CN117025727A - 一种金属有机框架颗粒-磁珠体系的高灵敏核酸检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种金属有机框架颗粒‑磁珠体系的高灵敏核酸检测方法，包括：(1)先将待检测溶液加入至试剂A中混合，再加入试剂B中进行孵育，然后利用磁铁进行分离并加入超纯水中，得到混合液；(2)将单线态氧指示剂溶液加至混合液中并测试其在426nm处吸光度，记为第一吸光度；(3)经过激光照射处理后，二次测试其在426nm处吸光度，记为第二吸光度；(4)根据第一吸光度和第二吸光度的差值，计算DPBF分解量及其分解率(DPBF分解率＝(第一吸光度‑第二吸光度)/第一吸光度))。
Description
技术领域
本发明涉及一种非扩增的核酸检测方法，具体涉及一种金属有机框架颗粒-磁珠体系的高灵敏核酸检测方法，属于分子体外诊断与生化分析研究领域。
背景技术
核酸作为生物重要的遗传信息载体，广泛的存在生物体中，是生物体的最基本信息，核酸检测在基础的生化研究到临床应用等各个领域变得越来越重要。例如病毒核酸检测，对疾病的传播筛查和临床诊断中发挥着至关重要的作用。
目前的核酸主要的检测手段是实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法，但其有操作复杂，检测时间长(2-4小时)；检测专业，对操作人员要求较高；仪器设备和试剂昂贵，单人检测成本高等缺点。
发明内容
为此，本发明提供了一种非诊断和治疗目的的高灵敏核酸检测方法，包括：
(1)先将待检测溶液加入至试剂A中混合，再加入试剂B中进行孵育，然后利用磁铁进行分离并加入超纯水中，得到混合液；
(2)将单线态氧指示剂溶液加至混合液中并测试其在426nm处吸光度，记为第一吸光度；
(3)经过激光照射处理后，二次测试其在426nm处吸光度，记为第二吸光度；
(4)根据第一吸光度和第二吸光度的差值，计算DPBF分解量及其分解率(DPBF分解率＝(第一吸光度-第二吸光度)/第一吸光度)。
较佳的，所述试剂A为金属有机框架颗粒@DNA1溶液，试剂B为Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2溶液。
本发明中，为了检测特定序列的RNA链段，在卟啉基金属有机框架颗粒PCN-224和四氧化三铁颗粒Fe3O4-SiO2-NH2表面分别修饰能够和目标RNA互补配对的碱基序列，卟啉基金属有机框架颗粒PCN-224的配体卟啉能够在特定波长的激发下产生单线态氧，利用单线态氧指示剂可间接获得PCN-224含量；另外磁性四氧化三铁颗粒用于结合互补RNA序列进而富集PCN-224颗粒，使用特定波长激光激发富集的PCN-224颗粒，指示剂变化可代表特定目标RNA的含量。
较佳的，所述金属有机框架颗粒@DNA1溶液的浓度为8～20μg/mL；所述金属有机框架颗粒@DNA1溶液的溶剂为DEPC水、超纯水、TE缓冲液中的至少一种。
较佳的，所述金属有机框架颗粒@DNA1中金属有机框架颗粒为PCN-224，DNA1为目标RNA互补配对的碱基序列1。
又，较佳的，所述目标RNA的序列为5`-AACUUCUCCUGCUAGAAUGGCUGGCAAUGGCGGUGAUGCUGCU-3`，所述DNA1的序列为5`-TTGAAGAGGACGATCTTACCGACCGT-3`。
较佳的，所述金属有机框架颗粒的粒径为80nm～110nm；所述DNA1和金属有机框架颗粒的质量比为(16～17)pM：1μg。
较佳的，所述Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2溶液的浓度为50～100μg/mL；所述Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2溶液的溶剂为DEPC水、超纯水、TE缓冲液中的至少一种。
较佳的，所述Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2中Fe3O4-SiO2-NH2为氨基化的包覆有SiO2层的四氧化三铁颗粒，所述Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2的总粒径为200～300nm。
又，较佳的，所述Fe3O4-SiO2-NH2中氨基化所用硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷中的至少一种；
