CN107075542B - 糖液及低聚木糖的制造方法 - Google Patents

Abstract

为了使用木聚糖酶制造低聚木糖，需要使用β‑木糖苷酶活性低的木聚糖酶。于是本发明发现：通过在一并生产糖液及低聚木糖的工艺中回收糖液制造工艺中使用的纤维素酶，在低聚木糖工艺中再利用，能够以低成本制备β‑木糖苷酶活性低的木聚糖酶，从而完成了本发明。

Description

糖液及低聚木糖的制造方法

技术领域

本发明涉及由含纤维素生物质制造糖液及低聚木糖的方法。

背景技术

以糖为原料的化学品的发酵生产工艺在各种工业原料生产中被利用。近年来广泛研究不与粮食竞争的以含纤维素生物质为原料的糖的制造工艺。其中，由于能源使用量及环境负荷少、且糖产量多，因此，使用纤维素酶的方法受到瞩目。

另一方面，低聚糖除了低甜味、低卡路里、防龋齿性等特性之外，还具有肠道细菌的选择性增殖促进效果，作为具有良好地保持肠胃状况的功能的特定保健用食品等有大量市售。这些低聚糖之中，低聚木糖不易被酸、淀粉酶等消化酶分解，人摄取时不被分解、吸收而到达大肠，因此，最小有效量为0.2～0.7g/天(菓子総合技術センター：オリゴ糖ハンドブック)，与其它低聚糖相比，以少一位数的量发挥其效果。低聚木糖不仅在人的食品用途中利用，也作为家畜饲料的添加剂利用。

低聚木糖由作为植物的主要构成成分之一的木聚糖制造。作为低聚木糖的制造方法，已知通过使高温高压水在粉碎了阔叶树中循环来水解提取原料中的半纤维素的方法(专利文献1)，用芽孢杆菌属微生物生产的木聚糖酶处理木聚糖而由反应滤液制造低聚木糖的方法(专利文献2)，将使半纤维素酶与化学浆料作用而得的反应滤液所含的低聚木糖复合体通过膜过滤法进行浓缩，从浓缩液中分离、回收低聚木糖的方法(专利文献3)等。

作为制造低聚木糖使用的酶，木聚糖酶是代表性的，已知以木霉属、枝顶孢属、链霉菌属、曲霉属等丝状菌为代表的各种各样的微生物生产的纤维素酶包含木聚糖酶活性，而另一方面，也已知也包含将低聚木糖分解成单糖单元的β-木糖苷酶活性。因此，为了有效地生产低聚木糖，需要从微生物生产的纤维素酶中纯化木聚糖酶除去β-木糖苷酶、或利用不生产β-木糖苷酶的微生物生产木聚糖酶等，从而排除β-木糖苷酶的影响，但这些方法均会涉及酶的成本增加。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特许第4557648号公报

专利文献2:日本特开昭61-242592号公报

专利文献3:日本特许第3951545号公报

发明内容

发明所要解决的课题

如上所述，利用酶制造低聚木糖要使用木聚糖酶，但使用包含木聚糖酶活性的纤维素酶的情况下，纤维素酶除聚糖酶活性以外，也包含水解低聚木糖的β-木糖苷酶活性。因此，使用纤维素酶制造低聚木糖是困难的。

于是，本发明的目的在于，通过构建利用纤维素酶一并生产糖液及低聚木糖的工艺，使属于有价物的糖液及低聚木糖的制造工艺整体中使用的酶量，与以往使用各自的酶制造糖液及低聚木糖的工艺的情况下的酶量相比削减。

用于解决课题的方法

本发明者们深入研究的结果发现，能够在低聚木糖制造中使用将含纤维素生物质通过源自丝状菌的纤维素酶进行水解而从该水解物中回收的纤维素酶，从而完成了本发明。

即，本发明具有以下[1]～[11]的构成。

[1]糖液及低聚木糖的制造方法，包括以下工序(1)～(3)，

工序(1)：将含纤维素生物质用源自丝状菌的纤维素酶进行水解，

工序(2)：将工序(1)的水解物进行固液分离，使溶液成分通过超滤膜而进行过滤，作为非透过液回收纤维素酶，作为透过液回收糖液，

工序(3)：使工序(2)的回收纤维素酶与含有木聚糖的原料作用，回收生成的低聚木糖。

[2]根据[1]所述的糖液及低聚木糖的制造方法，源自丝状菌的纤维素酶为源自里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶。

[3]根据[1]或[2]所述的糖液及低聚木糖的制造方法，在工序(2)中，工序(1)的水解物的电导率小于16mS/cm。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的糖液及低聚木糖的制造方法，工序(2)的回收纤维素酶的β-木糖苷酶活性小于工序(1)中使用的源自丝状菌的纤维素酶的5％。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的糖液及低聚木糖的制造方法，工序(2)的回收纤维素酶至少包含木聚糖酶。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的糖液及低聚木糖的制造方法，工序(1)是将含纤维素生物质的前处理物利用源自丝状菌的纤维素酶进行水解的工序。

[7]根据[6]所述的糖液及低聚木糖的制造方法，工序(1)是将含纤维素生物质的前处理物所含的固体物用水洗涤而得的物质利用源自丝状菌的纤维素酶进行水解的工序。

[8]根据[1]～[7]中任一项所述的糖液及低聚木糖的制造方法，含有木聚糖的原料是含纤维素生物质的前处理物。

[9]根据[8]所述的糖液及低聚木糖的制造方法，含有木聚糖的原料是将含纤维素生物质的前处理物进行固液分离而得的溶液成分。

[10]根据[8]所述的糖液及低聚木糖的制造方法，含有木聚糖的原料是将含纤维素生物质的前处理物进行固液分离而得的固体成分。

[11]根据[10]所述的方法，是将包括所述工序(1)～(3)的工艺反复进行的糖液及低聚木糖的制造方法，将工序(3)中得到的水解残留物作为后段工艺的工序(1)的含纤维素生物质的一部分或全部使用。

