CN104771786B

CN104771786B - 载植物生长因子4,5′,7‑三羟基异黄酮的生物复合材料多孔支架的制备方法

Info

Publication number: CN104771786B
Application number: CN201510152991.XA
Authority: CN
Inventors: 李鸿; 严永刚; 吕国玉; 杨爱萍
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2014-06-30
Filing date: 2014-06-30
Publication date: 2017-12-22
Anticipated expiration: 2034-06-30
Also published as: CN104771786A; CN104027849A; CN104027849B

Abstract

本发明涉及载植物生长因子4,5′,7‑三羟基异黄酮的生物复合材料多孔支架的制备方法。本发明公开了一种载大豆异黄酮的生物复合材料多孔支架的制备方法，其是将质量比为1～10:100的纳米缺钙磷灰石‑多元氨基酸共聚物复合材料和生长因子成分，以及为所述复合材料质量5‑15％的二水硫酸钙类成分的发泡剂混合后，以注塑方式，在注射温度150～180℃，注射压力50～70MPa，注射速度80～95％，模具温度50～70℃的条件下，注塑成型为所述的多孔支架产物。实验结果表明，本发明方法制备得到的多孔支架对MG‑63的细胞增值程度显著大于未负载大豆异黄酮的支架，具有显著性差异，表明本发明的多孔支架具有作为优异促进骨生成性能支架材料的良好前景。

Description

载植物生长因子4,5′,7-三羟基异黄酮的生物复合材料多孔支架的制备方法

本申请是申请日：2014年6月30日、申请号：201410303875.9、发明名称：载大豆异黄酮的生物复合材料多孔支架及制备的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种可降解的纳米缺钙磷灰石/多元氨基酸共聚物复合材料多孔支架的制备方法，特别是在支架材料中混合有大豆异黄酮作为生长因子成分而可促进骨细胞增殖和成骨的纳米缺钙磷灰石/多元氨基酸共聚物复合材料多孔支架的制备方法。

背景技术

骨不连是骨折治疗过程中常见的并发症。目前临床治疗的主要方法，是通过清除纤维组织等后再植入植骨材料、改变内固定以及对骨折端加压等手术方式进行。手术中通常用到的植骨材料，包括自体骨、异体骨、人工骨。自体骨兼具诱导活性和支架作用，可起到诱导成骨支架、提供成骨细胞的作用，成骨效果最好，且不会引起免疫反应及疾病传播，但其来源有限，并会造成患者的二次伤害，并可能引起取骨区域的并发症。异体骨也是选择之一，但具有骨传导性成骨缓慢，并且存在移植排斥反应而导致失败的缺点，存在传播肝炎和艾滋病等传染性疾病的危险，同时还牵涉伦理问题，因此其应用也受到限制。

随着生物材料、组织工程等学科的发展，已有多种人工骨替代材料出现，由于人工骨可批量生产，来源广泛，能够最终降低骨缺损治疗的成本，因此人工骨材料用于骨不连治疗始终是研究的热点和重点。但单纯使用人工骨材料对骨不连这类难愈合骨缺损的治疗，目前的效果并不理想。

据此，利用骨生长因子对细胞/组织的特殊调控作用，构建人工骨材料复合促进骨生长因子的复合支架用于骨不连修复，已是目前该领域的研究前沿热点之一。分子生物学研究表明，促进骨生长成分如骨形成发生蛋白因子(BMP)能够激活成骨细胞中某些基因，从而促进成骨细胞细胞吸附/黏附、增殖与分化等；载体材料则可为骨生长提供相应的钙、磷成分，因此二者的协同作用，可实现骨不连的良好修复。目前，人工骨复合BMP已是用于修复骨不连的常用方法之一。目前的研究表明，BMP虽能够诱导骨间充质细胞分化为骨、软骨、肌腱和神经等组织，具有强大的成骨作用，能够促进骨组织快速生长而达到修复的目的，但BMP的提取困难，价格昂贵，难以广泛使用，而且BMP在骨缺损区域刺激成骨的同时，也刺激了破骨细胞的增生，而且破骨细胞的增生早于成骨细胞；此外，其缺乏良好的载体材料，单独使用难以满足长期持续释放的要求，而且目前其临床试验效果显示弱于动物实验，并且BMP的种属、来源、使用剂量等都对成骨诱导活性会有很大影响。