所述Fe3O4-SiO2-NH2中SiO2层的厚度为5～20nm；
所述四氧化三铁颗粒的粒径为200～300nm。
较佳的，所述Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2中5`端羧基修饰的DNA2为目标RNA互补配对的碱基序列2；所述5`端羧基修饰的DNA2和Fe3O4-SiO2-NH2质量比为(6～15)pM：1μg。
又，较佳的，所述目标RNA的序列为5`-AACUUCUCCUGCUAGAAUGGCUGGCAAUGGCGGUGAUGCUGCU-3`，所述5`端羧基修饰的DNA2的序列为5`-COOH-AGCAGCATCACCGCCAT-3`；所述DNA2的序列为5`-AGCAGCATCACCGCCAT-3`。
较佳的，所述单线态氧指示剂为1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)、单线态氧荧光探针(SOSG)中的一种；所述单线态氧指示剂溶液的浓度为1～10mM；
待测液和试剂B的体积比为(0.02～0.05)：1；
所述试剂A和试剂B的体积比为(0.5～0.9)：1；
所述超纯水和试剂A的体积比为(0.5～1)：1；
所述述单线态氧指示剂溶液和试剂A的体积比为1：(100～300)。
较佳的，所述孵育的温度为20～37℃，时间为5～20分钟；
所述激光照射的参数包括：660nm的激光器，功率为500～1000mW，照射时间为4～10分钟；所述待测液为采样拭子棒采样后置于病毒裂解液中2～5分钟后提取所得。
较佳的，当分解率＞1.776％时，判定待检测溶液中有目标核酸存在，否则判定待检测溶液中不存在目标核酸。
另一方面，本发明提供了一种高灵敏核酸检测试剂盒，包括：试剂A和试剂B；其中试剂A为金属有机框架颗粒@DNA1溶液，试剂B为Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2溶液。
较佳的，还包括：单线态氧指示剂溶液、病毒提取液和拭子棒；
所述单线态氧指示剂为1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)、单线态氧荧光探针(SOSG)中的一种；所述单线态氧指示剂溶液的浓度为1～10mM；每份单线态氧指示剂溶液的体积为10～20μL；
所述病毒提取液的组分为Tris-HCl、DEPC水；所述Tris-HCl的pH＝6.0～6.5；DEPC水溶液DEPC含量为0.1wt％～0.15wt％；每份病毒提取液的体积为2～2.5mL。
较佳的，所述金属有机框架颗粒@DNA1溶液的浓度为8～20μg/mL；所述金属有机框架颗粒@DNA1溶液的溶剂为DEPC水(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)、超纯水、TE缓冲液中的至少一种；每份金属有机框架颗粒@DNA1溶液的体积为0.5～1mL。
较佳的，所述金属有机框架颗粒@DNA1中金属有机框架颗粒为PCN-224，DNA1为目标RNA互补配对的碱基序列1。又，较佳的，所述目标RNA的序列为5`-AACUUCUCCUGCUAGAAUGGCUGGCAAUGGCGGUGAUGCUGCU-3`，所述DNA1的序列为5`-TTGAAGAGGACGATCTTACCGACCGT-3`。
较佳的，所述金属有机框架颗粒的粒径为80nm～110nm；所述DNA1和金属有机框架颗粒的质量比为(16～17)pM：1μg。
较佳的，所述Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2溶液的浓度为50～100μg/mL；所述Fe3O4-SiO2-NH2@DNA2溶液的溶剂为DEPC水、超纯水、TE缓冲液中的至少一种；每份Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2溶液的体积为0.5～1mL。
较佳的，所述Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2中Fe3O4-SiO2-NH2为氨基化的包覆有SiO2层的四氧化三铁颗粒，所述Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2的总粒径为200～300nm。
又，较佳的，所述Fe3O4-SiO2-NH2中氨基化所用硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷中的至少一种；
