CN105288626A - 一种具有肿瘤靶向性光敏剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有肿瘤靶向性光敏剂及其制备方法和应用，本发明的光敏剂主要是通过3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二氢吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮及其衍生物与透明质酸共价结合的方法合成。该新型光敏剂具有良好的单线态氧产生能力、优异的水溶性和靶向特定肿瘤细胞，被应用于肿瘤细胞以及活体光动力治疗上，能有效的杀死肿瘤细胞，作为光动力肿瘤治疗光敏剂具有良好的应用前景。而且，本发明的光敏剂化合物结构明确、制备工艺简单易行。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种具有肿瘤靶向性的新型光敏剂及其制备方法和靶向性光动力治疗肿瘤的应用。
背景技术
癌症，也被称为恶性肿瘤，是人生命健康的第一杀手。从2014年世界癌症报告数据显示，全球癌症病例将会快速增长，从2012年的1400万人逐年增加到2025年的1900万人。当前癌症治疗主要包括:手术切除、化疗和放疗。然而，这些疗法有明显的副作用，比如:手术需要准确定位肿瘤位置，而化疗和放疗同时损伤正常细胞，这是对病人的巨大伤害。因此，开发更有效的癌症治疗已经吸引了众多的研究兴趣。
光动力疗法(PDT)是一种新的肿瘤治疗技术，它主要利用光敏剂的光化学反应进行肿瘤疾病的治疗。一般过程如下:光敏剂进入肿瘤细胞，然后光照肿瘤组织激发光敏剂产生单线态氧，导致肿瘤细胞凋亡。光敏剂在PDT中起着非常关键的作用，但目前许多光敏剂在应用方面受制于水溶性差、对肿瘤细胞无靶向、结构不稳定等缺陷的影响。因此开发具有靶向性的新型光敏剂，实现其耐光性、水溶性、生物相容性、特别是对肿瘤细胞的选择性，显得尤其重要。
吡咯并吡咯二酮(DPP)是一种具有易修饰，高耐热，耐光，颜色明亮等优点的染料。特别是3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二氢吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮衍生物(DTDPP-R)具有优良的荧光性能和单线态氧产率高的特性。然而，实现DTDPP-R的水溶性和对特定肿瘤细胞的靶向性仍然是一个巨大的挑战。
发明内容
本发明主要目的是解决现有DPP衍生物光敏剂水溶性差、无特定靶向性、结构不稳定等缺陷，为肿瘤的靶向性光动力治疗提供一种新型的光敏剂。
本发明的另一目的在于提供上述具有肿瘤靶向性新型光敏剂的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供上述具有肿瘤靶向性新型光敏剂在光动力肿瘤靶向性治疗方面的应用性能。特别是本发明所合成的具有肿瘤靶向性的新型光敏剂对CD44受体过度表达的肿瘤细胞具有特异选择性，可作为光动力肿瘤靶向性治疗的新药物。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种具有肿瘤靶向性的新型光敏剂，表达式为DTDPP-R-HA，其结构式为：
其中，R为H或Br中的一种。
上述具有肿瘤靶向性的新型光敏剂的制备方法包含以下步骤：
(1)氮气保护下，3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二氢吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮衍生物，优选3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二氢吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮(称为DTDPP-H)和3，6-二(2-溴-噻吩基)-2，5-二氢吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮(称为DTDPP-Br)，1，6-二溴己烷和无水碳酸钾加入无水DMF中，加热搅拌，除去溶剂得到粗产品，粗产品分离得到中间体DTDPP-R。
(2)氮气保护下，四丁基氢氧化铵，透明质酸钠加入到去离子水中，加热搅拌，冷冻干燥得到中间体HA-；
(3)氮气保护下，将中间体DTDPP-R和中间体HA-，加入到四氢呋喃溶液中，加热搅拌至反应结束，除去溶剂后，溶入去离子水中超声后过滤，收集滤液冷冻干燥得到DTDPP-R-HA。
DTDPP-R-HA的合成路线如下所示：
上述合成方法中3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二氢吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮衍生物作为光敏剂主体，透明质酸作为特定肿瘤靶向分子。
