CN117025524A - 一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的材料及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：S1.一水合葡萄糖与磷酸在水中充分加热反应，得到反应液1；S2.反应液1与聚乙二醇4000、丁二酸、癸二酸和十二碳二酸充分加热反应，冷却，得到反应液2；S3.用氢氧化钙悬浮液调节反应液2的pH至12～13，固液分离，收集固体，即得。本发明提供的新型材料中，主要成分二水合磷酸氢钙和混合酯类化合物以离子键、氢键等方式交联，产生了协同效果，具有良好的细胞相容性，无细胞毒性，且能够显著增强骨髓间充质干细胞的成骨能力，为骨损伤修复和治疗提供了新的技术选择。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞成骨分化领域，具体地，涉及一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的材料及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)由发育早期的中胚层产生，是一种具有高度更新能力和多向分化潜能的干细胞，可向骨、软骨、肌肉、皮肤、脂肪、神经等多种组织分化，起到支持其他细胞生存、促进受损组织修复等重要作用。目前，已有多种基于间充质干细胞的药物问世。间充质干细胞在体内广泛存在，包括骨髓、脂肪、肝脏、脐带血等。存在于骨髓中的间充质干细胞称为骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymalstem cells,BMSCs)，主要分化为骨骼细胞和脂肪细胞，在骨修复过程中，BMSCs需向成骨细胞分化，从而形成新的骨组织，修复骨缺损。植入的生物材料在骨缺损的修复中起到关键作用，在长骨大段骨缺损的修复中生物材料更是必须使用。早期的骨修复材料以金属支架等生物惰性的材料为主，在随后的发展中人们主要使用具有生物活性的植入物，如生物活性陶瓷或其复合材料。生物活性材料不仅具有生物安全性(biosafety)和生物相容性(biocompatibility)，且具有骨诱导(osteoinduction)、骨传导(osteoconduction)和成骨(osteogenicity)等多种能力。骨诱导性是材料促进干细胞向成骨细胞分化的一种能力，为材料成骨性能提供了基础。
生物活性陶瓷的主要成分一般为钙磷类化合物，如羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)、磷酸钙(tricalcium phosphate,TCP)、二水合磷酸氢钙(dicalcium phosphatedihydrate,DCPD)等。对于钙磷类材料，其骨诱导性与其溶解度密切相关——溶解度越高，骨诱导的能力越大。HA是所有磷酸钙类材料中溶度积最小者，也是天然存在的钙磷类化合物的最稳定相，因此HA的骨诱导性很低，成骨能力也很弱。TCP的溶解度比HA大，TCP常与HA混合制备双相陶瓷。DCPD具有比TCP和HA更大的溶解度，因此制备DCPD骨植入材料对于骨修复具有重要意义。然而，目前合成生物材料用DCPD时，常用硝酸钙与磷酸二氢铵复分解法。该法步骤较繁琐，且硝酸盐为管制试剂，故有必要开发更为简洁的制备方法。同时注意到，由于块状植入物几乎没有孔隙，导致降解速率降低，细胞也不易长入，所以时常需加入细胞生长因子，比如骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)。但是，细胞因子的制备价格高，且可能存在免疫排斥反应，因此加入更加经济、更加安全的添加剂也是制备骨修复材料的重要方面。
发明内容
为了解决现有技术中需要提高骨髓间充质干细胞的分化能力问题，本发明提供了一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的材料及其制备方法。
本发明第一个目的是提供一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的骨修复材料制备方法。
本发明第二个目的是提供一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的材料。
本发明第三个目的是提供上述材料在制备提高骨髓间充质干细胞分化能力的试剂中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种提高骨髓间充质干细胞分化能力的试剂。
为了实现上述目的，本发明通过以下方案予以实现：