所述Fe3O4-SiO2-NH2中SiO2层的厚度为5～20nm；
所述四氧化三铁颗粒的粒径为200～300nm。
较佳的，所述Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2中DNA2为目标RNA互补配对的碱基序列2；所述DNA2和Fe3O4-SiO2-NH2质量比为(6～15)pM：1μg。
又，较佳的，所述目标RNA的序列为5`-AACUUCUCCUGCUAGAAUGGCUGGCAAUGGCGGUGAUGCUGCU-3`，所述5`端羧基修饰的DNA2的序列为5`-COOH-AGCAGCATCACCGCCAT-3；所述DNA2的序列为5`-AGCAGCATCACCGCCAT-3`。
有益效果：
(1)本发明制备的PCN-224@DNA1-Fe3O4-SiO2-NH2@DNA2对特定目标核酸具有特异识别功能，结合酶标仪或者UV-Vis对样品中的目标核酸进行分析测定。对于不同浓度的目标核酸，其比色指示剂DPBF的分解率不同。目标核酸不存在时，指示剂分解率较低，这是由于体系无目标RNA，不能利用碱基互补配对使磁性Fe3O4-SiO2-NH2@DNA2结合PCN-224@DNA1，使用660nm激光无法使体系产生活性氧去氧化指示剂DPBF；
(2)本发明基于PCN-224@DNA1-Fe3O4-SiO2-NH2@DNA2构建一种基于一种金属有机框架颗粒-磁珠体系生物传感器并将其应用于病毒核酸的检测。重点解决了目前通用的RT-PCR法核酸检测存在的样品前处理过程繁琐，仪器昂贵，操作复杂，对人员要求高，成本高等缺点。本发明检测方式比较适宜临床快速筛查以及家庭诊断；
(3)本发明不仅限于实施的示例SARS-CoV-2RNA片段的定量及定性检测，可以设计不同互补核酸链段推广到任何一种DNA/RNA分子检测中。也就是说，本发明可针对不同的目标RNA设置不同的互补碱基序列，具有很好的通用性。
附图说明
图1为基于金属有机框架颗粒-磁珠体系核酸检测流程示意图；
图2为基于金属有机框架颗粒-磁珠体系核酸检测原理示意图；
图3中左图为合成的PCN-224颗粒扫描电子显微镜(SEM)图，形貌为球型，尺寸大概在90nm，分散良好；右图为合成的PCN-224@DNA1颗粒，形貌尺寸与未修饰颗粒相似；
图4中左图为合成的PCN-224颗粒扫描电子能能谱(SEM-EDS)图，右图为合成的PCN-224@DNA1颗粒扫描电子能能谱(SEM-EDS)图，修饰DNA1的PCN-224明显看出右DNA的特征元素P的出现，证明DNA1在PCN-224表面的成功负载；
图5为合成的Fe3O4-SiO2-NH2@DNA2颗粒透射电子显微镜(TEM)图，图中Si元素证明SiO2在颗粒表面的成功包覆，N元素证明包硅的颗粒表面成功胺化，P元素证明其表面DNA1的成功修饰；
图6为Fe3O4-SiO2-NH2以及Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2的傅里叶红外图谱，1410cm-1处的C-N键为酰胺反应的产物，1078cm-1处的P-O键证明5`端羧基修饰的DNA2的成功修饰；
图7为磁铁富集磁性四氧化三铁颗粒时间-效率图，从图中可知四氧化三铁磁珠在外磁场的作用下一分钟的富集率可达到97.96％，五分钟的富集率可达到99.6％；
图8为基于磁珠-金属有机框架核酸检测不同目标浓度指示剂DPBF分解率的分布图，其中、10aM测出结果与空白组相似率为0.566、100aM测出结果与空白组相似率为0.012、1fM测出结果与空白组的相似率为0.001、100fM测出结果与空白组相似率小于0.0001；
图9为模拟拭子检测图，从图中可知使用两批次共20个样本对100fM目标核酸对系统进行检测，不合格为1个，测出率为95％；
图10为检测试剂实物图。
具体实施方式
以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
本公开中，提供了一种卟啉基金属有机框架颗粒(PCN-224)-四氧化三铁磁珠(Fe3O4-SiO2-NH2)体系的高灵敏病毒核酸检测方法。通过在金属有机框架颗粒和四氧化三铁颗粒上分别修饰互补DNA1和DNA2用于特异性捕获病毒的目标RNA链段，利用目标RNA和DNA的互补特性，四氧化三铁磁珠捕获金属有机框架颗粒形成(PCN-224)-(Fe3O4-SiO2-NH2)体系，借助外磁场富集该体系，体系中PCN-224颗粒可在特定波长激光照射下产生活性氧使得指示剂发生显色变化放大检测信号，从而实现高灵敏核酸检测。该核酸检测方法具有操作简便，仪器要求少，无扩增，检测时间短和检测成本低等优点。
