CN103203040B - 一种骨修复材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种骨修复材料及其制备方法。该骨修复材料，其有效成分由半水硫酸钙和鹿瓜多肽注射液作为原料，通过经过混合、搅拌直至混合液呈凝胶状，再将混合液注入模具，经过高压压制，取出并置于常温下挥发，固化而制成。该骨修复材料与人体的生物相容性好，并且具有很好的骨诱导活性，可以较快地完成骨缺损的修复，因此在非常适合于骨外科临床应用。
Description
技术领域
本发明属于医用生物材料领域，涉及一种医用的骨修复材料及其制备方法。
背景技术
现有骨修复材料包括自体骨、同种异体骨以及人工骨材料三种。自体骨取自自身的髂骨、肋骨等松质骨，具有良好的骨诱导性、骨传导性及生物相容性等优点，是治疗骨缺损的金标准。但存在着可供利用的骨量少，取骨的部位存在着感染、出血、疼痛等并发症，且一定程度上影响美观等缺点。同种异体骨来源广泛、成骨性能良好，但是存在着免疫排斥及感染的风险。人工骨材料是目前研究及应用的热点。硫酸钙是常用的一种人工骨材料，其来源广泛，价格低廉。医用硫酸钙(外科级的α-半水硫酸钙)具有良好的生物相容性，可以制成各种形状，能在体内被彻底降解吸收，不引起免疫反应，对周围组织不产生炎症反应和异物刺激作用，适合作为骨移植替代材料填充修复骨缺损。但是硫酸钙的成骨活性较弱，仅具有骨传导性，缺乏骨诱导性，且降解较快。植入体内后，平均1.4个月即完全降解，而机体则需要至少3个月的时间才能修复骨缺损。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种与人体的生物相容性以及生物可吸收性好，成骨速度快的骨修复材料，并且该骨修复材料的骨诱导活性好，能为血管和成骨细胞长入提供骨引导性基质，并诱导间充质干细胞向骨细胞转化。
为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：
一种骨修复材料，该骨修复材料由以下按重量份数计的组分：
半水硫酸钙90份
鹿瓜多肽注射液10-30份
纯水0-20份
经过混合、搅拌直至混合液呈凝胶状，再将混合液注入模具，然后在8-10MPa压强下，将模具中的混合液压制成片，最后取出并置于常温下挥发，固化而制成。
作为优选，所述鹿瓜多肽注射液为30份；所述纯水为0份。
作为优选，所述鹿瓜多肽注射液为15份，纯水为15份。
作为优选，所述的半水硫酸钙晶体的平均长度在30-35μm之间，平均宽度在24-29μm之间，平均长径比在1.25-1.30之间。
作为优选，所述的半水硫酸钙晶体的平均长度为33μm，平均宽度为26μm，平均长径比为1.27。
一种上述骨修复材料的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
a.将所述半水硫酸钙、鹿瓜多肽注射液和纯水三种混合或者半水硫酸钙和鹿瓜多肽注射液两种混合，再充分搅拌直至混合液呈凝胶状，形成凝胶状的混合液；
b.将步骤a所得混合液注入模具中，经过8-10MPa的压强作用下，将模具中的混合液压制成片，并在常温下使溶剂挥发，固化得到固化物；
c.将步骤b中所得的固化物置于细胞培养皿中，放入37℃水浴箱中24h加强固化。
d.最后将步骤c所得的固化物经环氧乙烷消毒后，得到骨修复材料成品。
作为优选，步骤b中所述压强为10MPa。
作为优选，步骤b中所述模具为直径5mm的模具。
本发明采用了上述组分比例和方法制备出来的骨修复材料，这种骨修复材料与现有的骨修复材料相比，具有以下优点：
一、该骨修复材料与人体的生物相容性好，原因在于该修复材料选用了半水硫酸钙作生物相容性好的材料作为原材料，并且鹿瓜多肽注射液在半水硫酸钙中混合非常均匀，分散性好，再挥发、固化制成，该复合材料的生物相容性要优于单纯半水硫酸钙。
二、该骨修复材料的成骨性能良好，具有很好的骨诱导活性。作为骨骼空隙的填充物或骨移植手术中作为人造骨时，该骨修复材料不仅能持续地释放鹿瓜多肽，延长其半衰期，实现活性因子的靶向释放，在骨缺损局部发挥高效的诱导成骨作用，为血管和成骨细胞长入提供骨引导性基质，形成稳定的新骨生长环境，并诱导间充质干细胞向骨细胞转化；同时也能为植骨区域提供一定的力学支撑能力。该骨修复材料用在人体骨骼修复中，降解速度与单纯硫酸钙相同，但能加速机体成骨时间，平均2.5个月即可完成骨缺损的修复。
具体实施方式
下面对本发明做进一步描述。
