CN117100836A - 一种灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物及其在预防或治疗高尿酸症及抗疲劳的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物及其在制备预防和/或治疗受试者高尿酸血症及抗疲劳的应用，属于高尿酸血症和/或疲劳的预防和治疗技术领域。本发明首次发现灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物预防或治疗高尿酸血症及抗疲劳取得较好效果，治疗后小鼠血清尿酸（UA）、血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性(XOD)、血清肌酐(CRE)、血清尿素氮(BUN)、血清谷丙转氨酶（ALT）、血清谷草转氨酶（AST）水平等指标得到明显改善，同时能够调节高尿酸血症小鼠肠道菌群丰度，小鼠的抗疲劳能力增强。灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物通过降尿酸以及肠道菌群调节等对高尿酸血症及疲劳有预防和或治疗作用，具有重大产业价值。
Description
技术领域
本发明属于高尿酸血症和/或疲劳的预防和治疗技术领域，具体涉及一种灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物及其在预防或治疗高尿酸血症及抗疲劳的应用。
背景技术
高尿酸血症（HUA）是指在正常饮食状态下，体内尿酸生成过多和（或）排泄过少所致。非同日两次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/L，女性高于360μmol/L，即称为高尿酸血症。尿酸是人类嘌呤化合物的终末代谢产物。嘌呤代谢紊乱导致高尿酸血症。患者可通过饮用随低食物和控制体重，达到缓解、治疗高尿酸血症的效果。
高尿酸血症已经成为继“三高”疾病之后的“第四高”，尿酸的主要排泄渠道就是肾脏，当尿酸值超过了肾脏的代谢极限，尿酸盐就会结晶沉淀在关节腔内，出现关节疼痛、关节红肿等症状，诱发痛风性关节炎。一般质量方法为物理治疗和药物治疗，物理治疗不能从根本上解决问题，只能缓解痛风症状；药物治疗容易产生耐药性和不良反应。
专利CN202110500995.8公开了一种降尿酸促进痛风石溶解的制品及其制备方法和应用，其以菊苣粉、青梅粉、桑叶粉、栀子粉、平卧菊三七粉及土茯苓粉作为原料制得的制品，有效减少尿酸的生成，促进痛风石的溶解。
专利CN201510252129.6公开了一种预防和治疗痛风及高尿酸血症的复合超微粉及其制备方法，采用金钗石斛、束花石斛、芡实、薏苡仁、葛根、荷叶、肉桂作为原料，采用超微粉制备技术得到的产品，能够有效降低患者血尿酸的含量，缓解疼痛。
专利CN202210405514.X公开了一种防治高血尿酸症和痛风性关节炎的产品及其制备方法，包括以下原料：天然植物粉末，低聚糖，肽粉，能够有效降低血清尿素氮、血尿酸、血肌酐，减轻痛风性关节疼痛，降低高血尿酸症和痛风性关节炎的发生。
但现有技术中制备得到的产品，防治高血尿酸症和痛风性关节炎的效果有限，无法从根本上减少尿酸的生成，并且现有技术没有同时具有降低尿酸以及抗疲劳药物存在，因此，亟需找到一种治疗效果好，副作用低的替代药物。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物，其特征在于，所述组合物包含：
海洋鱼低聚肽 200-400份；
灵芝子实体 50-150份；
益智仁粉 50-100份；
姜黄粉 20-80份
栀子粉20-80份；
酸樱桃粉 20-80份；
维生素C 10-30份；
天然香料 100-200份；
酸度调节剂 100-250份；
抗性糊精 20-80份；
忧遁草提取物 10-30份；
槐米粉 20-80份；
水果粉 20-80份；
植物乳杆菌20-80份；
其中植物乳杆菌含量为100-400亿CFU/g。
本发明中的原料以及益生菌均从商业途径购买。
优选地，灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物包含或为：海洋鱼低聚肽 300份；
天然香料 100份；
灵芝子实体 100份；
益智仁粉 80份；
姜黄粉 50份
栀子粉50份；
酸樱桃粉 50份；
维生素C 25份；
天然香料 100份；
酸度调节剂 200份；
抗性糊精 50份；
忧遁草提取物 20份；
槐米粉 50份；
水果粉 55份；
植物乳杆菌50份；