参见图1和图2，以下示例性地说明金属有机框架颗粒-磁珠体系的高灵敏核酸检测方法。
采用一锅法合成金属有机框架颗粒PCN-224，包括苯甲酸，氧氯化锆和内消旋-四(羧基苯基)-卟吩和N,N-二甲基甲酰胺加入广口瓶中搅拌均匀，90℃油浴加热5h，自然冷却后用N,N-二甲基甲酰胺洗涤，用水交换溶剂，得到PCN-224水溶液。其中苯甲酸的质量为2.4～3.2g，氧氯化锆的质量为300mg，内消旋-四(羧基苯基)-卟吩质量为50～150mg，N,N-二甲基甲酰胺体积为80～140ml。
针对模板核酸链段，将设计好的互补核酸链段DNA1与PCN-224颗粒混合，反应四小时，离心后去除未修饰的核酸，得到核酸修饰的PCN-224@DNA1。其中，合成DNA1修饰的PCN-224，具体步骤为：PCN-224溶液加入一定浓度的DNA1，混合均匀后再37℃充分反应4-8h，反应结束离心后去除上清液中多余的DNA1，得到DNA1负载的PCN-224。其中PCN-224与DNA1的质量比为5：1。
采用溶剂热法制备磁性四氧化三铁颗粒，表面包覆二氧化硅层并修饰氨基，得到氨基化的四氧化三铁颗粒。具体，包括：六水合氯化铁、无水乙酸钠、二水合柠檬酸三钠混合加入乙二醇，在水浴60℃加热搅拌使其溶解形成均一溶液后转至水热釜中，200℃反应时间6-10h，用乙醇洗涤三次后磁铁收集，真空干燥后，得到四氧化三铁颗粒Fe3O4；其中六水合氯化铁：无水乙酸钠：二水合柠檬酸三钠＝13：24：5，乙二醇的体积为60-100ml。合成的四氧化三铁颗粒、氨水、无水乙醇混合并超声均匀分散，边搅拌边缓慢加入正硅酸乙酯，室温下反应8h，离心收集产物后真空干燥，得到二氧化硅包覆的四氧化三铁颗粒Fe3O4-SiO2；其中四氧化三铁颗粒0.5-1g，30％氨水10ml，无水乙醇80-100ml。二氧化硅包覆的四氧化三铁颗粒、3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶解在异丙醇中，70℃搅拌8h，离心收集产物后在真空干燥，得到氨基化二氧化硅包覆的四氧化三铁颗粒Fe3O4-SiO2-NH2；其中二氧化硅包覆的四氧化三铁颗粒0.2-0.4g，3-氨基丙基三乙氧基硅烷为0.3ml，异丙醇为120-160ml。
利用5’端羧基修饰的DNA2与颗粒表面的氨基进行酰胺反应，外磁场收集后得到核酸修饰的四氧化三铁颗粒Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2。具体，包括：一定浓度DNA2加入EDC/NHS的MES缓冲液中37℃活化1h后加入羧基化四氧化三铁颗粒剧烈反应，反应结束后用磁铁吸附收集，DEPC水洗涤得到5`端羧基修饰的DNA2功能化的四氧化三铁颗粒Fe3O4-SiO2-NH2@DNA2。其中Fe3O4-SiO2-NH2：5`端羧基修饰的DNA2＝2：1，EDC/NHS浓度为0.1-1M，MES缓冲液的PH＝6。
将待测液加入核酸修饰的PCN-224@DNA1溶液以及四氧化三铁颗粒Fe3O4-SiO2-NH2@DNA2溶液中，混合十分钟后用磁铁分离洗去未结合颗粒后加入超纯水混合均匀。PCN-224@DNA1:Fe3O4-SiO2-NH2@DNA2：target RNA＝10：9：1。
在体系中加入单线态氧指示剂1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)，利用660nm激光照射并观测体系在426nm处吸光度变化。加入指示剂DPBF的体积为0.5％-2％。其在100fM目标核酸浓度的检出率可达95％。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
一种金属有机框架颗粒-磁珠体系的高灵敏核酸的检测方法所用的DNA及RNA序列：
一般引物是从5'端向3'端形成双链，双链解旋成单链则方向相反。本文中不涉及解旋酶，但是正常的引物片段是有方向的，5'和3'这个只是注明方向。
实施例2卟啉基金属有机框架颗粒PCN-224的制备：
将2.8g苯甲酸，300mg氧氯化锆和100mg内消旋-四(羧基苯基)-卟吩和100ml N,N-二甲基甲酰胺加入广口瓶中搅拌均匀，90℃油浴加热5h，自然冷却后用N,N-二甲基甲酰胺洗涤三次，用水交换溶剂，得到PCN-224水溶液。所述PCN-224的粒径为80～110nm。
