CN116987099A - 具有双自由基的噻吩并噻二唑类有机小分子及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有双自由基的噻吩并噻二唑类有机小分子及其制备方法和应用。具有式(I)所示结构：其中，式(I)中的n相同或者不同，各自为0，1，2或3；式(I)中的X相同或者不同，各自为氮、氧、硫、硒或碲元素中的一种；式(I)中的R₁相同或者不同，各自为氢或烷基或烷氧基。该材料制备成纳米药物后能够在808nm近红外激光照射下实现时空同步析氧、产生Type I型活性氧物种及光热转换，克服了因肿瘤复杂微环境导致的治疗效果差等问题。

Description

具有双自由基的噻吩并噻二唑类有机小分子及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及有机功能分子领域，具体地说，是涉及一种具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子材料的制备方法和应用。

背景技术

癌症已经成为危害人类健康的主要疾病之一。目前用于癌症治疗的手段如手术治疗、放射性治疗、化疗等存在术后创伤大、副作用强和不确定的炎症反应等问题。而近年来新兴的光热治疗和光动力治疗具有非入侵性、低毒性、高选择性等优点，因此受到越来越多人的关注。彻底根除肿瘤对于减轻患者疼痛和延长患者寿命尤为重要。由于肿瘤的乏氧环境和耐热性等客观因素，极大的影响了单一的光热治疗或光动力治疗的癌症治疗效果，为单一光热治疗或光动力治疗癌症带来了极大挑战。

近年来，光热/光动力协同治疗可以弥补单一治疗模式的缺点，展现出独特的优势。光热治疗引起的光热效应可以加速肿瘤内血液循环，从而导致更多的氧气运输到肿瘤中，提高光动力治疗的治疗效果。光动力治疗可以弥补光热治疗的高功率依赖性，避免了肿瘤部位以外其他正常组织的热损伤。同时，光动力治疗可以阻碍热休克蛋白的表达，避免了光热治疗期间热休克蛋白的保护作用。为了同时满足上述条件，人们往往将光热材料、光动力材料以及产氧材料通过物理包覆混合到一起，以实现具有上述各种功能的纳米药物。但是该方法制备的复合材料通常具有较差的重复性，从而严重阻碍了其临床转化。此外，由于掺杂的成分具有不同的光学特性，往往需要多个不同波长的光来激发，这不仅增加了操作的复杂性，而且还会造成治疗延迟。并且，传统光敏剂药物的激发光波长通常都小于700nm，大大限制了其组织穿透深度。

因此，通过分子设计构建一种能够同时满足时空同步自供氧的光热/光动力协同应用的近红外吸收药物尤为重要。

发明内容

当前光疗药物存在诸多局限性，难以实现在肿瘤乏氧微环境下癌症的高效治疗。针对该技术问题，本发明提供了一种具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子材料及其制备方法和应用。该材料制备成药物后能够在808nm近红外激光照射下，实现时空同步析氧、产生Type-I型活性氧物种及光热转换。

本发明的目的之一是提供一种具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子，具有式(I)所示结构：

其中，式(I)中的n相同或者不同，各自为0，1，2或3；

式(I)中的X相同或者不同，各自为氮、氧、硫、硒或碲元素中的一种；式(I)中的R₁相同或者不同，各自为氢或烷基或烷氧基。

根据本发明，R₁可以在较宽的范围内选择。在本发明一种优选的实施方式中，R₁为氢或含1-24个碳原子的烷基或含1-24个碳原子的烷氧基；优选地，R₁为氢或含1-12个碳原子的烷基，例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12个碳原子的烷基。或者，R₁为含1-12个碳原子的烷氧基，例如可以为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12个碳原子的烷氧基。

本发明的目的之二是提供一种目的之一所述的具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子的制备方法，包括在无水无氧的条件下，以及在催化剂和溶剂的存在下，将式(Ⅱ)所示的化合物和丙二腈进行反应；

根据本发明，式(Ⅱ)所示的化合物和丙二腈的摩尔比可以在较宽的范围内选择。在本发明一种优选的实施方式中，式(Ⅱ)所示的化合物和丙二腈的摩尔比为1：(2-11)，优选为1：(5-8)。

根据本发明，所述催化剂的用量可以在较宽的范围内选择。在本发明一种优选的实施方式中，相对于1mmol式(Ⅱ)所示的化合物，所述催化剂的总用量为0.3-1.2mmol，优选为0.5-0.9mmol。

