CN117106093A - 双Fmoc保护的Tirzepatide主链39肽及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于多肽合成领域，涉及Fmoc保护的Tirzepatide主链肽和合成方法及应用。本发明使用正交保护策略，通过固相合成的方法在16位赖氨酸侧链和1位酪氨酸的α‑氨基位点进行Fmoc保护，为后续Tirzepatide及其类似物的合成应用奠定了坚实的基础。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种双Fmoc保护的Tirzepatide主链39肽及其合成方法和应用。
背景技术
Tirzepatide是由礼来公司开发的一款GIP和GLP-1双功能嵌合肽。Tirzepatide的主链是含有39个氨基酸的多肽，其N末端的序列主要来自于GIP，C末端的序列来自于艾塞那肽。其新颖的序列设计，使GIP和GLP-1的功能得到了嵌合，赋予了Tirzepatide同时可以激活GIP和GLP-1双受体的功能。
Tirzepatide主链的结构：Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp-Lys-Ile-Ala-Gln-Lys-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
同时，礼来公司在主链的20位赖氨酸侧链氨基上修饰了脂肪酸侧链(AEEA-AEEA-γ-Glu-Eicosanediotic acid)赋予了Tirzepatide较长的体内半衰期，可以实现一周一次给药。Tirzepatide主要用于治疗二型糖尿病，肥胖等疾病。Tirzepatide以其新颖的结构和显著的三期临床结果，分别“头对头”打败了度拉鲁肽和司美格鲁肽，吸引了无数科研人员和药企的青睐，成为了GLP-1类药物的一颗新星。
WO 2020/159949 A1中原研公司礼来公开了一种Tirzepatide的全固相合成和二种液相片段合成方法。
CN 110903355 A中成都圣诺公司公开了一种Tirzepatide的制备方法，该专利采用了特殊的保护氨基酸，其目的是为了解决规模化制备方法中Tirzepatide纯度偏低的问题。
因此本领域急需一种新的制备Tirzepatide的中间体。
发明内容
本发明的目的是提供一种双Fmoc保护的Tirzepatide主链肽。
本发明的另一目的是提供双Fmoc保护的Tirzepatide主链肽的制备方法。
本发明的又一目的是提供双Fmoc保护的Tirzepatide主链肽在制备Tirzepatide及其类似物中的应用。
本发明第一方面，提供了一种Fmoc保护的Tirzepatide主链肽，所述Fmoc保护的Tirzepatide主链肽为Fmoc保护16位赖氨酸侧链氨基和1位酪氨酸的α氨基的Tirzepatide主链肽，结构如下式I所示：
Fmoc-Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp-Lys(Fmoc)-Ile-Ala-Gln-Lys-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 I。
在本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的Fmoc保护的Tirzepatide主链肽的固相合成方法，包括步骤：
(S1)由树脂固相载体和N端Fmoc保护的丝氨酸[Fmoc-Ser(tBu)]偶联得到Fmoc-Ser(tBu)-氨基树脂，然后按照Tirzepatide主链肽序与相应的氨基酸前体依次偶联，得到树脂肽，
其中，所述的第16位氨基酸前体为Fmoc-Lys(R)，R选自Alloc、Dde或ivDe；
(S2)将16位赖氨酸的侧链保护基团(R)脱除；
(S3)使用Fmoc保护基原料保护16位赖氨酸的侧链，得到Fmoc保护的Tirzepatide主链树脂肽；
(S4)裂解所述Fmoc保护的Tirzepatide主链树脂肽，得到Fmoc保护的Tirzepatide主链肽。
在另一优选例中，在步骤(S2)中，最后偶联的1位氨基酸前体为Fmoc-Tyr(tBu)。
在另一优选例中，在步骤(S2)中，第20位氨基酸前体为Fmoc-Lys(Boc)。
在另一优选例中，在步骤(S2)中，按照如下肽序依次偶联：Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Pro，Fmoc-Pro，Fmoc-Pro，Fmoc-Ala，Fmoc-Gly，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Pro，Fmoc-Gly，Fmoc-Gly，Fmoc-Ala，Fmoc-Ile，Fmoc-Leu，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Val，Fmoc-Phe，Fmoc-Ala，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ile，Fmoc-Lys(Alloc)或Fmoc-Lys(Dde)或Fmoc-Lys(ivDe)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Aib，Fmoc-Ile，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Aib，Fmoc-Tyr(tBu)。
