CN117054585A - 用于对用两亲强碱性部分改性的聚糖进行分析的带电表面反相色谱材料方法 - Google Patents

用于对用两亲强碱性部分改性的聚糖进行分析的带电表面反相色谱材料方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117054585A
CN117054585A CN202310817329.6A CN202310817329A CN117054585A CN 117054585 A CN117054585 A CN 117054585A CN 202310817329 A CN202310817329 A CN 202310817329A CN 117054585 A CN117054585 A CN 117054585A
Authority
CN
China
Prior art keywords
chromatographic
groups
glycans
acid
glycan
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310817329.6A
Other languages
English (en)
Inventor
M.A.劳伯
S.A.麦考尔
B.奥肯德吉
P.C.伊拉内塔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Waters Technologies Corp
Original Assignee
Waters Technologies Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Waters Technologies Corp filed Critical Waters Technologies Corp
Publication of CN117054585A publication Critical patent/CN117054585A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/89—Inverse chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B01D15/325—Reversed phase
    • B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/12—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by acids having the group -X-C(=X)-X-, or halides thereof, in which each X means nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium, e.g. carbonic acid, carbamic acid
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3847—Multimodal interactions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8836—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving saccharides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了使用包含色谱表面的高纯度色谱材料以及能够向待分析的样品提供两亲强碱性标记部分的标记试剂来对聚糖进行色谱分析的新型方法，其中所述色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂。

Description

用于对用两亲强碱性部分改性的聚糖进行分析的带电表面反 相色谱材料方法
本申请是申请日为2017年4月21日，申请号为201780031836.X，发明名称为“用于对用两亲强碱性部分改性的聚糖进行分析的带电表面反相色谱材料方法”的发明专利的分案申请。
背景技术
聚糖在整个生物系统中以游离状态以及作为糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖的一部分以缀合形式存在。聚糖在各种生物和生理过程中发挥作用。此外，聚糖的结构纷繁复杂。因此，对聚糖谱进行全面分析一直存在困难。
之前已经利用了常规HPLC色谱来分析聚糖谱。这些方法包括反相色谱、离子交换色谱和HILIC分离。传统上，已经通过HILIC或者通过使用石墨固定相(诸如，多孔石墨化碳)和用甲酸酸化的流动相的反相色谱分离了释放的聚糖。(West,C.；Elfakir,C.；Lafosse,M.,Porous graphitic carbon:aversatilestationaryphaseforliquidchromatography.JChromatogrA 2010,1217(19),3201-16；Ruhaak,L.R.；Zauner,G.；Huhn,C.；Bruggink,C.；Deelder,A.M.；Wuhrer,M.,Glycan labeling strategies and their use inidentification and quantification.AnalBioanal Chem 2010,397(8),3457-81)。然而，由于聚糖具有亲水性和极性，这些方法不能提供足够的灵敏度来全面分析聚糖。另外，为了增加方法灵敏度而用各种部分标记的许多聚糖被过强地保留并且不能被充分拆分。
类似地，利用与C18键合的反相固定相，分离过程往往会产生有问题的共洗脱，因为净电荷方面有差别的聚糖结构之间的选择性较差。从糖蛋白诸如人免疫球蛋白G(hIgG)释放的N-聚糖与糖蛋白本身完全不同。具体地讲，释放的N-聚糖表现出不同于肽的电荷特性，因为它们通常仅含中性或酸性亲水残基。释放的N-聚糖中的酸性残基及其羧酸或磷酸基团对聚糖物质的特性和净电荷状态具有显著影响。含更多酸性残基的聚糖将具有更负的净电荷。类似地，这些酸性物质通常与生物药物的功效相关，正如依泊亭和溶酶体疾病酶替代疗法的情况。(Lauber,M.A.；Koza,S.M.；McCall,S.A.；Alden,B.A.；Iraneta,P.C.；Fountain,K.J.,High-Resolution Peptide Mapping Separations with MS-FriendlyMobile Phases and Charge-Surface-Modified C18.Anal Chem 2013,85(14),6936-44；Bennett,C.L.；Spiegel,D.M.；Macdougall,I.C.；Norris,L.；Qureshi,Z.P.；Sartor,O.；Lai,S.Y.；Tallman,M.S.；Raisch,D.W.；Smith,S.W.；Silver,S.；Murday,A.S.；Armitage,J.O.；Goldsmith,D.,A review of safety,efficacy,and utilization oferythropoietin,darbepoetin,and peginesatide for patients with cancer orchronic kidney disease:a report from the Southern Network on AdverseReactions(SONAR).Semin Thromb Hemost 2012,38(8),783-96)。
新型柱技术(诸如，美国专利公布No.2013/0319086中描述的技术)提供了新型多元色谱介质和聚糖分析方法，这在不同生物大分子之间提供了高分辨率，并且基于大小、组成、结构(例如，异构、键合)和/或电荷提供了独特的选择性。此外，这些柱允许通过标准方法(例如，质谱、荧光检测)检测从介质中洗脱的大分子，而无需或很少需要净化或纯化事后分析和预检测(例如，荧光标记)，这将极大地简化和方便大分子分析。
然而，这种技术仍然不能提供足够的灵敏度和选择性来完全分离聚糖，特别是N-聚糖。此外，对于O-聚糖也是如此。因此，仍然需要在聚糖分析中提供优异选择性的替代方法。
对N-聚糖进行荧光标记有利于检测聚糖，因为它提高了检测的灵敏度和选择性以及聚糖的色谱行为。聚糖分析对于药物制造商很重要，因为必须监测蛋白质的糖基化分布以确保治疗产品的一致性。在用具有荧光部分的试剂进行衍生化后，可以估计聚糖的身份。然后需要用质谱法(“MS”)来鉴定特定化合物。
利用MS的分析在聚糖和氨基酸分析以及蛋白质组学方面已达到高度发展。现有技术利用反应快速并且提供良好MS/荧光信号的标记分子。然而，期望的是MS和荧光检测的组合，因为荧光检测在确定以不同数量存在的相对量时是非常有用的工具。另一方面，MS用于确定分子构成。用于现有技术的聚糖检测的选择标签在相对高的疏水性与高pKa可电离残基配对时往往是独特的，使得它们成为所谓的“两亲强碱性”部分。
因此，需要对于用两亲强碱性部分标记的聚糖产生最佳选择性和分辨率的色谱材料和相应的分离方法。
发明内容
本发明提供了使用包含色谱表面的高纯度色谱材料(HPCM)以及能够向待分析的样品提供两亲强碱性标记部分的标记试剂来对标记的聚糖进行色谱分析的新型方法，其中色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂。
在一个方面，本发明提供了一种从样品中选择性分离聚糖的方法，该方法包括以下步骤：
a)使包含聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品
b)将标记的聚糖样品上样到色谱分离装置上，该色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当可电离改性剂不含两性离子时，可电离改性剂不含季铵离子部分，使得聚糖选择性地吸附到高纯度色谱材料上；以及
c)从高纯度色谱材料中洗脱吸附的标记聚糖，从而从样品中选择性分离标记的聚糖。
在另一个方面，本发明提供了一种从样品中分离多种聚糖的方法，该方法包括以下步骤：
a)使包含多种聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品
b)将含多种聚糖的标记聚糖样品上样到色谱分离装置上，该色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当可电离改性剂不含两性离子时，可电离改性剂不含季铵离子部分，使得聚糖吸附到高纯度色谱材料上；以及
c)从高纯度色谱材料中洗脱吸附的标记聚糖，从而分离标记的聚糖。
在再一个方面，本发明提供了一种纯化样品中所含的聚糖的方法，该方法包括：
a)使包含聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品
b)将标记的聚糖样品上样到色谱分离装置上，该色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当可电离改性剂不含两性离子时，可电离改性剂不含季铵离子部分，使得聚糖吸附到高纯度色谱材料上；以及
c)从高纯度色谱材料中洗脱吸附的聚糖，从而纯化聚糖。
在又一个方面，本发明提供了一种用于检测样品中的聚糖的方法，该方法包括以下步骤：
a)使包含聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品
a)将标记的聚糖样品上样到色谱分离装置上，该色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当可电离改性剂不含两性离子时，可电离改性剂不含季铵离子部分，使得聚糖吸附到高纯度色谱材料上；以及
b)从高纯度色谱材料中洗脱吸附的聚糖；以及
c)检测聚糖。
在某些实施方案中，聚糖是N-聚糖或O-多糖。在具体实施方案中，聚糖是hIgG聚糖、胎球蛋白聚糖、FA2BG2S2、FA2G2S1或FA2G2。
在一些实施方案中，聚糖标记试剂是MS-活性的快速荧光标记化合物；普鲁卡因胺试剂或普鲁卡因试剂。在具体实施方案中，聚糖标记试剂提供Log P值介于0和5之间、介于1和5之间或介于1和3之间的两亲强碱性部分。在某些实施方案中，聚糖标记试剂提供pKa值大于6、大于7或大于8的两亲强碱性部分。
在具体实施方案中，聚糖标记试剂是具有下式的试剂：
在本发明的一些实施方案中，高纯度色谱材料还包含色谱芯材料。
在某些实施方案中，本发明的HPCM包含可电离改性剂，该可电离改性剂含有羧酸基、磺酸基、芳基磺酸基、磷酸基、硼酸基、氨基、亚氨基、酰氨基、吡啶基、咪唑基、脲基、亚硫酰-脲基、脒基、胍基或氨基硅烷基。
在其他实施方案中，色谱表面上的可电离改性剂通过使色谱表面与选自具有以下各式的可电离改性试剂反应来提供：式(I)
式(II)：
式(III)：
或其组合
其中
m为1-8的整数；
v为0或1；
当v为0时，m'为0；
当v为1时，m'为1-8的整数；
Z表示化学反应性基团，包括(但不限于)
-OH、-OR6、胺、烷基胺、二烷基胺、异氰酸酯、酰氯、三氟甲磺酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、碳酸咪唑、NHS-酯、羧酸、酯、环氧化物、炔烃、烯烃、叠氮化物、-Br、-Cl或-I；
Y为嵌入式极性官能团；
每次出现的R1独立地表示硅上的化学反应性基团，包括(但不限于)-H、-OH、-OR6、二烷基胺、三氟甲磺酸酯、Br、Cl、I、乙烯基、烯烃或-(CH2)m-Q；
每次出现的Q为-OH、-OR6、胺、烷基胺、二烷基胺、异氰酸酯、酰氯、三氟甲磺酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、碳酸咪唑、NHS-酯、羧酸、酯、环氧化物、炔烃、烯烃、叠氮化物、-Br、-Cl或-I；
m”为1-8的整数
p为1-3的整数；
每次出现的R1’独立地表示F、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基或C1-C18杂芳基、氟代烷基或氟代芳基；
每次出现的R2、R2’、R3和R3’独立地表示氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C2-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基或C4-C18杂芳基、-Z或具有式-Si(R')bR”a或-C(R')bR”a的基团；
a和b各自表示0至3的整数，前提条件是a+b＝3；
R'表示C1-C6直链、环状或支链烷基；
R”为选自以下各项的官能化基团：烷基、烯基、炔基、芳基、氰基、氨基、二醇、硝基、酯、阳离子或阴离子交换基团、含有嵌入式极性官能团和手性部分的烷基或芳基。
R4表示氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基或C1-C18杂芳基；
R5表示氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基或C1-C18杂芳基；
每次出现的R6独立地表示C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基或C1-C18杂芳基；
Het表示包含至少一个氮原子的杂环或杂芳基环系；并且
A表示酸性可电离改性剂部分或双电荷可电离改性剂部分。
在其他实施方案中，可电离改性试剂是氨丙基三乙氧基硅烷、氨丙基三甲氧基硅烷、2-(2-(三氯甲硅烷基)乙基)吡啶、2-(2-(三甲氧基)乙基)吡啶、2-(2-(三乙氧基)乙基)吡啶、2-(4-吡啶基乙基)三乙氧基硅烷、2-(4-