近年有研究发现，提取自植物的大豆异黄酮(SI)具有与人体雌激素类似的化学结构和类似功能而被称为植物雌激素，能有效地预防和治疗绝经后妇女因缺乏雌激素而导致的骨质疏松、癌症方面以及心血管方面的疾病。Fanti和Picherit等报道通过对切除大鼠卵巢后经皮注射和饲喂大豆异黄酮，观察其对骨骼系统生长发育影响的结果表明，注射大豆异黄酮的实验组动物的股骨骨干、干骺端以及远端股骨网状结构的骨密度明显高于对照组，并能有效抑制骨质流失。

目前就对大豆异黄酮的使用而言，一般采用经皮注射和口服饲喂两种方式。但这两种方式都需要通过机体的代谢系统将药物成分运送到骨折部位，因此会导致骨折部位的药物量不足，不能有效持续释放。通常的解决办法是采用药物缓释系统载药后进行缓释，达到持续并稳定浓度给药，直接作用于病变部位的目的。例如，目前在支架等骨组织修复材料中常用的载药方式，通常是通过浸泡使药物等活性成分吸附在支架材料的表面。这种方法使活性成分在支架植入体内初期释放量较大，而支架降解后期则无活性成分的释放，释放速度极不均匀，不能达到支架完全降解前长效作用于病灶的目的。

发明内容

基于上述原因，本发明将提供一种能够长期匀速释放生长因子，有效促进对骨不连缺损修复，使骨缺损的修复速度与材料的降解速度匹配的生长因子/复合材料多孔支架的制备方法，具体讲是一种载大豆异黄酮的生物复合材料多孔支架的制备方法，以满足临床骨缺损修复的需要。

本发明制备载大豆异黄酮的生物复合材料多孔支架的制备方法，是将质量比为1～10:100的纳米缺钙磷灰石-多元氨基酸共聚物复合材料和生长因子成分，以及为所述复合材料质量5-15％的二水硫酸钙类成分的发泡剂混合后，以注塑方式，在注射温度150～180℃，注射压力50～70MPa，注射速度80～95％，模具温度50～70℃的条件下，注塑成型为所述的多孔支架产物。

优选地，所述物料注塑成型的注射温度为175℃，注射压力为70MPa，注射速度为80％，模具的温度为60℃。由于作为生长因子的Ge的熔点298℃，热稳定性优异，因此所述的注塑温度低于其熔融温度，从而可以保持其物理化学性能，以及其促生长性能均不会被破坏，特别是保证所形成的多孔材料的孔隙结构。

其中所述原料之一的纳米缺钙磷灰石-多元氨基酸共聚物复合材料，可以采用文献(Li h,Gong M,Yang AP,et al.Degradable biocomposite of nano calciumdeficient hydroxyapatite/multi-(amino acid)copolymer.International Journal ofNanomedcine.2012,7:1287-1295)的方式制备得到。例如，其基本制备过程，可首先将所选择的氨基酸单体按比例及适量的水加入反应容器并搅拌混合均匀，加热(例如160℃)脱水后，升温(例如210℃)待氨基酸熔融，再加入所述比例的纳米缺钙磷灰石分步进行反应(例如先反应0.5-2小时后，继续升温至220℃反应0.5-1小时)，冷却，即得到所述的纳米缺钙磷灰石-多元氨基酸共聚物复合材料。为避免氧化，聚合反应可在氮气等惰性气体保护环境中进行和完成。