在另一优选例中，在步骤(S1)中，所述树脂固相载体为氨基树脂，优选为MBHA树脂，例如Rink Amide MBHA树脂。
在另一优选例中，在步骤(S1)中，所述树脂的取代值为0.2-0.5mmol/g。
在另一优选例中，在步骤(S1)中，各偶联反应各自独立地包括一个或多个以下特征：
(1)树脂在反应前先脱除Fmoc基团，较佳地，脱Fmoc试剂为哌啶/DMF溶液，较佳地20％哌啶/DMF(体积比)；
(2)所述脱除Fmoc基团的时间为20-30min；
(3)脱Fmoc的树脂与氨基酸前体的摩尔比为1:2.0-3.5，较佳地，1:2.5-3.5，所述树脂用量以其总取代值计算；
(4)各偶联反应的偶联剂独立地选自下组：HOBt/DIC、TBTU/DIPEA、HATU/DIPEA、HOAt/DIC、TBTU/HOBt/DIPEA、HBTU/HOBt/DIPEA、PyBOP/DIPEA，或其组合；和/或
(5)氨基酸前体与偶联剂的摩尔比为1:1-3.5，较佳地，1:1-3，更佳地为1:2。
在另一优选例中，各偶联反应的偶联剂独立地选自下组：HOBt/DIC、TBTU/DIPEA、HATU/DIEA，或其组合。
在另一优选例中，在步骤(S1)中，各偶联反应各自独立地包括一个或多个以下特征：
(1)反应溶剂为DMF；
(2)所述偶联反应的温度为25±10℃，较佳地，25±5℃；
(3)所述偶联反应的时间为1-6h，较佳地，1-5h；和/或
(4)一个反应结束后，分离反应液，加入乙酰化(如乙酸酐)试剂乙酰化，DMF洗涤树脂，以进行下一步反应或结束反应。
在另一优选例中，所述树脂包括未进行偶联的树脂固相载体和已连接氨基酸前体的短肽树脂。
在另一优选例中，在步骤(S2)中，所述脱除反应中使用的脱除剂为四(三苯基膦)钯和苯硅烷，或水合肼。
在另一优选例中，所述四(三苯基膦)钯、树脂肽和苯硅烷的摩尔比为0.1-0.5:1:10-50，优选0.1:1:10。
在另一优选例中，在步骤(S2)中，所述脱除反应还包括一个或多个以下特征：
(1)所述反应溶剂为DCM或DMF；
(2)所述反应在惰性气体氛围下进行，较佳地，N2；
(3)所述反应在避光条件下进行；
(4)所述反应的温度为25±10℃，较佳地，25±5℃；
(5)所述反应的时间为0.2-0.5h。
在另一优选例中，所述步骤(S2)结束后，还包括洗涤的后处理步骤。
在另一优选例中，所述洗涤包括用DCM洗涤6遍，0.02mol/L N,N-二乙基二硫代氨基甲酸/DMF溶液洗涤2遍。
在另一优选例中，在步骤(S3)中，所述保护反应包括一个或多个以下特征：
(1)所述Fmoc保护基原料选自下组：Fmoc琥珀酰亚胺酯、Fmoc酰氯，或其组合；
(2)所述反应还需加入缩合剂，其中所述缩合剂为DIPEA；
(3)R保护基原料、步骤(S2)得到的树脂肽与缩合剂的摩尔比为2.0-3.5:1:4.0-7.0，较佳地，2.5-3.5:1:5.0-7.0，所述树脂用量以其总取代值计算；
(4)反应溶剂为DMF；和/或
(5)所述反应的反应时间为1-3h，例如2h。
在另一优选例中，在步骤(S4)中，所述裂解中使用的裂解试剂包含三氟乙酸。
在另一优选例中，在步骤(S4)中，所述裂解试剂还包含水和/或1,2-乙二硫醇。
在另一优选例中，在步骤(S4)中，所述反应包括一个或多个以下特征：
(1)所述裂解试剂中三氟乙酸、水和1,2-乙二硫醇的体积比为90-95:2.5-5:2.5-5；
(2)所述裂解试剂与树脂肽的体积质量分数为10-15mL/g；
(3)所述反应在25±10℃下进行，较佳地，25±5℃；和/或
(4)所述反应的时间为2-3h。
在本发明的第三方面，提供了如本发明第一方面所述的Fmoc保护的Tirzepatide主链肽的用途，用于制备Tirzepatide及其脂肪酸类似物。
在另一优选例中，所述Tirzepatide脂肪酸类似物包括T01。
在本发明第四方面，提供了一种Fmoc保护的Tirzepatide主链树脂肽，所述Fmoc保护的Tirzepatide主链树脂肽的结构如下式II所示：
Fmoc-Tyr(R’)-Aib-Glu(R’)-Gly-Thr(R’)-Phe-Thr(R’)-Ser(R’)-Asp(R’)-Tyr(R’)-Ser(R’)-Ile-Aib-Leu-Asp(R’)-Lys(Fmoc)-Ile-Ala-Gln(R’)-Lys(R’)-Ala-Phe-Val-Gln(R’)-Trp(R’)-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser(R’)-Ser(R’)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-树脂