吡啶基乙基)三甲氧基硅烷、2-(4-吡啶基乙基)三氯硅烷、氯丙基三甲氧基硅烷、氯丙基三氯硅烷、氯丙基三氯硅烷、氯丙基三乙氧基硅烷、咪唑基丙基三甲氧基硅烷、咪唑基丙基三乙氧基硅烷、咪唑基丙基三氯硅烷、磺丙基三硅烷醇、羧乙基硅烷三醇、2-(甲酯基)乙基甲基二氯硅烷、2-(甲酯基)乙基三氯硅烷、2-(甲酯基)乙基三甲氧基硅烷、n-(三甲氧基甲硅烷基丙基)乙二胺三乙酸、(2-二乙基磷酸乙基)三乙氧基硅烷、3-巯基丙基三乙氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷、双[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]二硫化物、双[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]四硫化物、2,2-二甲氧基-1-硫杂-2-硅杂环戊烷、双(三氯甲硅烷基乙基)苯磺酰氯、2-(氯磺酰基苯基)乙基三氯硅烷、2-(氯磺酰基苯基)乙基三甲氧基硅烷、2-(乙氧基磺酰基苯基)乙基三甲氧基硅烷、2-(乙氧基磺酰基苯基)乙基三甲氧基硅烷、2-(乙氧基磺酰基苯基)乙基三氯硅烷、磺酸苯乙基三硅烷醇、(三乙氧基甲硅烷基乙基)苯基膦酸二乙酯、(三甲氧基甲硅烷基乙基)苯基膦酸二乙酯、(三氯甲硅烷基乙基)苯基膦酸二乙酯、膦酸苯乙基三硅烷醇、N-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)吡咯、N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4,5-二氢咪唑、双(甲基二甲氧基甲硅烷基丙基)-N-甲胺、三(三乙氧基甲硅烷基丙基)胺、双(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)-N-甲胺、(N,N-二乙基-3-氨丙基)三甲氧基硅烷、N-(羟乙基)-N-甲基氨丙基三甲氧基硅烷、3-(N,N-二甲基氨丙基)三甲氧基硅烷、双(2-羟乙基)-3-氨丙基三乙氧基硅烷、N,N'-双(羟乙基)-N,N'-双(三甲氧基甲硅烷基丙基)乙二胺或N,N-二甲基-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷。
在一些实施方案中，HPCM的疏水表面基团是C4至C30键合相、芳族、苯基烷基、氟-芳族、苯基己基、五氟苯基烷基或手性键合相。
在其他实施方案中，HPCM的色谱芯是二氧化硅材料或杂化无机/有机材料。
在其他实施方案中，HPCM的色谱芯是表面多孔材料。
在某些实施方案中，高纯度色谱材料是用二乙基氨基乙基、二甲基氨基乙基、二甲基氨丙基、二甲基氨基乙基或二乙基氨丙基(DEAP)改性剂制备的固定相。
在其他实施方案中，洗脱步骤利用包含具有pH1至pH8、pH2至pH7或pH3至pH6的缓冲溶液的流动相。
在其他实施方案中，色谱分离装置是选自以下各项的装置：色谱柱、薄层板、过滤膜、微流体分离装置、样品净化装置、固体支持物、固相提取装置、微芯片分离装置和微量滴定板。
在其他实施方案中，本发明的方法还包括用二级色谱装置处理步骤c中洗脱的标记聚糖以进一步离析、纯化或分离聚糖的步骤。在具体这类实施方案中，二级色谱装置是包含以下材料的第二色谱分离装置：除包含色谱表面的高纯度色谱材料之外的色谱材料，其中色谱表面包含疏水表面基团和一个或多个可电离改性剂；或色谱分离装置中除包含色谱表面的高纯度色谱材料之外的第二色谱材料，其中色谱表面包含疏水表面基团和一个或多个可电离改性剂。在其他具体实施方案中，二级色谱分离装置是选自以下各项的装置：色谱柱、薄层板、过滤膜、微流体分离装置、样品净化装置、固体支持物、固相提取装置、微芯片分离装置和微量滴定板。
本发明的方法、标记试剂和方法以及包括杂化材料、二氧化硅、颗粒、整料和表面多孔材料在内的本发明HPCM的合成和使用的其他实施方案在下文更详细地描述。
附图说明
图1描绘了用两亲强碱性部分改性的聚糖(具体为RFMS标记的七糖聚糖)的示例性化学结构。
图2描绘了使用Thermo Hypercarb3μm 2.1×150mm柱得到的荧光色谱图，并且示出了使用石墨固定相时本发明的标记N-聚糖被过强地保留并且不能被充分拆分。分离条件可在实施例2中找到。
图3描绘了由使用常规C18反相材料得到的本发明的标记N-聚糖(FA2G2、FA2G2S1和FA2G2S2)的提取离子色谱图，并且示出了与所需选择性相比常规分离提供的选择性不足。分离条件在实施例2中描述。
图4描绘了使用Waters ACQUITY UPLC CSH C181.7μm2.1×150mm柱得到的荧光色谱图，其示出了使用带电表面反相材料时本发明的标记N-聚糖被保留并且以高峰容量独特地分离。(A)描绘了完整视图，而(B)描绘了观察到的色谱峰及其基于MS对中性、单唾液酸化和二唾液酸化聚糖结构的归属的放大视图。分离条件在实施例3中描述。
图5描绘了根据本发明标记的hIgG聚糖的荧光色谱图，其示出了通过使用各种水性流动相添加剂来调节灵敏度、保留性和选择性。(A)用Waters ACQUITY UPLC CSH C181.7μm 2.1×150mm柱和铵/甲酸类缓冲液分离的标记hIgG聚糖的荧光色谱图。(B)用Waters ACQUITY UPLC CSH C18/>1.7μm 2.1×150mm和甲酸铵/乙酸类缓冲液分离的标记hIgG聚糖的荧光色谱图。分离条件在实施例4中描述。
图6描绘了根据本发明标记的hIgG聚糖的荧光色谱图，其示出了恒定的离子强度分离有利于用HPCM拆分高度唾液酸化的聚糖。(A)用Waters ACQUITY UPLC CSH C181.7μm 2.1×150mm柱和含有不同组成的甲酸铵/乙酸类缓冲液的洗脱液流动相分离的标记胎球蛋白聚糖的荧光色谱图。“MeCN”代表乙腈。分离条件在实施例5中描述。
图7描绘了根据本发明标记的hIgG聚糖的荧光色谱图，其示出了使用HPCM柱色谱法的优化分离。用Waters ACQUITY UPLC CSH C181.7μm 2.1×150mm柱获得的(A)标记hIgG聚糖和(B)标记胎球蛋白聚糖的荧光色谱图。提供了基于MS的鉴别。分离条件在实施例6中描述。
图8描绘了根据本发明标记的hIgG聚糖的荧光色谱图，其示出了带有强碱性与弱碱性可电离改性剂的带电表面反相材料需要不同的流动相优化。用DEAP HPCM1.7μm2.1×150mm柱获得的标记hIgG聚糖的荧光色谱图。流动相A和B针对每次分离定义。“MeCN”表示乙腈。分离条件在实施例7中描述。
图9描绘了利用梯度条件时根据本发明标记的hIgG聚糖的荧光色谱图。用DEAPHPCM1.7μm 2.1×150mm柱获得的标记hIgG聚糖的荧光色谱图。梯度条件针对每次分离定义。分离条件在实施例8中描述。
图10描绘了利用二乙基氨丙基(DEAP)改性的HPCM色谱柱时根据本发明标记的hIgG聚糖的荧光色谱图。用DEAP HPCM1.7μm 2.1×150mm柱获得的(A)标记hIgG聚糖和(B)标记胎球蛋白聚糖的荧光色谱图。提供了基于MS的鉴别。星号标记非聚糖峰。分离条件在实施例9中描述。
图11描绘了利用二乙基氨丙基(DEAP)改性的HPCM色谱柱时根据本发明标记的hIgG聚糖的荧光色谱图，其示出了通过将初始条件调节为0至10mM甲酸铵/甲酸缓冲液的离子强度来改善标记聚糖的分离。用DEAP HPCM1.7μm 2.1×150mm柱和初始条件的不同离子强度(0、5和10mM甲酸铵/甲酸缓冲液)获得的标记hIgG聚糖的荧光色谱图。提供了梯度条件。“MeCN”表示乙腈。分离条件在实施例10中描述。
图12描绘了利用二乙基氨丙基(DEAP)改性的HPCM色谱柱时根据本发明标记的聚糖的荧光和基峰强度(BPI)色谱图，其示出了表明支持高灵敏度ESI+MS检测的改进分离。(A)用DEAP HPCM1.7μm 2.1×150mm柱和最佳方法条件获得的标记牛胎球蛋白聚糖的荧光和基峰强度(BPI)色谱图。(B)对应于在标记的保留时间处洗脱的标记聚糖的高信噪比、低背景ESI+质谱。分离条件在实施例9中描述。
图13描绘了利用二乙基氨丙基(DEAP)改性的HPCM色谱柱时根据本发明标记的聚糖的荧光色谱图，其示出了用各种两亲强碱性部分标记的释放胎球蛋白聚糖的改进分离。用DEAP HPCM1.7μm(相1A)2.1×150mm柱获得的(A)RFMS标记的、(B)普鲁卡因标记的和(C)普鲁卡因胺标记的胎球蛋白N-聚糖的荧光色谱图。分离条件在实施例11中描述。
图14描绘了与可商购获得的m混合模式柱相比，利用二乙基氨丙基(DEAP)改性的HPCM色谱柱时根据本发明标记的hIgG聚糖的荧光色谱图。分离条件在实施例12中描述。
图15描绘了与可商购获得的m混合模式柱相比，利用二乙基氨丙基(DEAP)改性的HPCM色谱柱时根据本发明标记的胎球蛋白N-聚糖的荧光色谱图。分离条件在实施例12中描述。
图16描绘了(A)带电表面反相材料(DEAP HPCM，相1A/1B)与(B)美国专利申请公布号US20140178912的相21的表示。示意性地估计了可电离配体与中性配体的比率。
具体实施方式
本发明提供了例如用于色谱分离的新型色谱材料、其制备过程；含有所述色谱材料的分离装置；及其使用方法。通过参考下文给出的定义将更全面地阐明本发明。
定义
“高纯度”或“高纯度色谱材料”包括由高纯度前体制备的材料。在某些方面，高纯度材料具有降低的金属污染和/或未减弱的色谱性质，包括但不限于表面硅烷醇的酸度和表面的异质性。
“色谱表面”包括提供样品色谱分离的表面。在某些方面，色谱表面是多孔的。在一些方面，色谱表面可以是颗粒、表面多孔材料或整料的表面。在某些方面，色谱表面由在色谱分离过程中组合使用的一种或多种颗粒、表面多孔材料或整料的表面构成。在某些其他方面，色谱表面是无孔的。
“可电离改性剂”包括带有给电子或吸电子基团的官能团。在某些方面，可电离改性剂含有一个或多个羧酸基、氨基、亚氨基、酰氨基、吡啶基、咪唑基、脲基、亚硫酰-脲基、脒基、胍基或氨基硅烷基，或其组合。在其他方面，可电离改性剂包含具有带自由电子孤对的氮或磷原子的基团。在某些方面，可电离改性剂共价连接到材料表面并具有可电离基团。在一些情况下，可电离改性剂通过表面杂化基团的化学修饰连接到色谱材料。
“疏水表面基团”包括色谱表面上表现出疏水性的表面基团。在某些方面，疏水基团可以是碳键合相，诸如C4至C18键合相。在其他方面，疏水表面基团可含有嵌入式极性基团，使得疏水表面的外部部分保持疏水性。在一些情况下，疏水表面基团通过表面杂化基团的化学修饰连接到色谱材料。在其他情况下，疏水基团可以是C4-C30嵌入式极性、手性苯基烷基或五氟苯基键合和涂层。
“色谱芯”包括色谱材料，包括但不限于颗粒、整料或另一合适结构形式的有机材料，诸如二氧化硅或如本文所定义的杂化材料，其形成本发明材料的内部部分。在某些方面，色谱芯的表面表示如本文所定义的色谱表面，或表示由如本文所定义的色谱表面包裹的材料。色谱表面材料可以以可辨别离散或明显转变的方式设置在色谱芯上或者结合或退火到色谱芯，或者可以以与色谱芯的表面共混产生材料梯度并且没有离散的内部芯表面的方式结合到色谱芯。在某些实施方案中，色谱表面材料可与色谱芯的材料相同或不同，并且可表现出与色谱芯不同的物理或物理化学性质，包括但不限于孔体积、表面积、平均孔径、碳含量或水解pH稳定性。
“杂化”(包括“杂化无机/有机材料”)包括无机类结构，其中有机官能团与内部或“骨架”无机结构以及混合材料表面均形成一体。杂化材料的无机部分可以是例如氧化铝、二氧化硅、钛、铈或锆或其氧化物，或陶瓷材料。“杂化”包括无机类结构，其中有机官能团与内部或“骨架”无机结构以及杂化材料表面均形成一体。如上所述，示例性杂化材料在美国专利号4,017,528、6,528,167、6,686,035和7,175,913中示出。
术语“脂环基团”包括三个或更多个碳原子的闭环结构。脂环基团包括为饱和环烃的环烷烃或环烷、具有两个或更多个双键的不饱和环烯烃以及具有三键的环乙炔。它们不包括芳族基团。环烷烃的示例包括环丙烷、环己烷和环戊烷。环烯烃的示例包括环戊二烯和环辛四烯。脂环基团还包括稠环结构和取代的脂环基团，诸如烷基取代的脂环基团。就脂环而言，这类取代基还可包括低级烷基、低级烯基、低级烷氧基、低级烷硫基、低级烷基氨基、低级烷基羧基、硝基、羟基、-CF3、-CN等。
术语“脂族基团”包括以通常具有1至22个碳原子的直链或支链为特征的有机化合物。脂族基团包括烷基基团、烯基基团和炔基基团。在复杂结构中，链可以是支链或交联的。烷基基团包括具有一个或多个碳原子的饱和烃，包括直链烷基基团和支链烷基基团。这种烃部分可在一个或多个碳上被例如卤素、羟基、硫醇、氨基、烷氧基、烷羧基、烷硫基或硝基基团取代。除非另外指定碳数量，否则本文所用的“低级脂族”是指如上所定义的但具有1至6个碳原子的脂族基团(例如，低级烷基、低级烯基、低级炔基)。这类低级脂族基团(例如，低级烷基基团)的代表是甲基、乙基、正丙基、异丙基、2-氯丙基、正丁基、仲丁基、2-氨基丁基、异丁基、叔丁基、3-硫代戊基等。如本文所用，术语“硝基”是指-NO2；术语“卤素”表示-F、-Cl、-Br或-I；术语“硫醇”是指SH；并且术语“羟基”是指-OH。因此，如本文所用的术语“烷基氨基”是指其上连接有氨基的如上所定义的烷基基团。合适的烷基氨基基团包括具有1至约12个碳原子、优选1至约6个碳原子的基团。术语“烷硫基”是指其上连接有巯基的如上所定义的烷基基团。合适的烷硫基基团包括具有1至约12个碳原子、优选1至约6个碳原子的基团。如本文所用的术语“烷基羧基”是指其上连接有羧基的如上所定义的烷基基团。如本文所用的术语“烷氧基”是指其上连接有氧原子的如上所定义的烷基基团。代表性烷氧基基团包括具有1至约12个碳原子、优选1至约6个碳原子的基团，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。术语“烯基”和“炔基”是指与烷基类似的但分别含有至少一个双键或三键的不饱和脂族基团。合适的烯基和炔基基团包括具有2至约12个碳原子、优选1至约6个碳原子的基团。
术语“烷基”包括饱和脂族基团，包括直链烷基基团、支链烷基基团、环烷基(脂环)基团、烷基取代的环烷基基团和环烷基取代的烷基基团。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有30个或更少的碳原子，例如对于直链为C1-C30或对于支链为C3-C30。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有20个或更少的碳原子，例如对于直链为C1-C20或对于支链为C3-C20，并且更优选地为18个或更少。同样，优选的环烷基在其环结构中具有4-10个碳原子，并且更优选地在环结构中具有4-7个碳原子。术语“低级烷基”是指链中具有1至6个碳的烷基基团以及环结构中具有3至6个碳的环烷基。
此外，如整个说明书和权利要求中所用的术语“烷基”(包括“低级烷基”)包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，后者是指在烃主链的一个或多个碳原子上具有置换氢的取代基的烷基部分。这类取代基可包括例如卤素、羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷硫基羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸酯、膦基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、芳烷基或者芳族或杂芳族部分。本领域技术人员将理解，如果合适，在烃链上被取代的部分本身可被取代。环烷基可进一步被例如上述取代基取代。“芳烷基”部分是被例如具有1至3个独立或稠合的环以及6至约18个碳环原子的芳基取代的烷基，例如苯甲基(苄基)。
如本文所用的术语“氨基”是指式-NRaRb的未取代或取代的部分，其中Ra和Rb各自独立地为氢、烷基、芳基或杂环基，或Ra和Rb与它们所连接的氮原子一起形成环中具有3至8个原子的环状部分。因此，除非另外说明，否则术语“氨基”包括环状氨基部分，诸如哌啶基或吡咯烷基基团。“氨基取代的氨基”是指其中Ra和Rb中的至少一者进一步被氨基基团取代的氨基基团。
术语“芳族基团”包括含有一个或多个环的不饱和环状烃。芳族基团包括可包含0至4个杂原子的5元和6元单环基团，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、恶唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。芳环可在一个或多个环位置处被例如卤素、低级烷基、低级烯基、低级烷氧基、低级烷硫基、低级烷基氨基、低级烷基羧基、硝基、羟基、-CF3、-CN等取代。
术语“芳基”包括可包含0至4个杂原子的5元和6元单环芳族基团，例如未取代或取代的苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、恶唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。芳基基团还包括多环稠合芳族基团，诸如萘基、喹啉基、吲哚基等。芳环可在一个或多个环位置处被例如上文针对烷基基团所述的那些取代基取代。合适的芳基基团包括未取代和取代的苯基基团。如本文所用的术语“芳氧基”是指其上连接有氧原子的如上所定义的芳基基团。如本文所用的术语“芳烷氧基”是指其上连接有氧原子的如上所定义的芳烷基基团。合适的芳烷氧基具有1至3个独立或稠合的环以及6至约18个碳环原子，例如O-苄基。