实施例3DNA修饰的PCN-224溶液的制备：
将1ml、10μg/ml PCN-224加入2.5μl，100μM的DNA1，混合均匀后再37℃充分反应4h，反应结束后11000rpm离心后去除上清液中多余的DNA1，得到DNA1负载的PCN-224。
实施例4硅胺包覆的四氧化三铁纳米颗粒的制备：
采用溶剂热法合成磁性四氧化三铁颗粒，具体步骤为：
(1)2.6g六水合氯化铁、4.8g无水乙酸钠、1.0g二水合柠檬酸三钠加入80ml乙二醇，在水浴60℃加热搅拌使其溶解形成均一溶液后转至水热釜中，200℃反应时间10h，用磁铁吸附交换溶剂为乙醇，并用乙醇洗涤三次后磁铁收集，在60℃真空干燥6h，得到四氧化三铁颗粒Fe3O4；
(2)0.5g四氧化三铁颗粒，2ml氨水，20ml水以及80ml乙醇混合并超声均匀分散，边搅拌边缓慢加入正硅酸乙酯2ml，室温下反应8h，离心收集产物后在60℃真空干燥6h，得到二氧化硅包覆的四氧化三铁颗粒Fe3O4-SiO2；
(3)0.4g二氧化硅包覆的四氧化三铁颗粒加入0.3ml，3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶解在140ml异丙醇中，70℃搅拌8h，离心收集产物后在60℃真空干燥6h，得到氨基化二氧化硅包覆的四氧化三铁颗粒Fe3O4-SiO2-NH2；所述Fe3O4-SiO2-NH2中SiO2层的厚度约为5～20nm；所述四氧化三铁颗粒的平均粒径为200～300nm。
实施例5DNA修饰的四氧化三铁颗粒的制备：
100μM，12.5μl 5`端羧基修饰的DNA2加入0.3M EDC/NHS 1ml于37℃恒温箱活化1h后加入1mg羧基化四氧化三铁颗粒剧烈反应4h后，用磁铁吸附收集，DEPC水洗涤得到5`端羧基修饰的DNA2功能化的四氧化三铁颗粒Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2。
实施例6金属有机框架颗粒-磁珠体系核酸检测方法具体步骤如下：
(1)将采集到的样本取10μl加入90μl，8.8μg/ml的PCN-224@DNA1(试剂A)，后将试剂A加入100μl，100μg/ml的Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2中，孵育10分钟后利用磁铁吸附1分钟后缓慢吸去上清液。然后加入200μl超纯水，摇晃均匀。
(2)加入1μl，10mM DPBF溶液后测其在426nm处的初始吸光度，使用660nm激光器照射反应体系，激光功率500mW，照射时间10分钟。再次测量其在426nm处吸光度，比较二者吸光度差值，计算DPBF分解量，若分解率大于1.176％判断有目标核酸存在，否则不存在。
实施例7
基于金属有机框架颗粒-磁珠体系核酸检测方法样本测定限规律的确定，具体方法如下：
(1)依次配制1nM,10pM，100fM，1fM，100aM,10aM，以及空白组0M(以等体积超纯水代替)，各加入并实施例1的方法对各个浓度进行检测，每个浓度测6个样品，并对所测样品进行统计计算其对应的DPBF分解量；
(2)对不同浓度测量的结果与空白组用SPSS软件进行t检验(student test，置信区间为0.05)，10aM的整体数据平均值与空白组相关性为0.566，100aM的整体数据平均值与空白组相关性为0.012，1fM的整体数据平均值与空白组相关性为0.001，100fM及以上浓度的整体数据平均值与空白组相关性均小于0.0001。
实施例8
基于金属有机框架颗粒-磁珠体系核酸检测方法重现性与稳定性评价，具体方法如下：
将实施例2中100fM目标核酸体系DPBF分解率均值与空白组均值相关性小于0.0001，使用100fM目标核酸在两批次合成的不同A试剂及B试剂共20个样本进行检测，其DPBF分解率低于空白组的有一个，即其误判率等于5％。
实施例95`端羧基修饰的DNA2修饰的四氧化三铁磁珠磁响应性能评价：
取5`端羧基修饰的DNA2修饰的四氧化三铁磁珠2ml，用磁铁在侧边富集，每隔一分钟取200μl，共取5分钟样品，将样品加入30％稀盐酸溶解并加超纯水至10ml利用测电感耦合等离子体原子发射光谱仪测Fe离子含量变化，并计算磁珠的富集效率。发现其1分钟内富集效率达99.3％，5分钟达99.6％，即1分钟后富集效率没有明显的上升。
实施例10DNA1修饰的PCN-224在水中的结构稳定性及光动力稳定性讨论：