II
其中，各个R’各自独立地选自tBu、OtBu、Trt、Boc；
所述树脂为氨基树脂，优选为MBHA树脂。
在另一优选例中，所述Fmoc保护的Tirzepatide主链树脂肽的结构选自下组：
Fmoc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Fmoc)-Ile-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂。
在本发明的第五方面，提供了一种Tirzepatide及其类似物的制备方法，所述方法以式I或式II化合物为原料或中间体进行制备。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：将式I化合物与侧链进行缩合，然后脱Fmoc保护基，得到所述Tirzepatide或其类似物。
在另一优选例中，所述Tirzepatide类似物包括T01。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了双Fmoc保护的39肽的高分辨质谱图。
图2显示了Tirzepatide的高分辨质谱图。
图3显示了T01的高分辨质谱图。
图4显示了Tirzepatide及其T01的脂肪酸侧链结构。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种Tirzepatide主链肽固相合成方法。为控制后期脂肪酸侧链定点修饰的准确性，本发明通过正交保护的方法，通过特定的保护基的选择，固相合成出Fmoc保护主链39肽的16位赖氨酸侧链氨基和1位酪氨酸的α氨基的Tirzepatide主链肽，从而使后续脂肪酸侧链定点地与20位赖氨酸缩合，保证对接准确性，为Tirzepatide的商业化提供帮助。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“室温”或“常温”是指温度为4-40℃，较佳地，25±5℃。
在本发明具体实施方式中，申请文件中所用的英文缩写对应的中文含义见表1。
表1
Fmoc保护的Tirzepatide主链肽
Tirzepatide主链中在第16位和20位均存在赖氨酸，因此16位赖氨酸将对20位赖氨酸上的侧链修饰产生影响，此外1位酪氨酸的α氨基也是侧链修饰过程中常见的错误位点。若不进行精确的保护基修饰设计，则极易对接错误，使得产率下降，以及增大后期分离操作的难度并最终影响纯度。
本发明合成了一种双Fmoc保护的Tirzepatide主链肽，进而为后续脂肪酸侧链定点修饰20位赖氨酸侧链氨基，最后合成Tirzepatide及其类似物奠定坚实的基础。
具体地，本发明通过正交保护策略使用在16位赖氨酸侧链氨基和1位酪氨酸的α氨基上定点用Fmoc保护，20位赖氨酸仍为Boc保护的方法制备了一种双Fmoc保护的Tirzepatide主链肽。得到的双Fmoc保护的Tirzepatide主链肽的结构如下式I所示：
Fmoc-Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp-Lys(Fmoc)-Ile-Ala-Gln-Lys-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 I
本发明采用赖氨酸侧链氨基的正交保护策略通过固相合成得到双Fmoc保护的39肽，目前用于正交保护策略的保护基有Alloc，Dde和ivDde，其中Dde和ivDde的脱保护策略是一致的，即使用一定比例的水合肼/DMF，然而，水合肼有剧毒。因此在本发明中，采用了Alloc的正交保护策略合成了双Fmoc保护的Tirzepatide主链肽。
Tirzepatide主链肽的固相合成方法
本发明提供了一种Fmoc保护的Tirzepatide主链肽的固相合成方法，包括以下步骤：
a、以氨基树脂为起始树脂载体，经过脱Fmoc，洗涤，活化剂和缩合剂的缩合反应，由树脂固相载体和N端Fmoc保护的丝氨酸[Fmoc-Ser(tBu)]偶联得到Fmoc-Ser(tBu)-氨基树脂；
b、通过固相合成法，按照正交保护策略和主链序列依次偶联各个氨基酸；
c、脱除16位赖氨酸保护基；
d、用Fmoc保护16位赖氨酸保护基；
e、裂解脱除树脂得到Fmoc保护的主链39肽。
进一步，步骤a中所述氨基树脂，取代值为0.2-0.5mmol/g。
进一步，步骤a所述的脱Fmoc方法具体为20％的哌啶/DMF脱除20min。
进一步，步骤a中所述缩合反应过程中以DIC/HOBt或HATU/DIPEA为活化缩合试剂。
进一步，步骤b所述的固相合成方法具体为：
(1)采用20％的哌啶/DMF脱除Fmoc保护基，得到NH2-Ser(tBu)-氨基树脂；