本发明的原理分为两个部分：一是骨修复材料主体成分DCPD的制备：本发明采用高浓度磷酸与氢氧化钙直接酸碱中和的方法制备DCPD，将氢氧化钙加入磷酸中，通过控制溶液pH值获得DCPD沉淀，简便易操作；二是在DCPD制备过程中加入葡萄糖、聚乙二醇(PEG)等添加剂，与磷酸、丁二酸等酸性物质相互作用生成酯类化合物，进一步提高了材料的骨诱导能力。
一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的材料的制备方法，包括以下步骤：
S1.一水合葡萄糖与磷酸在水中充分加热反应，得到反应液1；
S2.反应液1与聚乙二醇4000和长链二元酸充分加热反应，冷却，得到反应液2；
S3.用氢氧化钙悬浮液调节反应液2的pH至12～13，固液分离，收集固体，即得。
优选地，所述一水合葡萄糖、磷酸、聚乙二醇4000和长链二元酸在水中的浓度依次为(5～30)mg/mL、(15～50)mg/mL、(1～30)mg/mL和(0.7～4.5)mg/mL。
更优选地，所述长链二元酸包括丁二酸、癸二酸和十二碳二酸。
进一步优选地，所述一水合葡萄糖、磷酸、聚乙二醇4000、丁二酸、癸二酸和十二碳二酸在水中的浓度依次为(5～30)mg/mL、(15～50)mg/mL、(1～30)mg/mL(0.5～2.5)mg/mL、(0.1～1)mg/mL和(0.1～1)mg/mL。
更进一步优选地，所述一水合葡萄糖、磷酸、聚乙二醇4000、丁二酸、癸二酸和十二碳二酸在水中的浓度依次为(9～14)mg/mL、(15～22)mg/mL、(8～11)mg/mL、(0.8～1.4)mg/mL、(0.15～0.25)mg/mL和(0.15～0.25)mg/mL。
再进一步优选地，所述一水合葡萄糖、磷酸、聚乙二醇4000、丁二酸、癸二酸和十二碳二酸在水中的浓度依次为11mg/mL、22mg/mL、10mg/mL、1mg/mL、0.25mg/mL和0.25mg/mL。
再进一步优选地，所述一水合葡萄糖、磷酸、聚乙二醇4000、丁二酸、癸二酸和十二碳二酸在水中的浓度依次为14mg/mL、15mg/mL、8mg/mL、0.8mg/mL、0.2mg/mL和0.2mg/mL。
再进一步优选地，所述一水合葡萄糖、磷酸、聚乙二醇4000、丁二酸、癸二酸和十二碳二酸在水中的浓度依次为9mg/mL、15mg/mL、11mg/mL、1.4mg/mL、0.15mg/mL和0.15mg/mL。
最优选地，所述一水合葡萄糖、磷酸、聚乙二醇4000、丁二酸、癸二酸和十二碳二酸在水中的浓度依次为11mg/mL、22mg/mL、10mg/mL、1mg/mL、0.25mg/mL和0.25mg/mL。
优选地，所述一水合葡萄糖的质量为0.9g～1.4g，磷酸的质量为1.5g～2.2g，聚乙二醇4000的质量为0.8g～1.1g，丁二酸的质量为0.08g～0.14g，癸二酸的质量为0.015g～0.025g，十二碳二酸的质量为0.015g～0.025g，水的体积为100mL。
更优选地，所述一水合葡萄糖的质量为1.1g，磷酸的质量为2.2g，聚乙二醇4000的质量为1g，丁二酸的质量为0.1g，癸二酸的质量为0.025g，十二碳二酸的质量为0.025g，水的体积为100mL。
进一步优选地，所述一水合葡萄糖的质量为1.1g，75％(V/V)磷酸的体积为1.68mL(100％(V/V)磷酸的密度是1.772g/mL)，聚乙二醇4000的质量为1g，丁二酸的质量为0.1g，癸二酸的质量为0.025g，十二碳二酸的质量为0.025g，水的体积为100mL。
更优选地，所述一水合葡萄糖的质量为1.4g，磷酸的质量为1.5g，聚乙二醇4000的质量为0.8g，丁二酸的质量为0.08g，癸二酸的质量为0.02g，十二碳二酸的质量为0.02g，水的体积为100mL。
进一步优选地，所述一水合葡萄糖的质量为1.4g，70％(V/V)磷酸的体积为1.22mL(100％(V/V)磷酸的密度是1.772g/mL)，聚乙二醇4000的质量为0.8g，丁二酸的质量为0.08g，癸二酸的质量为0.02g，十二碳二酸的质量为0.02g，水的体积为100mL。
更优选地，所述一水合葡萄糖的质量为0.9g，磷酸的质量为1.5g，聚乙二醇4000的质量为1.1g，丁二酸的质量为0.14g，癸二酸的质量为0.015g，十二碳二酸的质量为0.015g，水的体积为100mL。
进一步优选地，所述一水合葡萄糖的质量为0.9g，80％(V/V)磷酸的体积为1.09mL(100％(V/V)磷酸的密度是1.772g/mL)，聚乙二醇4000的质量为1.1g，丁二酸的质量为0.14g，癸二酸的质量为0.015g，十二碳二酸的质量为0.015g，水的体积为100mL。
具体的，步骤S1中，将1.1g一水合葡萄糖与1.68mL体积分数为75％的磷酸在100mL水中充分加热反应，得到反应液1。