合成PCN-224@DNA1在DEPC水中4℃避光保存，分布对其1，3，5，7天冷冻干燥测量其XRD数据，发现其XRD数据峰型和位置没有变化，即PCN-224@DNA1在7天内能够保存结构稳定性；分布取2ml，10μg/ml的PCN-224@DNA1，分别在1，3，5，7天光照10分钟，测其光动力性能变化，发现其在7天内DPBF分解率略有下降，但都保持在35±1％，说明其在7天光动力性能较稳定。
实施例11DNA1在PCN-224颗粒负载量的确定：
取0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0μmol的DNA1测量其在260nm处的吸光度，做标准曲线可得线性方程为：AbOD260nm＝0.046+0.125×CDNA1，R2＝0.996；
取1ml，10μg/ml的PCN-224溶液，分别加入与其质量比为20：1、10：1、5：1、1：1、1：2的DNA1，混合均匀后再37℃充分反应4h，反应结束后11000rpm离心后去除上清液中多余的DNA1，利用酶标仪测量其在260nm处紫外吸收，可得不同DNA1浓度对应的负载率，通过线性公式计算可得每微克PCN-224负载约16.8pmol DNA1。
实施例12 5`端羧基修饰的DNA2在磁珠Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2颗粒负载量的确定：
取0.0625，0.125，0.25，1.25μmol的5`端羧基修饰的DNA2，加入0.5ml，0.3M的EDC/NHS,孵育一个小时后加入0.5ml，200μl的Fe3O4-SiO2-NH2溶液在37℃反应4h后离心去除多余的5`端羧基修饰的DNA2，利用酶标仪侧敲其在260nm处紫外吸收，可得不同5`端羧基修饰的DNA2浓度对应的负载率，通过线性公式计算可得每微克Fe3O4-SiO2-NH2负载约14pmol 5`端羧基修饰的DNA2。
Claims (18)
1.一种非诊断和治疗目的金属有机框架颗粒-磁珠体系的高灵敏核酸检测方法，其特征在于，包括：
(1)先将待检测溶液加入至试剂A中混合，再加入试剂B中进行孵育，然后利用磁铁进行分离并加入超纯水中，得到混合液；
(2)将单线态氧指示剂溶液加至混合液中并测试其在426nm处吸光度，记为第一吸光度；
(3)经过激光照射处理后，二次测试其在426nm处吸光度，记为第二吸光度；
(4)根据第一吸光度和第二吸光度的差值，计算DPBF分解量及其分解率(DPBF分解率＝(第一吸光度-第二吸光度)/第一吸光度))。
2.根据权利要求1所述的核酸检测方法，其特征在于，所述试剂A为金属有机框架颗粒@DNA1溶液，试剂B为Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2溶液。
3.根据权利要求2所述的核酸检测方法，其特征在于，所述金属有机框架颗粒@DNA1溶液的浓度为8～20μg/mL；所述金属有机框架颗粒@DNA1溶液的溶剂为DEPC水、超纯水、TE缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的核酸检测方法，其特征在于，所述金属有机框架颗粒@DNA1中金属有机框架颗粒为PCN-224，DNA1为目标RNA互补配对的碱基序列1。
5.根据权利要求4所述的核酸检测方法，其特征在于，所述目标RNA的序列为5`-AACUUCUCCUGCUAGAAUGGCUGGCAAUGGCGGUGAUGCUGCU-3`，所述DNA1的序列为5`-TTGAAGAGGACGATCTTACCGACCGT-3`。
6.根据权利要求2所述的核酸检测方法，其特征在于，所述金属有机框架颗粒的粒径为80nm～110nm；所述DNA1和金属有机框架颗粒的质量比为(16～17)pM：1μg。
7.根据权利要求2所述的核酸检测方法，其特征在于，所述Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2溶液的浓度为50～100μg/mL；所述Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2溶液的溶剂为DEPC水、超纯水、TE缓冲液中的至少一种。
8.根据权利要求2所述的核酸检测方法，其特征在于，所述Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2中Fe3O4-SiO2-NH2为氨基化的包覆有SiO2层的四氧化三铁颗粒，所述Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2的总粒径为200～300nm。