DTDPP-R可以为3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二(1-溴-己烷)吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮(即DTDPP-A)或3，6-二(2-溴-噻吩基)-2，5-二(1-溴-己烷)吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮(即DTDPP-B)；其中，中间体DTDPP-A为原料DTDPP-H制备所得,中间体DTDPP-B为原料DTDPP-Br制备所得。
其中步骤(1)所述3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二氢吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮衍生物与1，6-二溴己烷摩尔比为1：(1-10)，优选摩尔比为1：(2-5)，最优选摩尔比为1：(2-3)；3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二氢吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮衍生物与无水碳酸钾摩尔比为1：(1.5-50)，优选摩尔比为1：(1.5-5)，最优选摩尔比为1：(1.5-3)。
步骤(2)所述透明质酸钠，原料四丁基氢氧化铵摩尔比为1：(1-12)，优选摩尔比为1：(9-11)。
步骤(3)所述步骤(1)中所得红色中间体DTDPP-R和步骤(2)所得中间体HA-摩尔比为1：(1-20)，优选摩尔比为1-2:1-2。
步骤(1)所述加热搅拌的温度为45-105℃，加热搅拌的时间为10-30h；优选加热搅拌的温度为50-70℃，加热搅拌的时间为15-20h。
其中步骤(2)所述加热搅拌的温度为20-50℃，加热搅拌的时间为10-40h；优选加热搅拌的温度为35-55℃，加热搅拌的时间为10-20h。
其中步骤(3)所述加热搅拌的温度为20-80℃，加热搅拌的时间为10-20h。优选加热搅拌的温度为45-65℃，加热搅拌的时间为10-15h。
因此，本发明通过3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二氢吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮衍生物(DTDPP-R)与透明质酸共价结合，得到一种具有肿瘤靶向性的新型光敏剂：DTDPP-R-HA，其被应用于肿瘤细胞以及活体光动力治疗肿瘤上表现出良好的单线态氧产生能力、优异的水溶性和肿瘤细胞靶向性，能够有效的杀死肿瘤细胞，实现对肿瘤的靶向性光动力治疗。因此，DTDPP-R-HA有望成为光动力治疗肿瘤的候选药物，具有巨大的应用前景。
与现有技术相比，本发明的主要优点包括以下几个方面：(1)本发明合成的化合物结构明确，表现出良好的单线态氧产生能力；(2)本发明合成光敏剂具有优异的水溶性和肿瘤靶向性，能够有效的杀死肿瘤细胞；(3)本发明合成光敏剂作为光动力治疗所使用的光敏剂具有制备工艺简单、安全环保等特点。
附图说明
图1是本发明实施例具有肿瘤靶向性的新型光敏剂DTDPP-H-HA的中间体DTDPP-A的核磁共振氢谱图，其特征峰完全与DTDPP-A结构相吻合。
图2是本发明实施例具有肿瘤靶向性的新型光敏剂DTDPP-H-HA、中间体DTDPP-A和透明质酸(HA)的红外光谱图，其中3448cm–1和1702cm-1处的吸收峰证明酯基的存在，从而证明共价结构的形成。
图3是本发明实施例具有肿瘤靶向性的新型光敏剂DTDPP-H-HA、中间体DTDPP-A和原料DTDPP-H的紫外可见光吸收光谱，说明DTDPP-H-HA的紫外吸收在565nm。
图4是本发明实施例具有肿瘤靶向性的新型光敏剂DTDPP-Br-HA和中间体DTDPP-B的紫外可见光吸收光谱，图中可以看出，DTDPP-Br-HA的吸收在578nm。
图5是本发明实施例具有肿瘤靶向性的新型光敏剂DTDPP-Br-HA的核磁共振氢谱图，其中7.4左右的特征峰为DTDPP-B的氢峰。
图6是本发明实施例具有肿瘤靶向性的新型光敏剂DTDPP-H-HA进入HCT-116细胞(培养24h)后分别在光照(7分钟)和不光照情况下，DTDPP-H-HA浓度对细胞成活率的影响规律。
图7是本发明实施例具有肿瘤靶向性的新型光敏剂DTDPP-H-HA对荷瘤裸鼠(HCT-116肿瘤)进行体内治疗过程中，肿瘤体积随时间变化规律，对比不治疗组和给药不光照组，给药光照组对肿瘤生长起到明显的抑制作用。
图8是本发明实施例具有肿瘤靶向性的新型光敏剂DTDPP-Br-HA进入HCT-116细胞(培养24h)后在光照(7分钟)情况下，DTDPP-Br-HA浓度对细胞成活率的影响规律。
图9是本发明实施例具有肿瘤靶向性的新型光敏剂DTDPP-Br-HA，对荷瘤裸鼠(HCT-116肿瘤)进行体内治疗过程中，肿瘤体积随时间变化规律，对比不治疗组和给药不光照组，给药光照组对肿瘤生长起到明显的抑制作用。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行进一步解释说明：
