CN116990501A - 一种小熊猫IgG酶标抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于酶标抗体技术领域，具体涉及一种小熊猫IgG酶标抗体的制备方法，该方法采用Protein G亲和层析法提纯小熊猫血清IgG，以纯化的小熊猫IgG（H+L）作为抗原免疫山羊，制备山羊抗小熊猫IgG（H+L）抗血清，并用抗原亲和层析方法纯化山羊抗小熊猫IgG（H+L），过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶，即获得山羊抗小熊猫IgG（H+L）酶标抗体。本发明制备的抗体可用于包括ELISA、western‑blot在内的多种免疫学检测方法，初步解决了小熊猫IgG酶标抗体缺乏的现状，为小熊猫相关疾病的血清学检测技术的发展提供基础。

Description

一种小熊猫IgG酶标抗体的制备方法

技术领域

本发明属于酶标抗体技术领域，具体涉及一种小熊猫IgG酶标抗体的制备方法。

背景技术

小熊猫（Ailurus fulgens）隶属食肉目，小熊猫科，特产于喜马拉雅山脉-横断山脉。目前，小熊猫已被列入《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》（IUCN）的濒危级别；在我国，小熊猫被列为国家二级保护动物。随着栖息地的破坏和缩小，小熊猫的野外数量剧减，小熊猫物种的保护工作迈入一个新的阶段。圈养条件下，传染病给小熊猫保护工作带来了巨大的挑战，建立特异性的诊断方法对于小熊猫传染病的防控意义重大。尽管针对犬瘟热、猫瘟热等传染病已建立了核酸检测方法，但目前诊断小熊猫疾病的血清学特异性检测方法较少，这与缺少小熊猫特异性抗体有关，尤其是商品化的小熊猫IgG抗体的缺乏，严重制约了小熊猫疾病血清学检测方法的发展。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明旨在提供一种小熊猫IgG酶标抗体的制备方法，该方法采用Protein G亲和层析法提纯小熊猫血清IgG，以纯化的小熊猫IgG（H+L）作为抗原免疫山羊，制备山羊抗小熊猫IgG（H+L）抗血清，并用抗原亲和层析方法进行纯化，过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶，即获得山羊抗小熊猫IgG（H+L）酶标抗体。本发明制备的抗体可用于包括ELISA、western-blot在内的多种免疫学检测方法，初步解决了小熊猫IgG酶标抗体缺乏的现状，为小熊猫相关疾病的血清学检测技术的发展提供基础。

为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：

本发明提供一种小熊猫IgG酶标抗体的制备方法，包括如下步骤：

A、采集小熊猫血液，离心收集血清，并采用Protein G亲和层析法提纯得到小熊猫IgG；

B、取步骤A得到的小熊猫IgG与等量弗氏完全佐剂混合并充分乳化，皮下注射山羊进行首次免疫，首次免疫后间隔四周，取小熊猫IgG与等量弗氏不完全佐剂乳化进行第二次免疫，随后每间隔三周按照第二次免疫方法进行加强免疫，直至山羊血清效价合格；

C、抽取山羊的血液，并离心沉淀分离出血清，即为山羊抗小熊猫IgG多克隆抗体，-20℃冷冻保存；

D、对步骤C得到的山羊抗小熊猫IgG多克隆抗体进行纯化；

E、向活化的HRP溶液中加入HRP偶联缓冲液，静置后加入步骤D中纯化的山羊抗小熊猫IgG多克隆抗体，进行透析、还原，即得HRP标记的山羊抗小熊猫IgG多克隆抗体。

在一些实施例中，在步骤A中，具体包括以下步骤：

A1、采集小熊猫血液，将血液置于37℃放置1 h后，并在4℃静置12 h-24h， 1500rpm离心10 min后收集上层血清，分装至不同的EP管中，-20℃保存；取不同个体，数量大于等于5只的小熊猫血清融化后混匀，用20 mM pH 7.0的磷酸缓冲液按体积稀释10倍，装入预处理的透析袋中4℃透析24 h，期间每隔6 h更换一次透析液，透析后的小熊猫血清再经0.45 μm滤器过滤后备用；

