KR101566158B1

KR101566158B1 - L-아라보네이트를 생산하는 대장균 균주 ema2 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101566158B1
Application number: KR1020140083935A
Authority: KR
Inventors: 정욱진; 류 훠메이; 발데후에사 크리스; 라모스 크리스틴; 이원근
Original assignee: 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-04
Filing date: 2014-07-04
Publication date: 2015-11-05

Abstract

본 발명은 L-아라보네이트를 생산하는 대장균 균주 EMA2[E. coli MG1655 (DE3) ΔaraA/pET28a-aradH] 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 L-아라보네이트를 용이하게 대량으로 생산할 수 있는 대장균 균주 EMA2와 대장균 균주 EMA2의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, L-아라보네이트(L-Arabonate) 생산능이 우수한 대장균 균주 EMA2[E. coli MG1655 (DE3) ΔaraA/pET28a-aradH] 및 이를 용이하게 합성하는 방법을 제공할 수 있다.

Description

L-아라보네이트를 생산하는 대장균 균주 EMA2 및 이의 용도{ESCHERICHIA COLI STRAIN EMA2 FOR PRODUCING L-ARABONATE AND USE THEREOF}

본 발명은 L-아라보네이트를 생산하는 대장균 균주 EMA2[E. coli MG1655 (DE3) ΔaraA/pET28a-aradH] 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 L-아라보네이트를 용이하게 대량으로 생산할 수 있는 대장균 균주 EMA2와 대장균 균주 EMA2의 용도에 관한 것이다.

L-아라보네이트, D-자일로네이트(D-xylonate), D-갈락토네이트, D-글루코네이트 등의 당산은 화학물질, 식품, 화장품 및 건설 등의 산업에서 사용되는 중요한 원료물질이다. 또한 대사공학 또는 녹색 화학기술에 의한 바이오연료 및 바이오폴리머 등 다양한 화학물질 생산에서 중요한 역할을 한다. 가장 잘 알려진 당산은 D-글루코네이트로서 세계 8만7천t까지 매년 생산되고 있지만, L-아라보네이트, D-자일로네이트, D-갈락토네이트 등의 당 아미노산의 미생물적 생산은 수율이 낮아서 아직 실용화되지 못하고 있는 실정이다. 미생물 촉매를 포함한 당산 생산을 위해서 최근에 유전자 변형 효모, 대장균 또는 곰팡이 균주 기술 등이 보고되고 있다. 또한 아조스피릴럼의 브라실렌스(Azospirillum의 brasilense)에서 유래한 다양한 L-아라비노스 탈수소효소 (AraDH)를 이용한 L-아라보네이트 및 D-갈락토네이트의 생산 과정에 대한 연구결과가 보고된 바 있으나 더 많은 연구가 필요한 실정이다.

Nygard et al. 2011, Metabolic Engineering Vol. 13:383-391 [Doi 10.1016/j.ymben.2011.04.001] Toivari et al. 2010, Applied Microbiology and Biotechnology Vol. 88:751-760 [Doi 10.1007/s00253-010-2787-9] Liu et al. 2014, Bioprocess and Biosystems Engineering Vol. 37:383-391 [Doi 10.1007/s00449-013-1003-6] Liu et al. 2012, Bioresource Technology Vol. 115:244-248 [Doi 10.1016/j.biortech.2011.08.065] Niu et al. 2003, J American Chemical Society Vol. 125:12998-12999 [Doi 10.1021/ja036391+] Ramos et al. 2012, Bioprocess and Biosystems Engineering [Doi 10.1007/s00449-014-1228-z]

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 L-아라보네이트를 용이하게 대량으로 생산할 수 있는 대장균 균주 EMA2[E. coli MG1655 (DE3) ΔaraA/pET28a-aradH]를 제공한다. 또한 상기 대장균 EMA2를 제조하는 방법과 이의 용도를 제공한다.

본 발명은 수탁번호 KCTC 12540BP로 기탁된, L-아라보네이트(L-Arabonate) 생산능이 있는 대장균 EMA2[E. coli MG1655 (DE3) ΔaraA/pET28a-aradH] 균주를 제공한다.

상기 EMA2 균주는 대장균으로부터 아라비노스 이성화효소(arabinose isomerase, araA) 유전자가 제거된 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 araA 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 구성될 수 있다.

다만 상기 유전자는 상기 염기서열에 한정되지 않으며, 상기 서열에서 하나 또는 소수의 염기가 첨가, 결실 또는 치환된 서열로서 동일한 기능을 나타내는 염기서열을 가질 수 있다.

상기 대장균 균주는 아라비노즈 탈수소화효소(arabinose dehydrogenase, aradh) 유전자를 포함할 수 있다.

상기 aradh 유전자는 서열번호 1로 구성될 수 있다.

본 발명은, 대장균에서 아라비노스 이성화효소(arabinose isomerase, araA) 유전자를 제거시키는 단계(단계1); 아라비노즈 탈수소화효소(arabinose dehydrogenase, aradh) 유전자와 E. coli 발현 벡터 pET28a를 제한효소로 처리하고 리가아제로 결합하여 pET28a-aradh를 제조하는 단계(단계 2); 상기 단계 2에서 제조된 pET28a-aradh를 상기 단계 1을 거친 대장균에 형질 도입하는 단계(단계 3)를 포함하는 대장균 균주 EMA2의 제조방법을 제공한다.

상기 단계 1의 유전자 제거는 유전자 파괴 카세트(gene disruption cassette)를 이용하여 유전자를 파괴시키는 방법으로 수행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 당업계에서 사용되고 있는 유전자 녹아웃 방법은 모두 사용가능하다.

상기 제한효소는 NcoI 및 BamHI일 수 있다.

상기 aradh 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성될 수 있다.

다만 상기 유전자들은 상기 염기서열에 한정되지 않으며, 상기 서열에서 하나 또는 소수의 염기가 첨가, 결실 또는 치환된 서열로서 동일한 기능을 나타내는 염기서열을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 대장균 균주 EMA2[E. coli MG1655 (DE3) ΔaraA/pET28a-aradH]를 배양하여 배양액을 제조하는 단계: 및 상기 배양액으로부터 L-아라보네이트를 회수하는 단계를 포함하는 L-아라보네이트의 생산방법을 제공한다.

상기 배양은 비연속 발효법으로 이루어질 수 있다.

상기 배양은 27 ~ 40℃에서 수행할 수 있고, 더욱 바람직하게는 30~ 37℃를 유지하는 것이 좋다.

상기 배양은 pH 6 ~ 8에서 수행할 수 있고, 더욱 바람직하게는 pH 7로 유지하는 하는 것이 좋다.

상기 배양은 24 내지 48시간 배양시키는 것이 바람직하고, 36시간 정도 배양시키는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 배양은 탄소원을 포함하는 배지에서 수행할 수 있다.

본 발명에 따르면, L-아라보네이트(L-Arabonate) 생산능이 우수한 대장균 균주 EMA2[E. coli MG1655 (DE3) ΔaraA/pET28a-aradH] 및 이를 용이하게 합성하는 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 araA 유전자가 포함된 대장균과 araA 유전자가 파괴된 대장균에 대한 PCR 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 2는 탄소원으로 L-아라비노즈를 포함하는 고체 배지에서 E. coli MG1655 와일드 타입 균주와 araA 유전자가 파괴된 균주(ΔaraA)의 생장 정도를 분석한 결과를 나타내는 것이다.
도 3은 AraDH의 활성과 pH의 관계에 대한 분석 결과를 나타내는 것이다.
도 4는 EMA2[E. coli MG1655 (DE3) ΔaraA/pET28a-aradH]의 비연속 발효에 의한 L-아라보네이트의 생산능을 나타내는 것이다.
도 5는 비연속 발효로부터 회수한 L-아라보네이트 생산물에 대한 NMR 분석 결과를 나타내는 것이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적은, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 수 있다. 여기서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위하여 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의하여 본 발명의 권리범위가 제한되어서는 안 된다.

실시예: EMA2 [ E. coli MG1655 (DE3) Δ araA /pET28a- aradH ] 제조

균주 및 플라스미드 제조

E. coli MG1655 (DE3)에 대한 유전자 결실(gene deletions)은 Liu et al. (Bioprocess Biosyst Eng 2014 37:383-391)에 의해 수행되었다. 유전자 결실 실험은 원-스텝 불활성화 방법(one-step inactivation method, (Datsenko and Wanner, Proc Natl Acad Sci USA 2000 97:6640-6645)으로 수행하였다.

상기 E. coli MG1655 (DE3) 균주로부터 아라비노스 이성화효소(arabinose isomerase, araA) 유전자의 제거는 유전자 파괴 카세트를 이용하여 유전자를 파괴시키는 방법으로 수행하였다.

araA 파괴 카세트(disruption cassette)는 주형으로 pKD3와 다음의 프라이머(karaA 프라이머)를 이용하여 증폭시켰다: 포워드 프라이머(GATCGTTGCGCTGGTCTGGTGGTGTGGCTGCACACCTTCTCCCCGGCCAAAATGTGGATCCATATGAATATCCTCCTTAGT, 서열번호 3, karaA-F) 및 리버스 프라이머(TTCACCGTGTCGATGCAGTTAACCAGTAGACGGTAACGATCGCCGAGATCAATCAAGCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG, 서열번호 4, karaA-R). 제조된 PCR 생성물은 측면에 FRT사이트와 araA의 5 및 3번째 끝단 영역과 상응하는 40개 염기쌍 등을 갖는 클로르암페니콜 저항성 유전자를 포함하고 있다.

pKD46 플라스미드를 Red 재조합 발현 벡터로 사용하였고, E. coli MG1655 (DE3) 균주 내로 도입시켰다. 그 다음, 상동 재조합(homologous recombination)을 완성하기 위하여, E. coli MG1655 (DE3)/pKD46 균주 내로 araA 파괴 카세트(disruption cassette)를 도입하였다. 제조된 균주는 다음의 유전자형을 갖는다:E. coli MG1655 (DE3) ΔaraA::Cm/pKD46. pKD46 플라스미드는 42℃에서의 열처리를 통하여 균주로부터 제거되었다. 그 다음, 균주 E. coli NG1655 (DE3) ΔaraA::Cm 내로 pCP20을 도입하였다. pCP20은 FLP 효소로 번역되는 효모 FlP 재조합 유전자(flippase)를 운반하는 헬퍼 플라스미드로 사용되었다. FLP는 플립파아제 인식 사이트(FRT)가 숙주 염색체 내에 삽입된 항생제 저항성 유전자를 플랭킹(flanking)하는 것을 인식한다. FLP의 작용에 의해, 항생제 저항성 유전자는 제거되고, DNA scar는 FRT 사이트에 남겨진다 (참조. Cherepanov and Wackernagel, 1995, Gene Vol. 158, p. 1-14 [Doi 10.1016/0378-1119(95)00193-A]). 열 유도 및 처리(heat induction and treatment) 이후, 얻어진 균주(resulting strain)는 다음의 유전자형을 갖는다:E.coli MG1655 (DE3) ΔaraA. 유전자 파괴(gene disruption)는 다음의 프라이머(verification primers)를 이용한 PCR에 의해 확인하였다: 포워드 프라이머(GCACGCGCAA TCATGGAGT, 서열목록 5) 및 리버스 프라이머(TGAGATCTTCTAACATGTTGA, 서열번호 6). PCR 리액션 믹스(PCR reaction mix)를 1% 아가로스 겔 위에 로딩하여 분석하였고 그 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1에서 나타내는 바와 같이 인텍트(intact) 유전자는 밴드 사이즈(band size) 2.4 kb를 나타내는 반면에, 파괴된 araA 유전자는 밴드 사이즈 1.0 kb를 나타내었다. 상기 결과에서, E. coli MG1655 (DE3)에서 araA 유전자가 성공적으로 파괴되었다는 것을 확인할 수 있다.

생장 표현형(growth phenotype) 분석

단일 탄소원으로서 L-아라비노즈(L-arabinose)에 대한 와일드 타입 E. coli MG1655 (DE3)균주와 ΔaraA 균주의 생장 표현형을 테스트하였다. 균주들은 단일 탄소원(sole carbons source)으로서 L-아라비노즈 2 g L^-1및 1.8% 아가(agar)를 포함하는 M9 고체 배지에서 테스트되었다. 하룻밤 동안(overnight) 배양된 균주들은 OD₆₀₀에서 0.1 AU, 0.01 AU 및 0.001 AU으로 희석시켰다. 희석된 배양물 부분 표본(5 μL)을 고체 배지 표면에 떨어뜨리고 생장이 관찰될 때 까지 37℃에서 배양하고 그 결과를 도 2에 나타내었다. 와일드 타입 균주 MG1655는 L-아라비노즈에 대하여 생장을 나타내었으나 araA - 결실 균주는 생장을 나타내지 못하였다. L-아라비노즈에서 생장을 나타내지 못하는 균주가 바람직하므로, L-아라보네이트(L-arabonate) 생상의 호스트(host)로서 E. coli MG1655 (DE3) ΔaraA가 유용하다는 것을 확인할 수 있다.

pET28a- aradh 및 EMA2 제조

Bioneer (South Korea)에 의해 합성된, 아조스피릴룸 브라실렌스(Azospirillum brasilense)의 최적화된 코돈 aradh(GeneBank: ATCC29145.1, 서열번호 1)을 E. coli 발현 벡터 pET28a의 NcoI 및 BamHI 사이트에 연결하여 pET28a-aradh를 제조하였다. 그리고 이 플라스미드를 E. coli MG1655 (DE3) ΔaraA에 도입하여 형질전환시켜 EMA2 [E. coli MG1655 (DE3) ΔaraA/pET28a-aradH]를 제조하였다.

실험예 1: 효소 활성 분석

AraDH 활성은 공지된 방법(Liu et al., Bioprocess Biosyst Eng 2014 37:383-391)을 이용하여 크루드 셀 추출물(crude cell extracts)으로부터 측정하였다. 효소 활성의 1단위는 분당 1 μmol의 슈가 기질을 슈가산으로 전환하는 효소의 양으로 정의된다. 비활성(specific activity)은 mg 단백질 당 효소 활성으로 계산되었다. 포타슘 아세테이트 (100 mM, pH 5.0-7.0), 트리스-HCl (100 mM, pH 8.0-10.0) 및 글리신 (100 mM, pH 10-12.3) 버퍼들을 이용하여 AraDH의 최적의 pH를 pH 5.0 ~ 12.3으로 결정하였다. AraDH 활성과 pH의 관계를 분석한 결과는 도 3에 나타내었다. 상기 분석에서 기질(substrates)로 L-아라비노즈 및 NADP⁺를 사용하였다. 도 3에서 나타내는 바와 같이, AraDH의 최적의 pH는 10이었다.

공동 인자(co-factor)로서 NAD⁺또는 NADP⁺를 포함하는 L-아라비노스에 대한 AraDH 활성은 각각 2.9 ± 0.2 및 3.7 ± 0.2 (U/mg protein)이었다. 효소는 공동 인자로서 NADP+에 대한 약간의 선호도를 보여주었다. 대장균에서 추출한 pET28a의 빈 벡터가 잠복된 조효소에서는 당의 탈수소효소가 검출되지 않았거나 AraDH가 포도당 산화에 활성을 나타내지 않았다. 이는 혼합 탄소원을 사용한 L-아라보네이트의 제조에서 이 효소 사용의 장점을 보여주는 것이다

실험예 2: 비연속 발효 및 대사 산물 분석(L-아라보네이트 생산성 및 수율 분석)

EMA2의 L-아라보네이트 생산성 및 수율을 평가하기 위해, 5L 스케일의 실험실 비연속 발효기를 사용하여 비연속 발효를 수행하였다.

비연속 발효(batch fermentation)는 2L의 M9 미니멀 솔트(minimal salt), 5 g L^-1 트립톤, 32 g L^-1 글루코스, 40 mg L^-1 카나마이신 및 40 g L^-1 L-아라비노즈를 포함하는 5 L 실험실 스케일 발효기에서 수행되었다. 비연속 발효를 시작하기 위하여, 접종제(100 mL overnight culture)를 발효 용기 안으로 이동시켰다(t = 0 h). 온도 37℃, 교반속도 600 rpm, 에어 플로(airflow) 0.5 vvm으로 유지하였다. pH는 3M H₂SO₄ 또는 30% NH₄OH를 첨가함으로써 7.0으로 유지되도록 하였다. OD₆₀₀이 약 8.0 AU에 도달하였을 때, 0.5 mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thio-galactopyranoside)를 첨가하였고 온도를 30℃로 낮추었다. 용존 산소는 교반속도의 자동제어에 의해 20% 공기 포화(air saturation)에서 유지되도록 하였다. 거품 억제제(Antifoam A, Sigma, Korea)의 첨가에 따라 포밍(Foaming)은 최소화되었다.

세포외 대사산물(extracellular metabolites)은 Bio-Rad Aminex HPX-87H 컬럼(300ㅧ7.8 mm)이 장착된 Waters HPLC를 이용하여 분석하였다. 컬럼 온도는 55℃로 유지시켰다. 용리액은 흐름 속도 0.4 mL min^-1 로 펌핑되었고 피크는 Waters 2414 굴절률 디텍터를 이용하여 검출하였다. L-아라보네이트 생성을 위한 비연속 발효는, 쉐이크 플라스크-스케일 최적화 실험(shake flask-scale optimization experiments)에 따라 탄소원과 기질 비율을 이용하는 EMA2에 대하여 수행되었다. 분석결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타내는 바와 같이, EMA2는 36시간 내에 모든 L-아라비노즈를 소비하였다. L-아라보네이트의 최종 역가(final titer)는 43.9 g L^-1, 평균 생산성은 1.22 g L^-1 h^-1, 수율은 99.1 % (mol/mol)이었다. 발효기간 동안 L-아라보네이트의 소비는 감지되지 않았다. 이는 E.coli 호스트(host)인 EMA2가 L-아라보네이트 이화작용(L-arabonate catabolism)을 위한 고유의 경로(inherent pathway)를 가지고 있지 않다는 것을 나타내는 것이다.

실험예 3: 생성물 회수 및 NMR 분석

생성물인 L-아라보네이트는 다음의 방법을 이용하여 회수하였다. 배양 브로스(fermentation broth) 내의 세포들은 10분 동안 6000 rpm에서의 원심분리를 통하여 제거하였다. 상등액은 활성탄으로 처리하여 탈색한 후 진공에서 농축시켰다. 사전에 고체 KOH를 첨가해서 pH를 7.0로 조정한 후 5배 부피의 메탄올 첨가하여 L-아라보네이트 칼륨염을 침전시켰다. 용액을 4 ℃에서 12시간 동안 저장하여 침전물을 수거한 후 진공 건조시키고, 순도는 HPLC로 분석하였다. NMR분석을 위해서 정제된 생성물을 탈 이온수에 용해하고 네 사이클 메탄올 침전처리하여 샘플은 제조하였다. 최종 생성물은 중수에 용해시키고, 13C- 및 1H-NMR 분석을 실시하였는데, Varian Unity Inova 분광분석기를 사용하여 500 MHz에서 5mm PFG indirect NMR probe를 사용하여 분석하였다. 이 방법을 이용하여, 결과물의 92.6%를 88.8% 순도로 회수할 수 있었다. 메탄올 침전법을 4주기까지 반복하면 순도능 99.3%까지 증가하지만 결과물의 회수율은 83%로 감소되었다.

도 5에서 나타내는 바와 같이, 회수된 생성물인 L-아라보네이트 포타슘 염(Larabonic acid potassium salt)의 구조를 NMR 스펙트라를 통하여 확인하였다. L-아라보노-1,4-락톤(L-arabono-1,4-lactone)은 검출되지 않는 것으로 확인되었다.

회수된 L-아라보네이트의 NMR 분석 결과는 다음과 같다.

¹³C-NMR(도 6(a)): C1, 62.994 ppm; C2, 71.091 ppm; C3, 71.374 ppm; C4, 71.485 ppm; C5, 179.233 ppm.

¹H-NMR(도 6(b)): σ 4.086 (d, 1H, J 1.6, H₁), σ 3.680 (m, 2H, J 2.4, J 1.6, J 2.4, H₄, H₄), σ 3.569 (m, 1H, J 2.8, J 2.8, 2.4, H₂), σ 3.532 (dd, 1H, J 6.4, J 6.0, H₃)

한국생명공학연구원

KCTC12540BP

20140108

<110> MYONGJI UNIVERSITY INDUSTRY AND ACADEMIA COOPERATION FOUNDATION <120> ESCHERICHIA COLI STRAIN EMA2 FOR PRODUCING L-ARABONATE AND USE THEREOF <130> P14-0168/MJU <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 950 <212> DNA <213> Azospirillum brasilense <400> 1 ccatggatgt ctgaccaggt ttctctgggt gttgttggta tcggtaaaat cgcgcgtgac 60 cagcacctgc cggcgatcga cgcggaaccg ggtttcaaac tgaccgcgtg cgcgtctcgt 120 cacgcggaag ttaccggtgt tcgtaactac cgtgacctgc gtgcgctgct ggcggcggaa 180 cgtgaactgg acgcggtttc tctgtgcgcg ccgccgcagg ttcgttacgc gcaggcgcgt 240 gcggcgctgg aagcgggtaa acacgttatg ctggaaaaac cgccgggtgc gaccctgggt 300 gaagttgcgg ttctggaagc gctggcgcgt gaacgtggtc tgaccctgtt cgcgacctgg 360 cactctcgtt gcgcgtctgc ggttgaaccg gcgcgtgaat ggctggcgac ccgtgcgatc 420 cgtgcggttc aggttcgttg gaaagaagac gttcgtcgtt ggcacccggg tcagcagtgg 480 atctgggaac cgggtggtct gggtgttttc gacccgggta tcaacgcgct gtctatcgtt 540 acccgtatcc tgccgcgtga actggttctg cgtgaagcga ccctgatcgt tccgtctgac 600 gttcagaccc cgatcgcggc ggaactggac tgcgcggaca ccgacggtgt tccggttcgt 660 gcggagtttg actggcgtca cggtccggtt gaacagtggg aaatcgcggt tgacaccgcg 720 gacggtgttc tggcgatctc tcgtggtggt gcgcagctgt ctatcgcggg tgaaccggtt 780 gaactgggtc cggaacgtga atacccggcg ctgtacgcgc acttccacgc gctgatcgcg 840 cgtggtgaat ctgacgttga cgttcgtccg ctgcgtctgg ttgcggacgc gttcctgttc 900 ggtcgtcgtg ttcagaccga cgcgttcggt cgttgaggat ccgacatcta 950 <210> 2 <211> 1503 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 atgacgattt ttgataatta tgaagtgtgg tttgtcattg gcagccagca tctgtatggc 60 ccggaaaccc tgcgtcaggt cacccaacat gccgagcacg tcgttaatgc gctgaatacg 120 gaagcgaaac tgccctgcaa actggtgttg aaaccgctgg gcaccacgcc ggatgaaatc 180 accgctattt gccgcgacgc gaattacgac gatcgttgcg ctggtctggt ggtgtggctg 240 cacaccttct ccccggccaa aatgtggatc aacggcctga ccatgctcaa caaaccgttg 300 ctgcaattcc acacccagtt caacgcggcg ctgccgtggg acagtatcga tatggacttt 360 atgaacctga accagactgc acatggcggt cgcgagttcg gcttcattgg cgcgcgtatg 420 cgtcagcaac atgccgtggt taccggtcac tggcaggata aacaagccca tgagcgtatc 480 ggctcctgga tgcgtcaggc ggtctctaaa caggataccc gtcatctgaa agtctgccga 540 tttggcgata acatgcgtga agtggcggtc accgatggcg ataaagttgc cgcacagatc 600 aagttcggtt tctccgtcaa tacctgggcg gttggcgatc tggtgcaggt ggtgaactcc 660 atcagcgacg gcgatgttaa cgcgctggtc gatgagtacg aaagctgcta caccatgacg 720 cctgccacac aaatccacgg caaaaaacga cagaacgtgc tggaagcggc gcgtattgag 780 ctggggatga agcgtttcct ggaacaaggt ggcttccacg cgttcaccac cacctttgaa 840 gatttgcacg gtctgaaaca gcttcctggt ctggccgtac agcgtctgat gcagcagggt 900 tacggctttg cgggcgaagg cgactggaaa actgccgccc tgcttcgcat catgaaggtg 960 atgtcaaccg gtctgcaggg cggcacctcc tttatggagg actacaccta tcacttcgag 1020 aaaggtaatg acctggtgct cggctcccat atgctggaag tctgcccgtc gatcgccgca 1080 gaagagaaac cgatcctcga cgttcagcat ctcggtattg gtggtaagga cgatcctgcc 1140 cgcctgatct tcaataccca aaccggccca gcgattgtcg ccagcttgat tgatctcggc 1200 gatcgttacc gtctactggt taactgcatc gacacggtga aaacaccgca ctccctgccg 1260 aaactgccgg tggcgaatgc gctgtggaaa gcgcaaccgg atctgccaac tgcttccgaa 1320 gcgtggatcc tcgctggtgg cgcgcaccat accgtcttca gccatgcact gaacctcaac 1380 gatatgcgcc aattcgccga gatgcacgac attgaaatca cggtgattga taacgacaca 1440 cgcctgccag cgtttaaaga cgcgctgcgc tggaacgaag tgtattacgg gtttcgtcgc 1500 taa 1503 <210> 3 <211> 81 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for karaA <400> 3 gatcgttgcg ctggtctggt ggtgtggctg cacaccttct ccccggccaa aatgtggatc 60 catatgaata tcctccttag t 81 <210> 4 <211> 81 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for karaA <400> 4 ttcaccgtgt cgatgcagtt aaccagtaga cggtaacgat cgccgagatc aatcaagctg 60 gtgtaggctg gagctgcttc g 81 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for araA <400> 5 gcacgcgcaa tcatggagt 19 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for araA <400> 6 tgagatcttc taacatgttg a 21

