CN113466391B - 同时测定发酵液中乳糖酸与葡萄糖酸钠含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明所提出的同时测定发酵液中乳糖酸与葡萄糖酸钠含量的方法；因为该两种物质本身就存在共性交叉，且属于复杂样品，常规技术手段难以做到同时分离，而采用超高液相色谱与蒸发光散射检测法，并特殊选定了色谱柱AQ C18柱(4.6×250mm,5μm)；Luna C18柱(4.6×250mm,5μm)串联使用；并设计梯度流动相进行洗脱，使得乳糖酸与葡萄糖酸钠能够较好析出；所选出流动相可以将复杂样品中的杂质进行分离；以此来做到同时测定发酵液中乳糖酸与葡萄糖酸钠含量。

Description

同时测定发酵液中乳糖酸与葡萄糖酸钠含量的方法
技术领域
本发明涉及发酵液中同时对两种成分的定量分析技术领域，尤其涉及一种同时测定发酵液中乳糖酸与葡萄糖酸钠含量的方法。
背景技术
乳糖酸和葡萄糖酸在食品、日化等领域中的应用较为广泛；乳糖酸的结构决定了其特殊的功效,既有类似果酸的功效(剥离角质、去黑头粉刺、预防和减轻闭口、收缩毛孔、祛痘等)，又有抗氧化、抗衰、美白等功效；而葡萄糖酸钠在食品风味中的应用更是一绝,在应用中有显著掩盖大豆蛋白臭、鱼臭、及掩盖镁、铁、锌等微量金属元素，特别是镁的特有苦味效果,适合添加到饮料及健康食品中。所以测定发酵液中两种成分含量的变化,对揭示其代谢途径以及控制发酵过程，进而从代谢工程角度改良菌种和优化发酵工艺条件具有重要的意义。
葡萄糖酸钠是一种有机酸钠盐，是葡萄糖酸(是以含有葡萄糖的物质为原料，采用发酵法先同葡萄糖制得葡萄糖酸)由氢氧化钠进行中和而成；乳糖酸由一分子半乳糖和一分子葡萄糖酸连接而成的多羟基生物酸；两组分极易溶于水，且在分子结构中有共同的葡萄糖酸分子，也是造成难以分离的重要因素根源所在；因此在现有技术中，只能通过对其中一种物质进行单独测定，且只提及了对葡萄糖酸钠的检测，而没有提及到乳糖酸的检测；更没有得到和开发出能够同时测定两种物质的方法；而同时测定两种物质的含量，在工业生产和产品检验上都具有重大意义，因此亟需一种可以同时对发酵液中乳糖酸和葡萄糖酸钠进行测定的方法。
发明内容
针对上述技术中存在的如:还未有一种高效、快速同时测定发酵液中乳糖酸与葡萄糖酸钠含量的方法。
具体为一种同时测定发酵液中乳糖酸与葡萄糖酸钠含量的方法，包括以下步骤:
(1)对照工作溶液配制
称取乳糖酸与葡萄糖酸钠标准品，并用去离子水定容于25mL容量瓶中，使其浓度约为0.5mg/mL，做为标准母液；再精密量标准母液取0.5mL，1mL，3mL，5ml至10mL容量瓶中，用去离子水分别稀释并定容，即得各系列标准溶液；
(2)待测品制备
精密称取发酵乳样品约1.0000g定容至25mL的容量瓶中，用水振荡溶解稀释；将其中2mL的样品溶液置于离心管中，并在8000r/min下离心5min后，再用0.20μm微孔滤膜过滤，滤液供液相色谱检测；
(3)液相色谱分析
采用超高效液相色谱仪对步骤(1)得到的梯度浓度对照工作液和步骤(2)得到的滤液进行分析，利用ELSD检测器进行检测；
色谱条件：色谱柱AQ C18柱，规格4.6×250mm,5μm；和Luna C18柱，规格4.6×250mm,5μm串联使用：
流动相条件：A相为甲醇：0.1％甲酸＝5：95，B相为0.1％甲酸甲醇溶液，C相为乙腈；梯度条件如下表：
Figure GDA0003690992870000021
流速：0.3mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；漂移管温度：65℃；增益：400；气体流量：32psi；喷雾器：冷却状态；
空白实验组为用水作空白过0.2μm滤膜得到滤液，对滤液进行上述步骤测定。
作为优选，对照品为色谱级别。
本发明的有益效果是:本发明所提出的同时测定发酵液中乳糖酸与葡萄糖酸钠含量的方法；因为该两种物质本身就存在共性交叉，且属于复杂样品，常规技术手段难以做到同时分离，而采用超高液相色谱与蒸发光散射检测法，并特殊选定了色谱柱AQ C18柱(4.6×250mm,5μm)；Luna C18柱(4.6×250mm,5μm)串联使用；并设计梯度流动相进行洗脱，使得乳糖酸与葡萄糖酸钠能够较好析出；所选出流动相可以将复杂样品中的杂质进行分离；以此来做到同时测定发酵液中乳糖酸与葡萄糖酸钠含量。
附图说明
图1为本发明单色谱柱AQ C18柱实施例的液相色谱图；
图2为本发明单色谱柱Luna C18柱实施例的液相色谱图；
图3为本发明对照品的液相色谱图；
图4为本发明1号发酵液的液相色谱图；
图5为本发明2号发酵液的液相色谱图；
图6为本发明3号发酵液的液相色谱图；
图7为本发明4号发酵液的液相色谱图；
图8为本发明5号发酵液的液相色谱图；
图9为本发明6号发酵液的液相色谱图。
具体实施方式
为了更清楚地表述本发明，下面结合实施例对本发明作进一步地描述。
经多次实验结果表明，使用任何一根单一色谱柱，因其分离的作用力过小，无法将这两个组分进行完全分离。为了实现这一分离，用到柱子的串联，是想通过加大组分与柱填料的表面积，来加大分离的作用力，从而起到分离的作用。
实施例1
一种同时测定发酵液中乳糖酸与葡萄糖酸钠含量的方法，包括以下步骤:
(1)对照工作溶液配制