发明的效果

根据本发明，通过将在由含纤维素生物质制造糖液的工艺中得到的回收纤维素酶在低聚木糖的制造中再利用，能够降低糖液及低聚木糖的制造成本。

附图说明

图1是显示本发明的糖液及低聚木糖的制造方法的实施方式的示意图。

具体实施方式

下面，对于用于实施本发明的方式，逐个工序地进行说明。

[工序(1)：将含纤维素生物质利用源自丝状菌的纤维素酶进行水解的工序]

本发明中使用的含纤维素生物质是指包含纤维素成分的生物资源。纤维素是植物细胞壁的主成分之一，是β-1,4-键合而成的葡萄糖的聚合物。对包含纤维素成分的生物资源，没有特别限制，除可以使用种子植物、蕨类植物、苔藓植物、藻类、水草等以外，也可以使用废旧建材等。种子植物分类成裸子植物和被子植物，任一种均能够优选使用。作为裸子植物的具体例，可以举出杉树、松树等。被子植物分类成单子叶植物和双子叶植物，任一种均能够优选使用，作为单子叶植物的具体例，可以举出甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸秆、玉米芯、稻秸、麦秸、竹、细竹等，作为双子叶植物的具体例，可以举出甜菜浆、桉树、橡木、白桦、杨树、柏树等。

这些含纤维素生物质多数情况下也包含作为在纤维素纤维素微纤丝间存在的多糖类的半纤维素。因此，工序(1)中得到的含纤维素生物质的水解物除作为源自纤维素的糖类的葡萄糖以外，也包含作为源自半纤维素的糖类的木糖、阿拉伯糖、甘露糖等。

另外，含纤维素生物质也含有作为芳香族高分子的木质素、蛋白质等，因此，为了使利用源自丝状菌的纤维素酶的水解效率提高，优选使用实施了前处理的含纤维素生物质。作为前处理的方法，可以举出利用硫酸、醋酸等的酸处理、利用苛性钠、氨等的碱处理、水热处理、亚临界水处理、微粉碎处理、蒸煮处理、化学制浆处理(作为具体例，可以举出亚硫酸盐法蒸煮或硫酸盐法蒸煮(Kraft Cooking)。)。对含纤维素生物质实施了前处理的情况下，有时一部分半纤维素水解，可溶化成木糖、阿拉伯糖、甘露糖等、或者由这些糖构成的多糖、低聚糖。

工序(1)中使用含纤维素生物质的前处理物的情况下，可以使用包含固体物与溶液成分两者的状态、或通过固液分离和/或固体物的洗涤去除包含木糖等的溶液成分的状态中的任一状态。

对含纤维素生物质的前处理方法没有特别限定，但优选将从含纤维素生物质的化学制浆处理物的水解物中回收的纤维素酶用于后段的工序(3)中的低聚木糖的制造。另外，为了降低本发明的糖液及低聚木糖一并生产工艺整体的成本，优选工序(1)中使用的含纤维素生物质与工序(3)中使用的含有木聚糖的原料均是由相同的含纤维素生物质得到的前处理物。另外，如后所述，工序(3)中优选使用通过含纤维素生物质的水热处理、碱处理得到的含有木聚糖的原料，因此，工序(1)中使用的含纤维素生物质也可以是这些前处理物。另外，也可以将单一或多种前处理方法组合而制备含纤维素生物质和含有木聚糖的原料。例如作为化学制浆的前工序进行水热处理等前处理水解的情况下，可以回收含有木聚糖的原料作为溶液成分，然后对固体物实施化学制浆处理而作为含纤维素生物质使用。

本发明中，将工序(2)中得到的回收纤维素酶用于工序(3)中制造低聚木糖，因此，如后所述回收纤维素酶优选与工序(1)中使用的源自丝状菌的纤维素酶相比，其β-木糖苷酶活性降低。工序(1)的水解物所含的电解质越少，越易获得β-木糖苷酶活性低的回收纤维素酶。即，优选工序(1)的水解物的电导率低，具体而言，优选小于16mS/cm。进一步优选小于10mS/cm。所谓电导率，是溶液的电阻的倒数，其测定方法在JIS K0130“电导率测定法通则”中规定。溶液的电导率用在面积1m²的2个平面电极以1m的距离相对的容器中充满电解质水溶液而测定的电阻的倒数表示，溶液中的电解质越多，电导率越显示高值。本发明中的电导率是含纤维素生物质的水解物中电解质浓度的指标，因此在该水解物中残留固体物的情况下，是指通过离心分离、过滤等进行固液分离而得的溶液成分的电导率。

作为将工序(1)的水解物的电导率调整到小于16mS/cm的方法，例如可以通过将含纤维素生物质的前处理中得到的固体物用水洗涤除去电解质，从而将水解物调整到所希望的电导率。通过降低水解物的电导率，能够在工序(2)中获得比工序(1)中使用的纤维素酶β-木糖苷酶活性低的回收纤维素酶，可以优选在工序(3)的低聚木糖制造工艺中使用。