(2)在偶联剂系统的存在下，NH2-Ser(tBu)-氨基树脂和Fmoc保护的脯氨酸偶联得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂；
(3)重复步骤(1)和(2)，按照Tirzepatide主链39肽依次进行氨基酸的偶联。
进一步，步骤b所述的正交保护策略为20位赖氨酸采用Fmoc-Lys(Boc)和16位赖氨酸可以为Fmoc-Lys(Alloc)，Fmoc-Lys(Dde)或Fmoc-Lys(ivDde)，优选Fmoc-Lys(Alloc)。
进一步，步骤b得到的全保护树脂肽的结构为Fmoc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Alloc)-Ile-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂。
进一步，步骤b所述的固相合成方法中，最后一个氨基酸即1位氨基酸可以为Fmoc-Tyr(tBu)或Boc-Tyr(tBu)，优选Fmoc-Tyr(tBu)。
进一步，步骤c中，主链树脂肽合成结束后，通过四三苯基膦钯和苯硅烷脱除16位赖氨酸的侧链保护基。
进一步，步骤c得到的树脂肽的结构为Fmoc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(NH2)-Ile-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂。
进一步，步骤d中，脱除完成后，通过Fmoc-琥珀酰亚胺酯或Fmoc-酰氯保护16位赖氨酸的侧链氨基。
进一步，步骤d得到的树脂肽的结构为Fmoc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Fmoc)-Ile-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂。
进一步，步骤e得到的主链肽的结构为Fmoc-Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp-Lys(Fmoc)-Ile-Ala-Gln-Lys-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。
进一步，本发明提供的Fmoc保护的主链39肽，无需纯化，直接可进行脂肪酸侧链的定点修饰，可用于Tirzepatide及其一系列脂肪酸类似物的合成。
本发明的主要优点：
1：通过正交保护策略得到Fmoc保护主链39肽的16位赖氨酸侧链氨基和1位酪氨酸的α氨基的Tirzepatide主链肽(新化合物)。
2：提供了一个先导多肽，为应用于Tirzepatide及其类似物的定点修饰合成奠定了基础。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1:Fmoc双保护的Tirzepatide主链39肽的合成
Fmoc保护的Tirzepatide主链39肽的结构如下所示：
Fmoc-Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp-Lys(Fmoc)-Ile-Ala-Gln-Lys-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
使用Rink Amide MBHA树脂为起始树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与表2所示的保护氨基酸偶联，制得Fmoc保护的Tirzepatide主链树脂肽。本实施例使用的保护氨基酸如下表2所示：
表2
实施例1.1接入第1个保护氨基酸
取0.5g的Rink Amide MBHA树脂(取代值约0.29mmol/g)，采用20％哌啶/DMF溶液去保护20min，DMF洗涤6遍得到去Fmoc的树脂。
向上述装有树脂的反应器中，加入含0.45mmol的第1个保护氨基酸，0.45mmol的DIC和0.45mmol HOBt的10ml DMF溶液(或加入含0.45mmol的第1个保护氨基酸，0.45mmol的HATU和0.9mmol的DIPEA的10ml DMF溶液)，偶联反应1-5h，DMF洗涤6遍，得含有1个保护氨基酸的树脂Fmoc-Ser(tBu)-氨基树脂。
实施例1.2接入2-39个保护氨基酸
采用上述同样的方法，先去除Fmoc-Ser(tBu)-氨基树脂的Fmoc保护基，得到NH2-Ser(tBu)-氨基树脂，然后采用上述同样的方法进行缩合反应，得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂。
接着，以此类推，一次接入上述对应的第2-39个保护氨基酸，并保留最后一个氨基酸的氨基保护基Fmoc，得到如下式所示的结构：
