CN117110253A - 一种spr传感器芯片表面抗原修饰和定量检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种SPR传感器芯片表面修饰抗原和定量检测方法，SPR传感器芯片表面链接抗体的方法包括，在SPR传感器芯片表面通过化学修饰的方式先形成一层巯基自组装单分子层，使芯片表层巯基化，再用N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1‑（3‑二甲氨基丙基）‑3乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）活化后将Mouse‑Anti Human IgG抗体共价固定于芯片表面，抗原能够与抗体特异性结合，将抗原结合至SPR传感器芯片表面，引起SPR传感器表面等离子共振角发生变化，从而实现待测样品中抗原含量的定量检测，并且检测下限低至28.25ng/mL。
Description
技术领域
本发明涉及等离子共振传感器技术领域，特别涉及一种SPR传感器芯片表面抗原修饰和定量检测的方法。
背景技术
表面等离子共振技术简称SPR，SPR是一种物理光学现象，当一束P偏振光以一定角度入射到镀有金属薄膜的玻璃表面时，在玻璃与金属薄膜界面将产生表面等离子波，若入射光波的传播系数与表面等离子波的传播系数相匹配，金属膜内自由电子产生共振，即表面等离子共振。固定入射光的波长λ，改变入射角θ，得到反射率角度谱，在特定的入射角处满足共振匹配条件，出现共振凹槽。
基于SPR技术进行分析物检测，通常先将一种靶分子键合在SPR传感器芯片表面，再将含有另一种能与靶分子产生相互作用的分析物的溶液注入并流经SPR传感界面，分子间的结合会引起芯片表面质量的增加，导致折射指数按同样的比例增强，反射率角度谱会在角度方向发生移动，通过检测共振角的移动实现对分析物的检测；
SPR传感作为一种实时、快速、免标记和高灵敏的传感检测方法被广泛应用于各类小分子和大分子传感检测，包括药物筛选、生物分子检测等。因此，基于SPR技术，进行待测样品中抗原含量的定量检测，并提高准确度，具有重要的研究意义和实用价值。
发明内容
本发明所要解决的问题是：提供一种SPR传感器芯片表面抗原修饰和定量检测的方法，用于对SPR传感器芯片表面进行抗原修饰，以实现待测样品中抗原含量的定量检测。
本发明采用如下技术方案：一种SPR传感器芯片表面链接抗体的方法，包括以下步骤：
S1.1、采用注射泵将11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液以稳定流速流经SPR传感器芯片，用于SPR传感器芯片表面巯基化，自组装成巯基单分子层；
S1.2、采用注射泵将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液以稳定流速流经芯片，用于SPR传感器芯片表面羧基活化；
S1.3、采用注射泵将抗体溶液以稳定流速流经芯片，用于在SPR传感器芯片表面链接IgG抗体；
S1.4、屏蔽SPR传感器芯片表面非特异性结合位点。
具体的，步骤S1.1中，所述SPR传感器芯片表面巯基化，方法包括：取11-巯基十一烷酸加入到乙醇溶液中配置成11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液，将SPR传感器芯片放入溶液中浸泡，室温放置，使芯片表面巯基化；将芯片取出用乙醇溶液和去离子水冲洗后，氮气吹干。
步骤S1.2中，所述SPR传感器芯片表面羧基活化，方法包括：将所述SPR传感器芯片放置于样品台模块并贴上PDMS流道，采用注射泵以稳定流速通入去离子水，使溶液稳定流经芯片表面，冲洗表面残留的11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液；再以稳定流速通入PBS缓冲液，得到基线SPR响应信号；取EDC和NHS加入到PBS缓冲液中，充分溶解后，以稳定流速通入，使所述SPR传感器芯片表面羧基充分活化；冲洗SPR传感器芯片表面。
步骤S1.3中，所述SPR传感器芯片表面链接IgG抗体，方法包括：取Mouse Anti-Human IgG溶液加入PBS缓冲液，形成稀释的IgG抗体溶液，将抗体溶液以稳定流速通入并流经芯片表面，使芯片表面链接上IgG抗体，冲洗SPR传感器芯片表面。