其中植物乳杆菌含量为250亿CFU/g。
优选地，所述天然香料为芹菜籽提取物、核桃壳提取物、香叶提取物和苏合香提取物中的一种或多种，优选地，各个提取物之间质量配比为1:1。所述水果粉为椰子粉、甜橙粉和苹果粉等中的一种或多种，水果粉主要用于调节口感，可以根据口味需要进行选择。所述酸度调节剂为柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸和苹果酸中的一种或多种。所述植物乳杆菌可以为灭活或非灭活形式，具体地，植物乳杆菌为植物乳杆菌La10。
所述植物乳杆菌La10，其分类命名为Lactiplantibacillus plantarum，被保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63605，保藏时间为2023年6月30日，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
经过长时间的探索和研究，申请人意外的发现，单独采用灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物中的一种或多种组分均无法预防和/或治疗高尿酸血症和/或疲劳，而本发明特定含量的灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物却表现出较好的疗效，并且治疗效果优于阳性对照苯溴马隆药剂组。
因此，本发明的另一个目的在于提供包含所述的灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物的组方。
具体地，所述的组方的剂型包括但不限于粉剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、油剂。进一步具体地，所述的组方的剂型为粉剂。具体地，所述的组方中包括医学上可接受的载体。进一步具体地，所述的载体包括但不限于赋性剂、缓冲剂、乳化剂、稳定剂、稀释剂、粘合剂、防腐剂。再进一步具体地，所述赋性剂选自微晶纤维素、乳糖、预胶化淀粉、环糊精、羧甲基纤维素中的至少一种。再进一步具体地，所述缓冲剂选自磷酸二氢钠、碳酸氢钠、碳酸氢铵、醋酸钠、枸橼酸盐、琥珀酸盐中的至少一种。再进一步具体地，所述乳化剂选自硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸钙、硬脂酸甘油酯、山梨坦异硬脂酸酯、山梨坦油酸酯、甘油油酸酯中的至少一种。再进一步具体地，所述稳定剂选自金合欢胶、琼脂、藻酸、纤维素醚、羧甲基甲壳酯中的至少一种。再进一步具体地，所述稀释剂选自赤藓糖醇、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、乳糖、蔗糖、玉米淀粉、马铃薯淀粉、磷酸钙、柠檬酸钙中的至少一种。再进一步具体地，所述粘合剂选自乙醇、淀粉浆、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
本发明的另一个目的在于提供所述的灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物或上述组合物在制备预防和/或治疗受试者高尿酸血症和/或抗疲劳中的应用。
本发明治疗对象可以为任何哺乳动物，优选地，受试者为大鼠、小鼠、兔子、猴或人。
本发明预防和/或治疗通过改善血清尿酸（UA）、血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性(XOD)、血清肌酐(CRE)、血清尿素氮(BUN)、血清谷丙转氨酶（ALT）、血清谷草转氨酶（AST）水平中的一种或多种实现。本发明的预防和/或治疗还可以通过调解肠道菌群实现。
本发明首次提供一种灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物（样品组），发现其在降低尿酸水平方面有较好的效果，同时该组合物还具有较好的抗疲劳效果，治疗后小鼠血清尿酸（UA）、血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性(XOD)、血清肌酐(CRE)、血清尿素氮(BUN)、血清谷丙转氨酶（ALT）、血清谷草转氨酶（AST）水平与模型组相比，均得到明显改善。16S RNA肠道菌群丰度分析结果表明，低剂量样品组与模型组以及高剂量样品组与模型组之间有明显的分离，表明样品能够调节高尿酸血症小鼠肠道菌群丰度。将灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物开发成为具有治疗预防和/或治疗受试者高尿酸血症和/或疲劳的产品具有重要意义。