根据本发明，所述催化剂的种类可以有多种选择。在本发明一种优选的实施方式中，所述催化剂选自乙酸铵和/或β-丙氨酸；优选地，所述催化剂选自乙酸铵和β-丙氨酸，进一步优选地，乙酸铵和β-丙氨酸的摩尔比为1：(0.01-0.12)；优选为1：(0.03-0.08)。

根据本发明，所述溶剂可以在较宽的范围内选择。在本发明一种优选的实施方式中，所述溶剂选自冰醋酸和/或乙醇。

根据本发明，所述溶剂的用量可以在较宽的范围内选择。在本发明一种优选的实施方式中，相对于1mmol式(Ⅱ)所示的化合物，所述溶剂的用量为30-50mL，更优选为35-40mL。

根据本发明，所述反应的温度条件可以在较宽的范围内选择。在本发明一种优选的实施方式中，所述反应的条件包括：温度为50-120℃。

根据本发明，所述反应的时间条件可以在较宽的范围内选择。在本发明一种优选的实施方式中，所述反应的条件包括：时间为2-24小时。

在本发明一种具体的优选的实施方式中，所述制备方法包括：在无水无氧的条件下，先将式(Ⅱ)所示的化合物和丙二腈与催化剂混合，再加入溶剂，并将混合物加热至50-120℃，于混合条件下反应2-24小时。

在本发明一种优选的实施方式中，反应路径为：

优选的反应条件为：在无水无氧的条件下将一定摩尔比的式(Ⅱ)和丙二腈加入两口圆底烧瓶中，加入一定量的催化剂乙酸铵和β-丙氨酸。氮气抽换气三次，随后向反应体系中加入一定量冰醋酸，并将混合物加热至50-120℃，搅拌条件下反应2-24小时得到所述具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子材料。

在本发明一种优选的实施方式中，该制备方法还包括在反应结束后，对所得的产物进行分离的步骤。

对于分离方法，可采用柱层析等通常的分离方式，对此，本发明没有特别的限定。

本发明的目的之三是提供一种目的之一所述的具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子在药物或医疗器械中的应用。

在本发明一种优选的实施方式中，所述药物能够通过光热/光动力协同治疗乏氧肿瘤。

本发明所制备具有双自由基特征的有机小分子材料在808nm激光照射下具有时空同步析氧、产生Type I型活性氧物种及光热转换的功能。有望实现在808nm近红外激光触发下时空同步自供氧的光热/光动力协同治疗，克服了因肿瘤复杂微环境导致的治疗效果差等问题。通过体外细胞实验和体内小鼠抑瘤实验证明了所制备的具有双自由基特征的有机小分子在乏氧肿瘤治疗方面的突出表现。

根据上述技术方案，本发明所述噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子材料具有聚集态稳定的双自由基特征、优异的近红外吸收性能，在近红外光照下能够分解水产生氧气、还原氧气生成超氧自由基和进行高效的光热转换，同时具有良好的生物兼容性和稳定性。本发明同时还提供了具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子材料的制备方法及其在癌症光热/光动力协同治疗中的应用。该材料制备成纳米药物后能够在808nm近红外激光照射下实现时空同步析氧、产生Type I型活性氧物种及光热转换，克服了因肿瘤复杂微环境导致的治疗效果差等问题。该制备方法简单可控，具有较高的应用价值。

之所以本发明的小分子具有以上的技术效果，本发明的发明人通过研究验证，认为原因在于：

以噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑为电子受体中心，两侧接有噻吩基团作为供体单元(D)形成4,6-二噻吩-2-基噻吩并[3,4-c][1,2,5]-噻二唑核心骨架，再以高度缺电子单元(A)二氰基作为封端基团构建出了一种高度平面π共轭D-A结构的分子。强的D-A结构及双自由基特征可以促进分子吸收发生红移，此外，D-A结构还有利于电荷分离。高度平面π共轭不仅可以增强聚集态时π-π相互作用，还可以降低激子结合能促进电荷分离。封端二氰基中C≡N键剧烈的伸缩振动有利于在聚集态下保持分子内运动，从而提高光热转换。

附图说明

图1为实施例1产物的¹HNMR谱图。

图2为具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子固体粉末的电子顺磁共振谱。

图3为实施例1具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子药物的吸收光谱。

图4为具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子药物在808nm近红外激光照射下的光热性能测试。