具体的，步骤S2中，反应液1与1g聚乙二醇4000、0.1g丁二酸、25mg癸二酸和25mg十二碳二酸充分加热反应，冷却，得到反应液2。
优选地，步骤S1中，所述加热反应的条件为55℃～65℃反应2h～4h。
更优选地，步骤S1中，所述加热反应的条件为55℃～65℃反应3h。
更优选地，步骤S1中，所述加热反应的条件为60℃反应2h～4h。
进一步优选地，步骤S1中，所述加热反应的条件为60℃反应3h。
优选地，步骤S2中，所述加热反应的条件为55℃～65℃反应2h～4h。
更优选地，步骤S2中，所述加热反应的条件为55℃～65℃反应3h。
更优选地，步骤S2中，所述加热反应的条件为60℃反应2h～4h。
进一步优选地，步骤S2中，所述加热反应的条件为60℃反应3h。
优选地，步骤S2中，冷却至25℃～35℃。
更优选地，步骤S2中，冷却至30℃。
优选地，步骤S3中，所述氢氧化钙悬浮液的浓度为(5～15)mg/mL。
更优选地，步骤S3中，所述氢氧化钙悬浮液的浓度为10mg/mL。
具体的，步骤S3中，所述氢氧化钙悬浮液的制备方法包括以下步骤：1.0g氢氧化钙与200mL去离子水充分混匀，超声，即得。
优选地，步骤S3中，将氢氧化钙悬浮液逐滴加入反应液2。
更优选地，步骤S3中，将氢氧化钙悬浮液逐滴加入反应液2，边加边搅拌。
优选地，步骤S3中，调节反应液2的pH至12。
优选地，步骤S3中，所述固液分离的方法包括充分静置、搅拌和抽滤。
更优选地，步骤S3中，静置10h～15h。
进一步优选地，步骤S3中，静置13h。
更优选地，步骤S3中，持续搅拌8min～12min。
进一步优选地，步骤S3中，持续搅拌10min。
更优选地，步骤S3中，用布氏漏斗进行抽滤。
抽滤所得滤饼质地较为松散，经过压制后强度得以提升，更便于植入体内，具有更好的诱导成骨效果。
优选地，还包括步骤S4，将所得固体压制成片。
更优选地，步骤S4中，压制成片的最大压力为10kN～70kN。
进一步优选地，步骤S4中，压制成片的最大压力为70kN。
更优选地，步骤S4中，压制成片的温度为50℃～85℃。
进一步优选地，步骤S4中，压制成片的温度为85℃。
更优选地，步骤S4中，压制成片的时间为10min～20min。
具体的，所述压制成片包括以下步骤：
自然挥干步骤S3所得固体的表面水分，取0.7g研磨成粉末，转移至直径13mm压片模具中，在万能试验机上压片，调节压片的最大压力为70kN，温度为85℃，时间为10min。
一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的材料，由上述任一制备方法得到。
上所述材料在制备提高骨髓间充质干细胞分化能力的试剂中的应用也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述提高骨髓间充质干细胞分化能力包括：促进骨髓间充质干细胞分泌碱性磷酸酶、促进碱性磷酸酶相关基因的表达和/或促进成骨细胞相关基因的表达。
一种提高骨髓间充质干细胞分化能力的试剂，包含上所述材料的浸提液。
优选地，所述浸提液由参照国家标准GB/T 16886.12制备得到。
优选地，上述材料与用于制备浸提液的溶剂的质量体积比为1mL：(0.5mg～1.5mg)。
更优选地，上述材料与用于制备浸提液的溶剂的质量体积比为1mL：1mg。
优选地，用于制备浸提液的溶剂为用于培养骨髓间充质干细胞的培养基。
更优选地，所述培养基为含有体积分数为8％～12％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基。
进一步优选地，所述培养基中含有体积分数为10％的胎牛血清。
进一步优选地，所述培养基中还含有体积分数为0.8％～1.2％的双抗。
更进一步优选地，所述培养基中还含有体积分数为1.0％的双抗。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的新型骨修复材料中，主要成分二水合磷酸氢钙(DCPD)和混合酯类化合物以离子键和氢键的方式交联，产生了协同效果。本材料具有良好的细胞相容性，显著增强骨髓间充质干细胞的骨诱导能力。本材料的制备采用磷酸、氢氧化钙、葡萄糖、聚乙二醇、丁二酸等化合物作为原料，安全性高、价格低，为骨缺损修复和治疗提供了新的技术选择。
附图说明
图1为材料的实物照片；a为实施例1制得的材料；b为实施例2制得的材料；c为实施例3制得的材料；d为对比例1制得的滤饼；e为对比例1抽滤后的液体。
图2为实施例1制得的材料的IR谱图及XRD谱图；a为IR谱图；b为XRD谱图。
图3为实施例1制得的材料的CT图；a为植入金属材料(钛合金TC4)的天然骨；b为实施例1制得的材料；1～2号点为钛合金的支撑杆；3号点为钛合金的空心螺钉；4～5号点为天然骨；6号点为本发明实施例1制得的材料；各点后所列数值为X射线的HU值。