Claims

수탁번호 KCTC 12540BP로 기탁된, L-아라보네이트 생산능이 있는 대장균 균주 EMA2.
청구항 1에 있어서,
상기 대장균 균주 EMA2는 대장균으로부터 아라비노스 이성화효소(arabinose isomerase, araA) 유전자가 제거된 것을 특징으로 하는 대장균 균주 EMA2.
청구항 2에 있어서,
상기 araA 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 대장균 균주 EMA2.
청구항 1에 있어서,
상기 대장균 균주 EMA2는 아라비노즈 탈수소화효소(arabinose dehydrogenase, aradh) 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균 균주 EMA2.
청구항 4에 있어서,
상기 aradh 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 대장균 균주 EMA2.
대장균에서 아라비노스 이성화효소(arabinose isomerase, araA) 유전자를 제거시키는 단계(단계1);
아라비노즈 탈수소화효소(arabinose dehydrogenase, aradh) 유전자와 E. coli 발현 벡터 pET28a를 제한효소로 처리하고 리가아제로 결합하여 pET28a-aradh를 제조하는 단계(단계 2);
상기 단계 2에서 제조된 pET28a-aradh를 상기 단계 1을 거친 대장균에 형질 도입하는 단계(단계 3)를 포함하는 대장균 균주 EMA2의 제조방법.
청구항 6에 있어서,
상기 단계 1에서 유전자를 제거시키는 단계는 유전자 파괴 카세트(gene disruption cassette)를 이용하여 유전자를 파괴시키는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 대장균 균주 EMA2의 제조방법.
청구항 6에 있어서,
상기 제한효소는 NcoI 및 BamHI인 것을 특징으로 하는 대장균 균주 EMA2의 제조방법.
청구항 1의 균주를 배양하여 배양액을 제조하는 단계: 및
상기 배양액으로부터 L-아라보네이트를 회수하는 단계를 포함하는 L-아라보네이트의 생산방법.
청구항 9에 있어서,
상기 배양은 비연속 발효법으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 L-아라보네이트의 생산방법.
청구항 9에 있어서,
상기 배양은 27 ~ 40℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 L-아라보네이트의 생산방법.
청구항 9에 있어서,
상기 배양은 pH 6 ~ 8에서 수행하는 것을 특징으로 하는 L-아라보네이트의 생산방법.
청구항 9에 있어서,
상기 배양은 탄소원을 포함하는 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 L-아라보네이트의 생산방법.