附图说明
图1为给药前后小鼠体重变化图。
图2 是样品对血清尿酸水平影响图。
图3为样品对血清黄嘌呤氧化酶活性影响图。
图4为样品对肝脏黄嘌呤氧化酶活性影响图。
图5为样品对血清肌酐水平影响图。
图6为样品对血清尿素氮水平影响图。
图7为样品对血清谷丙转氨酶（ALT）活性影响图。
图8为样品对血清谷草转氨酶（AST）活性影响图。
图9为样品对小鼠的肠道菌群丰度影响图。图中，C表示正常组，M表示模型组，LS和HS分别表示低剂量样品组和高剂量样品组。
图10为样品对小鼠抗疲劳能力评估图。
图中，不同字母代表两者具体显著性差异（P<0.01）。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应该理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都落入本发明保护范围。实施例中未注明具体条件的实施方法，通常按照常规条件中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例使用的原料、试剂以及试剂盒等均通过商业途径购买获得。
本发明实施例中所用灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物样品含量包含：海洋鱼低聚肽 300g；灵芝子实体 100g；益智仁粉80g；姜黄粉50g；栀子粉50g；酸樱桃粉 50g；维生素C25g；天然香料 100g酸度调节剂 200g；抗性糊精 50g；忧遁草提取物 20g；槐米粉 50g；椰子粉 55g；植物乳杆菌La10 50g，含量为250亿CFU/g，其中，天然香料为芹菜籽提取物、核桃壳提取物、香叶提取物和苏合香提取物按照质量比1:1:1:1混合而成，酸度调节剂为柠檬酸钾和柠檬酸钠按照质量比1:1混合而成。
剂量选择：本实验设低和高2 个给药剂量组，分别为100 mg/kg，LS和200 mg/kg,HS。
本研究中涉及的动物实验经海南大学动物伦理委员会批准，使用的雄性C57 BL/J小鼠购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（湘）2019-0004。小鼠在规定的SPF级（无特殊病原体）环境中饲养，温度保持在25±2℃，湿度为60-70%，每12小时进行明暗交替。通过灌胃腺嘌呤和氧嗪酸钾（PO）的方法建立高尿酸血症小鼠模型（Cui等人，2023）。腺嘌呤为尿酸的前体物质；PO为尿酸氧化酶的化学抑制剂，可抑制小鼠体内尿酸酶的活性，使尿酸无法分解，导致体内尿酸水平上升，最终造成小鼠高尿酸血症。
适应性喂养7天后，小鼠被随机分为5组（n=6）：对照组（Control），高尿酸血症模型组（Model），苯溴马隆药剂（50mg/kg）阳性对照组（Ben），低剂量样品组（100 mg/kg，LS）和高剂量样品组（200 mg/kg, HS）。高尿酸血症模型组、苯溴马隆药剂阳性对照组、低剂量样品组和高剂量样品组连续21天给予2 mL溶解于生理盐水中的建模药物（PO 200 mg/kg+腺嘌呤50 mg/kg），而对照组给予无药物的生理盐水。建模药物给药后6 h，小鼠被灌胃对应剂量的阳性药物或样品（溶解于2 mL生理盐水），对照组被灌胃生理盐水作为对照。
样品采集：最后一次给药后，小鼠被禁食16小时，期间收集小鼠粪便并储存在-80℃冰箱用于小鼠肠道菌群丰度分析。通过摘眼取血法收集小鼠的血液样本。获得的血液在4℃冰箱中静置3小时后离心（3000 rpm，4℃），提取上层血清并储存在-80℃冰箱用于生化指标的测试。将小鼠肝脏取出后用预冷的PBS清洗，并放入液氮速冻。
根据试剂盒的说明书测试了小鼠血清尿酸（UA）、血清黄嘌呤氧化酶活性(XOD)、血清肌酐(CRE)、血清尿素氮(BUN)、血清谷丙转氨酶（ALT）、血清谷草转氨酶（AST）以及肝脏黄嘌呤氧化酶活性(XOD)等指标。试剂盒购买自南京建成生物工程研究所。血清样本可以直接用于检测，肝脏组织样品需加入PBS（质量（g）：体积(mL)=1：9）进行研磨，离心得到的上清液供试。
收集四组小鼠（n = 5）的粪便样本用于16S rRNA基因测序。高通量测序方法和数据处理如Deng等人（2023）所述，所有的所有组的粪便样本的DNA均使用EZNA土壤DNA试剂盒提取。采用Nanodrop对DNA进行定量，并通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。使用引物338F (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)对细菌基因的可变区域V3-V4区进行扩增。PCR产物经过纯化后用Illumina公司的TruSeq NanoDNA LT Library Prep Kit测序。高通量测序结果按照报告中的分析流程进行后续分析。