本发明上述制备方法中所述的硫酸钙类成分的发泡剂，采用二水硫酸钙。

在上述的注塑操作条件下，所述的原料混合物在注塑机内可呈熔融状态而可直接在模具中注塑加工成型。在此前提下，为使原料中的所述纳米缺钙磷灰石-多元氨基酸共聚物复合材料能与其它已为粉末状的原料能更快和更好的均匀混合效果，进一步可优选先将所述纳米缺钙磷灰石-多元氨基酸共聚物复合材料碎成粒径为3～5mm的颗粒后，再与其余成分混合。

在本发明上述的制备方法中，通过对所述发泡剂用量的控制和调整等，还可以改变支架材料中的孔隙率，从而得到具有不同降解速率的多孔支架，以达到使其中的生长因子具有不同的释放效率，以适应和满足不同的使用需要。例如，适当增加所述发泡剂的用量比例，可以得到具有更高孔隙率的支架产物，而孔隙率高的支架则可具有较高的降解速度，因而可以快速释放所述的生长因子。

所述多空支架是以纳米缺钙磷灰石-多元氨基酸共聚物复合材料多孔支架作为载体，载体材料中混合有大豆异黄酮作为生长因子成分，生长因子与复合材料的质量比为1～10:100。

所述作为生长因子成分的大豆异黄酮，为植物来源的5,4′,7-三羟基异黄酮。

所述支架中，异黄酮均匀分布在支架中，而非吸附在支架表面。

所述复合材料中的纳米缺钙磷灰石的质量比为10～50％，其余为多元氨基酸共聚物。

所述多孔支架载体的孔隙率为65～95％。优选地，所述多孔支架载体的孔隙率为80-95％。

本发明方法制备的载大豆异黄酮的生物复合材料多孔支架，以纳米缺钙磷灰石-多元氨基酸共聚物复合材料(nano calcium deficient hydroxyapatite-multi(aminoacid)copolymer，n-CDHA-MAC)多孔支架(porous n-CDHA-MAC scaffold，PCMS)作为载体，其特征是在所述载体材料中混合有大豆异黄酮作为生长因子成分，生长因子与复合材料的质量比为1～10:100。

试验结果显示，在该复合材料多孔支架中含有此比例范围的大豆异黄酮作为生长因子，可以产生有效促进骨细胞增殖和分化，即碱性磷酸酶的活性的效果，并可根据实际所使用该复合材料多孔支架的降解速度，在此范围内具体选择确定作为生长因子的大豆异黄酮的含量。例如，当所使用的支架材料具有较低降解速度时，则可以适当提高在支架中所含该生长因子的负载比例。

本发明上述多孔材料中作为载体的所述该纳米缺钙磷灰石-多元氨基酸共聚物复合材料，是在Li h,Gong M,Yang AP,et al.Degradable biocomposite of nano calciumdeficient hydroxyapatite/multi-(amino acid)copolymer.International Journal ofNanomedicine.2012,7:1287-1295)等文献中已有过报道的产品。其中，所述纳米缺钙羟基磷灰石的化学式为Ca_10-X(HPO₄)X(PO₄)_6-X(OH)_2-X，其中的0≤x<1，Ca/P介于1.50-1.67之间，其晶体结构不完整，组成与结构更加接近于骨磷灰石，因此具有降解速度快，生物活性高的特点。而常见且在骨组织修复材料已有诸多研究报道的的计量化学羟基磷灰石的化学式为Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂，Ca/P＝1.67，其溶解度小，在人体内的降解程度相对较低，长期存于体内不利于骨组织修复。