步骤S1.4中，所述屏蔽SPR传感器芯片表面非特异性结合位点，方法包括：取BSA加入到PBS缓冲液中，充分溶解后得到质量分数1％的BSA溶液，将BSA溶液以稳定流速通入并流SPR传感器芯片表面，将芯片表面非特异性活性位点屏蔽，再以稳定流速通入PBS缓冲液，冲洗SPR传感器芯片表面。
进一步的，所述稳定流速为20μl/min，所述冲洗SPR传感器芯片表面的方法包括：以所述稳定流速通入0.01M的PBS缓冲液，用于将芯片表面冲洗干净。
进一步的，所述SPR传感器芯片包括由内层向外层依次层叠的高折射率玻璃层、黏附层铬层和金层；所述高折射率玻璃为K9玻璃，折射率为1.515；所述黏附层铬层厚度为0-4nm；所述金层厚度为40-60nm。
本发明还包括一种SPR传感器芯片表面抗原定量检测的方法，使用上述任一项权方法在SPR传感器芯片表面链接抗体后，进行SPR传感器芯片表面抗原定量检测，芯片表面抗原定量检测方法包括以下步骤：
S2.1、采用注射泵将一系列已知浓度的抗原溶液以稳定流速流经芯片表面；
S2.2、实时采集SPR传感器响应信号并转化为相应SPR共振角，根据所得SPR角和预定的标准曲线获得待测溶液中抗原的含量，进行标准曲线拟合；
S2.3、抗原定量检测的准确度预测。
其中，所述抗原溶液为Human IgG抗原溶液，所述抗原定量检测为IgG抗原定量检测。
步骤S2.1中，所述一系列已知浓度分别为10，50，100，150，200μg/ml；
步骤S2.2中，所述标准曲线拟合，方法包括：基于上述SPR传感器芯片表面链接抗体过程后，配制一系列已知浓度抗原，采用注射泵将抗原按从低到高浓度以稳定流速流经芯片表面，实时采集SPR响应信号，得到不同浓度Human IgG抗原溶液与相应SPR响应值；将SPR响应值转化为相应的SPR共振角，并采用1：1结合的Langmuir模型进行拟合得到标准曲线，所述标准曲线为不同抗原浓度与相应SPR角的拟合曲线。
步骤S2.3中，所述IgG抗原定量检测的准确度预测，方法包括：基于步骤S2.2得到预测抗原浓度，并与实际抗原浓度比较，计算标准曲线对抗原的预测准确度。
其中，所述标准曲线为不同抗原浓度与相应SPR角的拟合曲线。
本发明采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：
1、具有实时监测生物分子相互作用的能力；
2、实现待测样品中抗原含量的定量检测，并且检测下限低至28.25ng/mL；
3、可以为某些疾病检测提供研究平台。
附图说明
图1为实现SPR传感器芯片表面抗原修饰和定量检测的流程图；
图2为SPR传感器芯片的制备过程及检测时发生免疫反应的示意图；
图3为芯片表面链接抗体过程中SPR传感器的响应示意图；
图4为不同抗原浓度流经芯片表面SPR传感器的响应示意图；
图5为不同抗原浓度与对应SPR角的拟合曲线；
图6为待测抗原检测过程中SPR传感器的响应示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对申请的技术方案做进一步地详尽阐述，所描述的实施例，也只是本发明所涉及实施例的一部分。本领域其他研究人员在该实施例上的所有非创新型实施例，都属于本发明的保护范围。同时对于本发明实施例中的步骤编号，其仅为了便于阐述说明而设置，对步骤之间的顺序不做任何限定，实施例中的各步骤的执行顺序均可根据本领域技术人员的理解来进行适应性调整。
在本发明的一个实施例中，一种SPR传感器芯片表面链接抗体的方法，如图1所示，包括以下步骤：
步骤1.1、芯片表面自组装巯基单分子层：
取0.0218g11-巯基十一烷酸加入到10mL乙醇溶液中配置成10mmol/L的11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液，将芯片放入溶液中浸泡，室温放置20h，使芯片表面巯基化；将芯片取出用乙醇溶液和去离子水大量冲洗次后，氮气吹干。
步骤1.2、芯片表面羧基活化：
将上述芯片放置于SPR传感器样品台模块并贴上自制的PDMS流道，采用注射泵以稳定流速缓慢通入去离子水，保持10min，使溶液稳定流经芯片表面，冲洗掉可能残留的11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液；再以稳定流速通入10min 0.01M的PBS缓冲液，得到基线SPR响应信号；