图4为实施例1制得的材料的TG曲线。
图5为实施例1制得的材料的PyGC-MS总离子流色谱图。
图6为对比例1制得的材料及上清液的IR谱图；a为对比例1制得的材料的IR谱图；b为对比例1制得的上清液的IR谱图。
图7为应用例2各组细胞的活-死染色情况。
图8为应用例2各组细胞的细胞活力统计结果。
图9为应用例2各组细胞的APL活性检测结果；a为各组细胞在处理第7天的APL检测结果；b为各组细胞在处理第14天的APL检测结果。
图10为应用例2各组细胞的qPCR检测结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步的详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1材料的制备方法
本发明提供一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的材料，其制备方法包括以下步骤：
(1)反应
称取1.1g一水合葡萄糖(CAS号：5996-10-1)置于150mL烧杯中，加入100mL去离子水，再加入1.68mL 75％(V/V)磷酸(100％(V/V)磷酸的密度是1.772g/mL)，充分搅拌，60℃水浴3h，得到反应液1。
向反应液1中加入1g聚乙二醇4000(PEG4000)(CAS号：25322-68-3)、0.1g丁二酸(琥珀酸)(CAS号：110-15-6)、25mg癸二酸(CAS号：111-20-6)和25mg十二碳二酸(CAS号：693-23-2)，60℃下继续水浴3h，之后将全部溶液转移至500mL大烧杯中，自然冷却至室温(30℃)，得到反应液2，此时溶液为无色透明状。
称取1.0g氢氧化钙粉末置于250mL烧杯中，加入200mL去离子水，搅拌混匀、超声即得(不用时用封口膜密封)。配制得到200mL质量体积分数为1％(即1g/100mL)的氢氧化钙悬浮液。进行中和反应时，边搅拌、边取液。
将质量体积分数为1％的氢氧化钙悬浮液逐滴加入反应液2，进行中和反应，边滴加边搅拌，使反应物接触更加均匀，加快反应速度，直至溶液的pH达到12，此时氢氧化钙会全部加入。静置1h，产生大量沉淀，上清液略显微黄色，再静置过夜(12h)，得到反应液3。
(2)制片
持续搅拌反应液3 10min，而后将全部反应液3倒入布氏漏斗中，抽滤，得到滤饼。
自然挥干滤饼表面水分，取0.7g滤饼研磨成粉末，转移至直径13mm压片模具中，在万能试验机上压片，调节压片的最大压力为70kN，温度为85℃，时间为10min。
实施例2材料的制备方法
(1)反应
称取1.4g一水合葡萄糖(CAS号：5996-10-1)置于150mL烧杯中，加入100mL去离子水，再加入1.22mL 70％(V/V)磷酸(100％(V/V)磷酸的密度是1.772g/mL)，充分搅拌，50℃水浴4h，得到反应液1。
向反应液1中加入0.8g聚乙二醇4000(PEG4000)(CAS号：25322-68-3)、0.08g丁二酸(琥珀酸)(CAS号：110-15-6)、20mg癸二酸(CAS号：111-20-6)和20mg十二碳二酸(CAS号：693-23-2)，50℃下继续水浴3h，之后将全部溶液转移至500mL大烧杯中，自然冷却至室温(30℃)，得到反应液2，此时溶液为无色透明状。
称取1.0g氢氧化钙粉末置于250mL烧杯中，加入200mL去离子水，搅拌混匀、超声即得(不用时用封口膜密封)。配制得到200mL质量体积分数为1％(即1g/100mL)的氢氧化钙悬浮液。进行中和反应时，边搅拌、边取液。
将质量体积分数为1％的氢氧化钙悬浮液逐滴加入反应液2，进行中和反应，边滴加边搅拌，使反应物接触更加均匀，加快反应速度，直至溶液的pH达到13，此时氢氧化钙会全部加入。静置0.5h，产生大量沉淀，上清液略显微黄色，再静置过夜(12h)，得到反应液3。
(2)制片
持续搅拌反应液3 10min，而后将全部反应液3倒入布氏漏斗中，抽滤，得到滤饼。
自然挥干滤饼表面水分，取0.7g滤饼研磨成粉末，转移至直径13mm压片模具中，在万能试验机上压片，调节压片的最大压力为10kN，温度为70℃，时间为15min。
实施例3材料的制备方法
(1)反应
称取0.9g一水合葡萄糖(CAS号：5996-10-1)置于150mL烧杯中，加入100mL去离子水，再加入1.09mL 80％(V/V)磷酸(100％(V/V)磷酸的密度是1.772g/mL)，充分搅拌，70℃水浴3h，得到反应液1。
向反应液1中加入1.1g聚乙二醇4000(PEG4000)(CAS号：25322-68-3)、0.14g丁二酸(琥珀酸)(CAS号：110-15-6)、15mg癸二酸(CAS号：111-20-6)和15mg十二碳二酸(CAS号：693-23-2)，70℃下继续水浴3h，之后将全部溶液转移至500mL大烧杯中，自然冷却至室温(30℃)，得到反应液2，此时溶液为无色透明状。