实施例1：
一种骨修复材料，该骨修复材料由半水硫酸钙和鹿瓜多肽注射液按照重量比为90:30的比例混合，再经过如下步骤制备而成：
(1)按90:30的比例将定量的半水硫酸钙与鹿瓜多肽注射液混匀，充分搅拌，直至半水硫酸钙均匀分布于鹿瓜多肽注射液中，混合液呈凝胶状。若简单混合，并未将其搅拌至凝胶状，表明搅拌未充分，结果会导致半水硫酸钙没有足够分散在鹿瓜多肽注射液中，最终导致骨修复材料的成骨活性的不均一，从而降低其成骨速度
(2)将上述步骤(1)所得混合液注入直径5mm的模具中，在10MPa压强作用下，将模具中的混合液压制制成3mm厚度片状材料；并在常温下，使得溶剂挥发，得到固化物。
(3)将上述步骤(2)中所得的固化物置于细胞培养皿中，放入37℃水浴箱中24h加强固化。
(4)最后将步骤(3)所得的固化物在400mg/l的环氧乙烷下，常压消毒2小时，得到骨修复材料成品，并放入温度为4℃冰箱密封、避光保存。
其中上述作为原料的半水硫酸钙是经环氧乙烷消毒的，上述整个加工过程在无菌环境中进行。
上述半水硫酸钙由中国科学院宁波材料所提供，半水硫酸钙晶体的平均长度是33μm之间，平均宽度是26μm，平均长径比是1.27。上述鹿瓜多肽注射液由哈尔滨誉衡有限公司提供。鹿瓜多肽注射液中有效成份是鹿瓜多肽，其中鹿瓜多肽是一种是的复方制剂，商品名为松梅乐，由鹿科动物梅花鹿的骨骼和葫芦科植物甜瓜的干燥成熟种子经分别提取后制成的灭菌水溶液，主要含有多种骨诱导多肽类生物因子、甜瓜籽提取物、多种游离氨基酸和有机钙、磷等成分，具有调节骨代谢，刺激成骨细胞增殖，促进新骨形成的作用，亦可调节钙磷代谢，增加骨钙沉积，防止骨质疏松，并具有抗炎、镇痛、抗风湿等作用。多项实验研究表明，其能促进骨组织中BMP-2、VEGF等细胞活性因子表达的增加，进而促进新骨的形成，利于骨折的愈合。
实施例2：
实施例2与实施例1不同之处在于，本实施例的骨修复材料由半水硫酸钙、鹿瓜多肽注射液和纯水按照重量比为90:15:15的比例混合的原料制成。其中的半水硫酸钙晶体的平均长度是30μm之间，平均宽度是25μm，平均长径比是1.25。
其中的制备方法中，步骤(2)是在10MPa作用下，将模具中的混合液压制制成3mm厚度片状材料，再常温下使其挥发，得到固化物。
其余制备步骤均与实施例1一致。
实施例3：
实施例2与实施例1不同之处在于，本实施例的骨修复材料由半水硫酸钙、鹿瓜多肽注射液和纯水按照重量比为90:10:15的比例混合的原料制成。其中的半水硫酸钙晶体的平均长度是33μm之间，平均宽度是26μm，平均长径比是1.28。
其中的制备方法中，步骤(2)是在8MPa作用下，将模具中的混合液压制制成3mm厚度片状材料，再在常温下使其挥发，得到固化物。
其余制备步骤均与实施例1一致。
实施例4：
实施例2与实施例1不同之处在于，本实施例的骨修复材料由半水硫酸钙、鹿瓜多肽注射液和纯水按照重量比为90:10:20的比例混合的原料制成。其中的半水硫酸钙晶体的平均长度是34μm之间，平均宽度是28μm，平均长径比是1.29。
其中的制备方法中，步骤(2)是在9MPa作用下，将模具中的混合液压制制成3mm厚度片状材料，再在常温下使其挥发，得到固化物。
其余制备步骤均与实施例1一致。
实施例5：
实施例2与实施例1不同之处在于，本实施例的骨修复材料由半水硫酸钙、鹿瓜多肽注射液和纯水按照重量比为90:30:5的比例混合的原料制成。其中的半水硫酸钙晶体的平均长度是33μm之间，平均宽度是27μm，平均长径比是1.27。
其余制备步骤均与实施例1一致。
对比例：
CCK-8细胞增殖-毒性实验：
将上述实施例1-5分别与现有的骨修复材料即单纯硫酸钙做五组CCK-8细胞增殖-毒性实验的对比实验，得到下表Ⅰ：
表Ⅰ：实施例1-5与现有技术相比
上述CCK-8细胞增殖-毒性实验是指利用CCK-8试剂盒所做的测试实验，CCK-8试剂盒是一种基于WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。其中CCK是Cell Counting Kit的简称，该实验的原理是：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。
该实验通过OD值反应细胞的增殖情况，OD值越大，意味着细胞的增殖越好。该实验所用的细胞为成骨细胞，这是成骨过程中主要的一种细胞。它的增殖情况越好，意味着骨修复的速度越快。上述表Ⅰ表明了采用本发明实施例1-5的骨修复材料，在其上成骨细胞增殖速度均快于采用单纯硫酸钙。