术语“陶瓷前体”旨在包括最终形成陶瓷材料的任何化合物。
术语“手性部分”旨在包括允许手性或立体选择性合成的任何官能团。手性部分包括但不限于具有至少一个手性中心的取代基团、天然和非天然氨基酸、肽和蛋白质、衍生化纤维素、大环抗生素、环糊精、冠醚和金属络合物。
术语“嵌入式极性官能团”是提供整体极性部分的官能团，使得由于屏蔽二氧化硅表面上未反应的硅烷醇基团而与碱性样品的相互作用降低。嵌入式极性官能团包括但不限于碳酸酯、酰胺、脲、醚、硫醚、亚磺酰基、亚砜、磺酰基、硫脲、硫代碳酸酯、硫代氨基甲酸酯、乙二醇、杂环、三唑官能团或诸如美国专利号5,374,755中公开的氨基甲酸酯官能团以及手性部分。
用语“色谱增强孔几何形状”包括本发明公开材料的孔构型的几何形状，已发现所述几何形状例如与本领域的其他色谱介质不同，可以增强材料的色谱分离能力。例如，可以形成、选择或构造几何形状，并且可以使用各种性质和/或因素来确定例如与本领域已知或常规使用的几何形状相比，材料的色谱分离能力是否已经“增强”。这些因素的示例包括高分离效率、更长的柱寿命和高传质性质(如通过例如减少的谱带扩展和良好的峰形状所证明)。可以使用本领域公认的技术来测量或观察这些性质。例如，本发明的多孔无机/有机杂化材料的色谱增强孔几何形状与现有技术材料的区别在于不存在“墨瓶”或“壳形”孔几何形状或形态，这两者都是不希望的，因为它们会例如降低传质速率，从而导致效率降低。
在仅含有少量微孔的杂化材料中发现了色谱增强孔几何形状。当直径为约的所有孔对材料的比表面积贡献小于约110m2/g时，在杂化材料中实现少量微孔。具有如此低微孔表面积(MSA)的杂化材料产生色谱增强，包括较高的分离效率和良好的传质性质(如通过例如减少的谱带扩展和良好的峰形状所证明)。微孔表面积(MSA)被定义为直径小于或等于/>的孔中的表面积，通过使用BJH方法从等温线的吸附段(adsorption leg)的多点氮吸附分析确定。如本文所用，首字母缩略词“MSA”和“MPA”可互换使用以表示“微孔表面积”。
术语“官能化基团”包括为色谱固定相赋予一定色谱功能的有机官能团。
术语“杂环基团”包括其中环中的一个或多个原子是除碳之外的元素例如氮、硫或氧的闭环结构。杂环基团可以是饱和的或不饱和的，并且杂环基团诸如吡咯和呋喃可以具有芳香性。它们包括稠环结构，诸如喹啉和异喹啉。杂环基团的其他示例包括吡啶和嘌呤。杂环基团也可在一个或多个组成原子处被例如卤素、低级烷基、低级烯基、低级烷氧基、低级烷硫基、低级烷基氨基、低级烷基羧基、硝基、羟基、-CF3、-CN等取代。合适的杂芳族和杂脂环基团通常将具有1至3个独立或稠合的环(每个环具有3至约8个成员)以及一个或多个N、O或S原子，例如香豆素基、喹啉基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、恶唑基、咪唑基、吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基和吡咯烷基。
术语“金属氧化物前体”旨在包括含有金属并最终形成金属氧化物(例如，氧化铝、二氧化硅、氧化钛、氧化锆)的任何化合物。
术语“整料”旨在包括填充到床层中的单个颗粒的集合，其中保持单个颗粒的形状和形态。有利的是使用将颗粒结合在一起的材料来填充颗粒。可以使用本领域公知的任何数量的结合材料，例如二乙烯基苯、甲基丙烯酸酯、氨基甲酸酯、烯烃、炔烃、胺、酰胺、异氰酸酯或环氧基团的线性或交联聚合物，以及有机烷氧基硅烷、四烷氧基硅烷、聚有机烷氧基硅氧烷、聚乙氧基硅氧烷和陶瓷前体的缩合反应物。在某些实施方案中，术语“整料”还包括通过其他方法制备的杂化整料，诸如美国专利号7,250,214中详述的杂化整料；由含有0-99摩尔％二氧化硅(例如，SiO2)的一种或多种单体的缩合制备的杂化整料；由聚结的多孔无机/有机颗粒制备的杂化整料；具有色谱增强孔几何形状的杂化整料；不具有色谱增强孔几何形状的杂化整料；具有有序孔结构的杂化整料；具有非周期孔结构的杂化整料；具有非结晶或无定形分子排序的杂化整料；具有结晶域或区域的杂化整料；具有各种不同大孔和中孔特性的杂化整料；以及各种不同纵横比的杂化整料。在某些实施方案中，术语“整料”还包括无机整料，诸如在G.Guiochon/J.Chromatogr.A 1168(2007)101-168中所描述的那些。
术语“纳米颗粒”是粉末/纳米粉末的微观颗粒/粒子或微观成员，其至少一个尺寸小于约100nm，例如直径或颗粒厚度小于约100nm(0.1mm)，其可以是结晶的还是非结晶的。纳米颗粒具有与常规块状材料不同且通常优于常规块状材料的性质，包括例如更高的强度、硬度、延展性、可烧结性和更高的反应性等。大量的科学研究仍在致力于确定纳米材料的性质，其中少量纳米材料已经通过多种工艺合成(主要合成为纳米级粉末)，所述工艺包括胶体沉淀、机械研磨以及气相核化和生长。大量综述记载了纳米相材料的最新发展，这些综述以引用方式并入本文：Gleiter,H.(1989)“Nano-crystalline materials，”Prog.Mater.Sci.33:223-315和Siegel,R.W.(1993)“Synthesis and properties ofnano-phase materials，”Mater.Sci.Eng.A168:189-197。在某些实施方案中，纳米颗粒包括以下各项的氧化物或氮化物：碳化硅、铝、金刚石、铈、炭黑、碳纳米管、锆、钡、铈、钴、铜、铕、钆、铁、镍、钐、硅、银、钛、锌、硼及其混合物。在某些实施方案中，本发明的纳米颗粒选自金刚石、氧化锆(无定形、单斜、四方和立方形式)、氧化钛(无定形、锐钛矿、板钛矿和金红石形式)、铝(无定形、α和γ形式)和氮化硼(立方形式)。在具体实施方案中，本发明的纳米颗粒选自纳米金刚石、碳化硅、二氧化钛(锐钛矿形式)、立方氮化硼及其任何组合。此外，在具体实施方案中，纳米颗粒可以是结晶的或无定形的。在具体实施方案中，纳米颗粒的直径小于或等于100mm，例如直径小于或等于50mm，例如直径小于或等于20mm。
此外，应当理解，表征为分散在本发明的复合材料内的纳米颗粒旨在描述外源添加的纳米颗粒。这不同于能够原位形成的纳米颗粒或与推定纳米颗粒具有显著相似性的形成物，其中例如大分子结构诸如颗粒可包含内源产生的这些物质的聚集体。
术语“基本上无序”是指基于X射线粉末衍射分析得出缺少孔排序。具体地讲，“基本上无序”由在X射线衍射图中对应于至少1nm的d值(或d-间距)的衍射角处缺少峰来定义。
“表面改性剂”(通常)包括为色谱固定相赋予一定色谱功能的有机官能团。多孔无机/有机杂化材料具有可另外被表面改性剂取代或衍生化的有机基团和硅烷醇基团。
用语“表面改性的”在本文中用于描述具有可另外被表面改性剂取代或衍生化的有机基团和硅烷醇基团的本发明复合材料。“表面改性剂”(通常)包括为色谱固定相赋予一定色谱功能的有机官能团。诸如本文所公开的表面改性剂例如通过衍生化或涂覆以及随后的交联而连接到基础材料上，从而为基础材料赋予表面改性剂的化学特性。在一个实施方案中，杂化材料的有机基团与表面改性剂反应形成有机共价键。改性剂可通过有机和聚合物化学中众所周知的许多机制形成与材料有机基团的有机共价键，所述机制包括但不限于亲核、亲电子、环加成、自由基、碳烯、氮烯和碳正离子反应。有机共价键被定义为涉及在有机化学的常见元素之间形成共价键，所述常见元素包括但不限于氢、硼、碳、氮、氧、硅、磷、硫和卤素。另外，碳-硅和碳-氧-硅键被定义为有机共价键，而硅-氧-硅键不被定义为有机共价键。各种合成转化在文献中是众所周知的，参见例如March,J.Advanced OrganicChemistry,3rd Edition,Wiley,New York,1985。
术语“母体样品”包括包含一种或多种聚糖的任何样品，包括但不限于来源于选自以下各项的生物流体的样品：血液、尿液、脊髓液、滑液、痰液、精液、唾液、泪液、胃液及其提取物和/或稀释液/溶液，在获得样品之前使所述生物流体经过色谱或其他分离装置，以便通过本发明的材料和方法进行离析、分离、纯化或检测。
术语“色谱分离装置”包括能够执行色谱分离的任何装置，包括但不限于色谱柱、薄层板、过滤膜、微流体分离装置、样品净化装置、固体支持物、固相提取装置、微芯片分离装置和微量滴定板。
术语“二级色谱分离装置”包括色谱分离装置和色谱分离装置所包含的色谱材料。在某些实施方案中，二级色谱分离装置是除本发明的方法中使用的色谱分离装置外单独或另外的色谱分离装置。在其他实施方案中，二级色谱分离装置是由本发明的方法中使用的相同色谱分离装置容纳的单独或另外的色谱材料。
色谱表面/固定相材料
本发明提供了一种包含色谱表面的高纯度色谱材料(HPCM)，其中色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当可电离改性剂不含两性离子时，可电离改性剂不含有季铵离子部分。
在某些方面，HPCM还可包含色谱芯材料。在一些方面，色谱芯是二氧化硅材料；杂化无机/有机材料；表面多孔材料；或表面多孔颗粒。色谱芯材料可呈离散颗粒的形式或可以是整料。色谱芯材料可以是任何多孔材料，并且可商购获得或可通过已知方法生产，诸如在例如美国专利号4,017,528、6,528,167、6,686,035和7,175,913中描述的那些方法。在一些实施方案中，色谱芯材料可以是无孔芯。
本领域普通技术人员可改变色谱表面材料和色谱芯材料(如果存在)的组成，以提供增强的色谱选择性、增强的柱化学稳定性、增强的柱效和/或增强的机械强度。类似地，周围材料的组成提供亲水/亲油平衡(HLB)、表面电荷(例如，等电点或硅烷醇pKa)和/或用于增强色谱分离的表面功能的变化。此外，在一些实施方案中，色谱材料的组成还可提供可用于进一步表面改性的表面功能。
可以使用已知方法来制备本发明的HPCM的可电离改性剂和疏水表面基团。一些可电离改性剂试剂可商购获得。例如，具有氨基烷基三烷氧基硅烷、甲基氨基烷基三烷氧基硅烷和吡啶基烷基三烷氧基硅烷的硅烷可商购获得。其他硅烷诸如氯丙基烷基三氯硅烷和氯丙基烷基三烷氧基硅烷也可商购获得。这些可以与咪唑键合并反应以产生咪唑基烷基甲硅烷基表面物质，或与吡啶键合并反应以产生吡啶基烷基甲硅烷基表面物质。其他酸性改性剂也可商购获得，包括但不限于磺丙基三硅烷醇、羧乙基硅烷三醇、2-(甲酯基)乙基甲基二氯硅烷、2-(甲酯基)乙基三氯硅烷、2-(甲酯基)乙基三甲氧基硅烷、n-(三甲氧基甲硅烷基丙基)乙二胺、三乙酸、(2-二乙基磷酸乙基)三乙氧基硅烷、2-(氯磺酰基苯基)乙基三氯硅烷和2-(氯磺酰基苯基)乙基三甲氧基硅烷。
本领域技术人员已知使用常规合成方案(包括格氏反应和氢化硅烷化)来合成这些类型的硅烷。可通过色谱、重结晶或蒸馏来纯化产物。
其他添加剂诸如异氰酸酯也可商购获得或可由本领域技术人员合成。常见的异氰酸酯形成方案是伯胺与光气或称为三光气的试剂进行反应。
在一些实施方案中，可电离改性剂含有羧酸基、磺酸基、磷酸基、硼酸基、氨基、亚氨基、酰氨基、吡啶基、咪唑基、脲基、亚硫酰-脲基、脒基、胍基或氨基硅烷基。
在其他方面，可电离改性剂试剂可选自以下基团：式(I)
式(II)：
式(III)：
其中
m为1-8的整数；
v为0或1；
当v为0时，m'为0；
当v为1时，m'为1-8的整数；
Z表示化学反应性基团，包括(但不限于)
-OH、-OR6、胺、烷基胺、二烷基胺、异氰酸酯、酰氯、三氟甲磺酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、碳酸咪唑、NHS-酯、羧酸、酯、环氧化物、炔烃、烯烃、叠氮化物、-Br、-Cl或-I；
Y为嵌入式极性官能团；
每次出现的R1独立地表示硅上的化学反应性基团，包括(但不限于)-H、-OH、-OR6、二烷基胺、三氟甲磺酸酯、Br、Cl、I、乙烯基、烯烃或-(CH2)m-Q；
每次出现的Q为-OH、-OR6、胺、烷基胺、二烷基胺、异氰酸酯、酰氯、三氟甲磺酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、碳酸咪唑、NHS-酯、羧酸、酯、环氧化物、炔烃、烯烃、叠氮化物、-Br、-Cl或-I；
m”为1-8的整数
p为1-3的整数；
每次出现的R1’独立地表示F、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基或C1-C18杂芳基、氟代烷基或氟代芳基；
每次出现的R2、R2’、R3和R3’独立地表示氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C2-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基或C4-C18杂芳基、-Z或具有式-Si(R’)bR”a或-C(R’)bR”a的基团；
a和b各自表示0至3的整数，前提条件是a+b＝3；
R'表示C1-C6直链、环状或支链烷基；
R”为选自以下各项的官能化基团：烷基、烯基、炔基、芳基、氰基、氨基、二醇、硝基、酯、阳离子或阴离子交换基团、含有嵌入式极性官能团和手性部分的烷基或芳基。
R4表示氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基或C1-C18杂芳基；
R5表示氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基或C1-C18杂芳基；
每次出现的R6独立地表示C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基或C1-C18杂芳基；
Het表示包含至少一个氮原子的杂环或杂芳基环系；并且
A表示酸性可电离改性剂部分或双电荷可电离改性剂部分。
在其他实施方案中，可电离改性剂是氨丙基三乙氧基硅烷、氨丙基三甲氧基硅烷、2-(2-(三氯甲硅烷基)乙基)吡啶、2-(2-(三甲氧基)乙基)吡啶、2-(2-(三乙氧基)乙基)吡啶、2-(4-吡啶基乙基)三乙氧基硅烷、2-(4-吡啶基乙基)三甲氧基硅烷、2-(4-吡啶基乙基)三氯硅烷、氯丙基三甲氧基硅烷、氯丙基三氯硅烷、氯丙基三氯硅烷、氯丙基三乙氧基硅烷、咪唑基丙基三甲氧基硅烷、咪唑基丙基三乙氧基硅烷、咪唑基丙基三氯硅烷、磺丙基三硅醇、羧基乙基硅烷三醇、2-(甲酯基)乙基甲基二氯硅烷、2-(甲酯基)乙基三氯硅烷、2-(甲酯基)乙基三甲氧基硅烷、n-(三甲氧基甲硅烷基丙基)乙二胺三乙酸、(2-二乙基磷酸酯基乙基)三乙氧基硅烷、3-巯基丙基三乙氧基硅烷、3-巯基丙基三甲氧基硅烷、双[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]二硫化物、双[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]四硫化物、2,2-二甲氧基-l-硫杂-2-硅杂环戊烷、双(三氯甲硅烷基乙基)苯基磺酰氯、2-(氯磺酰苯基)乙基三氯硅烷、2-(氯磺酰苯基)乙基三甲氧基硅烷、2-(乙氧基磺酰苯基)乙基三甲氧基硅烷、2-(乙氧基磺酰苯基)乙基三甲氧基硅烷、2-(乙氧基磺酰苯基)乙基三氯硅烷、磺酸苯乙基三硅醇、(三乙氧基甲硅烷基乙基)苯基膦酸二乙酯、(三甲氧基甲硅烷基乙基)苯基膦酸二乙酯、(三氯甲硅烷基乙基)苯基膦酸二乙酯、膦酸苯乙基三硅醇、N-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)吡咯、N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4,5-二氢咪唑、双(甲基二甲氧基甲硅烷基丙基)-N-甲胺、三(三乙氧基甲硅烷基丙基)胺、双(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)-N-甲胺、(N,N-二乙基-3-氨丙基)三甲氧基硅烷、N-(羟乙基)-N-甲基氨丙基三甲氧基硅烷、3-(N,N-二甲基氨丙基)三甲氧基硅烷、双(2-羟乙基)-3-氨丙基三乙氧基硅烷、N,N'-双(羟乙基)-N,N'-双(三甲氧基甲硅烷基丙基)乙二胺或N,N-二甲基-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷。
在某些实施方案中，当可电离改性剂具有式(III)时，酸性可电离改性剂是三硅烷醇、三烷氧基硅烷或三氯硅烷的保护或去保护形式；或者磺酸烷基硅烷、磺酸苯基烷基硅烷、磺酸苄基烷基硅烷、磺酸苯基硅烷、磺酸苄基硅烷、羧酸烷基硅烷、羧酸苯基烷基硅烷、羧酸苄基烷基硅烷、羧酸苯基硅烷、羧酸苄基硅烷、磷酸烷基硅烷、膦酸苯基烷基硅烷、膦酸苄基烷基硅烷、膦酸苯基硅烷、膦酸苄基硅烷、硼酸烷基硅烷、硼酸苯基烷基硅烷、硼酸苄基烷基硅烷、硼酸苯基硅烷、硼酸苄基硅烷的盐。