图5为具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子药物在808nm近红外激光照射下产生活性氧测试。

图6为具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子药物在808nm近红外激光照射下分解水产生氧气测试。

图7为在808nm近红外光照下，有或无具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子药物在常氧(21％O₂)或乏氧(1％O₂)氛围下细胞内活性氧成像。

图8为注射磷酸缓冲盐溶液(PBS)和具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子药物后在808nm激光(0.8W·cm^-2)照射下时空同步自供氧的光热/光动力协同治疗实验。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子材料的制备与其在乏氧肿瘤光热/光动力协同治疗中的应用进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。

以下实施例中，化合物TTD-CHO按照文献：J.Mater.Chem.,2011,21,4679–4688中记载的方法进行合成。

实施例与对比例中采用的原料，如果没有特别限定，那么均是现有技术公开的，例如可直接购买获得或者根据现有技术公开的制备方法制得。

以下实施例中，电子顺磁共振谱采用电子顺磁共振波谱仪检测；紫外-可见吸收光谱通过紫外-可见分光光度计检测；升温(实施例4)通过红外热成像仪检测；实施例5中活性氧产生情况以2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)活性氧指示剂为指标通过荧光光谱仪检测；实施例6中的产氧指标通过溶解氧测试仪检测；实施例7中细胞内活性氧成像以DCFH-DA活性氧指示剂为指标通过共聚焦显微镜检测；实施例8中的小鼠肿瘤部位升温情况通过红外热成像仪检测检测。

实施例1

在无水无氧的条件下将化合物TTD-CHO(0.395mmol)、丙二腈(2.443mmol)、乙酸铵(0.274mmol)和β-丙氨酸(0.010mmol)加入到两口圆底烧瓶中，氮气抽换气三次，随后向反应体系中加入15mL冰醋酸，将混合物加热至120℃，搅拌条件下反应24小时。反应结束后滤出固体，将固体用二氯甲烷溶解后萃取。萃取后的粗产物用硅胶柱纯化分离，洗脱剂为二氯甲烷/石油醚(1:3)。最终得到TTD-CN黑色产物。

实施例2

采用纳米共沉淀的方法制备了TTD-CN药物。具体制备过程为：首先，称取TTD-CN固体粉末(0.2mg)充分溶解在0.5mL的四氢呋喃中，再称取1mg的DSPE-PEG2000(百灵威公司购得)充分溶解在0.5mL的四氢呋喃中。将两种四氢呋喃溶液充分混合后通过细胞破碎仪，逐滴加入9mL的去离子水中。将滴加完成后的水溶液进行48h透析(透析袋型号MwCO:1000D)，透析过程中每8h换一次水，最终获得TTD-CN药物。选取1cm宽的石英比色皿，加入2ml浓度为10^-5M的TTD-CN药物的水溶液，通过紫外-可见分光光度计测试药物的吸收光谱。如图2所示，TTD-CN药物中的紫外吸收范围从300nm一直延伸到了950nm，证明该药物可用近红外光进行激发进行治疗。

实施例3

称取一定量的TTD-CN固体粉末，并测试其电子顺磁共振谱。如图3所示，该小分子表现出明显的碳自由基信号，具有双自由基特征。

实施例4

选取1cm宽的石英比色皿，加入1ml浓度为100μg/mL的TTD-CN药物的水溶液，以0.8W·cm^-2的808nm激光作为激发光源通过红外热成像仪测试了TTD-CN药物的光热性能。如图4所示，对照实验组纯水在相同光源照射下其温度不变。而浓度100μg/mL的TTD-CN药物在808nm激光(0.8W·cm^-2)照射下能够稳定上升27.3℃。

实施例5

本领域技术人员公知，活性氧由于含有不成对的电子，因而具有很高的化学反应活性。活性氧通过与细胞底物发生反应，进而对癌细胞造成杀伤。为了评估TTD-CN药物在808nm激光激发下能够生成活性氧，利用商业化活性氧指示剂DCFH-DA进行活性氧检测。TTD-CN药物产生的活性氧能够将活性氧指示剂氧化成具有强烈绿色荧光的荧光素，进而通过荧光光谱仪检测活性氧指示剂的荧光变化判断TTD-CN药物是否能产生活性氧。如图5所示，在808nm激光(0.8W·cm^-2)照射下，活性氧指示剂的荧光强度明显增加，表明TTD-CN药物产生了活性氧，可以作为产活性氧药剂进行光动力治疗。