ALP试验：
将上述实施例1-5分别与现有的骨修复材料单纯硫酸钙做五组ALP试验。得到下表Ⅱ。
表Ⅱ:实施例1-5与现有技术相比
上述ALP试验是指利用碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒做的试验，碱性磷酸酶是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，是成骨细胞功能和分化程度的特异性指标，其活性的高低可作为评估成骨细胞成熟的指标，没有碱性磷酸酶，成骨钙化不能发生。
碱性磷酸酶是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，是成骨细胞功能和分化程度的特异性指标，其含量越高，意味着成骨细胞增殖、分化能力越强，也就表明骨的重建修复过程越活跃。表Ⅱ表明实施例1-5所采用的骨修复材料相比现有的单纯硫酸钙作为骨修复材料，其成骨细胞增殖、分化能力强，骨的重建修复过程活跃。
RT-PCR试验：
RT-PCR为反转录RCR(reverse transcription PCR)和实时PCR(real timePCR)共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。通过此种检测手段，检测细胞内成骨活性因子在RNA水平的表达情况。
将上述实施例1-5分别与现有的骨修复材料单纯硫酸钙做五组RT-PCR试验，得到下表Ⅲ。
表Ⅲ：实施例1与现有技术的对比
BMP：中文名为骨形态发生蛋白，人骨形态发生蛋白不但具有良好的诱导成骨活性，可作为成骨因子应用于骨组织工程领域，还是7种重要的发育调节因子。其中BMP-2与成骨密切相关。
RUNX2是转录因子RUNXX家族成员之一，作为成骨细胞的特异转录因子,对骨组织的形成和重建起着重要作用。RUNX2决定着多能干细胞向成骨细胞分化，促进软骨细胞的成熟和软骨的血管化。另外，RUNX2与破骨细胞和细胞外基质的形成也有关。
TGF-b1：转化生长因子β1(transforming growth factor)TGF-β1在骨的形成和重建等方面起着重要作用。
可见，上述BMP-2、RUNX-2、TGF-b1均是成骨过程当中起重要作用的成骨活性因子，这些活性因子有助于提高成骨效率，加快骨缺损的修复。根据表Ⅲ数据可知，本发明实施例1-5在诱导成骨、促进干细胞向成骨细胞分化以及加速骨的形成等方面明显优于现有的骨修复材料。
Claims (7)
1.一种骨修复材料，其特征在于：该骨修复材料由以下按重量份数计的组分：
半水硫酸钙90份
鹿瓜多肽注射液10-30份
纯水0-20份
经过混合、搅拌直至混合液呈凝胶状，再将混合液注入模具，然后在8-10MPa压强下，将模具中的混合液压制成片，最后取出并置于常温下挥发，固化而制成；
所述的半水硫酸钙晶体的平均长度在30-35μm之间，平均宽度在24-29μm之间，平均长径比在1.25-1.30之间。
2.根据权利要求1所述的一种骨修复材料，其特征在于：所述鹿瓜多肽注射液为30份；所述纯水为0份。
3.根据权利要求1所述的一种骨修复材料，其特征在于：所述鹿瓜多肽注射液为15份，纯水为15份。
4.根据权利要求1所述的骨修复材料，其特征在于：所述的半水硫酸钙晶体的平均长度为33μm，平均宽度为26μm，平均长径比为1.27。
5.一种如权利要求1所述骨修复材料的制备方法，其特征在于：该制备方法包括如下步骤：
a.将所述半水硫酸钙、鹿瓜多肽注射液和纯水三种混合或者半水硫酸钙和鹿瓜多肽注射液两种混合，再充分搅拌直至混合液呈凝胶状，形成凝胶状的混合液；
b.将步骤a所得混合液注入模具中，经过8-10MPa的压强作用下，将模具中的混合液压制成片，并在常温下使溶剂挥发，固化得到固化物；
c.将步骤b中所得的固化物置于细胞培养皿中，放入37℃水浴箱中24h加强固化；
d.最后将步骤c所得的固化物经环氧乙烷消毒后，得到骨修复材料成品。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤b中所述压强为10MPa。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤b中所述模具为直径5mm的模具。
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