目前研究发现，在本发明上述多孔支架中可作为生长因子使用的大豆异黄酮，可分为9种糖苷和3种游离型异黄酮，其中优选的是植物来源的4,5′,7-三羟基异黄酮化合物(Ge)，分子式为C₁₅H₁₀O₅，分子量270，熔点298℃，具有良好的稳定性。因Ge化合物的结构与人体雌激素的结构最为接近，与细胞内的雌激素受体(ER)结合后，可导致ER构象发生翻转，并与DNA上不同启动区域的染色质结合从而激活基因转录，对靶向器官发挥纯激动剂、部分激动剂或纯拮抗剂的作用，在成骨过程中能促进骨源性生长因子胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的分泌，加快成骨细胞生长，并抑制破骨细胞增殖，实现对细胞生长的精确控制，因此Ge具有更好的生物活性。

上述多孔支架中，一般情况下，所述复合材料中的纳米缺钙磷灰石的质量比，可以参照包括前述文献在内的诸多已有报道和/或使用的类似多孔复合材料的方式，选择为10～50％，其余为多元氨基酸共聚物。实验结果显示，复合材料中磷灰石含量的高低，对本发明在该复合材料中负载所述的生长因子和/或生长因子的释放，均无明显的影响。

上述多孔支架组成中的多元氨基酸共聚物，特别是在含有羟基磷灰石类成分的有机-无机型骨修复/替代复合材料中作为有机材料组分的多元氨基酸共聚物，在包括公开号为CN101385869A、CN101417149A等本申请人的早期专利文献，特别是在前述的文献中都已有充分的介绍。其中，该多元氨基酸共聚物由6-氨基己酸作为主链，与人体所必须的天然氨基酸作为共聚单元，聚合成为一类降解速度可由聚合物的分子量、共聚天然氨基酸单元种类等进行调节的聚合物。其显著优点是，该多元氨基酸共聚物的降解产物为氨基酸单体或者低聚物，对人体无毒性，且不影响植入部位周围环境的pH值。

如前述文献已介绍，作为本发明上述多孔支架的载体，其可如前述文献所说，所述多孔支架载体的孔隙率一般可为65～95％，更好范围可选择为80-95％。实验显示，孔隙率保持在此范围内，都有利于细胞生长黏附，特别是在更好的孔隙率优选范围内最有利于细胞生长黏附。

实验结果表明，本发明方法采用的大豆异黄酮作为生长因子、特别是Ge，以及其用量比例，可使多孔支架在降解过程中释放的生物活性因子的浓度显著促进细胞生长；在细胞培养过程中，本发明方法制备的多孔支架的细胞增值程度，显著大于未负载该生长因子的同类多孔支架(PCMS)，并有显著性差异，表明本发明方法制备的多孔支架具有作为优异骨生成性能支架材料的良好前景。而采用注塑方式将具有生物活性的生长因子以混合方式载入到整个支架材料体之中，生长因子在支架中能基本呈均匀分布状，使其在骨植入部位的释放能随着支架的降解逐步进行，从而能使促进骨缺损愈合的生长因子释放速度与人体骨组织自主修复速度匹配，有利于骨缺损的快速修复。而且采用本发明方法制备多孔支架的原料易得，也无免疫疾病风险，制备方法简便易行，且可实现大批量生产和加工，可为骨科疾病，特别是对骨不连的治疗提供一类新的和有价值的骨缺损修复材料。

以下结合附图所示实施例形式的具体实施方式，对本发明上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。

附图说明

图1是在本发明实施例1和2及未载生长因子对照品多孔支架产物(PCMS)上，用MTT检测复合培养MG-63细胞1，3，5，7天的细胞增殖情况的对比。

具体实施方式

实施例1

将粒径为3～5mm和磷灰石含量为40wt％的纳米缺钙磷灰石-多元氨基酸共聚物复合材料(n-CDHA-MAC)颗粒，与发泡剂二水硫酸钙(CS)和植物来源的5,4′,7-三羟基异黄酮化合物生长因子(Ge)，按照n-CDHA/MAC：CS：Ge＝90：10：1(质量)混合均匀，在注射温度175℃、注射压力70Mpa、注射速度80％、模具温度60℃、单模注射量为40mm的条件下，得到载有生长因子Ge的本发明的复合材料多孔支架Ge-PCMS(产物1)，孔隙率为81％。在磷酸缓冲液中进行Ge释放试验，本例产物1一周内释放的Ge量约为0.0001g。以同杨方法制备的未载Ge生长因子的PCMS作为对照，将支架与MG-63细胞复合培养培养1，3，5，7天后发现，本例产物1的细胞增殖程度大于PCMS，且与PCMS有显著差异。细胞增殖OD值如图1所示。