在某些实施方案中，当可电离改性剂具有式(III)时，酸性可电离改性剂是磺酸烷基异氰酸酯、磺酸苯基烷基异氰酸酯、磺酸苄基烷基异氰酸酯、磺酸苯基异氰酸酯、磺酸苄基异氰酸酯、羧酸烷基异氰酸酯、羧酸苯基烷基异氰酸酯、羧酸苄基烷基异氰酸酯、羧酸苯基异氰酸酯、羧酸苄基异氰酸酯、磷酸烷基异氰酸酯、膦酸苯基烷基异氰酸酯、膦酸苄基烷基异氰酸酯、膦酸苯基异氰酸酯、膦酸苄基异氰酸酯、硼酸烷基异氰酸酯、硼酸苯基烷基异氰酸酯、硼酸苄基烷基异氰酸酯、硼酸苯基异氰酸酯或硼酸苄基异氰酸酯的保护或去保护形式或者盐。
在某些实施方案中，当可电离改性剂试剂选自式(III)时，A表示双电荷可电离改性剂部分。虽然不限于理论；但是双电荷可电离改性剂部分具有两个可显示相反电荷的亚组。在某些条件下，双电荷可电离改性剂部分可以类似于两性离子和两性电解质起作用，以显示正电荷和负电荷并保持零净电荷。在其他条件下，双电荷可电离改性剂部分可仅使一个基团电离并且可显示净正电荷或负电荷。双电荷可电离改性剂部分包括但不限于通过包括羧酸、磺酸、膦酸或硼酸的酸性基团可显示正电荷(通常在氮或氧原子上)和负电荷的烷基、支链烷基、芳基、环状、多芳族、多环、杂环和多杂环基团。或者，一些含金属的络合物可以显示正电荷和负电荷。双电荷可电离改性剂部分还可包括但不限于两性离子、两性电解质、氨基酸、氨基烷基磺酸、氨基烷基羧酸、单甲基氨基烷基磺酸和二甲基氨基烷基磺酸、单甲基氨基烷基羧酸和二甲基氨基烷基羧酸、吡啶鎓烷基磺酸和吡啶鎓烷基羧酸基团。或者，双电荷可电离改性剂部分可以是2-(N-吗啉基)乙磺酸、3-(N-吗啉基)丙磺酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)、N-环己基-3-氨基丙磺酸、N-环己基-2-羟基-3-氨基丙磺酸、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐、6-甲基-9,10-二脱氢-麦角灵-8-羧酸、酚磺酞、甜菜碱、醌类、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸和N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸基团。
本发明的另一方面需要使用带电表面反相材料，其中HPCM弱碱性可电离改性剂(pKa<7)被强碱性可电离改性剂(pKa>7)代替。在不改变可电离改性剂的覆盖率的情况下，可以由此获得具有不同物理化学性质的带电表面反相材料。
在这种类型的示例性固定相上使用二乙基氨基乙基、二甲基氨基乙基、二甲基氨基丙基、二甲基氨基乙基或二乙基氨基丙基(DEAP)改性剂；C18键合；以及后续封端(实施例1，阶段1A)。
在一些实施方案中，本发明的HPCM中疏水表面基团：可电离改性剂的比率为约4:1至约150:1；约20:1至约100:1；或约25:1至约100:1。
在其他实施方案中，本发明的HPCM中可电离改性剂的浓度小于约0.5μmol/m2；小于约0.4μmol/m2；小于约0.3μmol/m2；为约0.01μmol/m2至约0.5μmol/m2；为约0.1μmol/m2至约0.4μmol/m2；或为约0.2μmol/m2至约0.3μmol/m2。
在再一个方面，本发明的HPCM的定量表面覆盖率B/A为约2.5至约300，其中A表示可电离改性剂，B表示疏水基团。在某些方面，定量表面覆盖率B/A为约3至约200、约4至约35或约5至约22。
在另一方面，本发明的HPCM的疏水表面基团是C4至C18键合相。在某些方面，疏水表面基团是C18键合相。在其他方面，疏水表面基团是嵌入式极性键合相。在其他方面，疏水表面基团是芳族、苯基烷基、氟芳族、苯基己基或五氟苯基烷基键合相。在另一方面，疏水表面基团是C4-C30、嵌入式极性、手性、苯基烷基或五氟苯基键合或涂层。
在某些实施方案中，本发明的HPCM可以是颗粒、整料或表面多孔材料的形式。在某些其他方面，本发明的HPCM是无孔材料。
在某些方面，本发明的HPCM可以是无机材料(例如，二氧化硅)、杂化有机/无机材料、具有杂化表面层的无机材料(例如，二氧化硅)、具有无机(例如，二氧化硅)表面层的杂化颗粒，或具有不同杂化表面层的杂化颗粒。
在一个实施方案中，本发明的HPCM不具有色谱增强孔几何形状。在另一个实施方案中，本发明的HPCM具有色谱增强孔几何形状。
在某些实施方案中，本发明的HPCM的表面积为约25至1100m2/g；约80m2/g至500m2/g；或约120m2/g至330m2/g。
在其他实施方案中，本发明的HPCM的孔体积为约0.15cm3/g至1.7cm3/g；或约0.5cm3/g至1.3cm3/g。
在某些其他实施方案中，本发明的HPCM是无孔的。
在其他实施方案中，本发明的HPCM的微孔表面积小于约110m2/g；小于约105m2/g；小于约80m2/g；或小于约50m2/g。
在其他实施方案中，本发明的HPCM的平均孔径为约至/>约/>至约/>至/>或约/>至/>
在另一个实施方案中，本发明的HPCM在约1至约14的pH下；在约10至约14的pH下；或在约1至约5的pH下是水解稳定的。
在另一方面，本发明提供了如本文所述的材料，其中HPCM材料还包含纳米颗粒或分散在色谱表面内的多于一种纳米颗粒的混合物。
在某些实施方案中，纳米颗粒以小于20重量％的纳米复合材料、小于10重量％的纳米复合材料或小于5重量％的纳米复合材料存在。
在其他实施方案中，纳米颗粒是结晶的或无定形的，并且可以是碳化硅、铝、金刚石、铈、炭黑、碳纳米管、锆、钡、铈、钴、铜、铕、钆、铁、镍、钐、硅、银、钛、锌、硼、其氧化物或其氮化物。在具体实施方案中，纳米颗粒是包含选自纳米金刚石、碳化硅、二氧化钛和立方氮化硼的一个或多个部分的物质。
在其他实施方案中，纳米颗粒的直径可小于或等于200nm，直径小于或等于100nm，直径小于或等于50nm，或直径小于或等于20nm。
表面改性
本发明的HPCM材料还可被表面改性。
因此，在一个实施方案中，如本文所述的材料可用具有式Za(R')bSi-R”的表面改性剂进行表面改性，其中Z＝Cl、Br、I、C1-C5烷氧基、二烷基氨基或三氟甲磺酸酯；a和b各自为0至3的整数，前提条件是a+b＝3；R'为C1-C6直链、环状或支链烷基，并且R”为官能化基团。
在另一个实施方案中，材料已通过用聚合物涂覆进行表面改性。
在某些实施方案中，R'选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、异戊基、己基和环己基。在其他实施方案中，R'选自烷基、烯基、炔基、芳基、氰基、氨基、二醇、硝基、酯、阳离子或阴离子交换基团、含有嵌入式极性官能团和手性部分的烷基或芳基。在某些实施方案中，R'选自芳族、苯基烷基、氟芳族、苯基己基、五氟苯基烷基和手性部分。
在一个实施方案中，R”为C1-C30烷基基团。在另一个实施方案中，R”包含手性部分。在另一个实施方案中，R”为C1-C20烷基基团。
在某些实施方案中，表面改性剂包含嵌入式极性官能团。在某些实施方案中，这种嵌入式极性官能团包括碳酸酯、酰胺、脲、醚、硫醚、亚磺酰基、亚砜、磺酰基、硫脲、硫代碳酸酯、硫代氨基甲酸酯、乙二醇、杂环或三唑官能团。在其他实施方案中，这种嵌入式极性官能团包括诸如美国专利号5,374,755公开的氨基甲酸酯官能团以及手性部分。这类基团包括以下通式的那些：
其中l、m、o、r和s为0或1，n为0、1、2或3，p为0、1、2、3或4，并且q为0至19的整数；R3选自氢、烷基、氰基和苯基；并且Z、R'、a和b如上定义。优选地，氨基甲酸酯官能团具有如下所示的通用结构：
其中R5可为例如氰基烷基、叔丁基、丁基、辛基、十二烷基、十四烷基、十八烷基或苄基。有利的是，R5为辛基、十二烷基或十八烷基。
在某些实施方案中，表面改性剂选自苯基己基三氯硅烷、五氟苯基丙基三氯硅烷、辛基三氯硅烷、十八烷基三氯硅烷、辛基二甲基氯硅烷和十八烷基二甲基氯硅烷。在一些实施方案中，表面改性剂选自辛基三氯硅烷和十八烷基三氯硅烷。在其他实施方案中，表面改性剂选自异氰酸酯或1,1'-羰基二咪唑(特别是当杂化基团含有(CH2)3OH基团时)。
在另一个实施方案中，材料已通过有机基团和硅烷醇基团改性的组合进行表面改性。
在再一个实施方案中，材料已通过有机基团改性和用聚合物涂覆的组合进行了表面改性。在另一个实施方案中，有机基团包含手性部分。
在又一个实施方案中，材料已通过硅烷醇基团改性和用聚合物涂覆的组合进行了表面改性。
在其他实施方案中，材料已通过在颗粒的有机基团和改性试剂之间形成有机共价键进行了表面改性。
在其他实施方案中，材料已通过有机基团改性、硅烷醇基团改性和用聚合物涂覆的组合进行了表面改性。
在另一个实施方案中，材料已通过硅烷醇基团改性进行了表面改性。
在某些实施方案中，表面改性层可以是多孔的或无孔的。
标记试剂和部分
本发明的另一方面是标记试剂的用途，该标记试剂能够向待分析的样品提供两亲强碱性标记部分。
可使用多种标记试剂来提供用于分析和分离的所需部分。
在某些实施方案中，本发明的聚糖标记试剂提供Log P值介于0和5之间、介于0和3之间、介于1和5之间或介于1和3之间的两亲强碱性部分。在某些实施方案中，本发明的聚糖标记试剂提供pKa值大于6、大于7或大于8的两亲强碱性部分。
在某些实施方案中，标记试剂是MS活性的快速荧光标记化合物，其提供以下结构式的部分：
或者其盐或溶剂化物，其中
X＝C或N；
R1独立地选自O＝C＝N-，
R2独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C1-C8环烷基、卤素、二烷基氨基、CH2-二烷基氨基、氨基羰基、烷氧基羰基或烷氧基，但不是Cl或O＝C＝N-；并且
R3和R4独立地选自-H、烷基、烷基氨基、烷基磺酸、烷基膦酸，其中R3或R4为烷基氨基、烷基膦酸或烷基磺酸，并且其中R3和R4与它们所连接的氮一起可形成任选地被取代的5至8元饱和或部分不饱和的环，但是当R1为O＝C＝N-时不是。
本文所述的式的化合物可具有光学中心，因此可以不同的对映体和非对映体构型存在。本文所述的发明包括每个式的这类化合物的所有对映异构体、非对映异构体和其他立体异构体，以及外消旋化合物和外消旋混合物及其立体异构体的其他混合物。
本文所述的化合物还可与其他化合物形成氢键。氢键是极性分子之间的电磁吸引相互作用，其中氢与电负性原子诸如氮或氧键合。氢键表示强偶极-偶极吸引力。这些氢键吸引力可以发生在分子之间(分子间)或单个分子的不同部分内(分子内)。当氢原子连接到电负性原子时，其被认为是氢键供体。电负性原子被认为是氢键受体，无论其是否与氢原子键合。
不对称中心存在于本文提供的化合物中。这些中心用符号“R”或“S”表示，具体取决于手性碳原子周围取代基的构型。应当理解，本发明包括所有立体化学异构形式，包括非对映异构形式、对映异构形式和差向异构形式，以及d-异构体和1-异构体，及其混合物。化合物的单个立体异构体可以由含有手性中心的可商购获得的起始材料合成制备，或者通过制备对映异构体产物的混合物，然后分离，诸如转化成非对映异构体的混合物，然后分离或重结晶、色谱技术、在手性色谱柱上直接分离对映异构体，或本领域已知的任何其他合适的方法来制备。具体立体化学的起始化合物可商购获得，或者可通过本领域已知的技术制得和拆分。另外，本发明的化合物可作为几何异构体存在。本发明包括所有顺、反、顺式、反式、顺式异构(E)和反式异构(Z)及其适当的混合物。另外，化合物可作为互变异构体存在；所有互变异构体均由本发明提供。另外，本发明化合物可以非溶剂化形式以及与药学上可接受的溶剂诸如水、乙醇等的溶剂化形式存在。一般来讲，对于本发明的目的，溶剂化形式被认为等同于非溶剂化形式。
因此，本文所述的化合物还可以是盐或溶剂化物特别是酸加成盐的形式。通过与有机酸或无机酸发生反应，本文提供的化合物或化合物组可以形成盐。例如，在酸碱中和中，酸和碱反应形成水和盐。基本上，要一起反应，必须在酸和碱之间转移质子。而且，不同的酸可以产生不同的离子。例如，阿瑞尼斯酸在水中离解时产生水合氢离子。类似地，布朗斯特-劳瑞酸是将氢离子提供给碱的质子供体。因此，质子受体和质子供体是反应的基础，并且有时被称为共轭碱或共轭酸。共轭对是指具有共同特征的酸和碱，其中在对之间存在相等的质子损失/获得。例如，NH4+是碱NH3的共轭酸，因为当H2O提供氢离子以形成OH-即共轭碱时，NH3获得氢离子以形成NH4+。另一方面，在不同理论下，路易斯酸接受电子对，路易斯碱提供电子对供体。因此，质子H+可以是电子对受体。此外，化合物可以是路易斯酸和路易斯碱，具体取决于反应。例如，甲基碘可以表现为路易斯酸和路易斯碱，其中提供甲基基团以形成盐。
可用于形成本文提供的任何化合物的盐的酸的示例包括如本领域技术人员公知的无机酸和有机酸，诸如但不限于N-羟基琥珀酰亚胺、盐酸、氢氟酸、氢碘酸、氢溴酸、硫酸、氢硫酸、硫代硫酸、氢氰酸、磷酸、亚磷酸、次氯酸、亚氯酸、亚硝酸、硝酸、氯酸、高氯酸、亚硫酸、草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。还可通过将化合物与碱金属或碱土金属离子配位来形成盐。此外，其他酸可形成盐，包括但不限于1-羟基-2-萘甲酸、2,2-二氯乙酸、2-羟基乙磺酸、2-氧代戊二酸、4-乙酰氨基苯甲酸、4-氨基水杨酸、乙酸、己二酸、抗坏血酸(L)、天冬氨酸(L)、苯磺酸、苯甲酸、樟脑酸(+)、樟脑-10-磺酸(+)、癸酸(正癸酸)、己酸(正己酸)、辛酸(正辛酸)、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环己烷氨基磺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸(D)、葡萄糖酸(D)、葡萄糖醛酸(D)、谷氨酸、戊二酸、甘油磷酸、异丁酸、乳酸(DL)、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸(-L)、丙二酸、扁桃酸(DL)、甲磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、烟酸、硝酸、油酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、磷酸、丙酸、焦谷氨酸(-L)、水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸(+L)、硫氰酸、甲苯磺酸(p)、十一烯酸。
对于本文所述的化合物，抗衡离子可以是在使一种化合物或成组化合物与酸反应后形成的共轭碱。换句话讲，抗衡离子保持和与之缔合的该化合物或该组化合物的电荷相反的电荷。因此，关于本文的具有NH4+的共轭酸的化合物的可能盐，该抗衡离子代表盐的阴离子部分。
因此，本文所述的盐化合物的抗衡离子可包括但不限于以下常见阴离子和含氧阴离子中的任一者：N-羟基琥珀酰亚胺基、负氢离子(H-)、氟离子(F-)、氯离子(C-)、溴离子(Br-)、碘离子(I-)、氧离子(O2-)、氢氧根(OH-)、过氧根(O2 2-)、硫离子(S2-)、硫氢根(HS-)、硒离子(Se2-)、氮离子(N3-)、叠氮根(N3-)、磷离子(P3-)、砷离子(As3-)、碳离子(C4-)、氰离子(CN-)、次氯酸根(ClO1-)、亚氯酸根(ClO2-)、氯酸根(ClO3-)、高氯酸根(ClO4-)、亚硫酸根(SO3 2-)、硫酸根(SO4 2-)、硫酸氢根(HSO4-)、硫代硫酸根(S2O3 2-)、亚硝酸根(NO2-)、硝酸根(N3-)、亚磷酸根(PO3 2-)、磷酸根(PO4 3-)、(单)磷酸氢根(HPO42-)、磷酸二氢根(H2PO4-)、碳酸根(CO3 2-)、碳酸氢根(HCO3-)、草酸根(C2O4 2-)、氰酸根(NCO-)、异氰酸根(OCN-)、硫氰酸根(SCN-)、铬酸根(CrO4 2-)、重铬酸根(Cr2O7 2-O)、高锰酸根(MnO4-)。
在某些实施方案中，聚糖标记试剂为具有下式的试剂：
在其他实施方案中，标记试剂为普鲁卡因胺或普鲁卡因试剂。
在其他实施方案中，标记试剂及其对应的标签部分包括但不限于在以下专利中所述的标记试剂和部分：美国专利申请号14/342,131、14/193,418、14/458,760、和15/005,619；以及美国专利号5,296,599、7,148,069、7,494,815、和8,124,792。这些专利申请和专利中的每一个的公开内容全文以引用方式并入本文。
在某些实施方案中，标记部分通过仲胺、脲或酰胺键共价键合至聚糖。在其他实施方案中，可将标记试剂施加至N-聚糖或O-聚糖，使得结合了两亲强碱性标记部分，并且可有利地使用本文所述的色谱方法。
分离装置和试剂盒
本文所述的HPCM材料可用于具有含HPCM材料的固定相的各种分离装置。该分离装置包括例如色谱柱、薄层板、过滤膜、样品净化装置和微量滴定板。