称取1.0g氢氧化钙粉末置于250mL烧杯中，加入200mL去离子水，搅拌混匀、超声即得(不用时用封口膜密封)。配制得到200mL质量体积分数为1％(即1g/100mL)的氢氧化钙悬浮液。进行中和反应时，边搅拌、边取液。
将质量体积分数为1％的氢氧化钙悬浮液逐滴加入反应液2，进行中和反应，边滴加边搅拌，使反应物接触更加均匀，加快反应速度，直至溶液的pH达到12.5，此时氢氧化钙会全部加入。静置1h，产生大量沉淀，上清液略显微黄色，得到反应液3。
(2)制片
持续搅拌反应液3 10min，而后将全部反应液3倒入布氏漏斗中，抽滤，得到滤饼。
自然挥干滤饼表面水分，取0.7g滤饼研磨成粉末，转移至直径13mm压片模具中，在万能试验机上压片，调节压片的最大压力为30kN，温度为50℃，时间为20min。
对比例1材料的制备方法
(1)反应
称取1.1g一水合葡萄糖(CAS号：5996-10-1)置于150mL烧杯中，加入100mL去离子水，再加入1.68mL 75％(V/V)磷酸和1g聚乙二醇4000(PEG4000)(CAS号：25322-68-3)，充分搅拌，60℃水浴3h，得到反应液1。
向反应液1中加入0.1g丁二酸(琥珀酸)(CAS号：110-15-6)、25mg癸二酸(CAS号：111-20-6)和25mg十二碳二酸(CAS号：693-23-2)，60℃下继续水浴3h，之后将全部溶液转移至500mL大烧杯中，自然冷却至室温(30℃)，得到反应液2，此时溶液为无色透明状。
称取1.0g氢氧化钙粉末置于250mL烧杯中，加入200mL去离子水，搅拌混匀、超声即得(不用时用封口膜密封)。配制得到200mL质量体积分数为1％(即1g/100mL)的氢氧化钙悬浮液。进行中和反应时，边搅拌、边取液。
将质量体积分数为1％的氢氧化钙悬浮液逐滴加入反应液2，进行中和反应，边滴加边搅拌，使反应物接触更加均匀，加快反应速度，直至溶液的pH达到13，此时氢氧化钙会全部加入。静置0.5h，产生大量白色沉淀，上清液为棕黄色，得到反应液3。
(2)抽滤
持续搅拌反应液3 10min，而后将全部反应液3倒入布氏漏斗中，抽滤，得到滤饼。自然挥干滤饼表面水分。
应用例1材料的鉴定
一、外观鉴定
1、实验方法
将实施例1～3和对比例1制得的材料置于光线充足明亮的室内环境中，观察各材料的外观情况，并拍照记录。
2、实验结果
如图1中a～c所示，从外观上看，实施例1～3制得的材料均呈白色；如图1中d所示，对比例1制得的滤饼也呈白色，但质地松散，根本无法压制成片，如图1中e所示，对比例1得到抽滤后的液体呈棕黄色，且明显比实施例1～3的抽滤后的液体颜色更深。
二、密度鉴定
1、实验方法
将实施例1～3制得的材料，测量圆片直径和厚度的方法得到圆片的体积，用分析天平测得材料的质量，然后按照公式“密度＝质量/体积”计算得到材料的密度。
2、实验结果
表1各材料的密度检测情况
如表1所示，实施例1～3制得的材料的密度远低于钛合金TC4植入物(密度为4.44g/cm3)，已经与天然骨的密度(1.197g/cm3～1.228g/cm3)接近，这为CT影像学检查提供了很大便利。
三、成分分析
1、实验方法
对实施例1～3和对比例1制得的材料进行红外光谱(IR)、X射线衍射(XRD)、医用计算机断层扫描(CT)、热失重(TG)和裂解气相色谱-质谱联用(PyGC-MS)检测。
2、实施例1～3的实验结果
(1)IR谱图与XRD谱图
实施例1制得的材料的IR谱图如图2中的a所示，方法为溴化钾压片法，分辨率为4cm-1。从中可以看出，未出现916cm-1的葡萄糖特征峰，说明该材料中游离葡萄糖的含量极低。经对比发现，实施例1制得材料的IR谱图与二水合磷酸氢钙(DCPD)的IR标准谱图(https://www.nature.com/articles/s41467-020-15333-6)基本一致，因此材料的主体成分应为DCPD。标准谱图中同样出现了1725cm-1的谱峰(归属于某种合频)，因此该峰不宜解释为酯键，有机物的成分将通过质谱判断。
实施例1制得的材料的XRD谱图如图2中的b所示，X射线波长为方法为粉末多晶衍射。由图可见，最强峰在11.6°，实施例1制得材料的XRD谱图与DCPD的XRD标准谱图(PDF卡片号72-0713，XRD使用手册——书名：“Hanawalt search manual.Inorganicphases”，出版者：Newtown Square,Pa.:International Centre for Diffraction Data,2001，编写者：JCPDS--International Centre for Diffraction Data)基本一致，因此XRD亦证明本材料的主体成分为DCPD，与红外谱图的结论一致。实施例2和实施例3制得的材料的IR谱图与XRD谱图都与实施例1的情况基本相同。