实施例6

通过溶解氧测试仪测试了TTD-CN药物在808nm近红外激光照射下分解水产生氧气的效果。如图6所示，无光照条件下，随着时间的延长溶解氧测试仪示数基本不变，表示没有光激发TTD-CN药物不会产生氧气。当其他条件不变，只提供光照后，随着时间的延长溶解氧测试仪示数逐渐增加，TTD-CN药物在20min内析氧量高达1.1mg/mL。表明TTD-CN药物能够在808nm光激发下能够分解水产生氧气。

实施例7

为了进一步证明TTD-CN药物在活细胞内也同样具备活性氧生成能力。通过DCFH-DA活性氧试剂盒检测到了TTD-CN药物在活细胞内生成的活性氧。将TTD-CN药物与4T1细胞共孵育6h，待TTD-CN药物被4T1内吞后通过808nm激光照射4T1细胞，当TTD-CN药物受到光照后产生的活性氧会使活性氧指示剂发出明亮的绿色荧光。通过共聚焦显微镜拍照观察TTD-CN药物是否在4T1细胞内产生了活性氧，如图7内吞了TTD-CN药物的细胞发出明亮了绿色荧光，表明TTD-CN药物在活细胞内也能够很好的产生活性氧。

实施例8

在光热/光动力协同治疗抑制荷瘤小鼠肿瘤组织增长的实验过程中，通过0.8W·cm^-2的808nm近红外光对小鼠的肿瘤组织进行光照，用温感照相机检测肿瘤部位的温度变化，光照过程中肿瘤部位的升温效果如图8-a所示。

从图8-a中可以得出，TTD-CN药物通过尾静脉注射到小鼠体内后，可以很好的富集在肿瘤部位，并且在0.8W·cm^-2的808nm近红外光照下，能体现很好的光热升温效果，最后到达48.8℃温度平台。对于不含有TTD-CN药物，在0.8W·cm^-2的808nm近红外光照射15min后温度几乎不上升。证明了TTD-CN药物的光热转化率和体内潜在的光热治疗。

通过抑瘤实验测试了TTD-CN药物在808nm激光(0.8W·cm^-2)照射下自供氧光热/光动力协同治疗效果。将带有4T1肿瘤的小鼠随机分成四组：(a)TTD-CN药物、(b)TTD-CN药物+光照(808nm，0.8W·cm^-2)、(c)PBS和(d)PBS+光照(808nm，0.8W·cm^-2)。每隔两天记录一次小鼠体重和肿瘤体积，共监测15天。如图8-b所示，肿瘤在治疗9天后就完全消除。同时，在整个实验期间都没有再次复发，表明TTD-CN药物在808nm激光(0.8W·cm^-2)照射下自供氧的协同治疗模式可以完全抑制肿瘤的生长。在每2天小鼠模型的体重记录实验中，如图8-c所示四组荷瘤小鼠的体重都在生长，表明TTD-CN药物在体内具有优异的生物相容性和低毒性。从经过不同处理15天后小鼠肿瘤切除照片可以直观看出(图8-d)，治疗组的小鼠肿瘤几乎完全消失，进一步证明了TTD-CN药物在体内的优异协同作用。

实施例9

在无水无氧的条件下将化合物TTD-CHO(0.392mmol)、丙二腈(3.100mmol)、乙酸铵(0.272mmol)和β-丙氨酸(0.009mmol)加入到两口圆底烧瓶中，氮气抽换气三次，随后向反应体系中加入15mL冰醋酸，将混合物加热至120℃，搅拌条件下反应24小时。反应结束后滤出固体，将固体用二氯甲烷溶解后萃取。萃取后的粗产物用硅胶柱纯化分离，洗脱剂为二氯甲烷/石油醚(1:3)。经检测，最终得到TTD-CN黑色产物，收率与实施例1相当。

实施例10

在无水无氧的条件下将化合物TTD-CHO(0.396mmol)、丙二腈(2.458mmol)、乙酸铵(0.257mmol)和β-丙氨酸(0.020mmol)加入到两口圆底烧瓶中，氮气抽换气三次，随后向反应体系中加入15mL冰醋酸，将混合物加热至120℃，搅拌条件下反应24小时。反应结束后滤出固体，将固体用二氯甲烷溶解后萃取。萃取后的粗产物用硅胶柱纯化分离，洗脱剂为二氯甲烷/石油醚(1:3)。经检测，最终得到TTD-CN黑色产物，收率与实施例1相当。