对水解反应中的含纤维素生物质的固体物浓度没有特别限定，但优选1～30重量％的范围。如果固体物浓度低，则通过水解生成的糖浓度低，有时难以用作发酵原料。另一方面，如果浓度过高，则有时难以处理。其中，含纤维素生物质的重量使用绝干重量计算。绝干重量是指使含纤维素生物质在105℃干燥直到变成恒重后的重量。绝干重量的测定可以使用105℃的干燥机进行干燥直到含纤维素生物质的重量不变而测定。另外，含木聚糖生物质的绝干重量也利用同样的方法计算。

作为纤维素酶来源的丝状菌，可以举出木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)、腐质霉属(Humicola)、枝顶孢属(Acremonium)、耙齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、篮状菌属(Talaromyces)等的微生物。另外，也可以是源自通过对这些微生物用突变剂或紫外线照射等实施突变处理而纤维素酶生产性提高了的突变株的纤维素酶。

在丝状菌中，木霉属微生物由于在水解纤维素时在培养液中大量生产活性高的酶成分，因此可以优选在本发明中使用。作为源自木霉属微生物的纤维素酶的具体例，可以举出源自里氏木霉QM9414(Trichoderma reesei QM9414)、里氏木霉QM9123(Trichodermareesei QM9123)、里氏木霉RutC-30(Trichoderma reesei RutC-30)、里氏木霉PC3-7(Trichoderma reesei PC3-7)、里氏木霉CL-847(Trichoderma reesei CL-847)、里氏木霉MCG77(Trichoderma reesei MCG77)、里氏木霉MCG80(Trichoderma reesei MCG80)、绿色木霉QM9123(Trichoderma viride QM9123)的纤维素酶，这些纤维素酶可以单独或混合使用。上述源自木霉属微生物的纤维素酶中，更优选的是源自里氏木霉的纤维素酶。

源自丝状菌的纤维素酶是具有将纤维素和/或半纤维素水解而生成葡萄糖、木糖等单糖的活性的酶组合物，作为酶成分，优选包含选自纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶及β-木糖苷酶中的1种以上。例如作为源自里氏木霉的纤维素酶的酶成分，可以例示纤维二糖水解酶Ⅰ、纤维二糖水解酶Ⅱ、内切葡聚糖酶Ⅰ、内切葡聚糖酶Ⅲ、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶等，通过这样的多个酶成分的协同效果或互补效果，能够实施有效的纤维素和/或半纤维素的水解，因此优选在本发明中使用。

纤维二糖水解酶是通过水解纤维素链释放纤维二糖的酶的总称，作为EC号：EC3.2.1.91记载了归属于纤维二糖水解酶的酶群。纤维二糖水解酶Ⅰ从纤维素链的还原末端侧开始水解反应，纤维二糖水解酶Ⅱ从非还原末端侧开始水解反应。

内切葡聚糖酶是以从纤维素分子链的中央部分开始水解为特征的纤维素酶的总称，作为EC号：EC3.2.1.4记载了归属于内切葡聚糖酶的酶群。

β-葡萄糖苷酶是以作用于纤维寡糖或纤维二糖为特征的酶的总称，作为EC号：EC3.2.1.21记载了归属于β-葡萄糖苷酶的酶群。

木聚糖酶是以作用于半纤维素或特别是木聚糖为特征的酶的总称，作为EC号：EC3.2.1.8记载了归木聚糖酶的酶群。

β-木糖苷酶是以作用于低聚木糖为特征的酶的总称，作为EC号：EC3.2.1.37记载了归木糖苷酶的酶群。

这样的纤维素酶成分可以通过凝胶过滤、离子交换、二维电泳等公知方法进行分离，对分离而得的成分的氨基酸序列进行分析(N末端分析、C末端分析、质量分析)，通过与数据库的比较而鉴定。

另外，源自丝状菌的纤维素酶的酶活性可以以结晶纤维素、羧甲基纤维素(CMC)、纤维二糖、木聚糖、甘露聚糖等多糖为底物，通过其水解活性进行评价。显示结晶纤维素分解活性的主要的酶是具有从纤维素末端部分开始水解的特征的纤维二糖水解酶。显示纤维二糖分解活性的主要的酶是β-葡萄糖苷酶。参与CMC分解活性的主要的酶是纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶。显示木聚糖分解活性的主要的酶是木聚糖酶、β-木糖苷酶。在此，所谓“主要”的含义是来自已知最参与分解的表达，意味着除此以外的酶成分也参与其分解。

或者也有通过使用4-硝基苯基糖衍生物、4-甲基伞形基糖衍生物等糖衍生物底物，对通过水解反应而游离出的色素进行定量，从而测定各个酶的活性的方法。

由于丝状菌在培养液中产生纤维素酶，因此，可以直接使用其培养液作为粗酶剂，也可以将用公知的方法将酶群纯化、制剂化而得的产物作为源自丝状菌的纤维素酶混合物使用。作为将源自丝状菌的纤维素酶纯化、制剂化而得的产物使用的情况下，也可以将添加了蛋白酶抑制剂、分散剂、溶解促进剂、稳定剂等酶以外的物质的产物作为纤维素酶剂使用。此外，在本发明中，这些中优选使用粗酶物。粗酶物源自在为了使丝状菌产生纤维素酶而调制的培养基中将该微生物培养任意时间而得的培养上清。对使用的培养基成分不特别限定，但是为了促进纤维素酶产生，一般可以使用添加了纤维素的培养基。而且，作为粗酶物，优选直接使用培养液、或使用仅除去了菌体的培养上清。