以上结果表明，本发明制得的材料中的DCPD结晶性良好。
(2)CT图
一方面，骨修复材料植入体内后，通常需要定期CT检查，利用影像学对治疗效果进行评估。另一方面，对于骨肉瘤患者，在手术后需要接受放射治疗(放疗)，在放疗前需要利用CT进行治疗区域定位。在CT检查时，植入物的密度越大，伪影越大，对于CT图像观察的不利影响也越大。人体骨骼的密度在1g/cm3～1.6g/cm3之间，而金属植入物的密度通常很大，钛合金在4g/cm3～5g/cm3之间，不锈钢更是高达7g/cm3～8g/cm3。相反，与天然骨密度越接近，则对CT图像的影响越小。因此，制备与天然骨密度相近的骨植入材料十分重要。
本发明对钛合金植入物、天然骨和本发明实施例1制得的材料进行了CT检测，如图3中的a和b所示，天然骨的HU值在600～800之间，金属材料的HU值非常大，在4000以上，远远大于天然骨，而实施例1制得的材料的HU值约为1000，与天然骨接近。实施例2和实施例3制得的材料的HU值都与实施例1的HU值基本相同。因此，实施例1制得的材料对于CT检查的影响小，适合临床实际使用。
(3)TG曲线
实施例1制得的材料的热失重曲线如图4所示，升温速率20℃/min，与DCPD的热失重曲线(https://ieeexplore.ieee.org/stamp/stamp.jsp？tp＝&arnumber＝8066160)基本一致。DCPD中的结晶水在350℃的高温下才有可能全部失去。根据TG曲线中的最终残余质量计算可知，实施例1制得的材料中DCPD的含量约为93％，剩余部分大部分为游离水以及低含量的有机物。实施例2和实施例3制得的材料的TG曲线都与实施例1的情况基本相同。
(4)PyGC-MS谱图
实施例1制得材料的裂解气相色谱-质谱联用的总离子流色谱图如图5所示，裂解温度500℃，从中可见，其中有机物的峰非常弱，说明材料中有机物的含量很低，与IR谱图的结论一致。在保留时间12.765min处发现了葡萄糖单元的主要碎片峰(m/z 60,73,180)，而IR光谱发现游离葡萄糖含量极低，故此处葡萄糖单元可能来自葡萄糖的酯类化合物。在保留时间12.395min处，m/z 82,111的碎片离子归属为磷酸的葡萄糖酯，m/z 97的碎片离子归属为丁二酸的葡萄糖酯，m/z 133,177的碎片离子可能来自于聚乙二醇(PEG)。在保留时间11.775min处，连续出现了质荷比增加14的系列碎片，归属为长链烷基，应来自于长链脂肪酸。实施例2和实施例3制得的材料PyGC-MS谱图都与实施例1的情况相同。说明本发明制得的材料中含有与葡萄糖及PEG有关的化合物。
3、对比例1的实验结果
对比例1制得材料的红外光谱图如图6中的a所示，图中1033cm-1、603cm-1和564cm-1三个峰明确归属于羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)，而不是DCPD。所以，与实施例1相比，在其他条件不变的情况下，仅仅改变PEG4000的添加顺序即导致最终制得的材料主成分由DCPD变为HA。
对比例1制得上清液的红外光谱图如图6中的b所示，图中1103cm-1和2879cm-1两个峰归属于PEG，说明上清液的主体成分由PEG单元构成，835cm-1归属于葡萄糖，说明上清液中含有少量的葡萄糖单元，并且上清液闻起来具有甜味，可能也与此有关，沉淀中亦含有PEG单元。
4、小结
以上结果表明，本发明实施例1～3制得的材料的主要成分为DCPD，含量约93％，其余大部分为游离水，有机物含量很低。有机物的主要成分为葡萄糖与磷酸、丁二酸的酯，也包括PEG结构单元。在材料制备过程中改变PEG加入顺序后(对比例1)，沉淀的主要成分变为HA，上清液变为棕黄色，成分与实施例1均不同。因此，在材料制备过程中改变PEG4000的加入顺序对最终制得的材料成分有重大影响，这在进行本发明的实验之前是没有预料到的。
应用例2材料促进骨髓间充质干细胞分化
一、实验方法
1、浸提液的制备
由于在实际使用中，本发明制得材料中的成分必须进入体液中才能发挥促进骨髓间充质干细胞成骨分化的功能，所以以实施例1制得的材料为例，采用浸提法(参照国家标准GB/T 16886.12)提取该材料得到浸提液，并对其生物活性进行鉴定。
浸提法(参照国家标准GB/T 16886.12)的具体步骤如下：用完全培养基(即加入1％(V/V)双抗(penicillin与streptomycin)和10％(V/V)胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM))浸提实施例1制得的材料，完全培养基与实施例1制得的材料的最终浸提比例为1mL：1mg(即1mL完全培养基浸提1mg实施例1制得的材料)，浸提时间为24h。过滤，收集滤液即得到材料浸提液。