由于其提高的稳定性，HPCM材料为这些装置赋予延长的寿命。
此类装置包括：
a)具有圆柱形内部的柱，所述圆柱形内部用于接纳填充材料，以及
b)包含如本文所述的高纯度色谱材料的填充色谱床。
另一个此类装置包括色谱装置，包括
a)用于接纳填充材料的内部通道以及
b)包含如本文所述的高纯度色谱材料的填充色谱床。
HPCM材料也可用作包含如本文所述的HPCM材料以及使用说明书的试剂盒。试剂盒可用于分离装置，例如色谱柱、薄层板、过滤膜、样品净化装置和微量滴定板。在另一个实施方案中，说明书用于分离、离析、纯化或检测一种或多种聚糖。
分离/分析的方法
本发明提供了使用如本文所述的HPCM材料选择性地离析/分离、纯化、检测和/或分析聚糖或聚糖的混合物的方法。在某些实施方案中，本发明的方法和本文所述的HPCM材料可用于选择性地离析/分离、纯化、检测和/或分析糖肽、糖蛋白或糖脂。本发明的方法能够分离从而拆分化合物的复杂混合物，因而允许快速离析/分离、纯化、检测和/或分析此类混合物的组分化合物。
在一个方面，本发明提供了一种从样品中选择性分离聚糖的方法，该方法包括以下步骤：
a)使包含聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品
b)将标记的聚糖样品上样到色谱分离装置上，该色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中该色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当可电离改性剂不含两性离子时，该可电离改性剂不含季铵离子部分，使得聚糖选择性地吸附到高纯度色谱材料上；以及
c)从高纯度色谱材料中洗脱吸附的标记聚糖，从而从样品中选择性分离标记的聚糖。
在又一个方面，本发明提供了一种从样品中分离多种聚糖的方法，该方法包括以下步骤：
a)使包含多种聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品
b)将含多种聚糖的标记聚糖样品上样到色谱分离装置上，该色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中该色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当可电离改性剂不含两性离子时，该可电离改性剂不含季铵离子部分，使得聚糖吸附到高纯度色谱材料上；以及
c)从高纯度色谱材料中洗脱吸附的标记聚糖，从而分离标记的聚糖。
在又一个方面，本发明提供了一种用于纯化样品中所含的聚糖的方法，该方法包括以下步骤：
a)使包含聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品
b)将标记的聚糖样品上样到色谱分离装置上，该色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当可电离改性剂不含两性离子时，可电离改性剂不含季铵离子部分，使得聚糖吸附到高纯度色谱材料上；以及
c)从高纯度色谱材料中洗脱吸附的聚糖，从而纯化聚糖。
在又一个方面，本发明提供了一种用于检测样品中的聚糖的方法，该方法包括以下步骤：
a)使包含聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品
a)将标记的聚糖样品上样到色谱分离装置上，该色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中该色谱表面包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当可电离改性剂不含两性离子时，该可电离改性剂不含季铵离子部分，使得聚糖吸附到高纯度色谱材料上；以及
b)从高纯度色谱材料中洗脱吸附的聚糖；以及
c)检测聚糖。
在本发明的色谱方法的某些实施方案中，聚糖为N-聚糖或O-聚糖。在特定方面，聚糖是hIgG聚糖、胎球蛋白聚糖、FA2BG2S2、FA2G2S1或FA2G2。
在某些实施方案中，聚糖标记试剂是MS-活性的快速荧光标记化合物；普鲁卡因胺试剂或普鲁卡因试剂。
在某些其他实施方案中，聚糖标记试剂为具有下式的试剂：
本发明的方法可用于选择性地离析、纯化和/或检测来自多种样品的聚糖。在一个实施方案中，样品是或来源于选自血液、尿液、脊髓液、滑液、痰液、精液、唾液、泪液、胃液及其提取物和/或稀释液/溶液的生物流体。在某些实施方案中，样品包含化合物的生物混合物。
在某些实施方案中，发现与传统的不利用带电表面的色谱材料相比，本发明的材料产生明显改善的峰形。在另一个实施方案中，发现本发明的材料通过在其带电表面与分析物分子的相同或相反电荷之间产生库仑相互作用而产生有利的选择性。此外，发现本发明的材料减轻了与不使用带电表面的传统色谱材料相关的非特异性结合问题。具体地讲，这些益处允许通过质谱法鉴定或确认低丰度的大分子，因为它们不会因非特异性结合而丢失，并且不会被已显示的丰度物质的降解峰形遮蔽，而使用传统的色谱材料，需要样本质量的增加才能看到低丰度的物质。
在本发明的一个方面，本发明的方法利用流动相，在流动相中，与ESI+MS检测偶联的分离产生高信噪比质谱。此类流动相包括但不限于包含具有pH1至pH8、pH2至pH7、或pH3至pH6的缓冲溶液的流动相。在分离的含水流动相中使用缓冲添加剂可显著调节MS灵敏度、保留性和选择性(图5)。
在具体实施方案中，含水流动相包含pH 3.6的缓冲溶液-1mM甲酸铵/1mM甲酸。该溶液有效地产生显示高分离度异构体分离的分离以及由分析物电荷状态驱动的一些类别分离。然而，也如图6所示，包含17mM乙酸和1mM甲酸铵的含水流动相也是有效的。
在某些实施方案中，本发明的方法在恒定的离子强度条件下进行。这在标记的聚糖从牛胎球蛋白的分离中得到证实(图6)。这些聚糖在高度唾液酸化和高度支化方面是独特的。在洗脱液流动相中没有任何离子强度的情况下，预计四唾液酸化的标记聚糖不会从本发明的柱中洗脱。在洗脱液流动相中使用添加剂(其反映了含水流动相的添加剂)有助于高度唾液酸化结构的回收。因此，本发明的一个实施方案利用适当的添加剂选择以及梯度倾斜度的优化。图7示出了这些示例性分离，其中分析了来自hIgG和牛胎球蛋白的标记聚糖。对于标记的hIgG聚糖获得的色谱图值得注意的是，显示出所谓的中性N-聚糖结构(非岩藻糖基化物质和岩藻糖基化物质，无论有或没有等分的N-乙酰化葡糖胺)的高分离度聚类，以及在多个单-和二-唾液酸化的N-聚糖物质之间和之中的高分离度(图7A)。同时，对于标记的胎球蛋白聚糖获得的色谱图(图7B)值得注意的是，证明了在含有三个和四个唾液酸残基的聚糖中可获得合理的分离度。
在具体实施方案中，本发明的HPCM为用二乙基氨基乙基、二甲基氨基乙基、二甲基氨基丙基、二甲基氨基乙基或二乙基氨基丙基(DEAP)改性剂制备的固定相，包括但不限于1.7μm、平均孔径材料，该材料由有机二氧化硅颗粒、二乙基氨基乙基、二甲基氨基乙基、二甲基氨基丙基、二甲基氨基乙基或二乙基氨基丙基(DEAP)改性剂；C18键合；以及后续封端制备。(实施例1，相1A)。该“DEAP”材料(实施例1中所述的相1A)已针对其拆分用两亲强碱性部分标记的聚糖的能力进行了评估，如下文所述。
就这一点而言，已发现这种材料产生更明显的按其净电荷区分的聚糖类别分离。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了使用该DEAP固定相并使用递送增加浓度的有机溶剂和缓冲液两者的同步梯度对标记的hIgG聚糖的分析(图8)。这些分离所需的离子强度变化的大小可通过由hIgG和牛胎球蛋白制备的标记聚糖的分离来限定(图9)。在从0.5％至32％乙腈(MeCN)的线性梯度上，这些分离得到优化，梯度为0至100mM甲酸铵和100mM甲酸。正是通过有机溶剂和离子强度变化的这种配对，实现了所有聚糖物质的良好回收和按其唾液酸化程度因而按其净电荷区分的聚糖的最佳类别分离。虽然这里没有说明，但可以设想这些梯度可以用二元泵设备或甚至三元溶剂递送系统来实现。此外，可使用非线性或多台阶梯度来调整分离以实现不同的选择性和分离度。
本发明的材料的合成
本发明还提供了用于制备本文所述的高纯度色谱材料(HPCM)的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了用于制备本文所述的HPCM的方法，该方法包括以下步骤：
a.使色谱芯与可电离改性试剂反应以获得可电离改性材料；并且
b.使所得材料与疏水表面改性基团反应。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备本文所述的高纯度色谱材料的方法，该方法包括以下步骤：
a.使色谱芯与疏水表面改性基团反应以获得表面改性材料；并且
b.使所得材料与可电离改性试剂反应。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备本文所述的高纯度色谱材料的方法，该方法包括以下步骤：
a.使色谱芯与疏水表面改性基团反应以获得表面改性材料；并且
b.使所得材料与封端表面基团反应，并且
c.使所得材料与可电离改性试剂反应。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备本文所述的高纯度色谱材料的方法，该方法包括以下步骤：
a.使色谱芯与可电离改性试剂反应以获得可电离改性材料；并且
b.使所得材料反应以产生杂化表面层；并且
c.使所得材料与疏水表面改性基团反应。
在一个方面，如上所述的本发明的HPCM以约3至约133的电荷比B’/A’制备，其中A'代表制备中带电荷的可电离改性剂试剂，B'代表制备中带电荷的疏水基团。在某些方面，电荷比B’/A’为约4至约80、约4至约15或约6至约7。
在一个实施方案中，本文所述的方法还包括将剩余的硅烷醇基团封端的步骤。
在一个实施方案中，在所述方法中同时执行各步骤。
在另一个实施方案中，如通过氮气(N2)吸附分析所证实的，通过水热处理对制备好的高纯度色谱材料的孔结构进行改性，该水热处理扩大孔的开口以及孔径。通过制备含有制备好的杂化材料和碱的水溶液的浆料，在高压釜中在高温(例如，100℃至200℃)下加热浆料10h至30h的时间来进行水热处理。使用烷基胺诸如三甲胺(TEA)或三(羟甲基)甲胺或使用氢氧化钠是有利的。将由此处理过的材料冷却、过滤并用水和甲醇洗涤，然后在80℃下减压干燥16h。
在某些实施方案中，在水热处理之后，高纯度色谱材料的表面用各种试剂改性。这种“表面改性剂”(通常)包括为色谱固定相赋予一定色谱功能的有机官能团。在某些方面，当HPCM为杂化材料时，其具有可另外被表面改性剂取代或衍生化的有机基团和硅烷醇基团。
经水热处理的高纯度色谱材料的表面包含有机基团，其可通过与对材料的有机基团有反应的试剂反应来衍生化。例如，材料上的乙烯基可与多种烯烃反应性试剂诸如溴(Br2)、氢(H2)、自由基、增长聚合物自由基中心、二烯烃等反应。在另一个示例中，材料上的羟基可与如下所述的多种醇反应性试剂诸如异氰酸酯、羧酸、羧酸氯化物和反应性有机硅烷反应。这种类型的反应在文献中是众所周知的，参见例如，March,J，Advanced OrganicChemistry，第3版，Wiley，New York，1985；Odian,G，The Principles of Polymerization，第2版，Wiley，New York，1981。
此外，经水热处理的高纯度色谱材料的表面还包含硅烷醇基团，其可通过与反应性有机硅烷反应来衍生化。高纯度色谱材料的表面衍生化根据标准方法进行，例如通过在回流条件下在有机溶剂中与十八烷基三氯硅烷或十八烷基二甲基氯硅烷反应。有机溶剂诸如甲苯通常用于该反应。将诸如吡啶或咪唑的有机碱加入到反应混合物中以催化反应。然后用水、甲苯和丙酮洗涤该反应的产物。该材料可通过在经pH调节的含水有机溶液中在环境温度或高温下水解来进一步处理。有机溶剂诸如丙酮通常用于该水解。可使用酸或碱调节剂，包括三氟乙酸、甲酸、盐酸、乙酸、甲酸钠或甲酸铵、乙酸钠、乙酸钾或乙酸铵、磷酸盐缓冲液、氢氧化铵、碳酸铵或碳酸氢铵来实现pH的调节。然后用水、甲苯和丙酮洗涤水解产物，并在80℃至100℃下减压干燥16h。通过使用上述的类似程序，所得材料可进一步与短链硅烷诸如三甲基氯硅烷反应以将剩余的硅烷醇基团封端。
诸如本文所公开的表面改性剂例如通过衍生化或涂覆以及随后的交联而连接到基础材料上，从而为基础材料赋予表面改性剂的化学特性。在一个实施方案中，高纯度色谱材料的有机基团与表面改性剂反应形成有机共价键。改性剂可通过有机和聚合物化学中众所周知的许多机制形成与材料有机基团的有机共价键，所述机制包括但不限于亲核、亲电子、环加成、自由基、碳烯、氮烯和碳正离子反应。有机共价键被定义为涉及在有机化学的常见元素之间形成共价键，所述常见元素包括但不限于氢、硼、碳、氮、氧、硅、磷、硫和卤素。另外，碳-硅和碳-氧-硅键被定义为有机共价键，而硅-氧-硅键不被定义为有机共价键。
术语“官能化基团”包括为色谱固定相赋予一定色谱功能的有机官能团，包括例如十八烷基(C18)或苯基。此类官能化基团直接结合到基础材料中，或存在于例如本文所公开的表面改性剂中，所述表面改性剂例如通过衍生化或涂覆以及随后的交联而连接到基础材料上，从而为基础材料赋予表面改性剂的化学特性。
在某些实施方案中，硅烷醇基团为表面改性的。在其他实施方案中，有机基团为表面改性的。在其他实施方案中，高纯度色谱材料的有机基团和硅烷醇基团均为表面改性或衍生化的。在另一个实施方案中，高纯度色谱材料通过用聚合物涂覆进行表面改性。在某些实施方案中，通过用聚合物涂覆的表面改性与硅烷醇基团改性、有机基团改性或硅烷醇基团改性和有机基团改性两者结合使用。可通过硅烷醇基团改性、有机基团改性或硅烷醇基团改性和有机基团改性两者将可电离改性剂加入到材料中。可通过硅烷醇基团改性、有机基团改性或硅烷醇基团改性和有机基团改性两者将疏水性表面基团加入到材料中。
更一般地说，高纯度色谱材料的表面可通过以下方式改性：用包括式Za(R’)bSi-R”的化合物的表面改性剂处理，其中Z＝Cl、Br、I、C1-C5烷氧基、二烷基氨基例如二甲氨基或三氟甲磺酸；a和b各自为0至3的整数，前提条件是a+b＝3；R'为C1-C6直链、环状或支链烷基，并且R”为官能化基团。在某些情况下，这种材料已通过用聚合物涂覆进行表面改性。
R’包括，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、异戊基、己基或环己基；优选地，R’为甲基。
官能化基团R”可包括烷基、烯基、炔基、芳基、氰基、氨基、二醇、硝基、酯、阳离子或阴离子交换基团、含有嵌入式极性官能团或手性部分的烷基或芳基。合适的R”官能化基团的示例包括手性部分、C1-C30烷基，包括C1-C20，诸如辛基(C8)、十八烷基(C18)和三十烷基(C30)；烷芳基，例如，C1-C4-苯基；氰基烷基，例如，氰基丙基；二醇基团，例如，丙二醇；氨基，例如，氨基丙基；以及具有嵌入式极性官能团的烷基或芳基，例如，碳酸酯、酰胺、脲、醚、硫醚、亚磺酰基、亚砜、磺酰基、硫脲、硫代碳酸酯、硫代氨基甲酸酯、乙二醇、杂环、诸如美国专利号5,374,755中公开的三唑官能团或氨基甲酸酯官能团以及手性部分。在某些实施方案中，R”选自芳族、苯基烷基、氟芳族、苯基己基、五氟苯基烷基和手性部分。这类基团包括以下通式的那些：
其中1、m、o、r和s为0或1，n为0、1、2或3，p为0、1、2、3或4，并且q为0至19的整数；R3选自氢、烷基、氰基和苯基；并且Z、R'、a和b如上定义。优选地，氨基甲酸酯官能团具有如下所示的通用结构：
其中R5可为例如氰基烷基、叔丁基、丁基、辛基、十二烷基、十四烷基、十八烷基或苄基。有利的是，R5为辛基、十二烷基或十八烷基。
在某些应用诸如手性分离中，将手性部分作为官能化基团包括在内是特别有利的。
聚合物涂层在文献中是已知的，并且通常可通过以下方式提供：将物理吸附的单体聚合或缩聚到表面上而没有聚合物层到载体的化学键合(类型I)，将物理吸附的单体聚合或缩聚到表面上且具有聚合物层到载体的化学键合(类型II)，将物理吸附的预聚物固定到载体(类型III)，以及将预合成的聚合物化学吸附到载体的表面上(类型IV)。参见例如Hanson等人，J.Chromat.A656(1993)369-380，其文本以引用方式并入本文。如上所述，用聚合物涂覆杂化材料可与本发明中所述的各种表面改性结合使用。
因此，在某些实施方案中，疏水性表面改性剂选自苯基己基三氯硅烷、五氟苯基丙基三氯硅烷、辛基三氯硅烷、十八烷基三氯硅烷、辛基二甲基氯硅烷和十八烷基二甲基氯硅烷。在另一个实施方案中，表面改性剂选自辛基三氯硅烷和十八烷基三氯硅烷。
在另一个实施方案中，高纯度色谱材料已通过有机基团和硅烷醇基团改性的组合进行表面改性。
