JP2015192867A - 骨細胞増殖用足場材料およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞親和性および骨伝導性を有し、また強度ももった骨細胞増殖用足場材料として、基材膜の片面にリン酸カルシウムを析出させたキチン・キトサン膜を効率よく製造する方法が嘱望されている。【解決手段】キチン・キトサン膜同士を重ね合わせて密着させ密着膜を得る工程と、前記密着膜の両面にリン酸カルシウムを生成する工程と、前記密着膜を前記キチン・キトサン膜同士に分ける工程を含むことを特徴とする骨細胞増殖用足場材料の製造方法によって、リン酸カルシウムを片面だけに析出させたキチン・キトサン膜が容易に作製することができる。【選択図】図２

Description

この発明は、関節部に用いる骨細胞増殖用足場材料に関するものであり、より詳しくは片面のみにリン酸カルシウムを生成させた骨細胞増殖用足場材料を効率よく製造する製造方法および骨細胞増殖用足場材料に係る発明である。

けがや病気などによって骨に大きな欠損ができた場合、生体の本来もつ再生・修復能力には限界があるが、細胞が増殖するための土台である「足場」材料があると再生・修復が促進されることが知られている。そのため、足場材料を用いた骨の修復に関する研究開発が行われ、注目を集めている。

足場材料の原料として用いられる高分子には、コラーゲンなどの天然高分子やポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびそれらの共重合体などの生体吸収性合成高分子が用いられ、これらが無数の互いにつながった小さい孔を持つスポンジ（多孔質）状だと細胞の分布が均一になり、再生能力が大きく向上することがわかっている。

コラーゲンはすぐれた細胞親和性をもつが、スポンジに加工したものの力学強度は低く、容易に変形してしまうという問題があった。一方、乳酸とグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）のような合成高分子はコラーゲンスポンジよりも高い力学強度をもつ多孔質材料が得られる上、体内で吸収される性質をもつため、再生材料として用いられている。しかし、合成高分子は、細胞との親和性はコラーゲンよりも低い。

そこで、天然高分子、生体吸収性合成高分子の欠点をたがいに補い、長所をいかすために、両者を複合化した多孔質足場材料が提案されている。また、足場材料のみでは骨欠損の再生を刺激する能力に限界があるため、骨形成の誘導能力を高める因子を導入することで、さらに高い再生を実現できる足場材料の開発が進められている。

例えば、水酸アパタイトに代表されるリン酸カルシウム化合物は、生体適合性や表面に骨の形成が促進されるとの骨伝導性に優れるが、固くてもろく成形性の悪いセラミックスである。一方、キチン・キトサンは、骨伝導性はないが生分解性の高分子であり、生体適合性に優れた靱性のある材料である。そこで、これらを組合わせた複合材料が、ＧＢＲ（Ｇｕｉｄｅｄ Ｂｏｎｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）などとして検討されている（特許文献１）。

また、これらの材料の作製方法としては、リン酸カルシウム粉末とキチン・キトサンとを混合成形したり、キチン・キトサン膜表面にリン酸基を導入し、次いで擬似体液に浸漬するなどでその複合膜を作製する方法が知られている。

人工関節などの固定や椎体（背骨を構成する骨）の形成術には、生体活性セメントが用いられる。この生体活性セメントがリン酸カルシウム粉末を基材として用いるものである。その後の研究で、リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ：ＣａＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ）とリン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ：Ｃａ_４（ＰＯ_４）_２Ｏ）の混合粉に硬化液として水とリンゴ酸とキトサンを用いることで、生理温度で短時間に硬化し、高靭性を有する生体活性セメントが得られるという知見が知られている。

特開平１０−１０１８２３号公報

特許文献１は、キチン・キトサン材料の表面全面（両面）にリン酸カルシウムを生成させるものである。しかし、例えば、軟骨欠損部など骨との結合が必要なのは片面だけという場合もある。このような箇所に両面ともリン酸カルシウムを生成させたキチン・キトサン材料を用いると、軟骨同士が対向する部分にも骨が形成されてしまい、適当ではない。

また、関節の軟骨部においては、ある程度分厚い骨細胞増殖用足場を配置する必要がある。しかし、キチン・キトサン膜は、単層で分厚い膜を作製すると膜の厚み方向の中央部分の靱性が低下する。したがって、靱性を有する薄い骨細胞増殖用足場を複数枚重ねてある程度の厚みを稼ぐ必要がある。

したがって、キチン・キトサン膜の片面だけにリン酸カルシウムを生成させた骨細胞増殖用足場を効率よく作製する方法が嘱望される。

また、硬化した生体活性セメントは内部に適度な空隙がなく、骨細胞の侵入、骨との同化が困難であった。リン酸水素カルシウム二水和物とリン酸四カルシウムは、硬化させる際の硬化液中に中分子量キトサンを含有させることで、破骨細胞様環境下で多孔化することが見出されていた。しかし、骨細胞と同化するには十分な細孔を有しているとは言えなかった。

本発明は上記課題に鑑み、想到されたものであり、キチン・キトサン材料の片面だけに、リン酸カルシウムを生成させた骨細胞増殖用足場材料を効率よく作製する方法を提供するものである。

より具体的に、本発明の骨細胞増殖用足場材料の製造方法は、
キチン・キトサン膜同士を重ね合わせて密着させ密着膜を得る工程と、
前記密着膜の両面にリン酸カルシウムを生成する工程と、
前記密着膜を前記キチン・キトサン膜同士に分ける工程を含むことを特徴とする。

また、上記の骨細胞増殖用足場材料の製造方法において、
前記密着膜の両面にリン酸カルシウムを生成する工程は、
リン酸を含む溶液に前記密着膜を浸漬する工程と、
カルシウムを含む溶液に前記密着膜を浸漬する工程とを含むことを特徴とする。

また、上記の骨細胞増殖用足場材料の製造方法において、
前記密着膜の両面にリン酸カルシウムを生成する工程は、
前記密着膜の両面にカルシウムと結合しやすい官能基としてリン酸を導入する工程と、
前記密着膜をカルシウムを含む液に膜に浸漬する工程を含むことを特徴とする。