分析流程：
1) 首先对高通量测序的原始下机数据根据序列质量进行初步筛查；对问题样本进行重测、补测。
2) 通过质量初筛的原始序列按照index和Barcode信息，进行文库和样本划分，并去除barcode序列。
3) 按照QIIME2 dada2分析流程或Vsearch软件的分析流程进行序列去噪或OTU聚类。
4) 对各样本(组)在不同物种分类学水平的具体组成进行展示，了解整体概况。
5) 根据ASV/OTU在不同样本中的分布，评估每个样本的Alpha多样性水平，并通过稀疏曲线反映测序深度是否合适。
6) 在ASV/OTU层面，计算各样本的距离矩阵，并通过多种非监督的排序、聚类手段，结合相应统计学检验方法，衡量不同样本(组)间的beta多样性差异及差异显著性。
7) 在物种分类学组成层面，通过各种非监督、监督的排序、聚类和建模手段，结合相应统计学检验方法，进一步衡量不同样本(组)间的物种丰度组成差异，并尝试寻找标志物种。
8) 根据物种在各样本中的组成分布，构建关联网络，计算拓扑指数，并尝试找出关键物种。
9) 根据16S rRNA、18S rRNA和ITS基因测序结果预测样本的菌群代谢功能，找出差异通路，并获得特定通路的物种组成。
10) 在以上结果的基础上，绘制具备图表，并进行统计检验分析。
根据何双等人（2009）报道的方法：在实验末期，评估实验小鼠的抗疲劳能力，在小鼠尾部固定5%体重的铅块，使其在深水（30 cm×30 cm×30 cm）中游泳直至力竭，记录小鼠游泳时间，以评估小鼠的抗疲劳能力。
为了全面了解测试样品对高尿酸血症小鼠的治疗效果及机理，本研究使用试剂盒法测试了小鼠血清尿酸（UA）、血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性(XOD)、血清肌酐(CRE)、血清尿素氮(BUN)、血清谷丙转氨酶（ALT）、血清谷草转氨酶（AST）水平等指标。
图1为给药前后小鼠体重变化图。给药前，与模型组相比，苯溴马隆组、低、高剂量样品组的体重均无显著性差异。给药后，各组小鼠在实验结束后的体重组间差异具有统计学意义（P＜0.01）。说明测试样品在本试验条件下对动物的体重有明显影响，并且呈计量依赖性。结果见图1。
图2 是样品对血清尿酸水平影响图。由图2可知，模型组血清尿酸水平显著升高，而苯溴马隆组、低、高剂量样品组均可以显著降低血清尿酸水平，并且高剂量样品组与阳性对照组效果相当。
图3为样品对血清黄嘌呤氧化酶活性影响图。由图3可知，与模型组相比，样品组可显著降低血清黄嘌呤氧化酶活性，说明样品组可以通过降低血清黄嘌呤氧化酶活性达到降低尿酸水平的作用。
图4为样品对肝脏黄嘌呤氧化酶活性影响图。由图4可知，与模型组相比，样品组可显著降低肝脏中黄嘌呤氧化酶活性，说明样品组可以通过降低肝脏黄嘌呤氧化酶活性达到降低尿酸水平的作用。
图5为样品对血清肌酐水平影响图。由图5可知，与模型组相比，样品组可显著降低血清肌酐水平，并且高剂量样品组比阳性对照组效果更好，说明样品组可以通过降低血清肌酐水平达到降低尿酸水平的作用。
图6为样品对血清尿素氮水平影响图。由图6可知，与模型组相比，样品组可以显著降低血清尿素氮水平，说明样品组可以通过降低血清肌酐水平达到降低尿酸水平的作用，但是降低血清尿素氮的效果没有阳性对照组强，说明本申请的样品与阳性对照药机理存在差异。
图7为样品对血清谷丙转氨酶（ALT）活性影响图。由图7可知，与模型组相比，样品组可以显著降低血清谷丙转氨酶（ALT）活性，说明样品组可以通过降低谷丙转氨酶（ALT）活性水平达到降低尿酸水平的作用。
图8为样品对血清谷草转氨酶（AST）活性影响图。由图8可知，与模型组相比，样品组可以显著降低血清谷草转氨酶（AST）活性，说明样品组可以通过降低血清谷草转氨酶（AST）活性水平达到降低尿酸水平的作用。
图9为样品对小鼠的肠道菌群丰度影响图。采用16sRNA测序，对小鼠的肠道菌群丰度进行分析，由图9可知，结果表面，模型组与正常组表明高尿酸血症与肠道菌群丰度变化有一定相关性，低剂量样品组与模型组以及高剂量样品组与模型组之间有明显的分离，表明样品能够调节高尿酸血症小鼠肠道菌群丰度。图中，C表示正常组，M表示模型组，LS和HS分别表示低剂量样品组和高剂量样品组。