对粗酶物中的各酶成分的重量比没有特别限定，例如，源自里氏木霉的培养液中含有50～95重量％的纤维二糖水解酶，其余成分包含内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶等。此外，木霉属的微生物在培养液中产生强的纤维素酶成分，另一方面关于β-葡糖苷酶，由于其多数保持在细胞内或细胞表层，因而培养液中的β-葡糖苷酶活性低。因此可以在粗酶物中进一步添加异种或同种的β-葡糖苷酶。作为异种的β-葡糖苷酶，可以优选使用源自曲霉属的β-葡糖苷酶。作为源自曲霉属的β-葡糖苷酶，可以例示出由ノボザイム社市售的“Novozyme188”等。另外，可以在木霉属的微生物导入基因，培养进行了基因重组使其培养液中产生β葡糖苷酶的木霉属的微生物，使用β-葡萄糖苷酶活性提高了的培养液。

水解反应的温度只要依据源自丝状菌的纤维素酶的优选反应条件，就没有特别限定，但优选为30～75℃的范围，特别是使用源自木霉属微生物的纤维素酶的情况下，进一步优选为40～60℃的范围。

水解反应的pH也同样地只要依据源自丝状菌的纤维素酶的优选反应条件，就没有特别限定，但优选pH3.0～7.0的范围，进一步优选为pH4.0～6.0的范围。使用源自木霉属微生物的纤维素酶作为源自丝状菌的纤维素酶的情况下，其反应最适pH为5.0。并且，由于在水解过程中pH发生变化，因此，优选在反应液中添加缓冲液，或一边使用酸、碱保持一定pH一边进行。

优选水解反应的时间为2小时～200小时的范围。如果小于2小时，则有时无法获得足够的糖生成。另一方面，如果超过200小时，则有时纤维素酶失活而对回收纤维素酶的再利用性造成不良影响。

[工序(2)：将工序(1)的水解物进行固液分离，使溶液成分通过超滤膜而进行过滤，作为非透过液回收纤维素酶，作为透过液回收糖液的工序]

将工序(1)中得到的水解物进行固液分离而得的溶液成分中包含源自丝状菌的纤维素酶成分及糖成分，这些成分可以通过利用超滤膜的过滤进行分离。

作为固液分离的方法，没有特别限定，可以举出离心分离、压滤等。

所谓超滤膜，是截留分子量为300～200,000的膜，简称为Ultra filtration膜、UF膜等。此外，超滤膜孔径过小，难以用电子显微镜等对膜表面的细孔径进行计测，因此用截留分子量的值来代替平均细孔径作为孔径大小的指标。所谓截留分子量，像在日本膜学会编膜学実験シリーズ(膜学实验系列)第III卷人工膜编编集委员/木村尚史·中尾真一·大矢晴彦·仲川勤(1993年，共立出版)的第92中的记载：“溶質の分子量を横軸に、阻止率を縦軸にとってデータをプロットしたものを分画分子量曲線とよんでいる。そして阻止率が90％となる分子量を膜の分画分子量とよんでいる。(以溶质的分子量作为横轴、以截留率作为纵轴，将数据作图而得的曲线叫做截留分子量曲线。而且将截留率为90％的分子量叫做膜的截留分子量)。”那样，其作为表示超滤膜的膜性能的指标是本领域技术人员周知的。

在使用超滤膜进行的源自丝状菌的纤维素酶与糖成分的分离中，其截留分子量只要能够使作为糖液主成分的单糖的葡萄糖(分子量180)、木糖(分子量150)透过且能够截留源自丝状菌的纤维素酶就不特别限定，但是优选截留分子量为500～100,000，从保证源自丝状菌的纤维素酶成分的收率、且将对酶反应显示抑制作用的夹杂物质与源自丝状菌的纤维素酶成分分离的观点出发，更优选为截留分子量5,000～50,000的范围，进一步优选为截留分子量10,000～30,000的范围。

作为超滤膜的材料，可以使用聚醚砜(PES)、聚砜(PS)、聚丙烯腈(PAN)、聚1,1-二氟乙烯(PVDF)、再生纤维素、纤维素、纤维素酯、磺化聚砜、磺化聚醚砜、聚烯烃、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯等，但是由于再生纤维素、纤维素、纤维素酯受到源自丝状菌的纤维素酶的分解，因此优选使用以PES、PVDF等合成高分子作为材料的超滤膜。

作为超滤膜的过滤方式，有死端过滤、错流过滤，但从抑制膜污染的观点出发，优选错流过滤。此外，作为使用的超滤膜的膜形态，可以使用平膜型、螺旋型、管状型、中空丝型等适宜的形态。具体而言，可举出DESAL社的G-5型、G-10型、G-20型、G-50型、PW型、HWSUF型，KOCH社的HFM-180、HFM-183、HFM-251、HFM-300、HFK-131、HFK-328、MPT-U20、MPS-U20P、MPS-U20S，Synder社的SPE1、SPE3、SPE5、SPE10、SPE30、SPV5、SPV50、SOW30，旭化成株式会社制的マイクローザ(注册商标)UF系列的相当于截留分子量3,000～10,000的膜，日东电工株式会社制的NTR7410、NTR7450等。

工序(1)中使用的源自丝状菌的纤维素酶的酶成分的一部分在含纤维素生物质的水解反应中吸附到未分解纤维素、木质素这样的固体成分上。吸附的纤维素酶成分具有偏重，因此，作为利用超滤膜的过滤的非透过液获得的回收纤维素酶与工序(1)中使用的丝状菌纤维素酶相比，其β-木糖苷酶活性降低，优选在后述的工序(3)中用于制造低聚木糖。回收纤维素酶的β-木糖苷酶活性越低越好，更优选降低到小于工序(1)中使用的源自丝状菌的纤维素酶的5％。