9.根据权利要求8所述的核酸检测方法，其特征在于，所述Fe3O4-SiO2-NH2中氨基化所用硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基甲基二乙氧基硅烷中的至少一种；
所述Fe3O4-SiO2-NH2中SiO2层的厚度为5～20nm；
所述四氧化三铁颗粒的粒径为200～300nm。
10.根据权利要求2-9中任一项所述的核酸检测方法，其特征在于，所述Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2中5`端羧基修饰的DNA2为目标RNA互补配对的碱基序列2；所述5`端羧基修饰的DNA2和Fe3O4-SiO2-NH2质量比为(6～15)pM：1μg。
11.根据权利要求10所述的核酸检测方法，其特征在于，所述目标RNA的序列为5`-AACUUCUCCUGCUAGAAUGGCUGGCAAUGGCGGUGAUGCUGCU-3`，所述5`端羧基修饰的DNA2的序列为5`-COOH-AGCAGCATCACCGCCAT-3。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的核酸检测方法，其特征在于，所述单线态氧指示剂为1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)、单线态氧荧光探针(SOSG)中的一种；所述单线态氧指示剂溶液的浓度为1～10mM；
所述待测液和试剂B的体积比为(0.02～0.05)：1；
所述试剂A和试剂B的体积比为(0.5～0.9)：1；
所述超纯水和试剂A的体积比为(0.5～1)：1；
所述述单线态氧指示剂溶液和试剂A的体积比为1：(100-300)。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的核酸检测方法，其特征在于，所述孵育的温度为20-37℃，时间为5～20分钟；
所述激光照射的参数包括：660nm的激光器，功率为500～1000mW，照射时间为4～10分钟；
所述待测液为采样拭子棒采样后置于病毒裂解液中2～5分钟后提取所得。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的核酸检测方法，其特征在于，当分解率＞1.776％时，判定待检测溶液中有目标核酸存在，否则判定待检测溶液中不存在目标核酸。
15.一种高灵敏核酸检测试剂盒，其特征在于，包括：试剂A和试剂B；其中试剂A为金属有机框架颗粒@DNA1溶液，试剂B为Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2溶液。
16.根据权利要求15所述的高灵敏核酸检测试剂盒，其特征在于，还包括：单线态氧指示剂溶液、病毒提取液和拭子棒；
所述单线态氧指示剂为1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)、单线态氧荧光探针(SOSG)中的一种；所述单线态氧指示剂溶液的浓度为1～10mM；每份单线态氧指示剂溶液的体积为10～20μL；
所述病毒提取液的组分为Tris-HCl和DEPC水溶液中的至少一种，所述Tris-HCl的pH＝6.0～6.5；DEPC水溶液中DEPC含量为0.1wt％～0.15wt％；每份病毒提取液的体积为2～2.5mL。
17.根据权利要求15或16所述的高灵敏核酸检测试剂盒，其特征在于，所述金属有机框架颗粒@DNA1溶液的浓度为8～20μg/mL；所述金属有机框架颗粒@DNA1溶液的溶剂为DEPC水、超纯水、TE缓冲液中的至少一种；每份金属有机框架颗粒@DNA1溶液的体积为0.5～1mL。
18.根据权利要求15或16所述的高灵敏核酸检测试剂盒，其特征在于，所述Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2溶液的浓度为50～100μg/mL；所述Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2溶液的溶剂为DEPC水、超纯水、TE缓冲液中的至少一种；
每份Fe3O4-SiO2-NH2@5`端羧基修饰的DNA2溶液的体积为0.5～1mL。
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