称取乳糖酸与葡萄糖酸钠标准品，并用去离子水定容于25mL容量瓶中，使其浓度约为0.5mg/mL，做为标准母液；再精密量标准母液取0.5mL，1mL，3mL，5ml至10mL容量瓶中，用去离子水分别稀释并定容，即得各系列标准溶液；
(2)待测品制备
精密称取发酵乳样品约1.0000g定容至25mL的容量瓶中，用水振荡溶解稀释；将其中2mL的样品溶液置于离心管中，并在8000r/min下离心5min后，再用0.20μm微孔滤膜过滤，滤液供液相色谱检测；
(3)液相色谱分析
采用超高效液相色谱仪对步骤(1)得到的梯度浓度对照工作液和步骤(2)得到的滤液进行分析，利用ELSD检测器进行检测；
色谱条件：色谱柱AQ C18柱(4.6×250mm,5μm)和Luna C18柱(4.6×250mm,5μm)串联使用：
流动相条件：A相为甲醇：0.1％甲酸＝5：95，B相为0.1％甲酸甲醇溶液，C相为乙腈；梯度条件如下表1：
表1
Figure GDA0003690992870000041
流速：0.3mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；漂移管温度：65℃；增益：400；气体流量：32psi；喷雾器：冷却状态；
空白实验组为用水作空白过0.2μm滤膜得到滤液，对滤液进行上述步骤测定，上述所用的对照品为色谱级别。
正如本领域技术人员的一般认知，葡萄糖酸钠是一种有机酸钠盐，是葡萄糖酸(是以含有葡萄糖的物质为原料，采用发酵法先同葡萄糖制得葡萄糖酸)由氢氧化钠进行中和而成；乳糖酸由一分子半乳糖和一分子葡萄糖酸连接而成的多羟基生物酸；两组分极易溶于水，且在分子结构中有共同的葡萄糖酸分子，也是造成难以分离的重要因素根源所在；经多次实验结果表明，使用任何一根单一色谱柱，因其分离的作用力过小，无法将这两个组分进行完全分离。为了实现这一分离，用到柱子的串联，是想通过加大组分与柱填料的表面积，来加大分离的作用力，从而起到分离的作用。实验表明：通过将一根AQ C18柱与一根Luna C18柱的串联使用即可实现将两组分分离的目的；但是单根AQ C18柱或者Luna C18柱均无法做到基线的分离，如图1-图2。可见现有技术中常规选择无法达到目的。
将上述步骤(1)中的各浓度梯度的混合标准溶液按照方法流程进行测定得到图3的色谱图；同时对六个批次的发酵液进行测定；得到如图4-图9的液相色谱图；根据对照品的液相色谱图的出峰时间可以知道，每种物质的出峰时间并不重叠，但是非常紧凑，并且可以很快速准确的被分离检测到；所以在图4-图9可以判断出各物质的反应峰，从而利用保留时间和峰面积进行定性定量的分析；六批次发酵液的检测结果如下表2：
表2
名称 乳糖酸/mg·g-1 葡萄糖酸钠/mg·g-1
一号发酵液样品 22.61 12.88
二号发酵液样品 ND 21.20
三号发酵液样品 ND 16.81
四号发酵液样品 ND 11.39
五号发酵液样品 5.34 14.59
六号发酵液样品 ND 34.95
注：ND，表示未检出。
本发明的优势在于:
1)本发明建立了一种利用超高液相色谱配备ELSD检测器快速检测同时测定发酵液中乳糖酸与葡萄糖酸钠含量的方法，能够准确地进行定量，为不同类物质的准确判定、快速检测提供科学依据；
2)本发明中的处理流程选择对各种物质达到了优异的分离效果；
3)采用了双柱串联的方式，达到对有重合共性的物质进行精准分离。
以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种同时测定发酵液中乳糖酸与葡萄糖酸钠含量的方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)对照工作溶液配制
称取乳糖酸与葡萄糖酸钠标准品，并用去离子水定容于25mL容量瓶中，使其浓度约为0.5mg/mL，做为标准母液；再精密量标准母液取0.5mL，1mL，3mL，5ml至10mL容量瓶中，用去离子水分别稀释并定容，即得各系列标准溶液；
(2)待测品制备
精密称取发酵乳样品约1.0000g定容至25mL的容量瓶中，用水振荡溶解稀释；将其中2mL的样品溶液置于离心管中，并在8000r/min下离心5min后，再用0.20μm微孔滤膜过滤，滤液供液相色谱检测；
(3)液相色谱分析
采用超高效液相色谱仪对步骤(1)得到的梯度浓度对照工作液和步骤(2)得到的滤液进行分析，利用ELSD检测器进行检测；
色谱条件：色谱柱为AQ C18柱，规格4.6×250mm,5μm；和Luna C18柱，规格4.6×250mm,5μm串联使用：
流动相条件：A相为甲醇：0.1％甲酸＝5：95，B相为0.1％甲酸甲醇溶液，C相为乙腈；梯度条件如下表：
Figure FDA0003690992860000011
流速：0.3mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；漂移管温度：65℃；增益：400；气体流量：32psi；喷雾器：冷却状态；
空白实验组为用水作空白过0.2μm滤膜得到滤液，对滤液进行上述步骤测定。
2.根据权利要求1所述的同时测定发酵液中乳糖酸与葡萄糖酸钠含量的方法，其特征在于，对照品为色谱级别。
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