A2、向Protein G层析柱中加入10倍柱体积结合缓冲液冲洗柱子中的乙醇和平衡柱子，以0.5-5 mL/min加入步骤A1透析后的小熊猫血清，然后加入5-10倍柱体积结合缓冲液冲洗柱子，接着加入2-5倍柱体积洗脱缓冲液进行洗脱，即得小熊猫IgG。

在一些实施例中，在步骤B中，具体包括以下步骤：将3 mg纯化的小熊猫IgG与等量弗氏完全佐剂混合，充分乳化后作为抗原分点皮下注射山羊进行首次免疫；首次免疫后间隔4周，取1.5 mg纯化的小熊猫IgG与等量弗氏不完全佐剂乳化进行第二次免疫；此后，每间隔3周后按照二免方法加强免疫一次，二免后开始用间接ELISA检测山羊血清效价，直到效价合格。

在一些实施例中，在步骤E中，具体包括以下步骤：向活化的HRP溶液中加入HRP偶联缓冲液，静置30 min后加入1 mg纯化的山羊抗小熊猫IgG多克隆抗体，充分混匀并4℃透析12 h，透析后吸出透析袋中的液体，加入还原剂，室温静置2 h，即得HRP标记的山羊抗小熊猫IgG多克隆抗体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用Protein G层析柱提纯小熊猫血清IgG，经SDS-PAGE鉴定纯度后免疫山羊，制备山羊抗小熊猫IgG（H+L）抗血清，并用抗原亲和层析法纯化山羊抗小熊猫IgG（H+L）多克隆抗体，过碘酸钠法对纯化的山羊抗小熊猫IgG（H+L）多克隆抗体进行HRP标记。结果显示：小熊猫血清IgG经纯化后无明显杂质蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒测得纯化后的小熊猫IgG浓度为1.94-4.07 mg/mL。以纯化的小熊猫IgG（H+L）免疫山羊，经五次免疫后山羊血清中抗小熊猫IgG（H+L）的抗体效价达到期望水平。经HRP标记的山羊抗小熊猫IgG（H+L）能有效识别小熊猫IgG，表明成功制备了HRP标记的山羊抗小熊猫IgG（H+L）酶标抗体，为小熊猫疾病血清学检测方法的研发提供基础。

附图说明

图1为本申请实施例小熊猫IgG纯化产物SDS-PAGE图，M为蛋白质分子质量标准；1为小熊猫血清原液；2为流穿液；3为洗杂液；4为纯化的小熊猫IgG；

图2 为山羊抗小熊猫IgG（H+L）多克隆抗体效价图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本公开一些实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本公开所提供的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。

本实施例中符号对应的解释说明，如下表1所示：

表1

实施例

1 材料

1.1 小熊猫血清及实验动物

小熊猫血清样品是于小熊猫健康体检时采自6只成年小熊猫，其中雄性3只，雌性3只。体重28-32 kg健康波尔山羊1只。

1.2 主要试剂和溶液配制

Protein G亲和层析柱、SDS-PAGE电泳缓冲液、SDS-PAGE上样缓冲液、考马斯亮蓝R-250染色液与脱色液、BCA蛋白定量试剂盒、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HRP标记的兔抗山羊IgG抗体、脱脂奶粉、TMB底物显色液等。

血清抗体纯化相关试剂的配制

结合缓冲液（Binding Buffer，20 mM PB)：称取Na₂HPO₄ 为1.638 g，NaH₂PO₄·2H₂O为 1.32 g于适量体积的去离子中水溶解后，调节pH至7.0，定容至1 L。

洗脱缓冲液（Elution Buffer）：称取0.75 g甘氨酸充分溶解于800 mL去离子水中，调节pH至2.7，定容至1 L，室温保存备用。

1 M Tris-HCl (pH 9.0)：称取12.1 g Tris充分溶解于80 mL去离子水中，调节pH至9.0，定容至100 mL。

ELISA所用试剂的配制

磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS）：称取KH₂PO₄为0.27 g，KCl 为0.2 g，Na₂HPO₄为1.42 g，NaCl为8 g溶解于适量去离子水，调节pH至7.4，定容至1 L，室温保存备用。