实施例2

将粒径为3～5mm和磷灰石含量为40wt％的纳米缺钙磷灰石-多元氨基酸共聚物复合材料颗粒、发泡剂CS和Ge，按照n-CDHA/MAC：CS：Ge＝90：10：5(质量)混合均匀，在注射温度175℃、注射压力70Mpa、注射速度80％、模具温度60℃、单模注射量为40mm的条件下，得到本发明的复合材料多孔支架Ge-PCMS(产物2)，孔隙率为80.4％。在磷酸缓冲液中进行Ge释放试验，本例的产物2一周内释放的Ge量约为0.0004g。以PCMS作为对照，将支架与MG-63细胞复合培养1，3，5，7天后发现，本例产物2的细胞增殖程度大于PCMS，且与PCMS有显著差异。细胞增殖OD值如图1所示。图1结果清楚显示，本发明载有生长因子Ge的支架产物，对MG-63细胞的增殖促进作用均显著优于未载Ge的对照PCMS支架。

图1中，编号1-Ge-PCMS的样品即为实施例1的产物1，编号5-Ge-PCMS的样品即为实施例2的产物2。

实施例3

将粒径为3～5mm和磷灰石含量为40wt％的纳米缺钙磷灰石-多元氨基酸共聚物复合材料颗粒、发泡剂CS和Ge，按n-CDHA/MAC:CS:Ge＝90:10:10(质量)混合均匀，在注射温度175℃、注射压力70Mpa、注射速度80％、模具温度60℃、单模注射量为40mm的条件下，得到本发明的复合材料多孔支架Ge-PCMS(产物3)，孔隙率为81.7％。在磷酸缓冲液中进行Ge释放试验，本例的产物3一周内释放的Ge量约为0.001g。以PCMS作为对照，将支架与MG-63细胞复合培养发现，细胞增殖程度大于PCMS，且与PCMS有显著差异。

实施例4

将粒径为3～5mm和磷灰石含量为40wt％的纳米缺钙磷灰石/多元氨基酸共聚物复合材料颗粒、发泡剂CS和Ge，按n-CDHA/MAC:CS:Ge＝90:10:15(质量)混合均匀，在注射温度175℃、注射压力70Mpa、注射速度80％、模具温度60℃、单模注射量为40mm的条件下，得到本发明的多孔支架Ge-PCMS(产物4)，孔隙率为80.4％。在磷酸缓冲液中进行药物释放试验，本例的产物4一周内释放的Ge量约为0.0015g。以PCMS及实施例3的产物3样品作为对照，将支架与MG-63细胞复合培养发现，细胞增殖程度与PCMS相当，但显著低于产物3。

实施例5

将粒径为3～5mm和磷灰石含量为40wt％的纳米缺钙磷灰石/多元氨基酸共聚物复合材料颗粒、发泡剂CS和Ge，按n-CDHA/MAC:CS:Ge＝90:10:0.5(质量)混合均匀，在注射温度175℃、注射压力70Mpa、注射速度80％、模具温度60℃、单模注射量为40mm的条件下，得到本发明的多孔支架Ge-PCMS(产物5)，孔隙率为81.9％。在磷酸缓冲液中进行Ge释放试验，本例产物5一周内释放的Ge量约为0.00005g。以PCMS及产物1样品作为对照，将支架与MG-63细胞复合培养发现，细胞增殖程度与PCMS相当，与PCMS无显著差异，与产物1相比，细胞增殖程度显著降低。