按照上述浸提法，用完全培养基浸提DCPD(分析纯，CAS号：7789-77-7)制备最终浸提比例为1mg/mL的DCPD浸提液(即1mL完全培养基浸提1mg DCPD)，即得到DCPD浸提液。
根据现有技术CN115737911A的实施例1所描述的制备过程，区别在于：将矿物相由纯相的HA替换为DCPD(分析纯，CAS号：7789-77-7)+羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)(CAS号：1306-06-5)，即制备得到DCPD+HA+CF复合材料。按照上述浸提法，用完全培养基浸提DCPD+HA+CF复合材料制备最终浸提比例为1mg/mL的DCPD+HA+CF复合材料浸提液(即1mL完全培养基浸提1mgDCPD+HA+CF复合材料)，即得到DCPD+HA+CF复合材料浸提液。
2、细胞培养
将小鼠骨髓间充质干细胞(mouse bone marrow mesenchymal stem cells,mBMSCs)作为受试细胞，该细胞为mBMSCs细胞系(生产商为武汉普诺赛生命科技有限公司，规格为5×10细胞/T25细胞培养瓶，货号为CP-M131)。
将mBMSCs细胞以每孔5×104个细胞/mL培养基的密度接种在96孔板中，在37℃、5％ CO2培养箱中孵育24h。
3、细胞处理
去除mBMSCs的培养基，加入等体积的材料浸提液，作为材料处理组，记为“Glucose2#”。
去除mBMSCs的培养基，加入等体积的DCPD浸提液，作为DCPD阳性对照组，记为“DCPD”。
去除mBMSCs的培养基，加入等体积的DCPD+HA+CF复合材料浸提液，作为DCPD+HA+CF阳性对照组，记为“1#”。
去除mBMSCs的培养基，加入等体积的完全培养基，作为阴性对照组，记为Control。
以上各组细胞在处理结束后，于37℃、5％CO2的条件下继续培养，隔天换液，各浸提液处理组用各自对应的浸提液进行换液，阴性对照组用完全培养基进行换液，同时进行后续检测。
4、检测
(1)活-死染色
在细胞处理的第1、3和5天，用Calcein-AM/PI检测试剂盒对各组细胞进行活-死染色，采用倒置荧光显微镜观察。
(2)细胞活力检测
在处理的第1、3和5天，使用CCK-8试剂盒检测各组细胞的活力情况。在96孔板中每孔加入100μL细胞悬浮液，将孔板在37℃、5％ CO2培养箱中培养24h。接着，在每孔加入10μL待测物，培养后加入10μL CCK-8溶液，继续培养。最后用酶标仪在450nm处测定细胞活力。
(3)碱性磷酸酶(ALP)活性检测
骨骼细胞在成骨早期会大量分泌ALP，因此ALP的活力反应了干细胞的分化情况和成骨细胞的成骨能力。
将各组细胞在处理结束后进行消化离心、重悬。使用96孔板，使细胞浓度为每孔5×104个细胞/mL培养基。将孔板置于培养箱中，37℃、100％湿度、5％ CO2培养过夜，隔日换液。于处理的第7天和第14天取出培养板，弃去培养基，用PBS清洗2遍，然后加入0.2％的Triton X-100试剂裂解细胞。利用碱性磷酸酶检测试剂盒、BCA试剂盒测定ALP活性。
ALP的染色方法为：每孔加入4％多聚甲醛固定液400μL，常温固定20min，再用PBS冲洗3遍，每次5min。然后用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒显色，采用体视显微镜观察。
(4)RT-qPCR检测
在处理的第7天和第14天，取出细胞培养板，用总RNA提取试剂盒提取总RNA，方法为：首先裂解细胞，每106个细胞中加入1mL裂解液，静置后加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置5min。而后，在4℃时高速离心10min(转速12000rpm)，此时RNA富集在上层水相中。将水相用小柱净化并富集RNA，再用水洗脱，高速离心2min即得RNA。
接着使用逆转录试剂盒生成cDNA，所有实验在冰上进行。将样品置于PCR仪器中，先在42℃下反应2min；离心后再放置于PCR仪器中，37℃下反应2min；然后85℃下反应5s，即完成扩增，得到cDNA模板。
采用荧光实时定量PCR(RT-qPCR)方法测定ALP的mRNA表达水平。RT-qPCR所用引物如表2所示，内参基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)。
表2qPCR所用引物
RT-qPCR反应体系为：cDNA模板2μL，核苷酸胶体染料(Green I)10μL，10μM的正向引物0.4μL，10μM的反向引物0.4μL，去离子水7.2μL，合计20μL。