Fmoc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Alloc)-Ile-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂。
实施例1.3脱除16位赖氨酸的侧链保护基团Alloc
称取四(三苯基膦)钯(0.0145mmol，相对于树脂肽0.1倍量)及苯硅烷(1.45mmol，10倍量)加入10ml DCM溶解后加入到反应器中与树脂肽反应30min，此过程全程需在避光及氮气保护条件下进行。反应结束后，依次用DCM洗涤6遍，0.02mol/L N,N-二乙基二硫代氨基甲酸/DMF溶液洗涤2遍，每次2min，DMF洗涤6遍，得到如下式所示的结构：
Fmoc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(NH2)-Ile-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂。
实施例1.4 Fmoc保护16位赖氨酸的侧链氨基
称取0.45mmol的Fmoc琥珀酰亚胺酯或Fmoc酰氯和0.9mmol的DIPEA加入10ml DMF溶解后加入到反应器中与树脂肽(Fmoc原料：树脂肽为3:1)反应2h，反应结束后，DMF洗涤3遍，DCM洗涤3遍，40℃真空干燥树脂肽2h，得到Fmoc保护的Tirzepatide主链树脂肽，得到如下式所示的结构：
Fmoc-Tyr(tBu)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Aib-Leu-Asp(OtBu)-Lys(Fmoc)-Ile-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-氨基树脂。
实施例1.5.Fmoc双保护的Tirzepatide主链39肽
取实施例1.4制得树脂肽，加入体积比TFA:水:EDT＝95:2.5:2.5的裂解试剂(每克树脂肽加入10ml裂解试剂)，搅拌均匀，室温下反应2-3h，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量的TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入冰的无水乙醚沉淀和洗涤3次，抽干得类白色粉末即为Fmoc保护的Tirzepatide主链39肽。
双Fmoc保护的39肽纯度为60.2％，高分辨质谱结果为[1505.4238+3H]3+与理论分子量一致(见图1)。
此双Fmoc保护的主链39肽，无需纯化，直接可进行脂肪酸侧链的定点20赖氨酸侧链氨基的修饰。
实施例2.合成Tirzepatide
取实施例1.5中的双Fmoc保护的主链39肽100mg，并加入1％的三乙胺水溶液10mL(含50％的乙腈)，在磁力搅拌下溶解样品。其次，缓慢滴加1.2当量的Tirzepatide脂肪酸侧链琥珀酰亚胺酯(见图4)，磁力搅拌15min，RP-HPLC检测反应完全，随后加入1mL乙醇胺，室温下反应30min脱除Fmoc保护基，RP-HPLC检测反应完全，1M的盐酸调pH至8.5。最后反相HPLC制备，得到纯度98％以上的Tirzepatide，高分辨质谱结果为[1605.1847+3H]3+与理论分子量保持一致(见图2)，收率为60％。
实施例3.合成Tirzepatide的脂肪酸类似物
参见实施例3合成Tirzepatide的方法，合成Tirzepatide的类似物-T01(注：T01的脂肪酸侧链为Semaglutide的脂肪酸侧链，见图4)，最后反相HPLC制备T01，得到纯度98％以上的T01，高分辨质谱结果为[1595.8376+3H]3+与理论分子量保持一致(见图3)，收率为65％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种Fmoc保护的Tirzepatide主链肽，其特征在于，所述Fmoc保护的Tirzepatide主链肽为Fmoc保护16位赖氨酸侧链氨基和1位酪氨酸的α氨基的Tirzepatide主链肽，结构如下式I所示：
Fmoc-Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp-Lys(Fmoc)-Ile-Ala-Gln-Lys-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 I。
2.如权利要求1所述的Fmoc保护的Tirzepatide主链肽的固相合成方法，其特征在于，包括步骤：
(S1)由树脂固相载体和N端Fmoc保护的丝氨酸[Fmoc-Ser(tBu)]偶联得到Fmoc-Ser(tBu)-氨基树脂，然后按照Tirzepatide主链肽序与相应的氨基酸前体依次偶联，得到树脂肽，
其中，所述的第16位氨基酸前体为Fmoc-Lys(R)，R选自Alloc、Dde或ivDe；
(S2)将16位赖氨酸的侧链保护基团(R)脱除；
(S3)使用Fmoc保护基原料保护16位赖氨酸的侧链，得到Fmoc保护的Tirzepatide主链树脂肽；