取0.3834g 1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和0.0057g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到10mL PBS缓冲液中，充分溶解后，以稳定流速通入上述溶液，保持30min，使芯片表面羧基充分活化；再以稳定流速通入10min PBS缓冲液，将芯片表面冲洗干净。
步骤1.3、芯片表面链接IgG抗体：
取200μl 1mg/ml的Mouse Anti-Human IgG溶液加入3800μl PBS缓冲液稀释成50μg/ml的IgG抗体溶液，将抗体溶液以稳定流速通入并流经芯片表面，保持30min，使芯片表面链接上IgG抗体；再以稳定流速通入10min PBS缓冲液，将芯片表面冲洗干净。
步骤1.4、芯片表面非特异性结合位点屏蔽：
取1g BSA加入到10mL PBS缓冲液中，充分溶解后得到质量分数1％的BSA溶液，将BSA溶液以稳定流速通入并流经芯片表面，保持30min，将芯片表面非特异性活性位点屏蔽；再以稳定流速通入10min PBS缓冲液，将芯片表面冲洗干净。
上述步骤过程中均实时采集SPR响应值，得到如附图3所示芯片表面链接抗体过程中SPR传感器的响应示意图。
本实施例所述的SPR传感器芯片，如图2所述，包括依次层叠的高折射率玻璃、黏附层铬层和金层。
进一步地，所述高折射率玻璃为K9玻璃，折射率为1.515；所述黏附层铬层厚度为0-4nm；所述金层厚度为40-60nm。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种SPR传感器芯片IgG抗原的定量检测方法，包括以下步骤：
步骤2.1、芯片表面链接IgG抗原
在0.01M的PBS缓冲液中配制一系列已知浓度为10，50，100，150，200μg/ml的HumanIgG抗原溶液，按浓度从低到高以稳定流速通入流经芯片表面，每种浓度抗原溶液均保持通入30min，不同浓度抗原溶液通入前均以稳定流速通入PBS缓冲液保持10min冲洗芯片；上述过程中实时采集SPR响应信号，得到不同浓度与相应SPR响应值，如附图4所示。
步骤2.2、标准曲线拟合：
将SPR响应值转化为相应的SPR共振角，并采用1：1结合的Langmuir模型进行拟合得到标准曲线，如附图5所示。
步骤2.3、IgG抗原定量检测准确度预测：
在PBS缓冲液中配制20μg/ml的Human IgG抗原溶液，以稳定流速通入抗原溶液并保持30min，再通入PBS缓冲液保持10min，冲洗芯片，实时采集SPR响应信号，得到20μg/ml浓度抗原的SPR响应值，如附图6所示。
将SPR响应值转化为相应SPR角，并把该值带入到标准曲线可对抗原浓度进行预测，得到预测抗原浓度，并与实际抗原浓度比较，计算标准曲线对抗原的预测准确度。
需要特别说明的是，本实施例的SPR传感器芯片，除了如上的应用于IgG抗原的定量检测外，检测中的待测物质也可以是其他生物分子。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (13)
1.一种SPR传感器芯片表面链接抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.1、采用注射泵将11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液以稳定流速流经SPR传感器芯片，用于SPR传感器芯片表面巯基化，自组装成巯基单分子层；
S1.2、采用注射泵将N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐溶液以稳定流速流经芯片，用于SPR传感器芯片表面羧基活化；
S1.3、采用注射泵将抗体溶液以稳定流速流经芯片，用于在SPR传感器芯片表面链接IgG抗体；
S1.4、屏蔽SPR传感器芯片表面非特异性结合位点。
2.根据权利要求1所述的SPR传感器芯片表面链接抗体的方法，其特征在于，步骤S1.1中，所述SPR传感器芯片表面巯基化，方法包括：取11-巯基十一烷酸加入到乙醇溶液中配置成11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液，将SPR传感器芯片放入溶液中浸泡，室温放置，使芯片表面巯基化；将芯片取出用乙醇溶液和去离子水冲洗后，氮气吹干。