在其他实施方案中，高纯度色谱材料已通过有机基团改性和用聚合物涂覆的组合进行表面改性。
在其他实施方案中，高纯度色谱材料已通过硅烷醇基团改性和用聚合物涂覆的组合进行表面改性。
在另一个实施方案中，高纯度色谱材料已通过在杂化芯和/或周围材料的有机基团与改性试剂之间形成有机共价键进行表面改性。
在其他实施方案中，高纯度色谱材料已通过有机基团改性、硅烷醇基团改性和用聚合物涂覆的组合进行表面改性。
在一个实施方案中，高纯度色谱材料已通过硅烷醇基团改性进行表面改性。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中高纯度色谱材料通过进一步包括致孔剂进行改性。在另一个实施方案中，致孔剂选自环己醇、甲苯、均三甲苯、2-乙基己酸、邻苯二甲酸二丁酯、1-甲基-2-吡咯烷酮、1-十二烷醇和Triton X-45。在某些实施方案中，致孔剂为甲苯或均三甲苯。
在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中高纯度色谱材料通过包括表面活性剂或稳定剂进一步进行改性。在某些实施方案中，表面活性剂为Triton X-45、TritonX100、Triton X305、TLS、Pluronic F-87、Pluronic P-105、Pluronic P-123、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸铵、TRIS十二烷基硫酸盐或Triton X-165。在某些实施方案中，表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸铵或TRIS十二烷基硫酸盐。
如上所述包括杂化材料、二氧化硅、颗粒、整料和表面多孔材料在内的本发明HPCM的合成的某些实施方案在下面的实施例中进一步说明。
实施例
本发明可通过以下描述多孔色谱材料的表面改性的非限制性实施例进一步说明。
材料
除非另有说明，否则所有试剂均按原样使用。本领域技术人员将认识到存在以下供应品和供应商的等同形式，因此，下面列出的供应商不应被解释为限制性的。
通常，除了下文所述的方法之外，本发明的HPCM可使用美国专利申请号2013/0319086中概述的示例性方案制备，其公开内容以引用方式并入本文。
表征
本领域技术人员将认识到存在以下仪器和供应商的等同形式，因此，下面列出的仪器不应被解释为限制性的。
通过燃烧分析(CE-440元素分析仪；马萨诸塞州北切姆斯福德的EAI公司(ExeterAnalytical Inc.,North Chelmsford,MA))测量％C值、％H值、％N值，或者通过库仑碳分析仪(型号CM5300、CM5014，伊利诺伊州乔利埃特的UIC公司(UIC Inc.,Joliet,IL))测量％C。这些材料的比表面积(SSA)、比孔容(SPV)以及平均孔径(APD)使用多点N2吸附法(Micromeritics ASAP 2400；佐治亚州诺克罗斯的麦克仪器公司(MicromeriticsInstruments Inc.,Norcross,GA))测量。使用BET方法计算SSA，SPV是针对P/P0>0.98确定的单点值，并且使用BJH方法从等温线的解吸段计算APD。在7kV下进行扫描电镜(SEM)图像分析(JEOL JSM-5600仪器，日本东京(Tokyo，Japan))。粒度使用Beckman CoulterMultisizer 3分析仪(30μm孔，70,000计数；佛罗里达州迈阿密(Miami,FL))测量。将粒径(dp)测量为基于体积的粒度分布的50％累积直径。将分布的宽度测量为90％累积体积直径除以10％累积体积直径(表示为90/10比率)。使用Bruker Instruments Avance-300光谱仪(7mm双宽带探针)获得多核(13C,29Si)CP-MAS NMR光谱。旋转速度通常为5.0-6.5kHz，循环延迟为5秒，并且交叉极化接触时间为6毫秒。使用外标金刚烷(13C CP-MAS NMR,δ38.55)和六甲基环三硅氧烷(29Si CP-MAS NMR,δ-9.62)相对于四甲基硅烷来记录报告的13C和29SiCP-MAS NMR光谱移位。使用DMFit软件通过光谱反卷积评估不同硅环境的群体。[Massiot,D.；Fayon,F.；Capron,M.；King,I.；Le Calvé,S.；Alonso,B.；Durand,J.-O.；Bujoli,B.；Gan,Z.；Hoatson,G.Magn.Reson.Chem.2002,40,70-76]。滴定使用具有6.0232.100pH电极的Metrohm 716DMS Titrino自动滴定仪(瑞士黑里绍的万通公司(Metrohm，Hersau，Switzerland)，或等同形式)来进行。
实施例1
DEAP HPCM固定相的合成
根据以下程序合成DEAP HPCM固定相(相1A和相1B)：
步骤1：BEH多孔颗粒(马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation，Milford，Mass)；6.5％ C；SSA＝75-200m2/g；SPV＝0.60-0.75cc/g；)，式为(O1.5SiCH2CH2SiO1.5)(SiO2)4(用以下在美国专利号6,686,035中所述的方法制备)，使用Dean-Stark分离器在甲苯(5mL/g，新泽西州菲尔朗的赛默飞世尔科技公司(FisherScientific,Fairlawn,NJ))中回流1小时。在冷却后，将重蒸馏的(N,N-二乙基氨基丙基)三甲氧基硅烷(DEAP，北卡罗来纳州威尔明顿的Silar Laboratories公司(SilarLaboratories,Wilmington，NC))以0.3μmol/m2加入，并且将反应加热至回流2小时。随后使反应冷却，将产物过滤，并且依次用甲苯、1:1v/v丙酮/水和丙酮洗涤(所有溶剂都来自新泽西州菲尔朗的赛默飞世尔科技公司(Fisher Scientific,Fairlawn,NJ))。然后将产物在80℃下减压干燥16小时。
步骤2：使用Dean-Stark分离器将来自步骤1的材料在甲苯(5mL/g，新泽西州菲尔朗的赛默飞世尔科技公司(Fisher Scientific,Fairlawn,NJ))中回流1小时。在冷却后，将咪唑(威斯康星州密尔沃基的奥德里奇公司(Aldrich，Milwaukee，WI))和十八烷基三氯硅烷(宾夕法尼亚州莫里斯维尔的Gelest公司(Gelest Inc.,Morrisville,PA))以2.3μmol/m2加入，并且将反应加热至回流16小时。随后使反应冷却，将产物过滤，并且依次用甲苯、1:1v/v丙酮/水和丙酮洗涤(所有溶剂都来自新泽西州菲尔朗的赛默飞世尔科技公司(FisherScientific,Fairlawn,NJ))。然后在50℃下将材料在丙酮/含水0.1M碳酸氢铵(pH 10)溶液中回流20小时(水解)。水解后，将材料依次用1:1v/v丙酮/水和丙酮洗涤(所有溶剂都来自新泽西州菲尔朗的赛默飞世尔科技公司(Fisher Scientific,Fairlawn,NJ))。然后将产物在80℃下减压干燥16小时。
步骤3：使用Dean-Stark分离器将来自步骤2的材料在甲苯(5mL/g，新泽西州菲尔朗的赛默飞世尔科技公司(Fisher Scientific,Fairlawn,NJ))中回流1小时。在冷却后，将咪唑(威斯康星州密尔沃基的奥德里奇公司(Aldrich，Milwaukee，WI))和三乙基氯硅烷(TECS，宾夕法尼亚州莫里斯维尔的Gelest公司(Gelest Inc.,Morrisville,PA))加入，并且将反应加热至回流4小时。随后使反应冷却，将咪唑和三甲基氯硅烷(威斯康星州密尔沃基的奥德里奇公司(Aldrich，Milwaukee，WI))加入到反应中，并且再将反应加热至回流16小时。随后使反应冷却，将产物过滤，并且依次用甲苯、1:1v/v丙酮/水和丙酮洗涤(所有溶剂都来自新泽西州菲尔朗的赛默飞世尔科技公司(Fisher Scientific,Fairlawn,NJ))。然后将产物在80℃下减压干燥16小时。除非另外指明，否则上述程序中所述的所有试剂(步骤1至3)均按原样使用。本领域技术人员将认识到，存在等同形式，因此，尽管列出了供应品和供应商，但列出的供应品/供应商绝不应被解释为限制性的。
通过上述程序产生的固定相按以下方式表征。通过库仑碳分析仪(型号CM5300、CM5014，伊利诺伊州乔利埃特的UIC公司(UIC Inc.,Joliet,IL))测量％C值。这些材料的比表面积(SSA)、比孔容(SPV)以及平均孔径(APD)使用多点N2吸附法(Micromeritics ASAP2400；佐治亚州诺克罗斯的麦克仪器公司(Micromeritics Instruments Inc.,Norcross,GA))测量。使用BET方法计算SSA，SPV是针对P/P0>0.98确定的单点值，并且使用BJH方法从等温线的解吸段计算APD。粒度使用Beckman Coulter Multisizer 3分析仪(30μm孔，70,000计数；佛罗里达州迈阿密(Miami,FL))测量。将粒径(dp)测量为基于体积的粒度分布的50％累积直径。通过元素分析测得的表面改性前后的颗粒％C的差值来确定十八烷基三氯硅烷的总表面覆盖率。本领域技术人员将认识到存在以下仪器的等同形式，因此，下面列出的仪器不应被解释为限制性的。与两个DEAP HPCM相(相1A和相1B)相关的信息可在下面找到：
1如在US7919177、US 7223473、US 6686035中所述
实施例2
标记聚糖的石墨和常规C18反相色谱
根据先前公布的条件，由来自人IgG(Sigma 14506)的标记试剂-1(RFMS)制备根据受权利要求书保护的本发明标记的N-聚糖。(Lauber,M.A.；Yu,Y.Q.；Brousmiche,D.W.；Hua,Z.；Koza,S.M.；Magnelli,P.；Guthrie,E.；Taron,C.H.；Fountain,K.J.，“RapidPreparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Labeling Reagentthat Facilitates Sensitive Fluorescence and ESI-MS Detection。”Anal Chem 2015年，第87卷，第10期，第5401-5409页。)
然后使用石墨或常规C18反相色谱法和Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio LC系统分离根据受权利要求保护的本发明标记的人IgG N-聚糖。使用下文所述的条件进行分离以产生图2和图3所示的代表性色谱图。
柱：Thermo Scientific Hypercarb多孔石墨碳LC柱，3μm，2.1×150mm或者Waters ACQUITY UPLC BEH C18/>1.7μm，2.1×150mm
流动相A：0.1％(v/v)甲酸、水
流动相B：0.1％(v/v)甲酸、乙腈
柱温：60℃
进样量：4μL
样品浓度：10μmol/μL
样品稀释剂：水
荧光检测：Ex 265nm/Em 425nm(10Hz)
梯度表：
MS条件
实施例3
使用HPCM和甲酸流动相分离标记的聚糖
使用Waters ACQUITY UPLC CSH C18柱和Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio LC系统分离标记的人IgG N-聚糖。使用下文所述的条件进行分离以产生图4所示的代表性色谱图。
LC条件柱：Waters ACQUITY UPLC CSH C181.7μm 2.1×150mm
流动相A：0.1％(v/v)甲酸、水
流动相B：0.1％(v/v)甲酸、乙腈
柱温：60℃
进样量：4μL
样品浓度：10μmol/μL
样品稀释剂：水
荧光检测：Ex 265nm/Em 425nm(10Hz)
梯度表：
实施例4
使用HPCM和各种含水流动相添加剂对标记聚糖的LC-荧光-MS分析
使用Waters ACQUITY UPLC CSH C18柱、Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio LC系统和Waters Synapt G2-S质谱仪分析标记的人IgG N-聚糖。方法选择性和灵敏度通过使用各种含水流动相添加剂，包括甲酸、乙酸、甲酸铵和/或乙酸铵来调节(图5)。关于如何进行这些分离的细节可以在下面找到。
LC条件
柱：Waters ACQUITY UPLC CSH C181.7μm 2.1×150mm
流动相A(1)：0.1％(v/v)甲酸、水
流动相A(2)：50mM甲酸铵/10mM甲酸
流动相A(3)：5mM甲酸铵/5mM甲酸
流动相A(4)：1mM甲酸铵/1mM甲酸
流动相A(5)：17mM乙酸/1mM乙酸铵
流动相A(6)：17mM乙酸/1mM甲酸铵
流动相B：乙腈
柱温：60℃
进样量：4μL
样品浓度：10pmol/μL
样品稀释剂：水
荧光检测：Ex 265nm/Em 425nm(10Hz)
梯度表：
/>
MS条件
标记试剂-1(RFMS)
实施例5
用于使用HPCM分离高度唾液酸化的标记聚糖的恒定离子强度
标记N-聚糖由牛胎球蛋白(Sigma F3004)根据先前公布的方案(Lauber,M.A.；Yu,Y.Q.；Brousmiche,D.W.；Hua,Z.；Koza,S.M.；Magnelli,P.；Guthrie,E.；Taron,C.H.；Fountain,K.J.，“Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC AnalysisUsing a Labeling Reagent that Facilitates Sensitive Fluorescence and ESI-MSDetection。”Anal Chem 2015年，第87卷第10期，第5401-5409页)制备，随后使用ACQUITYUPLC CSH C18柱、Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio LC系统和Waters Synapt G2-S质谱仪进行LC-荧光-MS分析。使用以下方法条件获得在图6中显示的代表性色谱图：
LC条件
柱：Waters ACQUITY UPLC CSH C18 1.7μm 2.1×150mm
流动相A：17mM乙酸/1mM甲酸铵
流动相B(1)：40:60水/乙腈
流动相B(2)：17mM乙酸/1mM甲酸铵溶于40:60水/乙腈
流动相B(3)：34mM乙酸/2mM甲酸铵溶于40:60水/乙腈
流动相B(4)：85mM乙酸/5mM甲酸铵溶于40:60水/乙腈
柱温：60℃
进样量：3μL
样品浓度：来自0.17μg胎球蛋白/μL的聚糖
样品稀释剂：在5％乙腈中的200mM乙酸铵
荧光检测：Ex 265nm/Em 425nm(10Hz)
梯度表：
MS条件
实施例6
使用HPCM分离标记聚糖的示例性实施方案
使用ACQUITY UPLC CSH C18柱、Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio LC系统和Waters Synapt G2-S质谱仪对标记的人IgG和牛胎球蛋白N-聚糖进行LC-荧光-MS分析。使用以下方法条件获得在图7中显示的代表性色谱图：
LC条件
梯度表：
MS条件
实施例7
使用DEAP HPCM分离标记的人IgG聚糖的方法条件的优化
使用DEAP HPCM柱和Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio LC系统分析标记的人IgG N-聚糖。方法选择性通过使用各种含水流动相添加剂，包括甲酸、乙酸、甲酸铵和/或乙酸铵来调节(图8)。关于如何进行这些分离的细节可以在下面找到。
LC条件
柱：Waters DEAP HPCM1.7μm(相1A)2.1×150mm
流动相A(1)：17mM乙酸/1mM甲酸铵
流动相A(2)：1mM甲酸/1mM甲酸铵
流动相B(1)：20:80水/乙腈
流动相B(2)：10mM甲酸/10mM甲酸铵溶于20:80
水/乙腈
柱温：60℃
进样量：4μL
样品浓度：10pmol/μL
样品稀释剂：水
荧光检测：Ex 265nm/Em 425nm(10Hz)
梯度表：
实施例8
使用DEAP HPCM分离标记的胎球蛋白聚糖的方法条件的优化