封闭液：5 g脱脂乳充分溶解于100 mL PBS中，现配现用；

洗涤缓冲液（PBST）：0.5 mL Tween-20溶于1000 mL PBS中，现配现用；

抗体稀释液：2 g脱脂乳充分溶解于100 mL PBST中，现配现用；

终止液（2 M H₂SO₄）：于177.8 mL去离子水中缓慢加入22.2 mL浓硫酸，边加边搅拌，室温保存备用。

1.3主要仪器

台式离心机、移液枪、冰箱、电子天平、蛋白电泳仪、凝胶成像系统、核酸蛋白检测仪、酶标仪、恒温箱。

2 方法

2.1 血液采集及血清分离

在非麻醉状态下，日常体检时将小熊猫固定在保定笼内并伸出前腿，皮肤剃毛消毒后经腕前桡侧皮静脉穿刺，看见回血后再将采血针尾端插入红色真空采血管，收集血液2mL，拔出采血针时，并按压止血，血液室温静置1小时后4℃12-24 h，1500 rpm离心10 min后小心吸取上层血清，500 μL/支分装，-20℃保存。

2.2 小熊猫IgG的纯化

采用Protein G 亲和层析柱纯化小熊猫血清，具体方法为：

1、分别取6只不同个体小熊猫血清样品500 μL，混合后用Binding buffer稀释至30 mL，装入预处理的透析袋中，将透析袋置于Binding buffer中透析24 h，期间每隔6 h更换一次透析液，透析后的小熊猫血清经0.45 μm滤器过滤后备用；

2、取出HiTrap^TM Protein G HP纯化柱，按5 mL/min流速加入50 mL Bindingbuffer平衡柱子；

3、按1 mL/min流速加入步骤1中经透析和过滤的小熊猫血清，收集流穿液重复上样一次；

4、按5 mL/min流速加入40 mL Binding buffer平衡柱子；

5、准备一系列1.5 mL EP管并向每管中加入60 μL 1M Tris-HCl（pH 9.0）；

6、缓慢加入20 mL Elution buffer洗脱IgG，洗脱的IgG装入步骤5准备的EP管中；

7、按5 mL/min流速加入50 mL Binding buffer再生柱子，然后向柱子中缓慢加入25 mL 20%乙醇，封柱后置于4℃冰箱保存，可用于纯化同一种血清样品；

8、收集纯化过程中的流穿液、洗杂液和洗脱液进行SDS-PAGE鉴定，对纯化的小熊猫IgG使用BCA蛋白定量试剂盒测定浓度。

2.3 动物免疫程序

选取体重为28-32 kg的健康波尔山羊1只，将纯化的小熊猫IgG（H+L）与佐剂混合充分乳化后经背部皮下多点注射（8-12个注射点位）进行免疫，首次免疫抗原加入弗氏完全佐剂乳化，加强免疫采用弗氏不完全佐剂乳化。免疫程序见表2。

表2 免疫剂量和时间间隔

2.4 波尔山羊抗小熊猫IgG（H+L）多克隆抗体效价测定

以纯化的小熊猫IgG作为抗原包被酶标板，采用间接ELISA方法测定波尔山羊血清抗体效价，具体操作流程为：

1、纯化的小熊猫IgG稀释至0.1 μg/mL，每孔加入100 μL，4℃静置12-20 h，

2、弃掉包被液，PBST洗涤3次，用封闭液37 ℃封闭2 h；

3、PBST洗涤3次，将抗小熊猫IgG（H+L）波尔山羊血清按1：1000起做2倍倍比稀释，同时以未免疫波尔山羊血清作为阴性对照，37℃孵育2 h；

4、PBST洗涤3次，将HRP标记的兔抗山羊IgG稀释至0.1 μg/mL作为二抗，37℃孵育1.5 h；

5、PBST洗涤3次，加入TMB底物避光显色15 min，以2 M H₂SO₄终止反应并测定OD₄₅₀值。当阳性血清与阴性血清的吸光度（OD₄₅₀，P/OD₄₅₀，N）比值≥2.1判定为阳性。当波尔山羊血清作1：8000倍稀释时OD₄₅₀值为1.0左右时，表明抗体效价达到预期水平。

2.4 抗血清的收集

波尔山羊抗小熊猫IgG（H+L）血清效价达到预期水平后开始采血。采血前动物禁食12 h以减少血清中的脂肪含量。采用颈动脉放血的方法收集动物血液，待收集的血液凝固后用无菌滴管把血块与瓶壁剥离，37℃静置2 h后放入4℃ 12-24 h，使血清充分析出，经离心沉淀后分出血清，-20℃冷冻保存。