また、前記密着膜を得る工程は、
キチン・キトサン膜同士を重ね合わせて減圧下で保持する工程を含むことを特徴とする。

また、本発明に係る骨細胞増殖用足場材料は、片面にリン酸カルシウムを有するキチン・キトサン膜を複数枚積層したことを特徴とする。

また、本発明に係る生体活性セメントの製造方法は、
リン酸水素カルシウム二水和物とリン酸四カルシウムを混合しセメント粉を得る工程と、
水と中分子量キトサンとリンゴ酸と低分子量キトサンを混合して硬化液を得る工程と、
前記セメント粉と前記硬化液を混合して錬和物を得る工程を有することを特徴とする。

本発明に係る骨細胞増殖用足場材料の製造方法によれば、片面だけリン酸カルシウムを生成させた骨細胞増殖用足場材料を効率よく作製することができる。これによりリン酸カルシウムが生成していない側にキチン・キトサン膜を重ねることで、容易に分厚く、また靱性を有する膜を得ることができる。

また、この膜は片面だけにリン酸カルシウムが生成されているので、関節部で軟骨が対向する部分に好適に用いることができる。

基材膜を２つに折り、密着膜を得る工程を示す図である。 密着膜の両外面にリン酸カルシウムを析出させ、再び開く工程を示す図である。 内側面（未処理面）と外側面（処理面）のＳＥＭ写真である。 内側面（未処理面）と外側面（処理面）のＥＤＳ測定結果である。 基材膜の引っ張り試験の結果を示すグラフである。 リン酸エステル化処理をしていないものと、片面だけ、両面ともリン酸エステル化処理を行ったものとの強度の違いを示すグラフである。 生成物Ａの回折図形とリン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ：ＩＣＣＤ ＃２５−１１３７）の回折線図を示すチャートである。 ＴＴＣＰをメノウ乳鉢で粉砕し、ふるいを用いて分級した粒子と、市販品をボールミルで湿式粉砕したＤＣＰＤのレーザー回折／散乱式による粒度分布を示すグラフである。 粉砕時間を短縮し、ふるいパス回数を増やして得られたＴＴＣＰ粉と粉砕時間を更に長くして得られたＤＣＰＤの粒度分布を示すグラフである。 ＴＴＣＰとＤＣＰＤの粒径が異なるＣＰＣの圧縮強度を示すグラフである。 低分子量キトサン、あるいは中分子量キトサンを添加したＣＰＣについて、浸漬時間による圧縮強度の変化を示すグラフである。 セメント粉と硬化液の比（Ｐ／Ｌ比）による圧縮強度の変化を示すグラフである。 ＣＰＣについて、破骨細胞が作り出す環境下であるｐＨ５．５に調製した酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液中での吸収性試験の結果を示すグラフである。 吸収性ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験前後での乾燥試験片表面のＳＥＭ像を示す写真である。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。なお、以下は本発明の一例を示すものであり、本発明の趣旨を逸脱しない限り、以下の実施形態および実施例を変更しても本発明の技術的範囲に含まれるのは言うまでもない。

（実施の形態１）
本発明に係る骨細胞増殖用足場材料の製造方法では、基材となる膜（「基材膜」とも呼ぶ。）の一方の面を他の膜と密着させ密着膜を形成し、この密着膜の両面にリン酸カルシウムを析出させた後、密着膜を再び剥がし、片面だけリン酸カルシウムが析出した骨細胞増殖用足場材料を得る。

基材膜としては、キチン若しくはキトサンの少なくとも一方を含む膜が好適に利用できる。したがって、キチン膜、キトサン膜若しくはキチンとキトサンの混合膜が望ましい。これらの材料は骨と結びつく性質（骨伝導性）はないものの、靱性を有しており、関節軟骨の代用品として好適であるからである。キチン膜、キトサン膜若しくはキチンとキトサンの混合膜をキチン・キトサン膜と呼ぶ。

基材膜は厚さ数ｍｍ以下の膜状に形成する。１０ｍｍ以上の厚さになると、厚み方向の中央付近が乾燥しにくくなり、膜強度が低下するからである。厚い１枚の基材膜よりも、薄い複数枚の基材膜を重ねた方が、膜強度は増加する。なお、基材膜は、平坦な基台上に溶解させた基材膜の溶液を流しっぱなしにする（キャストする）だけの方法で形成してもよいし、平坦な基台上に基材膜の溶液を塗布して均一な厚みの膜に形成してもよい。

密着膜を作製する際に、基材膜の一方の面に密着させる他の膜は、同様にして作製した他の基材膜で行うのが好適である。同じ基材膜を用いれば、密着膜の両面にリン酸カルシウムを析出させることで、一度に２枚の骨細胞増殖用足場材料を得ることができるからである。また、基材膜の一方の面に液密に密着し、再度剥離することができる膜であって、毒性等がないものであれば、特に限定されるものではなく、他の種類の膜を用いることもできる。

密着膜は、基材膜を折り曲げて対向面同士を液密に密着させてもよい。別々の２枚の基材膜を重ねて液密に密着させるより、大きめの１枚の基材膜を折り曲げて、密着膜を形成する方が、容易に形成できるからである。図１には、この様子を示す。基材膜１は、２つに折られ対向面を合わせて密着させる（図１（ａ））。対向面を内側面２と呼び、外側に露出している面を外側面４と呼ぶ。２つに折られ内側面２を密着させた状態が密着膜１０となる（図１（ｂ））。密着膜１０の表面および裏面（「両外面」と呼ぶ。）は、どちらも基材膜１の外側面４である。

図２を参照する。出来上がった密着膜１０の両外面にリン酸カルシウム１５を析出させる（図２（ａ））。析出させる方法は特に限定されない。リン酸を含む溶液とカルシウムを含む溶液に交互に浸漬させる交互浸漬法、カルシウムと結合しやすい官能基を外側面に導入し、その後、カルシウムを含む溶液に浸漬するバイオミメティック法などが好適に利用できる。

その後密着膜１０同士を剥がす（図２（ｂ））。基材膜１自体を２つに折った場合は、内側面２を開く。このようにすることで、一方の面（外側面４）だけにリン酸カルシウムを析出させた骨細胞増殖用足場材を得ることができる。

薄い骨細胞増殖用足場材は膜強度が高く、複数枚重ねることで厚みのある骨細胞増殖用足場材とすることができる。また、一方の面４にリン酸カルシウム１５を析出させた基材膜１を積層することで、基材膜１間に栄養成分が滲み込みやすくなり、骨伝導性により好適な環境を得ることができる。

（実施の形態２）
本発明に係る生体活性セメントは、リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ：ＣａＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ）とリン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ：Ｃａ_４（ＰＯ_４）_２Ｏ）を原料に用いる。リン酸水素カルシウム二水和物とリン酸四カルシウムは、混合液中で溶解度以下の濃度にすると（１）、（２）式に従って、Ｃａ^２＋とＰＯ_４ ^３−等が溶出し、ハイドロキシアパタイト（以後「ＨＡｐ」とも記す。）に対してＣａ^２＋とＰＯ_４ ^３−などが過飽和になれば、（３）式に従いＨＡｐが析出する。ＨＡｐ結晶は針状に成長し、相互に絡み合うことで固化・硬化する。

キチン・キトサンの分子量はそれらの由来および調理法によって大きく異なっている。分子量が１．０×１０^５以上のものを高分子量キトサン、１．０×１０^４以下のものを低分子量キトサン、それ以外の分子量のものを中分子量キトサンとよぶ。キトサンは分子量により粘度に差があり、キトサンの分子量測定で最も一般的なのが粘度法である。キトサンの分子量と粘度の関係を表１に示す。

低分子量キトサンおよび中分子量キトサンは、粘度による分級方法で選別したものであってもよい。例えば表１の分級にしたがって、選別してもよい。

リン酸四カルシウムおよびリン酸水素カルシウム二水和物は、公知の方法で得ることができる。これらを混合してセメント粉は調製される。調製の際にリン酸四カルシウムの平均粒径は、リン酸水素カルシウム二水和物の平均粒径より大きいことが望ましい。より具体的には、リン酸四カルシウムの平均粒径は、３０〜５０μｍであり、リン酸水素カルシウム二水和物の平均粒径は２〜８μｍが好ましい。したがって、リン酸四カルシウムの平均粒径は、リン酸水素カルシウム二水和物の平均粒径の３．５倍から２５倍大きいことが望ましい。

硬化液は、水、低分子量キトサン（（Ｃ_６Ｈ_１１ＮＯ_４）_ｎ、ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ、 ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ２０−２００ｍＰａ・ｓ、 ＡＲＤＲＩＣＨ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、あるいは、中分子量キトサン（（Ｃ_６Ｈ_１１ＮＯ_４）_ｎ、ｍｅｄｉｕｍ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ、 ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ２００−８００ｍＰａ・ｓ、 ＡＲＤＲＩＣＨ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）とリンゴ酸を溶解して作製される。特に本発明に係る生体活性セメントは低分子量キトサンを必ず含ませる。

水は、超純水を用いるのが望ましい。ここで超純水とは、比抵抗が１８．２ＭΩ・ｃｍのものだけでなく、１５ＭΩ・ｃｍ以上の物であってもよい。

セメント粉と硬化液は、２〜４の比率（重量比）で混合するのが望ましい。これらを混合した錬和物は、水中で静置することで硬化し硬化体となる。錬和物は硬化させる前に型中に入れて形を形成しておけば、所望の形状の硬化体を得ることができる。本発明に係る生体活性セメントは、錬和物を体内に注入したり、直接必要な箇所に塗布することで体内に配置する。したがって、実用される場合は、硬化は体内で行われる。

以上のようにして得た生体活性セメントは、Ｃａの溶出量が多い。また、圧縮強度も実用化レベルであり、表面にも１０μｍ程度の空隙が多数観察される。よって、骨と同化しやすい性質を有する。

＜実施例１：膜材料＞
以下に実施例を示す。基材膜１はキチン・キトサン膜を用いた。市販のキトサン粉末（脱アセチル化度７５％）を酢酸に溶解し、基台上にキャストし、７０℃の環境で乾燥した。その後、水酸化ナトリウム水溶液に浸し、不溶化処理をおこない、厚みが約２ｍｍのキチン・キトサン膜を得た。

このキチン・キトサン膜を基台と接触していた面を内側面２とするように折りたたみ、１Ｐａの減圧下に２時間置くことで密着させ、密着膜１０を得た。

次に密着膜１０を、尿素を含むＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液に浸し、窒素雰囲気下で、１００℃まで昇温した。次いで、正リン酸とＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液を加え、１時間還流した。１時間後、降温し、６０℃程でＮ_２ガスの導入を止めた。密着膜１０から未反応物質を除去し十分に水洗した。

このように処理された密着膜１０は、外側面４がリン酸エステル化された密着膜１０となった。次にリン酸エステル化された密着膜１０を、飽和水酸化カルシウム溶液に入れ、室温〜体温程度の環境で２４時間から４８時間の間保持した。この処理が密着膜１０の両外面にリン酸カルシウムを生成する工程である。

その後、密着膜１０の内側面２を開いて骨細胞増殖用足場材料（以後単に「足場材料」とも呼ぶ。）を得た。なお、密着膜１０（基材膜１）の内側面２であった方の面を足場材料の未処理面と呼び、外側面４であった方の面を足場材料の処理面と呼ぶ。また、密着膜１０は糊付けしてはいないので、ピンセットで容易に剥がすことができた。

図３に足場材料のＳＥＭ写真を示す。図３（ａ）は、足場材料の外側面４のＳＥＭ写真であり、図３（ｂ）は足場材料の内側面２のＳＥＭ写真である。

基材膜１は半透明であり、外側面４がリン酸エステル化されてもほぼ同様にやや灰色に見える。しかし、飽和水酸化カルシウム処理すると、外側面４が白色を帯びた。足場材料の外側面４を、ＳＥＭで拡大して見ると、図３（ａ）に示すように繊維状の細長い析出物が観察された。

リン酸エステル化したキチン・キトサン膜を飽和水酸化カルシウム溶液に浸漬すれば、部分加水分解により、リン酸がキチン・キトサン膜近傍に生成し、飽和水酸化カルシウム溶液のＣａ^２＋と結合して、リン酸カルシウムが析出すると考えられる。

なお、飽和水酸化カルシウム溶液はｐＨ１２程度で強い塩基性であり、塩基性ではリン酸カルシウム化合物の中で最も溶解度積が小さいアパタイトあるいはその前駆体が析出する。よって、局所的にアパタイトあるいはその前駆体が析出し、それにより、その近傍のリン酸カルシウムの濃度が高まり、更に析出が促進されると思われる。つまり、上記の手順では、リン酸カルシウムは、粒子状の析出物として得られる可能性が高いと考えられた。

一方、足場材料の内側面２である図３（ｂ）を見ると、析出物がほぼ見られず、視野内が全体的に平坦に見えた。

図４（ａ）、（ｂ）に図３（ａ）、（ｂ）に示したサンプルのＥＤＳ（エネルギー分散型Ｘ線分光法）プロファイルを示す。横軸はエネルギー（ｋｅＶ）であり、縦軸はカウント数である。図中でリンのピークは「Ｐ」と矢印で表し、カルシウムのピークは「Ｃａ」と矢印で表した。また、ピークの頂点をバツ印「×」で表した。

飽和水酸化カルシウムに晒した外側面４（図４（ａ））は、内側面２（図４（ｂ））と比較すると、リンとカルシウムのピークが多く観測された。また、未処理面側（図４（ｂ））では、リンとカルシウムを含む析出物はごくわずかであった。本発明に係る製造方法によれば、外側面４だけにリン酸カルシウムを析出させたキチン・キトサン膜（骨細胞増殖用足場材料）を得ることができた。

次に作製したキチン・キトサン膜の力学的特性を引っ張り試験で調べた。測定試料は、幅５ｍｍ、長さ３０ｍｍの長方形にした。なお、長さ方向の両端にはそれぞれ１０ｍｍずつの引っ張り試験機のチャックの固定代を設けた。したがって、測定試料の長さは、固定代も合わせて５０ｍｍ（チャック間距離が３０ｍｍ）となった。測定試料の膜厚は、測定部分（３０ｍｍの部分）のうち、両端付近および中央部の３点の膜厚を測定し、平均したものをその測定試料の膜厚とした。

引っ張り試験は、チャックの離隔速度１ｍｍ／ｓｅｃとし、測定試料が破断するまで引張った。横軸に伸び（ｍｍ）、縦軸に力（Ｎ）として得たチャートより、破断応力（ＭＰａ）と、弾性率（ＭＰａ）を求めた。

図５に、膜厚と破断応力の関係を示す。横軸は膜厚（ｍｍ）であり、縦軸は破断応力（ＭＰａ）である。厚みが薄い試料の方が破断応力は高かった。これより、所定の厚みの骨細胞増殖用足場材料を得ようとした際には、厚い基材膜で構成するのではなく、薄い基材膜を複数枚重ねる方が強い足場材料を得ることができると結論できる。

図６には、基材膜１（キチン・キトサン膜）をリン酸エステル化処理した場合の応力の影響を示す。横軸は歪（無次元）であり、縦軸は応力（ＭＰａ）である。（ａ）は、リン酸エステル化処理をしていないもの（基材膜１のみ）であり、（ｂ）は片面だけにリン酸エステル化処理を行ったものであり、（ｃ）は両面をリン酸エステル化処理を行ったものである。

片面だけのリン酸エステル化処理（ｂ）は、基材膜１だけの場合（ａ）と比較してほぼ同じ特性を示している。しかし、両面ともリン酸エステル化処理をしたもの（ｃ）は、引っ張り試験の最中にチャックの部分で膜が破断した。このように片面だけのリン酸エステル化処理は、基材膜１の機械的な強度を損なうことがない。したがって、１つの膜を薄く作製し、複数枚を積層することで、強度を有する骨細胞増殖用足場材料を得ることができる。

＜実施例２：セメント材料＞
以下生体活性セメント（リン酸カルシウムセメント：ＣＰＣ）の調製と、各評価方法および評価結果について説明する。

＜生成物Ａ（リン酸四カルシウム：ＴＴＣＰ）の調製＞
市販品の水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）_２、特級、ナカライテスク株式会社）とリン酸（Ｈ_３（ＰＯ）_４、特級、和光純薬工業）を原料に用いた。Ｃａ／Ｐ比が２となるようにＣａ（ＯＨ）_２を３１．３２ｇ（０．４１ｍｏｌ）、Ｈ_３（ＰＯ）_４を２３．０６ｇ（０．２０ｍｏｌ）、上皿電子分析天びん（ｓｅｆｉ ＩＢＡ−２００、アズワン）で精秤し、それらを、４００ｍＬ、５０ｍＬの超純水にそれぞれ加えた。超純水は超純水製造装置（ＤｉｒｅｃｔＱ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）からメスシリンダーで採取した。

得られたＣａ（ＯＨ）_２水溶液にＨ_３（ＰＯ）_４水溶液を攪拌しながら少量ずつ滴下した。攪拌は、ホットスターラー（ＲＳＨ−１０、アズワン）を用いて行った。滴下後、溶液を２４時間室温で熟成させた。その後、遠心分離機（インバーター・コンパクト高速冷却遠心機６９００、久保田製作所）を用い５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。

上澄み液をデカンテーションで除き、さらに５０００ｒｐｍで７分間遠心分離した。分離した沈殿物を、ろ別し、乾熱減菌機（ＤＯＶ−４５０Ｐ、アズワン）で１１０℃、２４時間乾燥させた。乾燥させた試料をアルミナ製ボート（ＳＳＡ−Ｈ２Ｂ、日化陶）に入れ、電気炉（Ｓｕｐｅｒ ｍｉｌｌ、ＭＡＲＵＳＨＯ ＥＬＥＣＴＲＯ−ＨＥＡＴ ＣＯ、 ＬＴＤ）で、大気中、１５００℃、５時間焼成した。昇降温速度は１０℃／ｍｉｎとした。

焼成後、試料を電気炉から取り出し、超硬質鋼乳鉢（ＷＤ型、伊藤製作所）で粉砕し、さらにメノウ乳鉢で微粉砕し、生成物Ａを得た。後述する組成確認で生成物Ａはリン酸四カルシウムであることが確認される。

＜リン酸水素カルシウム二水和物の調製＞
リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ：ＣａＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、和光純薬工業、特級）を上皿天秤で１５．００ｇ精秤し、超純水１８０ｍｌ、ジルコニアボール５００ｇと共にポットミルに加えた。超純水はメスシリンダーで、ジルコニアボールは上皿天秤で秤量した。室温、１１０ｒｐｍで４８時間、一軸型ボールミル（Ａ−３、ニッカトー）にて湿式粉砕した。

得られた湿式粉砕生成物を吸引ろ過し、シャーレに入れ、定温乾燥機（ＤＶＳ４０２、アズワン）内、５０℃で２４時間乾燥した。得られた試料をメノウ乳鉢で解砕した。

＜セメント粉末の調製＞
セメント粉末は以下の方法で調製した。合成した生成物Ａ（ＴＴＣＰ）６．８０ｇ（０．１８６ｍｏｌ）とリン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）３．２０ｇ（０．１８６ｍｏｌ）を、それぞれを上皿天秤で精秤し、５０ｍｌネジ付試験管（アズワン）に入れ、振とう機（ＭＡＬＴＩ ＳＨＡＫＥＲ ＭＳ−３００、アズワン）に設置し１３００ｒｐｍ、１００分間振とう混合した。混合物をメノウ乳鉢で５分間乾式混合し、セメント粉とした。

＜硬化液の調製＞
硬化液は超純水に、低分子量キトサン（（Ｃ_６Ｈ_１１ＮＯ_４）_ｎ、ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ、 ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ２０−２００ｍＰａ・ｓ、 ＡＲＤＲＩＣＨ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、あるいは、中分子量キトサン（（Ｃ_６Ｈ_１１ＮＯ_４）_ｎ、ｍｅｄｉｕｍ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ、 ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ２００−８００ｍＰａ・ｓ、 ＡＲＤＲＩＣＨ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）と、リンゴ酸（Ｃ_４Ｈ_６Ｏ_５、ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ_２−ＣＯＯＨ、和光純薬工業、特級）を溶解したものを用いた。それぞれ上皿天秤で精秤した。キトサン、リンゴ酸の順に超純水に加え、液が完全に透明になるまで攪拌することで溶解し、硬化液を得た。

＜生体活性セメントの調製（圧縮試験用）＞
以下のように硬化体の試料を作製した。セメント粉１ｇ、硬化液０．３３ｇを上皿天秤で精秤した。硬化液は練和の際に使用するヘラの上にのせて上皿天秤を用い秤量した。セメントの練和はガラス板の上、大気中（２５℃）で行った。セメント粉は１／３ずつに分けた。はじめに硬化液をガラス板に薄く伸ばし、セメント粉の１／３を硬化液に刷り込むよう１０秒間練和した。次の１／３を加え同様に２０秒間練和、残りの１／３を加えて２０秒で練和した。その後、ヘラを用いてガラス板上に薄く伸びた練和ペーストを回収し、ステンレス製薬さじを用いて更に２０秒間練和し錬和物を得た。合計７０秒間で練和を終了した。

上記の要領で得た練和物を、直ちにテフロン（登録商標）製割型（内径φ６×１２の円柱型）に注入した。注入には、ステンレスの薬さじとガラス棒（φ５．６）を用いた。なるべく気泡が入らないように、薬さじである程度注入し、適宜ガラス棒で上から押さえた。テフロン（登録商標）製割型は割型で、ＪＩＳ規格（Ｔ６６２０−（１９９３））に準拠して作製した。したがって、分解することで型中に注入した試料を取り出せる。

練和物を注入したテフロン（登録商標）割型ごと、３７℃に保持したクールインキュベータ（ＣＮ−４０Ａ、三菱電機エンジニアリング）中に置いたガラス容器中に入れた。湿度１００％を維持するために、ガラス容器の底に、超純水に浸漬済みのスポンジを敷き詰めた。ガラス容器中で１時間保持後、テフロン（登録商標）製割型を慎重に分解して固化した練和物を取り出した。

固化した練和物を、５０ｍｌの超純水を入れたスクリュー管瓶中に浸漬し、クールインキュベータ中３７℃で２４時間静置し硬化体を得た。以上の様に得られた硬化体を、圧縮試験の直前に超純水から取り出し、表面の水分を拭って圧縮試験片とした。

圧縮強度測定は、万能試験機（ＡＵＴＯＧＲＡＰＨ ＡＧ−１０、ＳＨＩＭＡＤＺＵ）で行った。引張方向を圧縮方向に転換する引張−圧縮変換器を用いた。５ｋＮロードセル（８７３９４、ＳＨＩＭＡＤＺＵ）を選択し、測定条件は、ヘッドスピード０．５００ｍｍ／ｓｅｃ、サンプリング間隔１００ｍｓｅｃとしソフトウェア（Ｔｒａｐｅｚｉｕｍ、島津製作所）を用いて測定を行った。

圧縮強度の有意差検定は、カレイダグラフ（ヒューリンクス）の分散分析（ＡＮＮＯＶＡ）を用いて行った。結果は後述する。

＜試料片の作成（吸収性ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験用）＞
破骨細胞が作り出す環境下であるｐＨ５．５の溶液中にて．試料からのカルシウムイオン溶出量、質量減少量の測定をおこなった。試料は、練和後３７℃湿度１００％で固化、さらに３７℃の超純水５０ｍｌ中、７日浸漬して硬化させた後、表面の水分をぬぐい、定温乾燥機中、５０℃、２４時間乾燥して、試験片とした。つまり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験用のサンプルは硬化の後乾燥させてある。

＜０．０８ｍｏｌ／Ｌ 酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐｈ５．５）の調製＞
ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行うにあたり、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液と校正用のＣａ標準液を調製した。

酢酸４．８０４ｇ（０．０８ ｍｏｌ、ＣＨ_３ＣＯＯＨ、和光純薬工業、特級）を上皿天秤で精秤し、超純水を加えてメスシリンダーを用いて１Ｌに定容した。得られた溶液を０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液と称する。一方、酢酸ナトリウム６．５６２ｇ（０．０８ｍｏｌ、ＣＨ_３ＣＯＯＮａ、和光純薬工業、特級）を上皿天秤で精秤し、同様に１Ｌに定溶して、得られた溶液を０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液と称する。

この作業を２回繰り返し、０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液を２Ｌ作製した。酢酸溶液２．０ｍｌと酢酸ナトリウム溶液Ｘｍｌを採取して「試し混合」し、ｐＨ５．５０±０．０２になるＸを求めた．ｐＨ値はｐＨメーター（ＰＣＳ Ｔｅｓｔｅｒ、ＯＡＫＴＯＮ）を用いた。Ｘ＝１３．０、１３．５、１４．０、１４．５で試し混合をおこない、Ｘ＝１４．０でｐＨ５．４９〜５．５０となった。

よって、０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液と０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液を混合比２．０：１４．０で混合することで０．０８ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．５０±０．０２の酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を調製できる事がわかった。この結果に基づき、０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液２００ｍｌと０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液１４００ｍｌを２００ｍｌメスシリンダーを用いて秤量し、ホットスターラーと攪拌子を用いて均一に混合して０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液２０００ｍｌを調製した。調製した緩衝液は、２Ｌポリ瓶に保管して用いた。

＜校正用１ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／ＬＣａ標準液の調製＞
１０００ｐｐｍＣａ^２＋標準液は以下の手順で調製した。硝酸９．１３２ｇ（０．１ｍｏｌ、ＨＮＯ_３、６９−７０ｍａｓｓ／ｍａｓｓ％、キシダ化学、特級）を上皿天秤で精秤し、超純水を加えてメスシリンダーで１０００ｍｌに定容し、０．１ｍｏｌ／Ｌ硝酸溶液とした。また、炭酸カルシウム２．５０２ｇを上皿天秤で秤量し、０．１ｍｏｌ／Ｌ硝酸溶液に溶解してメスシリンダーで１０００ｍｌに定容し、１０００ｐｐｍＣａ^２＋標準溶液とした。調製した標準は、１Ｌポリ瓶に保管して用いた。

０．８ｍｏｌ／Ｌ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を以下の手順で作製した。酢酸４．８０４ｇ（０．０８ｍｏｌ）を上皿天秤で精秤し、超純水を加えてメスフラスコを用いて１００ｍｌに定容し、０．８ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液とした。また、酢酸ナトリウム６５．６２ｇ（０．８ｍｏｌ）を上皿天秤で精秤し、超純水を加えてメスシリンダーで１Ｌに定容し、０．８ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液とした。

上記の「試し混合」で得られたＸの値に基づき、０．８ｍｏｌ／Ｌ酢酸溶液と０．８ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液を２．０：１４．０の割合で混合した。

１０００ｐｐｍＣａ^２＋標準液を、１００ｍｌメスフラスコ（アズワン）と１０ｍｌホールピペット（アズワン）を用いて段階希釈し、１００ｐｐｍ、１０ｐｐｍのＣａ^２＋標準液を作製した。それぞれのＣａ^２＋標準液１０ｍｌと０．８ｍｏｌ／Ｌ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液１０ｍｌを混合し、超純水を加えてメスフラスコで１００ｍｌに定容、０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸−酢酸ナトリウム−１００ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／ＬＣａ^２＋標準液を調製した。

（Ｃａイオン溶出量測定）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験では、硬化体からのＣａイオン溶出量を測定した。測定は以下のようにして行った。測定日、予め超純水５００ｍｌ中に２時間、０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸‐酢酸ナトリウム緩衝液５００ｍｌ中に３０分間、攪拌し、Ｃａイオン電極（ＣＨ−９１０１、Ｍｅｔｒｏｈｍ）のコンディショニングをおこなった。

上記の要領で調製した校正用Ｃａ標準液を用いて、測定をおこなうたびに検量線を作成した。攪拌下、１、１０、１００ｍｇ／ＬＣａ^２＋標準液の順にＣａイオン電極を浸漬し、電位差の表示が安定するまで待ち、測定値を得た。

Ｃａイオン濃度は以下のように測定した。樹脂製の攪拌子台を使用して、試料に攪拌子の回転による影響が及ばないよう、試料を容器底部に設置した。次にＣａイオン電極を容器内にセットし、０．０８ｍｏｌ／Ｌ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液１００ｍｌを容器に静かに注入し、ホットスターラー（ＲＳＨ−１ＤＮ、アズワン）で攪拌子を回転（４３０ｒｐｍ）させてから測定を開始した。

このとき、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液と試料が接触してから１分以内に測定を開始するように努めた。測定開始２０分後までは２分おき、１５０分後までは１５分おき、その後３０分おきに測定し、開始３００分後に終了した。３回測定し、その平均を実験結果とした。イオン濃度は、イオンメーター（デジタルｐＨ／イオン計６９２型、Ｍｅｔｒｏｈｍ）及びＣａ電極を用いて測定した。結果は後述する。

（質量減少量測定）
吸収性ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験用の要領と同様に作製した試料片（乾燥した硬化体）を、超純水に浸漬した。所定時間後、取り出し、表面をぬぐい、乾熱減菌機（ＤＯＶ−４５０Ｐ、アズワン）中で５０℃、２４時間、乾燥した。浸漬前の試料と、浸漬後の乾燥試料の質量を上皿天秤にて繰り返し（Ｎ＝５）精秤し、その差を質量減少量とした。結果は後述する。

（粉末Ｘ線回折による試料の同定）
錬和物の原料となるリン酸四カルシウムは、合成して得たものである。したがって、以下の要領で組成を同定した。生成物Ａの同定は、Ｘ線回折装置（Ｒｉｇａｋｕ、ＲＩＮＴ ２２００）、解析ソフト（Ｒｉｇａｋｕ、ＪＡＤＥ６）を用いた。Ｘ線源は封入管（ターゲットＣｏ、２ＫＷ）である。測定条件は以下の通りである。測定角度１０°〜５０°、サンプリング角度０．０１°、スキャン速度１．０°（ｍｉｎ^−１）、管電圧４０ｋＶ、管電流２０ｍＡ、スリット（ＤＳ：１°、ＳＳ：１°、ＲＳ：０．３ｍｍ）、Ｃｏフィルターを使用した。なお、Ｃｏ−Ｋα_１の波長は、１．７９０Åである。

（ＦＥ−ＳＥＭによる試料の観察）
吸収性ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験の前後の試料の表面状態を以下の方法で観察した。試料をデシケータ−に入れ、ダイヤフラム型真空ポンプ（ＤＡＵ−２０、ＵＬＶＡＣ）で２００Ｐａに減圧して密閉し、２４時間乾燥した。乾燥後、Ｏｓｍｉｕｍ Ｐｌａｓｍａ Ｃｏａｔｅｒ（ＯＰＣ６０Ａ、Ｆｉｌｇｅｎ）を用い、Ｏ_ｓＯ_４を１２ｎｍコーティングしてＳＥＭ試料とした。電界放射型走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ：ＪＥＯＬ、ＪＳＭ−６５００Ｆ）で各試料の観察を行った。観察時の加速電圧は１５ｋＶ、真空度５．００×１０^−４Ｐａ以下でおこなった。

（粒度分布測定）
リン酸四カルシウムとリン酸水素カルシウム二水和物の粒度分布は、レーザー回折／散乱式測定装置（ＨＯＲＩＢＡ製、ＬＡ９２０）で行った。リン酸カルシウムの溶解を防ぐため、分散媒にエタノールを用いた。分散剤は使用せず、試料ごとに超音波洗浄機で十分に分散してから測定に供した。エタノールに対するリン酸カルシウムの屈折率は、１．１６とした。

＜評価結果＞
（粉末Ｘ線回折による試料の同定）
生成物Ａの回折図形とリン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ：ＩＣＣＤ ＃２５−１１３７）の回折線図を図７に示す。横軸は２θ（°）であり、縦軸は強度（任意）である。リン酸四カルシウムの回折線図とピーク位置、強度がほぼＩＣＣＤ＃２５−１１３５によるリン酸四カルシウムの回折線図と一致し、それ以外の回折ピークは確認されなかった。したがって生成物Ａはリン酸四カルシウム単一相であると考えられる。

（粒度分布）
合成したリン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）粒子をメノウ乳鉢で粉砕し、ふるい振とう機（ＭＶＳ−１、アズワン）とステンレスふるい（Φ７５ｘ２０ｍｍｍ、９０〜７５μｍ）を用いて分級した粒子と、市販品をボールミルで湿式粉砕したリン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）試料のレーザー回折／散乱式による粒度分布をそれぞれ図８（ａ）、（ｂ）に示す。図８では、（ａ）、（ｂ）ともに、横軸は粒子径（μｍ）であり、左縦軸は頻度（％）であり、右縦軸は通過分積算（％）である。

リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）は、０．５μｍ付近と８−９μｍ付近に頻度のピークがある。また、リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）は６−７μｍ付近に頻度のピークが見られる。平均粒径は、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）で７．６８μｍ、リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）で６．３３μｍであった。

セメント粉原料の粒径は生体活性セメント（ＣＰＣ）硬化後の強度に大きく影響を与える。リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）とリン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）の粒径は差がある方がＣＰＣ硬化後の強度が大きいことが知られていた。そこで、粉砕時間を短縮し、ふるいパス回数を増やして得られたリン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）粉と粉砕時間を更に長くして得られたリン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）の粒度分布を図９（ａ）、（ｂ）に示す。図９では、（ａ）、（ｂ）ともに、横軸は粒子径（μｍ）であり、左縦軸は頻度（％）であり、右縦軸は通過分積算（％）である。

リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）は、０．４μｍ付近と１７−１８μｍ付近、５８−５９μｍ付近に頻度のピークがある。また、リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）は、０．４μｍ付近と５−６μｍ付近に頻度のピークが見られる。

平均粒径は、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）で３６．９２μｍ、リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）で４．６９μｍであった。水和硬化の際、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）とリン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）から溶出するＣａ及びリン酸がアパタイト組成でアパタイトへの転化及び硬化に好適なのは、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）の方が、溶解度が高いため、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）の粒径が７５μｍ以下で、リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）がそれより相当小さい組み合わせと報告されている。上記のリン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）とリン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）の粒度の組み合わせは、高強度の硬化体を得るのに好適であると考えられる。

（圧縮強度）
図１０に、低分子量キトサン３ｗｔ％、リンゴ酸３ｗｔ％添加でリン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）とリン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）の粒径が異なる生体活性セメント（ＣＰＣ）の圧縮強度を示す。縦軸は圧縮強度（ＭＰａ）であり、横軸は水への浸漬時間（ｄａｙ）である。水中浸漬時間は１、３日とした。Ｐ／Ｌ（セメント粉／硬化液比率）比（重量比）は２．５である。

白棒グラフは、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）平均粒径：７．６８μｍ、リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）平均粒径：６．３３μｍで調製したサンプルを表す。灰色棒グラフは、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）平均粒径：３６．９２μｍ，リン酸水素カルシウム二水和物（ＤＣＰＤ）平均粒径：４．６９μｍで調製したサンプルを表す。

いずれのサンプルもセメント粉７１ｗｔ％と硬化液２９ｗｔ％で作製したものである。なお、硬化液は低分子キトサン３ｗｔ％とリンゴ酸３ｗｔ％と超純水からなり、Ｐ／Ｌは２．５であった。

粒径差が大きい灰色棒グラフの方の圧縮強度が高く、粒度分布は生体活性セメント（ＣＰＣ）硬化後の強度に大きく影響を与えることが明瞭である。

図１１に低分子量キトサン、あるいは中分子量キトサンを３ｗｔ％、リンゴ酸を３ｗｔ％添加した生体活性セメント（ＣＰＣ）について、浸漬時間による圧縮強度の変化を示す。縦軸は圧縮強度（ＭＰａ）であり、横軸は水への浸漬時間（ｄａｙ）である。水中浸漬時間は１、３、７日とした。Ｐ／Ｌ比は２．５である。灰色棒グラフは低分子量キトサンを含む硬化液を用いた場合であり、白棒グラフは中分子量キトサンを含む硬化液を用いた場合である。

いずれのサンプルもセメント粉７１ｗｔ％と硬化液２９ｗｔ％で作製したものである。なお、硬化液は低分子キトサン３ｗｔ％とリンゴ酸３ｗｔ％と超純水からなり、Ｐ／Ｌは２．５であった。

浸漬時間が長くなるにつれ、圧縮強度が低下する傾向が見られた。水中浸漬により、溶解・析出が生じるが、析出、硬化より溶解が優越したためと考えられる。また中分子量キトサンを用いた場合、練和が困難であり、圧縮強度に試料によるばらつきが大きかったが、低分子量キトサンを用いた場合と圧縮強度の差の統計的な有意差は認められるものの、その差は相対的に小さかった。

図１２にセメント粉と硬化液の比（Ｐ／Ｌ比）による圧縮強度の変化を示す。縦軸は圧縮強度（ＭＰａ）を示す。横軸はサンプルの違いである。硬化液は、低分子量キトサン３ｗｔ％、リンゴ酸を３ｗｔ％添加したものであり、水中浸漬時間は１日とした。白棒グラフはＰ／Ｌ比が２．５の場合であり、灰色棒グラフはＰ／Ｌ比が３の場合を示す。Ｐ／Ｌ比が大きい方の圧縮強度が大きい。一方、Ｐ／Ｌ比が大きいと、セメント粉が多いので練和が困難となり、試料によるばらつきが大きかった。

なお、いずれのサンプルもセメント粉７１ｗｔ％と硬化液２９ｗｔ％で作製したものである。なお、硬化液は低分子キトサン３ｗｔ％とリンゴ酸３ｗｔ％と超純水からなる。

（カルシウムイオン溶出量・質量減少量）
低分子量キトサン３ｗｔ％、リンゴ酸３ｗｔ％添加した硬化液を用いた生体活性セメント（ＣＰＣ）（Ｐ／Ｌ＝２．５）について、破骨細胞が作り出す環境下であるｐＨ５．５に調製した酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液中での吸収性試験の結果を示す。図１３（ａ）にカルシウムイオン溶出量の経時変化、図１３（ｂ）に吸収性試験後の溶液１００ｍｌあたりのカルシウムイオン溶出量とＣＰＣ質量減量とその差を示す。図１３（ｂ）では、棒グラフＡは、ＣＰＣ質量減量を示し、Ｂはカルシウムイオン溶出量を示し、Ｃは両者の差を表す。

いずれのサンプルもセメント粉７１ｗｔ％と硬化液２９ｗｔ％で作製したものである。なお、硬化液は低分子キトサン３ｗｔ％とリンゴ酸３ｗｔ％と超純水からなり、Ｐ／Ｌは２．５であった。

図１３（ａ）では縦軸がＣａ^２＋濃度（ｍｇ／Ｌ）を表し、横軸は時間（分）を表す。また、図１３（ｂ）では、縦軸は質量減量およびＣａ^２＋溶出量（ｍｇ）を表し、横軸はサンプルを示す。

カルシウムイオン溶出量と質量減量の差（図１３（ｂ）のＣ）は、リン酸、キトサンなどカルシウム以外の溶出物の質量と考えられる。キトサンを添加したＣＰＣはカルシウムやリン酸以外にキトサンを失っていると示唆される。

（表面の観察）
図１４に吸収性ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験前後での乾燥試験片表面のＳＥＭ像を示す。セメント粉７１ｗｔ％、硬化液が２９ｗｔ％のサンプルである。硬化液中に低分子量キトサンは３ｗｔ％、リンゴ酸は３ｗｔ％含まれる。またセメント粉と硬化液の割合であるＰ／Ｌは２．５である。また、図１４（ａ）は７０倍であり、図１４（ｂ）は５００倍の倍率による写真である。図１４（ａ）および（ｂ）ともに、浸漬前（「ｂｅｆｏｒｅ」と表示）および浸漬後（「ａｆｔｅｒ」と表示）の写真を並べて示した。

浸漬前の表面には目立った孔は見られないが、浸漬後の表面には１０μｍ程度の孔が多数観察される。同じ含有量の中分子量キトサンの場合（図示せず）には、浸漬後の表面に目立った孔は見られなかった。

以上のことから以下の点が結論された。
（１）吸収性ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験により、低分子量キトサンを硬化液に添加したＣＰＣは破骨細胞が作り出すｐＨ条件下（ｐＨ５．５）ではキトサンの溶解が盛んであることがわかり、浸漬後の表面に１０μｍ程度の孔が多数観察されたことから、多孔化したと考えられた。同程度の添加量の中分子量キトサンより多孔化が進んだ。

（２）ＴＴＣＰ平均粒径が７．６８μｍ、ＤＣＰＤ平均粒径が６．３３μｍのセメント粉とＴＴＣＰ平均粒径が３６．９２μｍ、ＤＣＰＤ平均粒径が４．６９μｍのセメント粉について硬化液に低分子量キトサンを３ｗｔ％、リンゴ酸を３ｗｔ％添加したＣＰＣについて圧縮強度測定を行った。粒径に差をつけたことにより圧縮強度が実用レベルにあがった。

（３）ＴＴＣＰとＤＣＰＤの等モル混合物をセメント粉とし、硬化液に低分子量キトサンを３ｗｔ％、リンゴ酸を３ｗｔ％添加して得られた固化体を、超純水に１、３、７日浸漬し硬化させた。その圧縮強度は１日で１６．６±１．７ＭＰａ、３日で１３．９±１．０ＭＰａ、７日で１１．４±１．９ＭＰａとなった。浸漬時間１日で海綿骨以上の強度が得られ、実用的な強度が得られた。

（４）セメント粉と硬化液の比を２．５から３に変え作製したＣＰＣの圧縮強度は水中浸漬時間１日で２２．２±３．７ＭＰａとなり、さらに高強度となった。

本発明は、骨細胞増殖用足場材として、関節部分およびその他の骨の部分に好適に利用することができる。

１ 基材膜
２ 内側面
４ 外側面
１０ 密着膜
１５ リン酸カルシウム

Claims (8)

1. キチン・キトサン膜同士を重ね合わせて密着させ密着膜を得る工程と、
   前記密着膜の両面にリン酸カルシウムを生成する工程と、
   前記密着膜を前記キチン・キトサン膜同士に分ける工程を含むことを特徴とする骨細胞増殖用足場材料の製造方法。
2. 前記密着膜の両面にリン酸カルシウムを生成する工程は、
   リン酸を含む溶液に前記密着膜を浸漬する工程と、
   カルシウムを含む溶液に前記密着膜を浸漬する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載された骨細胞増殖用足場材料の製造方法。
3. 前記密着膜の両面にリン酸カルシウムを生成する工程は、
   前記密着膜の両面にカルシウムと結合しやすい官能基としてリン酸を導入する工程と、
   前記密着膜をカルシウムを含む液に膜に浸漬する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載された骨細胞増殖用足場材料の製造方法。
4. 前記密着膜を得る工程は、
   キチン・キトサン膜同士を重ね合わせて減圧下で保持する工程を含むことを特徴とする請求項１乃至３の何れかの請求項に記載された骨細胞増殖用足場材料の製造方法。
5. 一方の面にリン酸カルシウムを有するキチン・キトサン膜を複数枚積層した骨細胞増殖用足場材料。
6. リン酸水素カルシウム二水和物とリン酸四カルシウムを混合しセメント粉を得る工程と、
   水と中分子量キトサンとリンゴ酸と低分子量キトサンを混合して硬化液を得る工程と、
   前記セメント粉と前記硬化液を混合して錬和物を得る工程を有することを特徴とする生体活性セメントの製造方法。
7. 前記セメント粉を得る工程では、
   前記リン酸四カルシウムの平均粒径が前記リン酸水素カルシウム二水和物の平均粒子より大きいことを特徴とする請求項６に記載された生体活性セメントの製造方法。
8. 前記セメント粉と前記硬化液の比率が２乃至４であることを特徴とする請求項６又は７の何れかの請求項に記載された生体活性セメントの製造方法。