使用DEAP HPCM柱和Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio LC系统分析标记的胎球蛋白N-聚糖。方法选择性通过使用各种含水流动相添加剂，包括甲酸、乙酸、甲酸铵和/或乙酸铵来调节(图9)。关于如何进行这些分离的细节可以在下面找到。
LC条件
柱：Waters DEAP HPCM1.7μm(相1A)2.1×150mm
流动相A：99.5:0.5水/乙腈
流动相B(1)：18.9mM甲酸/18.9mM甲酸铵溶于40:60水/乙腈
流动相B(2)：37.8mM甲酸/37.8mM甲酸铵溶于40:60水/乙腈
流动相B(3)：94.5mM甲酸/94.5mM甲酸铵溶于40:60水/乙腈
柱温：60℃
进样量：3μL
样品浓度：来自0.17μg胎球蛋白/μL的聚糖
样品稀释剂：在5％乙腈中的200mM乙酸铵
荧光检测：Ex 265nm/Em 425nm(10Hz)
梯度表：
实施例9
使用DEAP HPCM分离标记聚糖的示例性实施方案
使用DEAP HPCM柱、Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio LC系统和Waters SynaptG2-S质谱仪对标记的人IgG和牛胎球蛋白N-聚糖进行LC-荧光-MS分析。使用以下方法条件获得在图10和图12中显示的代表性色谱图和代表性质谱：
LC条件
柱：DEAP HPCM1.7μm(相1A)2.1×150mm
流动相A：水
流动相B：100mM甲酸/100mM甲酸铵溶于40:60水/乙腈
柱温：60℃
进样量：3μL(胎球蛋白聚糖)，4μL(人IgG聚糖)
样品浓度：来自0.17μg胎球蛋白/μL的聚糖(胎球蛋白聚糖)，10pmol/μl(人IgG聚糖)
样品稀释剂：在5％乙腈(胎球蛋白聚糖)、水(人IgG聚糖)中的200mM乙酸铵
荧光检测：Ex 265nm/Em 425nm(10Hz)
梯度表：
MS条件
实施例10
在方法的初始条件期间增加离子强度以改善标记聚糖的分离
已使用DEAP固定相(图10)获得两个示例性分离，如下所述。图10A示出了用于标记的hIgG N-聚糖的色谱图，其中在所述单-和二-唾液酸化的结构(S1和S2结构)之间实现了优异的分离度。另一方面，与其他材料(参见图7A)相比，中性结构以稍低的分离度分离，但是在梯度的初始条件期间实现较高的离子强度可增加DEAP固定相上的分离度，尤其是相对于非岩藻糖基化的和等分的GlcNAc(N-乙酰葡糖胺)结构(图11)。虽然不限于理论，但据信在分离的初始步骤中的一些离子强度有利地降低了带电表面反相材料的基础颗粒与标记后带有两亲强碱性部分的中性聚糖之间的离子排斥。图10B显示了使用DEAP分析来自牛胎球蛋白的高度唾液酸化的高触角标记聚糖的示例性结果。利用这种带电表面反相材料和开发的技术，可以实现非常高的分离度，尤其是对于主导色谱图的三唾液酸化三触角结构(S3)。该方法的突出能力是能够拆分对应于三唾液酸化(S3)结构的保留时间窗口前面的精细结构。通过MS分析，该色谱精细结构已被确认为对应于S3物质的+16Da形式，其通常可归因于存在已知为N-羟乙酰基神经氨酸NGNA(与N-乙酰基神经氨酸NANA比较)的非人类唾液酸形式(图10B插图)。这是本发明的非常重要的能力，因为含有N-羟乙酰基神经氨酸的唾液酸化聚糖如果存在于生物药物上，则可能在患者中引起免疫原性反应。8还发现含有N-羟乙酰基神经氨酸的唾液酸化聚糖是与长期食用红肉有关的生物标志物9，并且它们的存在已被认为是癌症风险因素。鉴于与使用带电表面反相材料相关的独特选择性，断言该技术可被进一步优化以使含有N-羟乙酰基神经氨酸的聚糖物质实现甚至更高的分离度并非不合理。毫无疑问，即使它们以较低的相对丰度存在于样品中，拥有监测这些物质的灵敏技术也很有价值。
使用DEAP HPCM带电表面反相材料的一个优点是，用两亲强碱性残基标记的聚糖的最佳色谱条件恰好也是通过ESI+MS进行分析的合适条件。例如，可使用DEAP HPCM固定相分析来自牛胎球蛋白的标记聚糖，从而实现对于荧光和MS检测两者而言相当的信噪比(图12)。还值得注意的是，两个色谱图中的峰值曲线非常一致。此外，可从这些分析中提取的质谱在表现出高信噪比方面确实是示例性的(图12B)。
在梯度的初始条件期间使用在离子强度上变化的方法分离标记的人IgG N-聚糖。使用DEAP HPCM柱和Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio LC系统对样品进行LC-荧光分析。使用以下方法条件获得在图11中显示的色谱图：
LC条件
柱：Waters DEAP HPCM1.7μm(相1A)2.1×150mm
流动相A：水
流动相A(1)：2.5mM甲酸铵/2.5mM甲酸
流动相A(2)：5mM甲酸铵/5mM甲酸
流动相B(3)：100mM甲酸/100mM甲酸铵溶于40:60
水/乙腈
柱温：60℃
进样量：4μL
样品浓度：10pmol/μL
样品稀释剂：水
荧光检测：Ex 265nm/Em 425nm(10Hz)
梯度表：
实施例11
用各种两亲强碱性部分标记的释放胎球蛋白聚糖的优化分离
普鲁卡因和普鲁卡因胺标记的N-聚糖由牛胎球蛋白(Sigma F3004)根据先前发布的方案(Lauber,M.A.；Yu,Y.Q.；Brousmiche,D.W.；Hua,Z.；Koza,S.M.；Magnelli,P.；Guthrie,E.；Taron,C.H.；Fountain,K.J.，“Rapid Preparation of Released N-Glycansfor HILIC Analysis Using a Labeling Reagent that Facilitates SensitiveFluorescence and ESI-MS Detection。”Anal Chem 2015年，第87卷第10期，第5401-5409页)制备，随后使用DEAP HPCM1.7μm(相1A)柱和Waters ACQUITY UPLC H-Class BioLC系统进行LC-荧光-MS分析。使用实施例9中所列的方法条件获得在图13中显示的代表性色谱图。普鲁卡因(标记试剂-2)标记的聚糖的荧光检测器波长为Ex 295nm/Em 335nm，而普鲁卡因胺(标记试剂-3)标记的聚糖的荧光检测器波长为Ex 265nm/Em 345nm。
标记试剂-2(“即用型普鲁卡因”)
标记试剂-3(“即用型普鲁卡因胺”)
实施例12
对应于使用DEAP HPCM与GlycanPac AXR-1柱分离标记的人IgG和胎球蛋白N-聚糖 的比较例
作为本发明一部分描述的方法和材料不同于Liu、Aich和Pohl先前在美国专利申请公布号US20140178912中描述的阴离子交换混合模式材料和聚糖分析方法。在阴离子交换的反相材料的示例性实施方案中，Liu、Auch和Pohl定义了固定相(相21)，该固定相通过与由亲水性酰胺基团封端的中性十碳烷基链构成的一个配体和由二甲基化叔胺封端的十一碳烷基链组成的第二配体结合而形成。
据信，相21已可以以GlycanPac AXR-1柱(即Thermo Scientific目录号088136)的形式从赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)商购获得。在此，将使用DEAP HPCM实现的色谱分离与使用GlycanPac AXR-1获得的色谱分离进行对比。图14显示了使用带电表面反相材料(DEAP HPCM，相1A)在其最佳使用条件下对标记的hIgG聚糖的分离，并且与可商购获得的混合模式GlycanPac AXR-1柱在相同使用条件下以及为改善这些类型聚糖的性能而定制的其他柱相比较。
与已建立的荧光检测技术相当的标记聚糖的MS检测使得能够以任一检测模式获得相似的色谱曲线。目前，MS检测器仍未在QC实验室中常规使用。所标记的标记试剂的强碱性部分和喹啉环结构是在MS模式和荧光模式下提供类似信噪比的关键。该试剂特性使得能够立即探询在QC测试期间可能观察到的未知峰。MS可以在QC实验室中使用的确切条件下运行的支持设施中检查相同的样品。伴随使用该标签和本公开中描述的带电表面材料能够进行直接的样品探询，否则可能需要用MS兼容试剂重新标记样品、开发LC方法和鉴定未知峰。用强碱性部分标记的聚糖对于用GlycanPac AXR-1柱进行最佳分离具有挑战性。将可电离改性剂基团(在这种情况下为叔胺)置于相21上的配体末端(并且可能是GlycanPac AXR-1相，参见图16)突出了柱的离子交换特性，这不利于用带正电的标签分离聚糖。可增加流动相的离子强度以减轻离子排斥并增加保留，但这也会减轻在唾液酸化聚糖的类分离中所期望的离子吸引。带电表面反相材料经过优化，以在低离子强度条件下(灵敏MS分析所需)提供良好的峰形(实现高分离度)和保留度(选择性分离带电分析物所必需的)。10-13图14清楚地说明了带电基团放置在表面上与放置在配体末端相比的影响。请注意，虽然标记的hIgG聚糖被DEAP HPCM(相1A)材料强烈保留并很好地拆分，但当它们注入到GlycanPac AXR-1柱上并在相同条件下分离时，它们在空隙中洗脱。很明显，这些用两亲强碱性部分标记的聚糖被GlycanPac AXR-1固定相非常强烈地排斥，其排斥程度与商购获得的HPCM固定相和DEAPHPCM固定相在大小上明显不同。此外，发现当在分离的初始步骤期间使用高离子强度条件时，对于本发明重要的聚糖只能保留在GlycanPac AXR-1柱上；即便如此，保留度和分离度对于分析而言仍然不足。值得注意的是，标记的三-和四-唾液酸化聚糖更好地保留在GlycanPac AXR-1固定相上。然而，即使在优化条件下使用时，GlycanPac AXR-1固定相产生的分离度也被观察到低于类似粒度DEAP HPCM(相1A)产生的分离度(图15)。据信，GlycanPac AXR-1材料的性能较差是由于其可电离改性剂的定位和可接近性(图16)。在美国专利申请公布号US20140178912的相21上，叔胺可电离改性剂位于配体的末端，其长度与另一个丰度更高的中性基团相等，该中性基团本身由烷基链和酰胺端基构成。因此，键合相和流动相的界面自身将具有正电位。此外，界面将以极性酰胺端基为主导。正是相21的这些属性被认为是造成对用两亲强碱性残基改性的聚糖的不良适用性的原因。
条件
这里使用实施例9中提供的条件，以使用DEAP HPCM固定相产生标记的人IgG和胎球蛋白N-聚糖的示例性分离。还使用如图14和图15所示的相同方法条件，使用ThermoScientific GlycanPac AXR-1柱进行分离。此外，为了优化使用GlycanPac AXR-1柱来分离标记的人IgG N-聚糖，采用以下条件：
LC条件
梯度表：
MS条件
以引用方式并入
本文引用的所有专利、公布的专利申请和其他参考文献的全部内容均据此明确地全文以引用方式并入本文。
等同形式
本领域技术人员将认识到或者仅使用常规实验便能确定本文所述具体程序的许多等同形式。这样的等同形式被认为是在本发明的范围内并由以下权利要求书所涵盖。

Claims (11)

1.一种从样品中选择性分离聚糖的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使包含聚糖的样品与标记试剂反应以产生标记的聚糖样品；
b)将所述标记的聚糖样品上样到色谱分离装置上，所述色谱分离装置包括包含色谱表面的高纯度色谱材料，其中所述色谱表面是带电的并且包含疏水表面基团和一种或多种可电离改性剂，条件是当所述可电离改性剂不含两性离子时，所述可电离改性剂不含季铵离子部分，使得所述标记的聚糖选择性地吸附到所述高纯度色谱材料上，其中所述一种或多种可电离改性剂含有羧酸基、磺酸基、芳基磺酸基、磷酸基、硼酸基、氨基、吡啶基、咪唑基、脒基、胍基或氨基硅烷基；以及
c)使用同步梯度，使包含有机溶剂和缓冲液溶剂的溶剂相通过色谱分离装置，以通过与色谱材料的带电色谱表面相互作用，从所述样品中分离所述标记的聚糖；以及
d)从所述高纯度色谱材料中洗脱吸附的标记的聚糖，从而从所述样品中选择性分离所述标记的聚糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚糖为N-聚糖或O-聚糖。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚糖为hIgG聚糖、胎球蛋白聚糖、FA2BG2S2、FA2G2S1或FA2G2。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚糖标记试剂为MS-活性的快速荧光标记化合物；普鲁卡因胺试剂或普鲁卡因试剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚糖标记试剂提供Log P值介于0和5之间的两亲强碱性部分。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚糖标记试剂提供pKa值大于6的两亲强碱性部分。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚糖标记试剂为具有下式的试剂：
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述高纯度色谱材料还包含色谱芯材料。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述色谱表面上的所述可电离改性剂通过使所述色谱表面与选自具有以下各式的可电离改性试剂反应来提供：式(I)、
式(II)、
式(III)，
或它们的组合
其中
m为1-8的整数；
V为0或1；
当V为0时，m'为0；
当V为1时，m'为1-8的整数；
Z表示化学反应性基团，选自
-OH、-OR6、胺、烷基胺、二烷基胺、异氰酸酯、酰氯、三氟甲磺酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、碳酸咪唑、NHS-酯、羧酸、酯、环氧化物、炔烃、烯烃、叠氮化物、-Br、-Cl或-I；
Y为嵌入式极性官能团；
每次出现的R1独立地表示硅上的化学反应性基团，包括-H、-OH、-OR6、二烷基胺、三氟甲磺酸酯、Br、Cl、I、乙烯基、烯烃或-(CH2)m-Q；
每次出现的Q为-OH、-OR6、胺、烷基胺、二烷基胺、异氰酸酯、酰氯、三氟甲磺酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、碳酸咪唑、NHS-酯、羧酸、酯、环氧化物、炔烃、烯烃、叠氮化物、-Br、-Cl或-I；
m”为1-8的整数
p为1-3的整数；
每次出现的R1’独立地表示F、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基或C1-C18杂芳基、氟代烷基或氟代芳基；
每次出现的R2、R2’、R3和R3’独立地表示氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C2-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基或C4-C18杂芳基、-Z或具有式-Si(R’)bR”a或-C(R’)bR”a的基团；
a和b各自表示0至3的整数，前提条件是a+b＝3；
R'表示C1-C6直链、环状或支链烷基；
R”为选自以下各项的官能化基团：烷基、烯基、炔基、芳基、氰基、氨基、二醇、硝基、酯、阳离子或阴离子交换基团、含有嵌入式极性官能团和手性部分的烷基或芳基；
R4表示氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基或C1-C18杂芳基；
R5表示氢、C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基或C1-C18杂芳基；
每次出现的R6独立地表示C1-C18烷基、C2-C18烯基、C2-C18炔基、C3-C18环烷基、C1-C18杂环烷基、C5-C18芳基、C5-C18芳氧基或C1-C18杂芳基；
Het表示包含至少一个氮原子的杂环或杂芳基环系；并且
A表示酸性可电离改性剂部分或双电荷可电离改性剂部分。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水表面基团是C4至C30键合相、芳族、苯基烷基、氟-芳族、苯基己基或五氟苯基烷基。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述色谱芯材料为二氧化硅材料或杂化无机/有机材料。
CN202310817329.6A 2016-04-24 2017-04-21 用于对用两亲强碱性部分改性的聚糖进行分析的带电表面反相色谱材料方法 Pending CN117054585A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662326783P 2016-04-24 2016-04-24
