agttaaggtg ataatgaaga gggcatggta 420
ggtgccgaaa gaagcaccga gtggcgagtc cgagagagta gctacgtgga aatcaaagaa 480
ttgaatgggg aaaagtgctc gatcgaaaaa tccagctagt tttgagctcg ttagagcccc 540
aaaacagcca taaccatttc tcaactccac accgccatct cgcccttaac ccaaatctag 600
tccacacatt tccccacgat aactctatat tatgcggtgg cttcggtaat tctctttgtt 660
tgcgactttc acacgcccct ttaagctccc acaaaccatg tgcgtgtgat tatatatata 720
taggtggggg tagcgaaacg ccgagtcaag acgaaactaa ggccttattg aaaagtgagt 780
acccaggagg actgtttgga cgggcaattc gataccggga aagcagcccc atggacgcag 840
cgggttgatt cggatgatct ggtggtttca cgggctatag atattgcccc atcaatgagg 900
ggaagacgct caagtccgaa caccgcaaca taatacgaca gtggtgatag acaactcgcc 960
taaagccaac aacaacaaca ccaatagcat actaactcag 1000
<210> 2
<211> 1000
<212> DNA
<213> 解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)
<400> 2
acggttgaag caaagcttta gtgtgttagc gttgtagttg aatgaaatta taacttatgg 60
acaataaaac ttgccttgta tatatttttt ggcagtattt gtacaatttc atagtacaag 120
tagcttgagt gacatgggtt tgcactttgt gtacgtatgt atcgtacata ctgtacatac 180
ggtacgagca caaactgtac caagtactcg tacatagatc ttcctcgaac aaggagttgg 240
tccaagatag agttattggc tcgcttagga cccttggtgc agggaattga actcaatcag 300
gtcagaagta ttatctgaga tattagagga ttgcttgagt gcgttttggt accagtcgaa 360
cacaacatgt gtcttatcat tgcatcatag tgagttcaca tgatacttat caataatacc 420
cttggtgttt cgtcactatg cccaagactg attagttcac tgtgtcatgg ctgtccaaga 480
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atacggagga cacaaaatac acccaacaag acaccacctc tttcagttat cgaaaacgta 600
tcaagcccaa gcgaaagacc catatcatcg gtatcaacac ggatgaggtt gaccaggaga 660
tcttctccag cattgaagct gcacaaagta aactagaggc gtcgaacact gaggcagcca 720
gacttgagca gcagatcaaa gacattatca aacaacagaa ggacctagag ggcgacattg 780
ctgacctgga gagggagaat gaaagattgc tacgaggcag aaggaagact tctccaagag 840
ctgacgctac agcacactcc ttcacctcaa ccgtttctgg tcagaaatca aacgcagaac 900
ccaagactgc gagatgccat tacgaagact tgttttcagt caacattgcc gatcgcatga 960
gtcgttcccc gcaccgacaa ggatggtctc aggatgtgta 1000
Claims (10)
1.一种提高虾青素产量的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括将解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG1转入产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌DN21的染色体中，获得虾青素产量提高的解脂耶氏酵母基因工程菌，其中：
所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG1的序列的NCBI登录号为GB:XM_503558.1。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还包括进一步将解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)内源的过氧化氢酶基因CAT敲除，得到过氧化氢敏感型解脂耶氏酵母菌株，其中：
所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)内源的过氧化氢酶基因CAT的序列的NCBI登录号为GB:XP_506075.1。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述过氧化氢酶基因CAT的敲除是以过氧化氢酶基因CAT的左右臂基因片段通过同源重组交换的方式取代解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)染色体中的过氧化氢酶基因CAT，所述过氧化氢酶基因CAT的左右臂基因片段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，还包括对获得的基因工程菌进行一轮或多轮过氧化氢介导的连续适应性进化，然后筛选高产菌株。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述过氧化氢介导的连续适应性进化包括三轮。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述三轮过氧化氢介导的连续适应性进化是将菌株短暂培养在适宜浓度的过氧化氢水溶液中，随后正常培养以恢复菌株生长的重复过程，具体如下：
第一轮：在菌液中加入100mmol/L的过氧化氢水溶液，培养1小时，用PBS缓冲液洗涤后恢复正常培养23小时，重复该过程30次；
第二轮：在菌液中加入800mmol/L的过氧化氢水溶液，培养1小时，用PBS缓冲液洗涤后恢复正常培养23小时，重复该过程20次；
第三轮：在菌液中加入2000mmol/L的过氧化氢水溶液，培养1小时，用PBS缓冲液洗涤后恢复正常培养23小时，重复该过程20次。
7.一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是通过将解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG1转入产虾青素的解脂耶氏酵母基因工程菌DN21的染色体中而获得，其中：
所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMG1的序列的NCBI登录号为GB:XM_503558.1。
8.一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是通过将权利要求7所述的基因工程菌内源的过氧化氢酶基因CAT敲除而获得，其中：
所述解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)内源的过氧化氢酶基因CAT的序列的NCBI登录号为GB:XP_506075.1。
9.根据权利要求8所述的的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述过氧化氢酶基因CAT的敲除是以过氧化氢酶基因CAT的左右臂基因片段通过同源重组交换的方式取代解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)染色体中的过氧化氢酶基因CAT，所述过氧化氢酶基因CAT的左右臂基因片段的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
10.一种解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是通过对权利要求7或8获得的基因工程菌进一步进行一轮或多轮过氧化氢介导的连续适应性进化，然后筛选高产菌株而获得。
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