实施例1
3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二氢吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮共价结合透明质酸(DTDPP-H-HA)的合成：
氮气保护下，原料3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二氢吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮(1.24g，5.0mmol)，原料1，6-二溴己烷(6.02g，12mmol)和原料无水碳酸钾(0.52g，9.28mmol)加入25mlDMF中，55℃下搅拌20h后，水洗，用DCM萃取除去DMF得到粗产品，粗产品用硅胶色谱柱分离得到红色中间体DTDPP-A。
氮气保护下，原料四丁基氢氧化铵(2.98g，29mmol)，透明质酸钠(1.16g，2.8mmol)加入到去离子水中，40℃搅拌15h后，冷冻干燥得到中间体HA-。
氮气保护下，将上述步骤中所得中间体3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二(1-溴-己烷)吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮即DTDPP-A(0.81g，1.3mmol)和中间体HA-(0.539g，1.3mmol)，加入到20ml四氢呋喃溶液中，50℃搅拌10h，旋蒸除去溶剂后，溶入去离子水中超声过滤，收集滤液冷冻干燥得到DTDPP-H-HA(0.539g，产率40％)。
DTDPP-H-HA肿瘤细胞体外光动力治疗实验：
实验选取CD44受体过度表达的HCT-116肿瘤细胞进行光动力治疗，测试其暗毒性和光毒性。具体实验步骤如下：DTDPP-H-HA在PBS溶液溶解，然后用DMEM稀释成各种浓度。HCT-116细胞被接种在黑底96孔培养板，37℃下培养24h使其贴壁生长，用PBS溶液清洗，避光加药(100μL)培养24h后，一组细胞继续避光，另一组是由配备了510nm滤光片的氙灯辐照8分钟(40mW/cm2)，然后，继续培养48h，然后用MTT比色法进行测定。20μLMTT溶液(5mg/ml)添加到细胞中在相同的环境孵育4h后加入DMSO(150μL)，然后使用Bio-Tek微型板块酶标仪测定吸收峰为490nm的吸收值。图6是本发明所述具有肿瘤靶向性的新型光敏剂DTDPP-H-HA进入HCT-116细胞培养24h后在光照7分钟或者不光照的情况下，在不同DTDPP-H-HA浓度下的成活率。在约700μg/ml浓度下，光照后细胞成活率为50％。
DTDPP-H-HA肿瘤细胞体内光动力治疗实验：
选择将HCT-116细胞注入腋下的裸鼠作为肿瘤模型。当肿瘤体积约为70mm3。18只裸鼠随机分为3组。在第一和第二组的小鼠分别通过尾静脉注射DTDPP-H-HAPBS溶液(5mg/ml，0.1ml)。最后一组通过尾静脉注射生理盐水。24小时后，肿瘤在小鼠的第一组和第三组是由配备了510nm滤光片的氙灯辐照15分钟(40mW/cm2)，第二组不进行特别光照。上述过程重复了40天，肿瘤大小每2天测量一次。图7是实施例具有肿瘤靶向性的新型光敏剂DTDPP-H-HA，在长有HCT-116肿瘤的裸鼠体内进行治疗的肿瘤体积大小的变化，3组肿瘤起始体积约为70mm3，40天实验结束后，第一组肿瘤增长到约118mm3，第二组肿瘤增长到约614mm3，第三组肿瘤增长到约1400mm3，对比不治疗组和给药不光照组，给药光照组对肿瘤起到明显的抑制作用。
实施例2
3，6-二(2-溴-噻吩基)-2，5-二氢吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮共价结合透明质酸(DTDPP-Br-HA)的合成：
氮气保护下，原料3，6-二(2-溴-噻吩基)-2，5-二氢吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮(DTDPP-Br)(2.04g，5.0mmol)，原料1，6-二溴己烷(7.525g，15mmol)和原料无水碳酸钾(0.84g，15mmol)加入25ml无水DMF中，70℃下搅拌15h后，水洗，用DCM萃取除去DMF，得到粗产品，粗产品用硅胶色谱柱分离得到红色中间体DTDPP-B。
氮气保护下，原料四丁基氢氧化铵(2.98g，29mmol)，原料透明质酸钠(1.16g，2.8mmol)加入到去离子水中，45℃搅拌10h后，冷冻干燥得到中间体HA-。
氮气保护下，将上述步骤中所得红色中间体3，6-二(2-溴-噻吩基)-2，5-二(1-溴-己烷)吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮即DTDPP-B(1.018g，1.3mmol)和中间体HA-(0.539g，1.3mmol)，加入到20ml四氢呋喃溶液中，45℃搅拌15h，旋蒸除去溶剂后，溶入去离子水中超声过滤，收集滤液冷冻干燥得到DTDPP-Br-HA(0.642g，产率40％)。