2.5 波尔山羊抗小熊猫IgG（H+L）多克隆抗体的纯化

采用抗原亲和层析法纯化波尔山羊抗小熊猫IgG（H+L）多克隆抗体，具体操作步骤为：

1、将Sepharose CL-4B装入层析柱中并进行活化；

2、将1.5 mg纯化的小熊猫IgG加入到已活化的层析柱中，再加入5 mL偶联液，置于摇床室温孵育4 h；

3、去除偶联液用10 mL冲洗液洗涤柱子，加入5 mL封闭液，置于旋转摇床室温孵育4 h；

4、去除封闭液，10 mL冲洗液洗涤柱子；

5、加入10 mL波尔山羊血清，使血清从层析柱自然流出，收集流穿液，将流穿液再次加入层析柱，重复10次，其中每2次后用5 mL冲洗液冲洗一次柱子，弃去流出的冲洗液，收集最后一次的流穿液；

6、用10 mL冲洗液洗涤柱子，加入5 mL预洗脱液洗脱一次，弃去流穿液；

7、准备一系列1.5 mL EP管，向每管中加入50 μL收集液；

8、加入10 mL洗脱液，洗脱的抗体收集到步骤7准备的EP管中；

9、用10 mL冲洗液冲洗柱子，重复5次，缓慢加入10 mL 20%乙醇溶液，封存后于4℃保存；

10、间接ELISA检测各管抗体的效价，保留效价最高的5 mL抗体；

11、纯化后抗体含量以751型紫外分光光度计进行测定。

2.6 HRP酶标抗体的制备

参照HRP偶联试剂盒（过碘酸盐法）说明书对纯化后的波尔山羊抗小熊猫IgG（H+L）多克隆抗体进行标记，具体操作步骤为：

1、向500 μL HRP溶液中加入200 μL HRP活化缓冲液，充分混匀后室温孵育30min；

2、加入200 μL HRP偶联缓冲液，静置30 min，溶液应缓慢变回棕黄色；

3、加入1 mg纯化的波尔山羊抗小熊猫IgG（H+L）多克隆抗体，充分混匀后转移到预处理的透析袋中，置于2 L偶联透析液中，4℃透析12-24 h；

4、吸出透析袋中的液体，加入100 μL还原剂（HRP标记过程中，为防止HRP的氨基与醛基反应发生自身偶联，标记前会暂时封闭HRP的α-和ε-氨基；当HRP与抗体结合后会加入还原剂（如硼氢化钠）还原形成稳定的结合物。文中采用的HRP偶联试剂盒进行标记，还原剂是试剂盒的一种组分），室温静置2 h，期间每间隔半小时用移液器轻轻混匀。

2.7 酶标抗体的检测

采用直接ELISA方法检测检测酶标抗体的标记效果，具体操作流程为：

1、纯化的小熊猫IgG分别稀释至0.001、0.01、0.1和0.1 μg/mL，每孔加入100 μL，4℃ 12-24 h；

2、弃掉包被液，PBST洗涤3次，封闭液37℃封闭2 h；

3、PBST洗涤3次，将HRP标记的波尔山羊抗小熊猫IgG（H+L）稀释至0.1 μg/mL，同时以未标记的波尔山羊抗小熊猫IgG（H+L）（4 μg/mL）作为阴性对照，100 μL/孔，37℃孵育1.5h；

4、PBST洗涤3次，加入TMB底物避光显色15 min，以2 M H₂SO₄终止反应并测定OD₄₅₀值。

3 结果

3.1 小熊猫IgG纯化及浓度测定

小熊猫血清经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE分析表明：纯化后的小熊猫IgG可见分子量约为55 kDa和25 kDa的蛋白带，分别代表IgG分子在SDS和β-巯基乙醇作用下解离的重链和轻链（如图1）。使用BCA蛋白定量试剂盒测定纯化后IgG浓度1.94-4.07 mg/mL。通过图1可知小熊猫血清经Protein G层析柱纯化后，获得高纯度的IgG，可以用于后续多克隆抗体的制备。