图10为样品对小鼠抗疲劳能力评估图。由图10可知，样品组可以显著增加模型组的力竭时间。也即样品不仅具有降低尿酸水平的作用，同时还具有促进小鼠抗疲劳的效果。
总之，给予样品治疗后，小鼠体重、血清尿酸（UA）、血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性(XOD)、血清肌酐(CRE)、血清尿素氮(BUN)、血清谷丙转氨酶（ALT）、血清谷草转氨酶（AST）等水平得到明显改善。16S RNA肠道菌群丰度分析结果表明，低剂量样品组与模型组以及高剂量样品组与模型组之间有明显的分离，表明样品能够调节高尿酸血症小鼠肠道菌群丰度。同时样品还具有抗疲劳的效果。将灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物开发成为具有治疗预防和/或治疗受试者高尿酸血症和/或疲劳的产品具有重要意义。
申请人声明通过上述实施实例来说明本发明的产品、用途及其使用方式，但本发明并不局限于上述详细用途或使用方式，即不意味着本发明必须依赖上述详细用途和使用方式才能实验。所属技术领域的人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加，具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物，其特征在于，所述组合物包含：
海洋鱼低聚肽 200-400份；
灵芝子实体 50-150份；
益智仁粉 50-100份；
姜黄粉 20-80份；
栀子粉20-80份；
酸樱桃粉 20-80份；
维生素C 10-30份；
酸度调节剂 100-250份；
天然香料 100-200份；
抗性糊精 20-80份；
忧遁草提取物 10-30份；
槐米粉 20-80份；
水果粉 20-80份；
植物乳杆菌20-80份；
其中植物乳杆菌含量为100-400亿CFU/g。
2.如权利要求1所述的灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物，其特征在于，所述组合物包含：
海洋鱼低聚肽 300份；
灵芝子实体 100份；
益智仁粉 80份；
姜黄粉 50份；
栀子粉50份；
酸樱桃粉 50份；
维生素C 25份；
天然香料 100份；
酸度调节剂 200份；
抗性糊精 50份；
忧遁草提取物 20份；
槐米粉 50份；
水果粉 55份；
植物乳杆菌50份；
其中植物乳杆菌含量为250亿CFU/g。
3.权利要求1-2任一项所述的灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物，其特征在于，所述天然香料为芹菜籽提取物、核桃壳提取物、香叶提取物和苏合香提取物中的一种或多种，所述水果粉为椰子粉、甜橙粉和苹果粉中的一种或多种。
4.权利要求1-2任一项所述的灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物，其特征在于，所述酸度调节剂为柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸和苹果酸中的一种或多种。
5.权利要求1-2任一项所述的灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌La10，所述植物乳杆菌La10的保藏编号为GDMCC No：63605。
6.包含权利要求1-2任一项所述的灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物的组方，所述组方为片剂、粉剂或液体制剂。
7.权利要求1-5任一项所述的灵芝益智仁海洋鱼低聚肽组合物或权利要求6所述的组方在制备预防和/或治疗受试者高尿酸血症和/或疲劳药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述受试者为哺乳动物。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗通过改善血清尿酸（UA）、血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性(XOD)、血清肌酐(CRE)、血清尿素氮(BUN)、血清谷丙转氨酶（ALT）、血清谷草转氨酶（AST）水平中的一种或多种实现。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗通过调解肠道菌群实现。
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