具体而言，回收纤维素酶的β-木糖苷酶活性降低的结果，优选为回收纤维素酶的β-木糖苷酶活性降低到每单位回收纤维素酶的蛋白质量小于0.01U/mg。β-木糖苷酶活性可以以4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷为底物，对通过水解反应而游离出的4-硝基苯酚用比色法进行定量，由此测定。

并且，为了在工序(3)中使用回收纤维素酶制造低聚木糖，优选回收纤维素酶至少包含木聚糖酶。木聚糖酶催化水解木聚糖主链的中间，生成低聚木糖的反应。源自丝状菌的纤维素酶的情况下，已知编码xyn1(GH11)、xyn2(GH11)、xyn3(GH10)、xyn4(GH5)、xyn5b(GH5)、xyn11(GH11)等木聚糖酶的基因。

作为利用超滤膜的过滤的透过液而被回收的糖液是以作为单糖的葡萄糖和木糖为主成分的糖液，可以直接作为后述发酵工序中的发酵原料使用，但是为了提高发酵工序的效率，也可以进行进一步提高糖浓度的浓缩处理。作为糖液的浓缩处理，可以示例出蒸发浓缩、减压浓缩、膜浓缩等，但是通过能量使用量少且能够分离糖液中所包含的发酵抑制物质的WO2010/067785号中记载的、通过纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤的方法，能够获得糖成分浓缩了的浓缩糖液。

通过培养具有将由本发明获得的糖液作为发酵原料来生产化学品的能力的微生物，能够制造各种化学品。这里所谓的作为发酵原料而使微生物生长繁育，意思是将糖液中所包含的糖成分或氨源作为微生物的营养素进行利用，从而进行微生物的增殖、生长繁育维持。这样的化学品是以糖液中的糖成分作为碳源，在其代谢过程中在生物体内外作为化学品而蓄积产生的。作为化学品的具体例，可举出乙醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、甘油等醇，乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸等有机酸，肌苷、鸟苷等核苷，肌苷酸、鸟苷酸等核苷酸，尸胺等胺化合物。进而，本发明的糖液还能够应用于酶、抗生素、重组蛋白质等的生产中。

[工序(3)：使工序(2)的回收纤维素酶与含有木聚糖的原料作用，回收生成的低聚木糖的工序]

如前所述，工序(2)的回收纤维素酶与工序(1)中使用的源自丝状菌的纤维素酶相比，其β-木糖苷酶活性降低，能够优选用于由含有木聚糖的原料制造低聚木糖。

本发明中使用的含有木聚糖的原料只要含有木聚糖就没有特别限定。木聚糖是在植物细胞的细胞壁存在的半纤维素的构成成分，是在β-1,4-键合而成的木糖主链上结合有各种侧链的杂多糖。其结构多种多样，在植物种间不同。例如作为单子叶植物所含的木聚糖，已知阿拉伯木聚糖，在侧链有阿拉伯糖残基。另一方面，作为双子叶植物所含的木聚糖，已知葡糖醛酸阿拉伯木聚糖、葡糖醛酸木聚糖，在侧链有葡萄糖醛酸残基及阿拉伯糖残基。进而作为双子叶植物中特别是阔叶树所含的木聚糖，已知4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖，在侧链有4-O-甲基葡糖醛酸残基。另外，作为裸子植物所含的木聚糖，已知4-O-甲基葡糖醛酸阿拉伯木聚糖，在侧链有阿拉伯糖残基及4-O-甲基葡糖醛酸残基。本发明中，包含这些中的任一种的物质都能够作为含有木聚糖的原料使用。

因此，工序(1)中作为含纤维素生物质举出的源自生物资源的生物质，也能够作为含有木聚糖的原料利用。单子叶植物的具体例可以举出甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸秆、玉米芯、稻秸、麦秸、竹、细竹等。另外，双子叶植物的具体例可以举出桉树、橡木、白桦等阔叶树、其废材。

如工序(1)中所述，由于通过前处理而酶的水解效率提高，因此将这些含纤维素生物质在工序(3)中作为含有木聚糖的原料使用的情况下，优选与工序(1)同样地实施前处理。前处理的方法也与工序(1)中的前处理同样地可以举出利用硫酸、醋酸等的酸处理、利用苛性钠、氨等的碱处理、水热处理、亚临界水处理、微粉碎处理、蒸煮处理、化学制浆处理(作为具体例可以举出亚硫酸盐蒸煮或硫酸盐蒸煮(Kraft Cooling)。)。此外，为了获得高的低聚木糖收率，优选尽可能抑制木聚糖分解到木糖的前处理方法，具体而言，优选水热处理、碱处理。

含有木聚糖的原料是含纤维素生物质的前处理物的情况下，根据前处理方法不同，木聚糖有时作为固体物存在，有时作为溶液成分溶出。在本发明中，任一种情况均能够将含有木聚糖的物质作为含有木聚糖的原料使用。另外，可以将含有溶液成分和固体物两者的状态作为含有木聚糖的原料使用，也可以进行固液分离而仅使用包含木聚糖的馏分，但为了制造纯度高的低聚木糖，优选进行固液分离而仅将包含木聚糖的馏分作为含有木聚糖的原料使用。

如工序(1)中所述，也可以将水热处理与化学制浆处理等一种或多种前处理方法组合来制备含纤维素生物质和含有木聚糖的原料。另外，通过含纤维素生物质的前处理而得的包含木聚糖的溶液成分多数情况下也包含木质素等杂质，因此，也可以将利用膜分离、溶剂提取等方法除去杂质而得的物质作为含有木聚糖的原料使用。