3.2 波尔山羊抗小熊猫IgG（H+L）多克隆抗体制备及效价测定

使用小熊猫IgG（H+L）对波尔山羊进行5次免疫后，波尔山羊血清抗体效价达到预期水平（如图2），最终获得抗血清约400 mL，通过图2可知波尔山羊经小熊猫IgG（H+L）免疫后，可诱导机体产生针对小熊猫IgG（H+L）的特异性多克隆抗体，且随着免疫次数的增加，抗体效价逐步上升。波尔山羊经五次免疫后，间接ELISA方法测得波尔山羊血清稀释8000倍时OD₄₅₀值为0.975，满足期望抗体水平。

3.3 波尔山羊血清的纯化和HRP标记

波尔山羊抗小熊猫IgG（H+L）多克隆抗体经抗原亲和层析后获得的抗体浓度不小于2.64 mg/mL，进一步用HRP偶联试剂盒（过碘酸盐法）进行HRP标记，标记后的抗体浓度为2.94 mg/mL。

3.4 酶标抗体的检测

直接ELISA测定结果显示：包被抗原小熊猫IgG浓度为0.1 μg/mL时，HRP标记抗体反应后OD₄₅₀值可达1.865，未标记抗体反应后的OD₄₅₀值为0.004（表3），表明波尔山羊抗小熊猫IgG（H+L）多克隆抗体已成功标记HRP。

表3 HRP-波尔山羊抗小熊猫IgG（H+L）的检测

在本说明书的描述中，具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (4)

1.一种小熊猫IgG酶标抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、采集小熊猫血液，离心收集血清，并采用Protein G亲和层析法提纯获得小熊猫IgG；

B、取步骤A得到的小熊猫IgG与等量弗氏完全佐剂混合并充分乳化，经皮下注射山羊进行首次免疫，首次免疫后间隔四周，取纯化的小熊猫IgG与等量弗氏不完全佐剂乳化进行第二次免疫，随后每间隔三周按照第二次免疫过程进行加强免疫，直至山羊血清效价合格；

C、抽取山羊的血液，并离心沉淀分离出血清，即为山羊抗小熊猫IgG多克隆抗体，－20℃冷冻保存；

D、对步骤C得到的山羊抗小熊猫IgG多克隆抗体进行纯化；

E、向活化的HRP溶液中加入HRP偶联缓冲液，静置后加入步骤D中纯化的山羊抗小熊猫IgG多克隆抗体，进行透析、还原，即得HRP标记的山羊抗小熊猫IgG多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤A中，具体包括以下步骤：

A1、采集小熊猫血液，将血液置于37℃放置1 h后，并在4℃静置12 h-24 h，1500 rpm离心10 min后收集上层血清，分装至不同的EP管中，-20℃保存；取不同个体，数量大于等于5只的小熊猫血清融化后混匀，用20 mM pH 7.0的磷酸缓冲液按体积稀释10倍，装入预处理的透析袋中4℃透析24 h，期间每隔6 h更换一次透析液，透析后的小熊猫血清再经0.45 μm滤器过滤后备用；

A2、向Protein G层析柱中加入10倍柱体积结合缓冲液冲洗柱子中的乙醇和平衡柱子，以0.5-5 mL/min加入步骤A1透析后的小熊猫血清，然后加入5-10倍柱体积缓冲液冲洗柱子，接着加入2-5倍柱体积洗脱缓冲液进行洗脱，即得小熊猫IgG。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤B中，具体包括以下步骤：

将3 mg纯化的小熊猫IgG与等量弗氏完全佐剂混合，充分乳化后作为抗原分点皮下注射山羊进行首次免疫；首次免疫后间隔4周，取1.5 mg纯化的小熊猫IgG与等量弗氏不完全佐剂乳化进行第二次免疫；此后，每间隔3周后按照二免方法加强免疫一次，二免后开始用间接ELISA检测山羊血清效价，直到效价合格。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤E中，具体包括以下步骤：

向活化的HRP溶液中加入HRP偶联缓冲液，静置30 min后加入1 mg纯化的山羊抗小熊猫IgG多克隆抗体，充分混匀后4℃透析12 h，透析后吸出透析袋中的液体，加入还原剂，室温静置2 h，即得HRP标记的山羊抗小熊猫IgG多克隆抗体。