实施例11

在无水无氧的条件下将化合物TTD-CHO(0.454mmol)、丙二腈(3.193mmol)、乙酸铵(0.351mmol)和β-丙氨酸(0mmol)加入到两口圆底烧瓶中，氮气抽换气三次，随后向反应体系中加入15mL冰醋酸，将混合物加热至120℃，搅拌条件下反应24小时。反应结束后滤出固体，将固体用二氯甲烷溶解后萃取。萃取后的粗产物用硅胶柱纯化分离，洗脱剂为二氯甲烷/石油醚(1:3)。经检测，最终得到TTD-CN黑色产物。与实施例1相比，TTD-CN的产率略降低。

对比例1

对(市售)按照相同的方法进行检测，虽然该化合物与本发明中的TTD-CN结构相近，但经检测发现此化合物不具备双自由基信号。

按照实施例3的方法，对以上实施例9-11中的产物测试其电子顺磁共振谱。对应实施例中所得的小分子表现出明显的碳自由基信号，具有双自由基特征。结果如表1所示。

表1

	有无双自由基信号
		实施例1	有
实施例9	有
		实施例10	有
实施例11	有
		对比例1	无

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

本说明书提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献全都通过引用并入本文。除非另有定义，本说明书所用的所有技术和科学术语都具有本领域技术人员常规理解的含义。在有冲突的情况下，以本说明书的定义为准。

当本说明书以词头“本领域技术人员公知”、“现有技术”或其类似用语来导出材料、物质、方法、步骤、装置或部件等时，该词头导出的对象涵盖本申请提出时本领域常规使用的那些，但也包括目前还不常用，却将变成本领域公认为适用于类似目的的那些。

在本申请文件中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。在下文中，各个技术方案之间原则上可以相互组合而得到新的技术方案，这也应被视为在本文中具体公开。

在本说明书的上下文中，除了明确说明的内容之外，未提到的任何事宜或事项均直接适用本领域已知的那些而无需进行任何改变。

而且，本文描述的任何实施方式均可以与本文描述的一种或多种其他实施方式自由结合，由此而形成的技术方案或技术思想均视为本发明原始公开或原始记载的一部分，而不应被视为是本文未曾披露或预期过的新内容，除非本领域技术人员认为该结合是明显不合理的。

Claims (10)

1.一种具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子，具有式(I)所示结构：

其中，式(I)中的n相同或者不同，各自为0，1，2或3；

式(I)中的X相同或者不同，各自为氮、氧、硫、硒或碲元素中的一种；式(I)中的R₁相同或者不同，各自为氢或烷基或烷氧基。

2.根据权利要求1所述的具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子，其特征在于：

R₁为氢或含1-24个碳原子的烷基或含1-24个碳原子的烷氧基；优选地，

R₁为氢或含1-12个碳原子的烷基或含1-12个碳原子的烷氧基。

3.一种权利要求1或2所述的具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子的制备方法，包括在无水无氧的条件下，以及在催化剂和溶剂的存在下，将式(Ⅱ)所示的化合物和丙二腈进行反应；

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

式(Ⅱ)所示的化合物和丙二腈的摩尔比为1：(2-11)，优选为1：(5-8)。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

相对于1mmol式(Ⅱ)所示的化合物，所述催化剂的总用量为0.3-1.2mmol，优选为0.5-0.9mmol；

所述催化剂选自乙酸铵和/或β-丙氨酸；优选地，

乙酸铵和β-丙氨酸的摩尔比为1：(0.01-0.12)；优选为1：(0.03-0.08)。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

所述溶剂选自冰醋酸和/或乙醇；

相对于1mmol式(Ⅱ)所示的化合物，所述溶剂的用量为30-50mL，更优选为35-40mL。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

所述反应的条件包括：温度为50-120℃；和/或，时间为2-24小时。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

在无水无氧的条件下，先将式(Ⅱ)所示的化合物和丙二腈与催化剂混合，再加入溶剂，并将混合物加热至50-120℃，于混合条件下反应2-24小时。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

该制备方法还包括在反应结束后，对所得的产物进行分离的步骤。

10.一种权利要求1或2所述的具有双自由基特征的噻吩并[3,4-c][1,2,5]噻二唑类有机小分子在药物或医疗器械中的应用；

优选地，所述药物能够通过光热/光动力协同治疗乏氧肿瘤。