3.根据权利要求2所述的SPR传感器芯片表面链接抗体的方法，其特征在于，步骤S1.2中，所述SPR传感器芯片表面羧基活化，方法包括：将所述SPR传感器芯片放置于样品台模块并贴上聚二甲基硅氧烷PDMS流道，采用注射泵以稳定流速通入去离子水，使溶液稳定流经芯片表面，冲洗表面残留的11-巯基十一烷酸无水乙醇溶液；再以稳定流速通入磷酸盐PBS缓冲液，得到基线SPR响应信号；取1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS加入到磷酸盐缓冲液中，充分溶解后，以稳定流速通入，使所述SPR传感器芯片表面羧基充分活化；冲洗SPR传感器芯片表面。
4.根据权利要求3所述的SPR传感器芯片表面链接抗体的方法，其特征在于，步骤S1.3中，所述SPR传感器芯片表面链接IgG抗体，方法包括：取Mouse Anti-Human IgG溶液加入PBS缓冲液，形成稀释的IgG抗体溶液，将抗体溶液以稳定流速通入并流经芯片表面，使芯片表面链接上IgG抗体，冲洗SPR传感器芯片表面。
5.根据权利要求4所述的SPR传感器芯片表面链接抗体的方法，其特征在于，步骤S1.4中，所述屏蔽SPR传感器芯片表面非特异性结合位点，方法包括：取牛血清蛋白BSA加入到PBS缓冲液中，充分溶解后得到质量分数1％的BSA溶液，将BSA溶液以稳定流速通入并流SPR传感器芯片表面，将芯片表面非特异性活性位点屏蔽，再以稳定流速通入PBS缓冲液，冲洗SPR传感器芯片表面。
6.根据权利要求1至5任一项所述的SPR传感器芯片表面链接抗体的方法，其特征在于，所述稳定流速为20μl/min；所述冲洗SPR传感器芯片表面的方法包括：以所述稳定流速通入0.01M的PBS缓冲液，用于将芯片表面冲洗干净。
7.根据权利要求1至5任一项所述的SPR传感器芯片表面链接抗体的方法，其特征在于，所述SPR传感器芯片包括由内层向外层依次层叠的高折射率玻璃层、黏附层铬层和金层。
8.根据权利要求7所述的SPR传感器芯片表面链接抗体的方法，其特征在于，所述高折射率玻璃为K9玻璃，折射率为1.515；所述黏附层铬层厚度为0-4nm；所述金层厚度为40-60nm。
9.一种SPR传感器芯片表面抗原定量检测的方法，其特征在于，使用上述权利要求1至5任一项方法在SPR传感器芯片表面链接抗体后，进行SPR传感器芯片表面抗原定量检测，所述芯片表面抗原定量检测方法包括以下步骤：
S2.1、采用注射泵将一系列已知浓度的抗原溶液以稳定流速流经芯片表面；
S2.2、实时采集SPR传感器响应信号并转化为相应SPR共振角，根据所得SPR角和预定的标准曲线获得待测溶液中抗原的含量，进行标准曲线拟合；
S2.3、进行抗原定量检测的准确度预测。
10.根据权利要求9所述的一种SPR传感器芯片表面抗原定量检测的方法，其特征在于，所述抗原为Human IgG抗原，所述抗原定量检测为IgG抗原定量检测，所述已知浓度的抗原溶液，浓度包括：10、50、100、150、200μg/ml。
11.根据权利要求10所述的一种SPR传感器芯片表面抗原定量检测的方法，其特征在于，步骤S2.2中，所述标准曲线拟合，方法包括：基于上述SPR传感器芯片表面链接抗体过程后，配制一系列已知浓度抗原，采用注射泵将抗原按从低到高浓度以稳定流速流经芯片表面，并且实时采集SPR响应信号，得到不同浓度Human IgG抗原溶液与相应SPR响应值；将SPR响应值转化为相应的SPR共振角，并采用1：1结合的Langmuir模型进行拟合得到标准曲线，所述标准曲线为不同抗原浓度与相应SPR角的拟合曲线。
12.根据权利要求11所述的一种SPR传感器芯片表面抗原定量检测的方法，其特征在于，步骤S2.3中，所述IgG抗原定量检测的准确度预测，方法包括：基于步骤S2.2得到预测抗原浓度，并与实际抗原浓度比较，计算标准曲线对抗原的预测准确度。
13.根据权利要求12所述的一种SPR传感器芯片表面抗原定量检测的方法，其特征在于，所述标准曲线为不同抗原浓度与相应SPR角的拟合曲线。
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