US62/326783 2016-04-24
PCT/US2017/028856 WO2017189357A2 (en) 2016-04-24 2017-04-21 Charged surface reversed phase chromatographic materials method for analysis of glycans modified with amphipathic, strongly basic moieties
CN201780031836.XA CN109154604B (zh) 2016-04-24 2017-04-21 用于对用两亲强碱性部分改性的聚糖进行分析的带电表面反相色谱材料方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780031836.XA Division CN109154604B (zh) 2016-04-24 2017-04-21 用于对用两亲强碱性部分改性的聚糖进行分析的带电表面反相色谱材料方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117054585A true CN117054585A (zh) 2023-11-14

Family

ID=60161044

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780031836.XA Active CN109154604B (zh) 2016-04-24 2017-04-21 用于对用两亲强碱性部分改性的聚糖进行分析的带电表面反相色谱材料方法
CN202310817329.6A Pending CN117054585A (zh) 2016-04-24 2017-04-21 用于对用两亲强碱性部分改性的聚糖进行分析的带电表面反相色谱材料方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780031836.XA Active CN109154604B (zh) 2016-04-24 2017-04-21 用于对用两亲强碱性部分改性的聚糖进行分析的带电表面反相色谱材料方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20200332028A1 (zh)
EP (1) EP3449253A4 (zh)
JP (1) JP7005515B2 (zh)
CN (2) CN109154604B (zh)
WO (1) WO2017189357A2 (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11709155B2 (en) 2017-09-18 2023-07-25 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved chromatography of metal interacting analytes
US11173418B2 (en) 2018-07-11 2021-11-16 Waters Technologies Corporation Materials and methods for trap-elute mixed mode chromatography
TW202012926A (zh) * 2018-07-13 2020-04-01 美商再生元醫藥公司 醣基化肽之偵測及定量
US11994499B2 (en) * 2019-02-27 2024-05-28 Waters Technologies Corporation Coated flow path components for chromatographic effects
US20200406252A1 (en) * 2019-06-26 2020-12-31 Waters Technologies Corporation Coatings with immobilized affinity ligands and enzymes and use thereof in liquid chromatography assays
WO2021092328A1 (en) * 2019-11-07 2021-05-14 Waters Technologies Corporation Materials and methods for mixed mode, anion exchange reversed phase liquid chromatography
CN114787622A (zh) 2019-12-05 2022-07-22 沃特世科技公司 用于提高回收率并将系统损失减到最小的聚膦酸
US20210255196A1 (en) * 2020-01-17 2021-08-19 Waters Technologies Corporation Low binding surfaces for peptide mapping
US11918936B2 (en) 2020-01-17 2024-03-05 Waters Technologies Corporation Performance and dynamic range for oligonucleotide bioanalysis through reduction of non specific binding
EP4147041A1 (en) * 2020-05-05 2023-03-15 Waters Technologies Corporation Liquid chromatography based detection and quantitation of phospho prodrugs and their active metabolites
CN112945925B (zh) * 2021-02-07 2022-07-05 中国科学院新疆理化技术研究所 一种香豆素基探针检测高锰酸根的方法
EP4364840A1 (en) * 2021-06-29 2024-05-08 Resonac Corporation Filler and manufacturing method therefor, and column for size exclusion chromatography
CN113466391B (zh) * 2021-08-12 2022-08-05 深圳波顿香料有限公司 同时测定发酵液中乳糖酸与葡萄糖酸钠含量的方法

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0650306B2 (ja) * 1985-06-03 1994-06-29 ガスクロ工業株式会社 シリカゲル系充填剤の改良法
US5296599A (en) 1991-09-19 1994-03-22 Millipore Corporation Activated carbamates compounds
US5268097A (en) * 1992-06-19 1993-12-07 Sepracor Inc. Passivated and stabilized porous mineral oxide supports and method for the preparation and use of same
US6524863B1 (en) * 1999-08-04 2003-02-25 Scynexis Chemistry & Automation, Inc. High throughput HPLC method for determining Log P values
DE60102327T3 (de) * 2000-08-11 2012-07-05 Rohm And Haas Co. Polymerabsorbentien und zugehöriges Herstellungsverfahren
WO2003069328A1 (fr) 2002-02-14 2003-08-21 Ajinomoto Co., Inc. Procede d'analyse aminofonctionnelle et reactif analytique
US7125488B2 (en) 2004-02-12 2006-10-24 Varian, Inc. Polar-modified bonded phase materials for chromatographic separations
WO2005116629A1 (ja) 2004-05-26 2005-12-08 Ajinomoto Co., Inc. アミノ官能性化合物の分析方法及び装置
DK2252584T3 (en) 2008-02-04 2017-01-16 Prozyme Inc COMPOUNDS AND PROCEDURES FOR QUICK LABELING OF N-GLYCANS
EP2153877A1 (de) * 2008-07-30 2010-02-17 MERCK PATENT GmbH Mischpfropfpolymere für die Ionenaustauschchromatographie
CN101498697A (zh) * 2009-02-25 2009-08-05 中国海洋大学 一种用液相色谱法测定羧甲基壳聚糖中杂质的方法
US10159911B2 (en) * 2009-08-04 2018-12-25 Waters Technologies Corporation High purity chromatographic materials comprising an ionizable modifier
IN2012DN00363A (zh) * 2009-08-04 2015-08-21 Waters Technologies Corp
MX2012003404A (es) 2009-09-22 2012-09-12 Volker Sandig Procedimiento para producir moleculas que contienen estructuras de glicano especializadas.
EP3974412A1 (en) 2011-09-28 2022-03-30 Waters Technologies Corporation Rapid fluorescence tagging of glycans and other biomolecules with enhanced ms signals
JP6189218B2 (ja) * 2011-12-15 2017-08-30 旭化成株式会社 タンパク質吸着材を製造する方法
WO2013173494A1 (en) * 2012-05-15 2013-11-21 Waters Technologies Corporation Chromatographic materials
CN102759596B (zh) * 2012-07-09 2014-08-20 山东大学 一种低分子肝素的离子对反相色谱质谱联用检测方法
EP2745905A1 (en) * 2012-12-21 2014-06-25 ThyssenKrupp Uhde GmbH Process for the purification of carboxylic acids by subcritical or supercritical fluid chromatography
EP3054295B1 (en) * 2013-09-30 2022-04-20 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Method for detecting and determining quantity of galacto-oligosaccharides
US10119944B2 (en) * 2013-12-24 2018-11-06 Waters Technologies Corporation Materials for hydrophilic interaction chromatography and processes for preparation and use thereof for analysis of glycoproteins and glycopeptides
EP3137474B1 (en) * 2014-04-30 2019-02-06 Beckman Coulter, Inc. Glycan sample preparation
JP6774748B2 (ja) * 2014-08-13 2020-10-28 ウオーターズ・テクノロジーズ・コーポレイシヨン 強められたｍｓ信号を有するグリカンおよび他の生体分子の迅速蛍光タグ付け
CN104785230B (zh) * 2015-03-27 2017-04-12 武汉大学 一种两性键合硅胶固定相及其制备方法和应用
US20180094293A1 (en) * 2016-10-03 2018-04-05 Waters Technologies Corporation Labeled glycan amino acid complexes useful in lc-ms analysis and methods of making the same

Also Published As

Publication number Publication date
CN109154604A (zh) 2019-01-04
US20200332028A1 (en) 2020-10-22
EP3449253A4 (en) 2019-12-25
JP7005515B2 (ja) 2022-02-10
JP2019516969A (ja) 2019-06-20
WO2017189357A2 (en) 2017-11-02
EP3449253A2 (en) 2019-03-06
WO2017189357A3 (en) 2017-12-21
CN109154604B (zh) 2023-07-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109154604B (zh) 用于对用两亲强碱性部分改性的聚糖进行分析的带电表面反相色谱材料方法
US10974167B2 (en) High purity chromatographic materials comprising an ionizable modifier
EP3288658B1 (en) High purity chromatographic materials comprising ion paired-bonded phases for supercritical fluid chromatography
US11059026B2 (en) Chromatographic materials
EP4129466A1 (en) High purity chromatrographic materials comprising an ionizable modifier
US7125488B2 (en) Polar-modified bonded phase materials for chromatographic separations
US20230256413A1 (en) High purity chromatographic materials comprising an ionizable modifier for retention of acidic analytes
EP2714225B1 (en) Method of separation of lipid and biological molecular species using high purity chromatographic materials
JP2018021929A (ja) サイズ排除クロマトグラフィーを行うための装置および方法
WO2019067632A1 (en) LIQUID CHROMATOGRAPHY SEPARATION OF GLUCIDIC TAUTOMERS

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination