CN1169963C - 一种植物纤维原料酶降解制备低聚木糖的方法 - Google Patents
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Abstract
一种以植物纤维为原料经微生物分泌的酶生物降解制备功能性食品添加剂低聚木糖的方法，其特征是严格控制产酶前期和后期的反应条件使微生物产出高活力的里氏木霉木聚糖酶，并采用超滤技术对酶液进行分级。产酶的碳源是聚合度高的酶解废弃物，产酶的微生物是里氏木霉(Trichoderma reesei)。应用本发明所提供的方法，可制得木糖含量低、聚合度为2至5的低聚木糖产品。
Description
本发明属植物纤维原料经微生物分泌的酶生物降解后，制取功能性食品添加剂——低聚木糖的技术。
人体中存在着大量的细菌，仅肠道里就生活着1014个细菌，达400余种。在众多的肠道正常菌群中，具有最重要作用的益生菌就是各种双歧杆菌。这些双歧杆菌具有抑制肠道内腐败细菌的生长、促进蛋白质的消化吸收、分解有害有毒物质、促进肠道蠕动、提高人体免疫力等生理功能。
低聚糖或称寡糖(oligosaccharide)，是由2-8个单糖通过糖苷键连接形成的具有直链或支链的低度聚合糖类的总称，分子量约300～2000。功能性低聚糖，是指具有特殊的生物学功能，特别是能促进肠道内双歧杆菌的增殖，有益于人体健康的一类低聚糖，即所谓的双歧因子。国外作为商品进入市场的主要品种是低聚乳糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、低聚果糖、帕拉金糖、低聚木糖等。国内的研究，目前主要集中在大豆低聚糖、低聚异麦芽糖和低聚果糖的制取和利用方面。
低聚木糖是由2～8个木糖以β-(1，4)糖苷键连接而成的低聚糖。与其它功能性低聚糖相比，低聚木糖由于具有对双歧杆菌有高选择性增殖效果、很难被人体消化酶系统所分解、独特的酸稳定性和难发酵性等优点而倍受人们青睐。
低聚木糖可从富含木聚糖的植物纤维原料(如玉米芯、甘蔗渣、桦木、杨木等)制得。其基本方法是：
木聚糖的提取：植物纤维原料中的半纤维素木聚糖用碱提取、热水提取、高压蒸汽爆破、微波降解等方法，与纤维素和木质素进行分离，得到聚合度较高的粗品。粗木聚糖可用乙醇沉淀、超滤、纳滤、柱层析等方法提纯；
木聚糖的酶降解：木聚糖加入一定量的水和少量木聚糖酶，在一定的温度、pH条件下反应，木聚糖在酶的催化作用下降解成为可溶于水的低聚木糖，其聚合度为2～8；
低聚木糖的分离提纯：低聚木糖水溶液可用离心分离、层析分离、离子交换、纳滤、超滤等方法分离提纯；
低聚木糖产品的制备：提纯后的低聚木糖水溶液可用真空蒸发、冷冻浓缩、喷雾干燥等方法制成产品，直接用于各领域。
在以上方法中，木聚糖酶的酶活力和酶系构成对于低聚木糖的得率和产品质量影响最大。木聚糖醇的制备一般以木聚糖为碳源，加入蛋白胨、硫酸铵、尿素等氮源和磷、钾及其他元素作为营养盐，以微生物为产酶菌。许多细菌、放线菌、真菌和酵母菌均可产生木聚糖酶。由于丝状真菌具有产生的胞外酶便于分离和提取、产酶能力一般比酵母菌和细菌都高、可以同时产生降解半纤维素支链所必需的多种辅助酶等诸多优点，因而得到较多应用。
一般的真菌如木霉(Trichoderma)和曲霉(Aspergillus)产生的木聚糖酶酶系组成复杂，特别是木二糖酶酶活力高，用这种木聚糖酶降解木聚糖原料制备低聚木糖时，产物中聚合度为2至5的低聚木糖含量不高，而木糖(单糖)的含量却过高，影响了产品的质量和使用效果。
本技术的发明目的是，针对一般的真菌如木霉(Trichoderma)和曲霉(Aspergillus)在制取低聚木糖时的问题和不足之处，寻求一种更为优质高效制取低聚木糖产品的微生物酶和工艺方法。
本发明的技术解决方案为：以聚合度高的酶解废弃物为碳源，以里氏木霉(Trichoderma reesei)为产酶菌，通过对产酶反应条件的严格控制，制备高活力的里氏木霉木聚糖酶，再用超滤方法对里氏木霉木聚糖酶进行分级，从而制备木二糖酶酶活力低的里氏木霉木聚糖酶。用这种里氏木霉木聚糖酶去酶降解木聚糖原料，可以制得木糖含量低、聚合度为2至5的低聚木糖含量高的产品。使用本发明的具体工艺路线如下：
1.以木聚糖原料经酶降解并分离出低聚木糖后，留下的木聚糖聚合度高的酶解废弃物为碳源，蛋白胨、硫酸铵、尿素为氮源制成液体培养基，以里氏木霉(Trichoderma reesei)为产酶菌，在通气式生化反应器中间歇式培养制备里氏木霉木聚糖酶。
产酶过程中要严格控制反应条件。具体要求为在液体产酶培养基中，酶解废弃物木聚糖的初始浓度为7～15g/L，初始pH值为4.8。反应前期(一般一天左右)控制温度为30～32℃，通空气量为20～30L/L·h，使菌体细胞快速繁殖，菌体浓度迅速提高。当木聚糖消耗了50％左右、氮源基本耗尽、pH降至4.2左右时，反应进入后期，此时控制温度为24～26℃，通空气量为10～15L/L·h，使菌体细胞内的木聚糖酶大量分泌到培养液中。当培养液的pH值上升到7.0～7.5时，终止反应。用离心机将菌体细胞从培养液中分离出来，得到高活力的里氏木霉木聚糖酶液。产酶的反应历程见附图1。
2.用截留分子量为10000～30000的超滤设备对里氏木霉木聚糖酶液进行分级。超滤设备可用平板膜、中空管状膜等，超滤膜材料可用再生纤维素、聚砜等。超滤时控制操作压力不高于150Kpa，温度不高于25℃。收集超滤透过液，得到木二糖酶酶活力低的里氏木霉木聚糖酶液。
3.用里氏木霉木聚糖酶超滤透过液，按木聚糖与里氏木霉木聚糖酶超滤透过液中的蛋白质含量比≤875∶1的比例混合，用常规工艺进行酶降解木聚糖原料，即可制得木糖含量低、聚合度为2至5的低聚木糖含量高的产品。
典型实施例：
1.酶解废弃物的收集
将1kg绝干玉米芯粉碎成1cm左右的颗粒，加入氢氧化钠0.45kg，水7.5kg，于85～90℃蒸煮3h。压滤分离蒸煮液和渣。蒸煮液用硫酸中和至pH5.0。中和液用超滤技术脱盐，90％以上的无机盐和低分子化合物可随超滤透过液除去，粗木聚糖则留在超滤母液中。
粗木聚糖用普通木聚糖酶(如木霉[Trichoderma]木聚糖酶或曲霉[Aspergillus]木聚糖酶)进行酶降解。酶降解在pH4.8～5.2、反应温度48～52℃的条件下进行，反应时间为2～8h，得到酶水解液。酶水解液用截留分子量为1000的超滤设备分离出低聚木糖。残留在超滤母液中的固形物称为“酶解废弃物”，主要由聚合度高的木聚糖(约占70％)、木质素和酶蛋白组成。1kg绝干玉米芯经以上方法处理，可得到180g左右的酶解废弃物。
2.里氏木霉木聚糖酶的制备
在10L通气式生化反应器中间歇式培养制备里氏木霉木聚糖酶。液体培养基中碳源和营养盐浓度(g/L)如下：
酶解废弃物 12(其中木聚糖，8.7)
木糖 1
蛋白胨 1
尿素 0.3
(NH4)2SO4 1.4
KH2PO4 2.0
CaCl2·2H2O 0.4
MgSO4·7H2O 0.3
MnSO4·H2O 0.016
FeSO4·7H2O 0.050
CoCl2·6H2O 0.037
液体培养基的初始pH值为4.8。
反应初期控制液体培养基温度为30～32℃，通空气量为20L/L·h。24小时后，木聚糖消耗了52％，pH降至4.2，菌丝体浓度达3.5g/L。改变反应条件，控制温度为24～26℃，通空气量为10L/L·h。48小时后，培养液的pH值上升到7.2，终止反应。用离心机将菌体细胞从培养液中分离出去，得到里氏木霉木聚糖酶液。分析该种里氏木霉木聚糖酶液，结果为：木聚糖浓度，2.6g/L(为初始浓度的32％)；菌体细胞浓度，3.2g/L；蛋白质浓度，0.56mg/ml；木聚糖酶活力，48IU/ml。
3.里氏木霉木聚糖酶的超滤分级
用美国Millipore公司生产的Pellicon切向流超滤设备对里氏木霉木聚糖酶液进行分级，超滤膜为该公司生产的截留分子量为10000的再生纤维素平板膜，有效膜面积为0.024m2。超滤时控制操作压力为120kPa，温度为20℃，流速为200ml/min。分别收集超滤截留液和透过液。
对超滤前的酶液和超滤后的截留液、透过液进行分析，结果如表1所示。分析结果表明，超滤能有效地去除木二糖酶活力，超滤透过液的酶系构成有利于制备低聚木糖。
表1里氏木霉木聚糖酶液超滤前后比较
| 木聚糖酶活力 | 木二糖酶活力 | 蛋白质浓度 | |
| 超滤前的酶液 | 100％ | 100％ | 100％ |
| 超滤后的截留液 | 6.3％ | 89.7％ | 11.0％ |
| 超滤后的透过液 | 89.9％ | 3.5％ | 85.2％ |
注：(各种酶活力与蛋白质浓度以超滤前为100％)
4.用里氏木霉木聚糖酶超滤透过液对木聚糖原料的酶降解
取用植物纤维原料(如玉米芯、甘蔗渣、桦木、杨木等)制得的木聚糖35g，加入蛋白质总量为40mg的里氏木霉木聚糖酶超滤透过液，加水至1L，于50℃酶解10h。同法用普通木聚糖酶和超滤前的里氏木霉木聚糖酶液作比较，结果如表2所示。分析结果表明，超滤能有效地改善酶活力，使得低聚木糖几乎不能降解成木糖，从而大幅度提高低聚木糖的得率。
表2不同木聚糖酶液对木聚糖的酶解效果比较
| 酶液 | 35g木聚糖的降解产物 | |
| 木糖(g) | 低聚木糖(g) | |
| 普通木聚糖酶 | 6.5 | 2.1 |
| 超滤前的里氏木霉木聚糖酶液 | 8.8 | 3.9 |
| 超滤后的里氏木霉木聚糖酶透过液 | 0.2 | 19.1 |
注：(高效液相色谱法测定，低聚木糖包括木二糖、木三糖、木四糖和木五糖)
附图的说明：
图1为采用本发明提供的方法，以聚合度高的酶解废弃物为碳源，以里氏木霉(Trichoderma reesei)为产酶菌，在通气式生化反应器中间歇式培养制备里氏木霉木聚糖酶的过程中，木聚糖浓度(％)、蛋白质浓度(mg/ml)、菌体细胞浓度(g/L)、木聚糖酶活力(IU/ml)和培养液pH值随反应时间(d)变化的典型规律。
采用本发明所提供的方法，可以植物纤维为原料，制得木糖含量低、聚合度为2至5的低聚木糖含量高的功能性食品添加剂产品。
Claims (1)
1.一种植物纤维原料酶降解制备低聚木糖的方法，其特征在于：
a.以植物纤维原料制取的木聚糖为原料，用里氏木霉制取得到的木聚糖酶液进行降解；
b.里氏木霉木聚糖酶液的制备方法为：
(1)以木聚糖原料经酶降解并分离出低聚木糖后，留下的木聚糖聚合度高的酶解废弃物为碳源，蛋白胨、硫酸铵、尿素为氮源制成液体培养基，以里氏木霉为产酶菌，在通气式生化反应器中间歇式培养制备里氏木霉木聚糖酶；
(2)产酶过程中的反应条件为，在液体产酶培养基中，酶解废弃物木聚糖的初始浓度为7～15g/L，初始pH值为4.8，反应前期控制温度为30～32℃，通空气量为20～30L/L·h；当木聚糖消耗了50％、氮源基本耗尽、pH降至4.2时的反应后期，控制温度为24～26℃，通空气量为10～15L/L·h；当培养液的pH值上升到7.0～7.5时，终止反应，用离心机将菌体细胞从培养液中分离，得到里氏木霉木聚糖酶液；
(3)用截留分子量为10000～30000的超滤设备对里氏木霉木聚糖酶液进行分级，收集超滤透过液，得到降解制取低聚木糖的里氏木霉木聚糖酶液。
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