通过含纤维素生物质的前处理而使木聚糖作为溶液成分溶出的情况下，优选将含纤维素生物质的前处理物进行固液分离而仅将溶液成分作为含有木聚糖的原料供与工序(3)的水解。这种情况下，通过以固体物作为工序(1)的含纤维素生物质进行水解，可以通过一次前处理而同时获得含纤维素生物质和含有木聚糖的原料，因此，在能够削减制造成本的方面上是有利的。

含纤维素生物质的前处理物所含的木聚糖是固体物的情况下，通过在工序(3)中以该固体物作为含有木聚糖的原料进行水解，回收生成的低聚木糖，在下一循环的工序(1)中将工序(3)的水解残留物作为含纤维素生物质使用，由此能够由水解残留物中残余的纤维素制造糖液。即，能够将含有木聚糖的原料的水解残留物作为含纤维素生物质再利用，因此对制造成本削减是有利的。

对含有木聚糖的原料是固体物的情况下的水解反应中固体物浓度没有特别限定，但优选1～30重量％的范围。如果固体物浓度低，则获得足够的低聚木糖产量所需的液量增加，因此，有时对后面的低聚木糖纯化工序不利。另一方面，如果固体物浓度过高，则有时难以处理。

水解反应的温度与工序(1)同样地只要依据源自丝状菌的纤维素酶的优选反应条件，就没有特别限定，但优选为30～75℃的范围，特别是工序(1)中使用源自木霉属微生物的纤维素酶的情况下，进一步优选为40～60℃的范围。

水解反应的pH也同样地只要依据源自丝状菌的纤维素酶的优选反应条件，就没有特别限定，但优选pH3.0～7.0的范围，进一步优选为pH4.0～6.0的范围。工序(1)中使用源自木霉属微生物的纤维素酶的情况下，其反应最适pH为5.0。并且，由于在水解过程中pH发生变化，因此，优选在反应液中添加缓冲液，或一边使用酸、碱保持一定pH一边进行。

水解反应的时间优选为10分钟～48小时的范围。本发明的低聚木糖优选聚合度为2～10的范围的低聚木糖，特别优选以作为肠道细菌的乳酸菌、双歧杆菌的同化性良好的聚合度为2(木二糖)和/或聚合度为3(木三糖)的低聚木糖为主成分。如果反应时间小于10分钟，则有时无法获得足够的低聚木糖生成。另一方面，如果反应时间过长，则有时会由于回收纤维素酶所含的微量的β-木糖苷酶的作用、木聚糖酶的作用而导致低聚木糖分解，作为单糖的木糖增加，因此优选在48小时以内结束反应。

通过回收纤维素酶的作用而生成的低聚木糖液包含其它种类的杂质、残留物，因此，可以利用过滤、或离子交换树脂、合成吸附剂、活性碳等吸附剂纯化低聚木糖。通过使用吸附剂，能够除去源自含有木聚糖的原料的着色成分，因此，在加工食品、饮料加工等中的利用性提高。得到的低聚木糖液也可以根据需要进行粉末化。

实施例

下面，通过实施例进一步具体说明本发明。但是，本发明不受其限定。

(参考例1)源自木霉属微生物的纤维素酶的制备

源自木霉属微生物的纤维素酶利用以下方法制备。

[预培养]

以玉米浸渍液5％(w/v)、葡萄糖2％(w/v)、酒石酸铵0.37％(w/v)、硫酸铵0.14％(w/v)、磷酸二氢钾0.14％(w/v)、氯化钙二水合物0.03％(w/v)、硫酸镁七水合物0.03％(w/v)、氯化锌0.02％(w/v)、氯化铁(Ⅲ)六水合物0.01％(w/v)、硫酸铜(Ⅱ)五水合物0.004％(w/v)、氯化锰四水合物0.0008％(w/v)、硼酸0.0006％(w/v)、七钼酸六铵四水合物0.026％(w/v)的方式溶解到RO水中，将100mL加入到500mL容量带挡板的三角烧瓶中，在121℃下高压釜灭菌15分钟。放冷后，将与其分开地分别在121℃的温度下高压釜灭菌了15分钟的PE-M和Tween80分别以0.01％(w/vol)添加。在该预培养培养基中以1×10⁵个/mL的方式接种里氏木霉QM9414，以28℃、180rpm振荡培养72小时，作为预培养液(振荡装置：TAITEC制造BIO-SHAKER BR-40LF)。

[主培养]

以玉米浸渍液5％(w/v)、葡萄糖2％(w/v)、纤维素(Avicel)10％(w/v)、酒石酸铵0.37％(w/v)、硫酸铵0.14％(w/v)、磷酸二氢钾0.2％(w/v)、氯化钙二水合物0.03％(w/v)、硫酸镁七水合物0.03％(w/v)、氯化锌0.02％(w/v)、氯化铁(Ⅲ)六水合物0.01％(w/v)、硫酸铜(Ⅱ)五水合物0.004％(w/v)、氯化锰四水合物0.0008％(w/v)、硼酸0.006％(w/v)、七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/v)的方式溶解到蒸留水中，将2.5L加入到5L容量的发酵罐(ABLE制造DPC-2A)中，在121℃下高压釜灭菌15分钟。放冷后，将与其分开地分别在121℃的温度下高压釜灭菌了15分钟的PE-M和Tween80分别以0.01％添加，接种用前述方法得到的预培养液250mL。其后，以28℃、300rpm、通气量1vvm进行87小时培养。将得到的培养液进行离心分离，培养上清作为粗酶液使用。此外，按照后述的参考例2测定培养上清的蛋白质浓度，结果为10g/L。

(参考例2)蛋白质浓度的测定

蛋白质浓度使用市售的蛋白质浓度测定试剂(Quick Start Brad ford ProteinAssay，Bio-Rad制造)。在恢复到室温的蛋白质浓度测定试剂250μL中添加稀释的纤维素酶溶液5μL，在室温下用酶标仪(Multiskan GO，サーモサイエンティフィック制造)测定静置5分钟后在595nm下的吸光度。以牛血清白蛋白水溶液为标准液，与校正曲线对照计算出纤维素酶溶液的蛋白质浓度。

(参考例3)糖浓度的测定

糖液所含的葡萄糖、木糖、木二糖及木三糖浓度在下述所示的HPLC条件下，通过与标准品的比较来定量。

柱：AQUITY UPLC BEH Amide(Waters制造)

流动相A：80％乙腈+0.1％TFA

流动相B：30％乙腈+0.1％TFA

流速：0.12mL/min

在10分钟内使流动相B的比例从0缓慢上升到40％，在10.01分钟再次仅为流动相A，进行分析到20分钟为止。

检测方法：ELSD(蒸发光散射检测器)

温度：55℃。

(参考例4)β-木糖苷酶活性的测定方法

作为β-木糖苷酶活性，测定4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(pNP-Xyl)的分解活性。在包含1.1mM底物的55mM醋酸缓冲液(pH5.0)0.9mL中加入酶液0.1mL，在30℃下使其准确反应30分钟(底物的终浓度1mM，缓冲液的终浓度50mM)后，添加0.1mL的2M碳酸钠水溶液使反应停止，测定405nm下的吸光度(ODtest)。对于在底物溶液中依次添加2M碳酸钠水溶液、酶液而得的样品也同样测定405nm下的吸光度作为空白(ODblank)。将在上述反应体系中1分钟生成1μmol的4-硝基苯酚的酶量定义为1U，按照下述式计算出活性值(U/mL)。此外，上述反应体系中的4-硝基苯酚的毫摩尔分子吸光系数为17.2L/mmol/cm。

β-木糖苷酶活性(U/mL)＝{(ODtest-ODblank)×1.1(mL)×酶稀释倍率}/{17.2×30(分钟)×0.1(mL)}。

(参考例5)含纤维素生物质的前处理

使用橡木、甘蔗渣、白桦三种前处理物作为含纤维素生物质。橡木使用制浆了的产物(兵库浆)作为橡木前处理物1。甘蔗渣及白桦分别按照以下所示的步骤进行前处理，作为甘蔗渣前处理物1～4、白桦前处理物1～3使用。

(1)甘蔗渣的水热处理

将甘蔗渣制浆(固体成分浓度30重量％)，200℃处理10分钟。水热处理结束后进行固液分离，将固体物充分洗涤而得的物质作为甘蔗渣前处理物1，将溶液作为甘蔗渣前处理物2。

(2)甘蔗渣的碱处理

将相对于每1g甘蔗渣的固体物添加了100mg氢氧化钠而得的固体成分浓度30重量％的浆在180℃处理10分钟。碱处理结束后进行固液分离，将固体物充分洗涤而得的物质作为甘蔗渣前处理物3，将溶液作为甘蔗渣前处理物4。

(3)白桦的水热处理

将白桦屑的浆(固体成分浓度30重量％)在150℃下处理4小时。水热处理结束后进行固液分离，将固体成分充分洗涤而得的物质作为白桦树前处理物1，将溶液作为白桦树前处理物2。

(4)白桦前处理物2的丙酮分级

添加与前项(3)所得的白桦前处理物2等量的冷丙酮，在冰上搅拌5分钟后，室温下静置。在1小时后进行过滤，使所得固体物干燥，作为白桦树处理物3。

(参考例6)利用源自木霉属微生物的纤维素酶的含纤维素生物质的水解和回收纤维素酶的制备

[工序1：含纤维素生物质的水解]

使用橡木前处理物、甘蔗渣前处理物1、甘蔗渣前处理物3中的任一种作为含纤维素生物质。在50mL容量离心管中取以绝干重量计为1g的各前处理物，加入RO水制备浆。此外，含水率使用红外线水分仪(ケツト科学研究所制造FD-720)，通过使样品在105℃下干燥而测定。添加稀硫酸将浆的pH调节到pH4.7～5.3的范围内，添加1.0mL按照参考例1制备的源自木霉属微生物的纤维素酶(蛋白质浓度：10g/L)、和0.45mL源自黑曲霉的β-葡萄糖苷酶(Megazyme制造，E-BGLUC，蛋白质浓度：1.1g/L)。以最后总重量为10g的方式加入RO水并使固体物终浓度为10重量％，在50℃下使用杂交转子旋转混和24小时(日伸理化株式会社制造SN-06BN)。

[工序2：回收纤维素酶的制备]

将水解物通过离心分离(8,000G、10分钟)进行固液分离，获得溶液成分和水解残留物。使回收的溶液成分通过孔径为0.2μm的精密过滤膜(25mmGD/X注射器过滤器，材质：PVDF，GEヘルスケア·ジャパン制造)除去微粒后，用截留分子量10,000的超滤膜(VIVASPIN Turbo15材质：PES，Sartorius stedim biotech制造)过滤。回收非透过侧，作为糖液回收透过侧。对于糖液，按照参考例3测定糖浓度。对于回收纤维素酶液，按照参考例4进行β-木糖苷酶活性测定。糖液的糖浓度示于表1，回收纤维素酶液的β-木糖苷酶活性示于表2。

表1

(比较例1)使用源自丝状菌的纤维素酶水解含有木聚糖的原料

作为含有木聚糖的原料，分别在50mL容量离心管中分别取10mL甘蔗渣前处理物2、10mL白桦前处理物2、10g甘蔗渣前处理物3或白桦前处理物3的浆(固体物浓度10重量％，用稀硫酸调整到pH5)，添加1.0mL的RO水或1.0mL按照参考例1制备的源自木霉属微生物的纤维素酶。在50℃下旋转混和6小时后进行离心分离(8,000G，10分钟)，按照参考例3分析上清的糖浓度。

(实施例1)使用源自木霉属微生物的回收纤维素酶水解含有木聚糖的原料

用按照参考例6获得的回收纤维素酶的总量来代替源自木霉属微生物的纤维素酶，其它与比较例1同样地实施水解。将比较例1及实施例1的糖浓度示于表3。在使用源自作为禾本科植物的甘蔗渣、作为阔叶树的白桦中的任一者的含有木聚糖的原料的情况下，均是通过使回收纤维素酶作用，与使源自木霉属微生物的纤维素酶作用的情况相比，生成了更多的低聚木糖。

表3

(实施例2)含纤维素生物质水解物的电导率与回收纤维素酶的β-木糖苷酶活性的关系

使用橡木前处理物作为含纤维素生物质，利用与参考例6同样的方法进行水解及制备回收纤维素酶。但是，在水解反应中添加氯化钠，获得不同的电导率的水解物。

参考例6中使用的源自黑曲霉的β-葡萄糖苷酶(Megazyme制造E-BGLUC，蛋白质浓度：1.1g/L)是悬浮于3.2M的硫酸铵中的制品，因此用截留分子量10,000的超滤膜(VIVASPIN Turbo15材质：PES，Sartorius stedim biotech制造)加水过滤而进行脱盐，制备稀释到1,000倍以上的脱盐酶溶液。在该脱盐酶溶液中按表4所示的浓度添加氯化钠，制备各电导率的水解物。对于电导率为9.4mS/cm以上的水解物，使用非脱盐酶溶液制备。

由各水解物获得回收纤维素酶液，按照参考例4测定β-木糖苷酶活性。将水解物的电导率和回收纤维素酶的β-木糖苷酶活性示于表4。在水解物的电导率小于16.3mS/cm的情况下，β-木糖苷酶活性小于5％。

(实施例3)回收纤维素酶的β-木糖苷酶活性与生成低聚木糖的关系

使用实施例2中得到的回收纤维素酶，利用与实施例1同样的方法实施甘蔗渣前处理物2的水解。将上清的糖浓度示于表5。

由这些结果可知，不使用回收纤维素酶的情况下，木聚糖分解到单糖木糖，没有检测到低聚木糖，与此相对，通过使用回收纤维素酶，以高糖产量获得低聚木糖。另外可知，在回收后的β-木糖苷酶的活性降低到小于回收前的5％的情况下，以特别高的糖产量获得低聚木糖。

产业可利用性

根据本发明中的糖液及低聚木糖的制造方法，回收为了由含纤维素生物质制造糖液而使用的源自丝状菌的纤维素酶，在低聚木糖的制造中再利用，由此能够削减低聚木糖的制造成本。另外，本发明中制造的糖液能够作为各种化学品的发酵原料使用。本发明中制造的低聚木糖能够作为食品、饲料中的添加剂使用。

Claims (10)

1.低聚木糖的制造方法，包括以下工序(1)～(3)：

工序(1)：将含纤维素生物质利用源自丝状菌的纤维素酶进行水解，

工序(2)：将工序(1)的水解物进行固液分离，使溶液成分通过超滤膜而进行过滤，作为非透过液回收纤维素酶，作为透过液回收糖液，

工序(3)：作为与工序(1)独立的工序，使工序(2)的回收纤维素酶与含有木聚糖的原料作用，回收生成的低聚木糖，

其中，所述丝状菌的纤维素酶具有木聚糖酶活性和β-木糖苷酶活性，

在工序(2)中，工序(1)的水解物的电导率小于16mS/cm。

2.根据权利要求1所述的低聚木糖的制造方法，源自丝状菌的纤维素酶为源自里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶。

3.根据权利要求1或2所述的低聚木糖的制造方法，工序(2)的回收纤维素酶的β-木糖苷酶活性小于工序(1)中使用的源自丝状菌的纤维素酶的5％。

4.根据权利要求1或2所述的低聚木糖的制造方法，工序(2)的回收纤维素酶至少包含木聚糖酶。

5.根据权利要求1所述的低聚木糖的制造方法，工序(1)是将含纤维素生物质的前处理物利用源自丝状菌的纤维素酶进行水解的工序。

6.根据权利要求5所述的低聚木糖的制造方法，工序(1)是将含纤维素生物质的前处理物所含的固体物用水洗涤而得的物质利用源自丝状菌的纤维素酶进行水解的工序。

7.根据权利要求1所述的低聚木糖的制造方法，含有木聚糖的原料是含纤维素生物质的前处理物。

8.根据权利要求7所述的低聚木糖的制造方法，含有木聚糖的原料是将含纤维素生物质的前处理物进行固液分离而得的溶液成分。

9.根据权利要求7所述的低聚木糖的制造方法，含有木聚糖的原料是将含纤维素生物质的前处理物进行固液分离而得的固体成分。

10.根据权利要求9所述的方法，是将包括所述工序(1)～(3)的工艺反复进行的低聚木糖的制造方法，将工序(3)中得到的水解残留物作为后段工艺的工序(1)的含纤维素生物质的一部分或全部使用。

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