RT-qPCR反应程序为：首先进行预变性，条件95℃、2min。接着开始循环，其中变性条件为95℃、10s，退火条件为60℃、15s，延伸条件为60℃、15s。扩增40个循环后停止检测。在522nm处测定绿色荧光的强度。
二、实验结果
(1)活死染色结果
如图7所示，从绝对数量上来看，随着时间推移，各组细胞的数量均快速增多，且近似于对数增长，符合细胞生长规律。从细胞形态上看，材料处理组与阴性对照组基本一致，无明显改变。在培养的第1、3和5天时，都只有很少数量的死细胞。说明本发明实施例1制得的材料对于细胞无毒性。
(2)细胞活力检测结果
如图8所示，在处理的第1、3和5天，各组细胞的凋亡比例无显著性差异，细胞活力维持在97％以上。说明实施例1制得的材料没有细胞毒性，且细胞相容性好。
(3)ALP活性检测结果
如图9中的a和b所示，在4组细胞中，材料处理组的ALP活性在第7天和第14天都最高且基本稳定不变，持续高于DCPD+HA+CF阳性对照组，显著地持续高于阴性对照组和DCPD阳性对照组。并且，DCPD阳性对照组和DCPD+HA+CF阳性对照组的ALP活性在第7天和第14天均有波动。说明本发明实施例1制得的材料可有效提高和维持mBMSCs分泌ALP的能力，使得ALP的活性在较长时间内保持稳定。
(4)qPCR检测结果
如图10所示，ALP mRNA的表达趋势与ALP活性检测结果一致，材料处理组的ALPmRNA高于DCPD+HA+CF阳性对照组，且显著高于阴性对照组与DCPD阳性对照组。这说明本发明实施例1制得的材料能促进成骨相关基因ALP的表达。
以上结果表明，本发明提供的材料能够有效诱导骨髓间充质干细胞的分化，从而提高其成骨能力。而且，本发明材料的效果优于纯品DCPD以及DCPD+HA+CF构成的复合材料。其原因在于本发明提供的材料中含有葡萄糖与磷酸、丁二酸等构成的混合酯类化合物，以及带有PEG结构单元的化合物。这些有机物又与DCPD以离子键、氢键等方式交联，进一步产生了协同作用，使得材料促进干细胞成骨的作用得以增强。虽然这些有机物在本材料中的含量非常低，但效果却非常显著。
此外，在本发明提供的材料加入了长链二元酸(癸二酸和十二碳二酸)等添加剂，目的是加强材料内部交联而有助于其成型。PyGC-MS检测结果显示，本材料中的长链二元酸(癸二酸和十二碳二酸)亦可能发生酯化反应，反应产物与常用的细胞裂解剂Triton X-100(上文有应用)应有相似结构，尽管本发明提供的材料可能因此而具有一定的裂解细胞的能力，但并不影响其具有良好的细胞相容性和生物安全性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.一水合葡萄糖与磷酸在水中充分加热反应，得到反应液1；
S2.反应液1与聚乙二醇4000和长链二元酸充分加热反应，冷却，得到反应液2；
S3.用氢氧化钙悬浮液调节反应液2的pH至12～13，固液分离，收集固体，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述一水合葡萄糖、磷酸、聚乙二醇4000和长链二元酸在水中的浓度依次为(5～30)mg/mL、(15～50)mg/mL、(1～30)mg/mL和(0.7～4.5)mg/mL。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述长链二元酸包括丁二酸、癸二酸和十二碳二酸。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述一水合葡萄糖、磷酸、聚乙二醇4000、丁二酸、癸二酸和十二碳二酸在水中的浓度依次为(5～30)mg/mL、(15～50)mg/mL、(1～30)mg/mL(0.5～2.5)mg/mL、(0.1～1)mg/mL和(0.1～1)mg/mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述加热反应的条件为55℃～65℃反应2h～4h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述加热反应的条件为55℃～65℃反应2h～4h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述氢氧化钙悬浮液的浓度为(5～15)mg/mL。
8.一种提高骨髓间充质干细胞成骨能力的材料，其特征在于，由权利要求1～7任一所述制备方法得到。
9.权利要求7所述材料在制备提高骨髓间充质干细胞分化能力的试剂中的应用。
10.一种提高骨髓间充质干细胞分化能力的试剂，其特征在于，包含权利要求7所述材料的浸提液。
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