(S4)裂解所述Fmoc保护的Tirzepatide主链树脂肽，得到Fmoc保护的Tirzepatide主链肽。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(S2)中，最后偶联的1位氨基酸前体为Fmoc-Tyr(tBu)，第20位氨基酸前体为Fmoc-Lys(Boc)。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(S2)中，按照如下肽序依次偶联：Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Pro，Fmoc-Pro，Fmoc-Pro，Fmoc-Ala，Fmoc-Gly，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Pro，Fmoc-Gly，Fmoc-Gly，Fmoc-Ala，Fmoc-Ile，Fmoc-Leu，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Val，Fmoc-Phe，Fmoc-Ala，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ile，Fmoc-Lys(Alloc)或Fmoc-Lys(Dde)或Fmoc-Lys(ivDe)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Aib，Fmoc-Ile，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Gly，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Aib，Fmoc-Tyr(tBu)。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(S1)中，各偶联反应各自独立地包括一个或多个以下特征：
(1)树脂在反应前先脱除Fmoc基团，较佳地，脱Fmoc试剂为哌啶/DMF溶液，较佳地20％哌啶/DMF(体积比)；
(2)所述脱除Fmoc基团的时间为20-30min；
(3)脱Fmoc的树脂与氨基酸前体的摩尔比为1:2.0-3.5，较佳地，1:2.5-3.5，所述树脂用量以其总取代值计算；
(4)各偶联反应的偶联剂独立地选自下组：HOBt/DIC、TBTU/DIPEA、HATU/DIPEA、HOAt/DIC、TBTU/HOBt/DIPEA、HBTU/HOBt/DIPEA、PyBOP/DIPEA，或其组合；和/或
(5)氨基酸前体与偶联剂的摩尔比为1:1-3.5，较佳地，1:1-3，更佳地为1:2。
6.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，在步骤(S2)中，所述脱除反应中使用的脱除剂为四(三苯基膦)钯和苯硅烷，或水合肼。
7.如权利要求2所述的合成方法，其特征在于，在步骤(S3)中，所述保护反应包括一个或多个以下特征：
(1)所述Fmoc保护基原料选自下组：Fmoc琥珀酰亚胺酯、Fmoc酰氯，或其组合；
(2)所述反应还需加入缩合剂，其中所述缩合剂为DIPEA；
(3)R保护基原料、步骤(S2)得到的树脂肽与缩合剂的摩尔比为2.0-3.5:1:4.0-7.0，较佳地，2.5-3.5:1:5.0-7.0，所述树脂用量以其总取代值计算；
(4)反应溶剂为DMF；和/或
(5)所述反应的反应时间为1-3h，例如2h。
8.如权利要求1所述的Fmoc保护的Tirzepatide主链肽的用途，其特征在于，用于制备Tirzepatide及其脂肪酸类似物。
9.一种Fmoc保护的Tirzepatide主链树脂肽，其特征在于，所述Fmoc保护的Tirzepatide主链树脂肽的结构如下式II所示：
Fmoc-Tyr(R’)-Aib-Glu(R’)-Gly-Thr(R’)-Phe-Thr(R’)-Ser(R’)-Asp(R’)-Tyr(R’)-Ser(R’)-Ile-Aib-Leu-Asp(R’)-Lys(Fmoc)-Ile-Ala-Gln(R’)-Lys(R’)-Ala-Phe-Val-Gln(R’)-Trp(R’)-Leu-Ile-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser(R’)-Ser(R’)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-树脂
II
其中，各个R’各自独立地选自tBu、OtBu、Trt、Boc；
所述树脂为氨基树脂。
10.一种Tirzepatide及其类似物的制备方法，其特征在于，所述方法以式I或式II化合物为原料或中间体进行制备。
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