实施例6

将粒径为3～5mm和磷灰石含量为40wt％的纳米缺钙磷灰石/多元氨基酸共聚物复合材料颗粒、发泡剂硫酸钙CS和Ge，按照n-CDHA/MAC:CS:Ge＝85:15:5(质量比)比例混合均匀，在注射温度175℃、注射压力60Mpa、注射速度90％、模具温度60℃、单模注射量为40mm的条件下，得到本发明复合材料多孔支架Ge-PCMS(产物6)，孔隙率为95％。在磷酸缓冲液中进行Ge释放试验，本例产物6一周内释放的Ge量约为0.0007g。以PCMS及产物3样品作为对照，将支架与MG-63细胞复合培养发现，细胞增殖程度大于PCMS，且与PCMS有显著差异。

实施例7

将粒径为3～5mm和磷灰石含量为40wt％的纳米缺钙磷灰石/多元氨基酸共聚物复合材料颗粒、发泡剂硫酸钙CS和Ge，按照n-CDHA/MAC:CS:Ge＝95:5:5(质量比)比例混合均匀，在注射温度175℃、注射压力60Mpa、注射速度90％、模具温度60℃、单模注射量为40mm的条件下，得到本发明复合材料多孔支架Ge-PCMS(产物7)，孔隙率为65％。在磷酸缓冲液中进行Ge释放试验，本例产物7一周内释放的Ge量约为0.0002g。以PCMS样品作为对照，将支架与MG-63细胞复合培养发现，细胞增殖程度大于PCMS，且与PCMS有显著差异。

实施例8

将粒径为3～5mm和磷灰石含量为10wt％的纳米缺钙磷灰石/多元氨基酸共聚物复合材料颗粒、发泡剂硫酸钙CS和Ge，按照n-CDHA/MAC:CS:Ge＝90:10:5(质量比)比例混合均匀，在注射温度175℃、注射压力60Mpa、注射速度90％、模具温度60℃、单模注射量为40mm的条件下，得到本发明复合材料多孔支架Ge-PCMS(产物8)，孔隙率为81.6％。在磷酸缓冲液中进行Ge释放试验，本例产物8一周内释放的Ge量约为0.0005g。以PCMS样品作为对照，将支架与MG-63细胞复合培养发现，细胞增殖程度大于PCMS，且与PCMS有显著差异。

上述各实施例得到的本发明载有Ge的复合材料多孔支架Ge-PCMS产物，与未载生长因子支架产物的对细胞增殖程度影响的对比结果，如表1所示。

表1 本发明支架产物与对照支架对细胞增殖程度影响的对比结果

注：√表示样品的细胞增殖程度显著高于对照样；

×表示样品的细胞增殖程度与对照样相当，无显著性差异。

Claims

1.一种制备载大豆异黄酮的生物复合材料多孔支架的制备方法，其特征是将纳米缺钙磷灰石-多元氨基酸共聚物复合材料和生长因子成分，以及为所述复合材料质量5-15％的二水硫酸钙类成分的发泡剂混合后，以注塑方式，在注射温度175℃，注射压力60～70MPa，注射速度80～90％，模具温度60℃的条件下，注塑成型为所述的多孔支架产物；所述多孔支架是以纳米缺钙磷灰石-多元氨基酸共聚物复合材料多孔支架作为载体，载体材料中混合有大豆异黄酮作为生长因子成分，生长因子与复合材料的质量比为1～10:100。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述作为生长因子成分的大豆异黄酮，为植物来源的5,4′,7-三羟基异黄酮。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是异黄酮均匀分布在支架中，而非吸附在支架表面。

4.权利要求1或2所述的方法，其特征是所述复合材料中的纳米缺钙磷灰石的质量比为10～50％，其余为多元氨基酸共聚物。

5.权利要求1或2所述的方法，其特征是所述多孔支架载体的孔隙率为65～95％。

6.权利要求5所述的方法，其特征是所述多孔支架载体的孔隙率为80-95％。