DTDPP-Br-HA肿瘤细胞体外光动力治疗实验：
实验选取CD44受体过度表达的HCT-116肿瘤细胞进行光动力治疗，测试其暗毒性和光毒性。具体实验步骤如下：DTDPP-Br-HA在PBS溶液溶解，然后用DMEM稀释成各种浓度。HCT-116细胞被接种在黑底96孔培养板，37℃下培养24h使其贴壁生长，用PBS溶液清洗，避光加药(100μL)培养24h后，一组细胞继续避光，另一组是由配备了510nm滤光片的氙灯辐照8分钟(40mW/cm2)，然后，继续培养48h，然后用MTT比色法进行测定。20μLMTT溶液(5mg/ml)添加到细胞中在相同的环境孵育4h后加入DMSO(150μL)，然后使用Bio-Tek微型板块酶标仪测定吸收峰为490nm的吸收值。图8是实施例具有肿瘤靶向性的新型光敏剂DTDPP-Br-HA进入HCT-116细胞培养24h后在光照7分钟或者不光照的情况下，在不同DTDPP-Br-HA浓度下的成活率。在约400μg/ml浓度下，光照后细胞成活率为50％。
DTDPP-Br-HA肿瘤细胞体内光动力治疗实验：
选择将HCT-116细胞注入到腋下的裸鼠作为肿瘤模型。当肿瘤体积约为140mm3。18只裸鼠随机分为3组。在第一和第二组的小鼠分别通过尾静脉注射DTDPP-Br-HAPBS溶液(5mg/ml，0.1ml)。最后一组通过尾静脉注射生理盐水。24小时后，肿瘤在小鼠的第一组和第三组是由配备了510nm滤光片的氙灯辐照15分钟(40mW/cm2)，第二组不进行特别光照。上述过程重复了40天，肿瘤大小每2天测量一次。图9是实施例具有肿瘤靶向性的新型光敏剂DTDPP-H-HA，在长有HCT-116肿瘤的裸鼠体内进行治疗的肿瘤体积大小的变化，3组肿瘤起始体积约为140mm3，40天实验结束后，第一组肿瘤增长到约314mm3，第二组肿瘤增长到约873mm3，第三组肿瘤增长到约2204mm3，对比不治疗组和给药不光照组，给药光照组对肿瘤起到明显的抑制作用。
Claims (9)
1.一种具有肿瘤靶向性的新型光敏剂，其化学结构式如下：
其中，R为H或Br。
2.一种权利要求1所述具有肿瘤靶向性的新型光敏剂的制备方法，其特征在于该方法包含以下步骤：
(1)氮气保护下，3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二氢吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮衍生物，1，6-二溴己烷和无水碳酸钾加入无水DMF中，加热搅拌，除去溶剂后得到粗产品，粗产品分离后得到中间体DTDPP-R；
(2)氮气保护下，四丁基氢氧化铵，透明质酸钠加入去离子水中，加热搅拌，冷冻干燥得到中间体HA-；
(3)氮气保护下，将中间体DTDPP-R和中间体HA-加入到四氢呋喃溶液中，加热搅拌至反应结束，除去溶剂后，溶入去离子水中超声后过滤，收集滤液冷冻干燥得到DTDPP-R-HA。
3.根据权利要求2所述的具有肿瘤靶向性的新型光敏剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二氢吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮衍生物与1，6-二溴己烷的摩尔比为1：(1-10)；3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二氢吡咯并[3，4-c]吡咯-1，4-二酮衍生物与无水碳酸钾摩尔比为1：(1.5-50)。
4.根据权利要求2所述的具有肿瘤靶向性的新型光敏剂的制备方法，其特征在于步骤(2)所述透明质酸钠与四丁基氢氧化铵摩尔比为1：(1-12)。
5.根据权利要求2所述的具有肿瘤靶向性的新型光敏剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的中间体DTDPP-R与中间体HA-摩尔比为1：(1-20)。
6.根据权利要求2所述的制备方法其特征在于步骤(1)所述加热搅拌的温度为45-105℃，加热搅拌的时间为10-30h；优选加热搅拌的温度为50-70℃，加热搅拌的时间为15-20h。
7.根据权利要求2所述的制备方法其特征在于，步骤(2)所述加热搅拌的温度为20-50℃，加热搅拌的时间为10-40h；优选加热搅拌的温度为35-55℃，加热搅拌的时间为10-20h。
8.根据权利要求2所述的制备方法其特征在于步骤(3)所述加热搅拌的温度为20-80℃，加热搅拌的时间为10-20h；优选加热搅拌的温度为45-65℃，加热搅拌的时间为10-15h。
9.权利要求1所述的具有肿瘤靶向性的新型光敏剂在制备用于光动力靶向肿瘤治疗药物中的应用。
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