CN110856750B - pH敏感缀合物、胶束及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供具有高信号激活效应的pH敏感缀合物、胶束、及其制备方法和用途。所述的pH敏感缀合物包含亲水链段和疏水链段，亲水链段主要为聚乙二醇等强亲水性聚合物，疏水链段则为如下式1所示具有叔氨基结构的聚烷基氨基丙烯酸酯，其中，各个符号如说明书中所定义。疏水链段中包含标记分子。通过将标记分子修饰在聚合物的疏水链段，可实现光动力效应的pH响应激活，降低对正常组织的光毒性。此外，本发明还提供所述pH敏感缀合物、胶束在肿瘤、皮肤病和眼科疾病的光动力治疗以及与光热治疗、化学治疗和免疫治疗的联合应用中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及光动力医药领域，特别涉及具有高信号激活效应的pH敏感缀合物、胶束和胶束组合物，其制备及其医药用途。
背景技术
光动力治疗(Photodynamic therapy,PDT)，是指用特定波长的激发光照射局部组织，使在组织中分布的光敏剂分子激发，并产生单线态氧等活性氧，能够与细胞内脂质、氨基酸残基和核酸等生物活性大分子反应，直接诱导细胞的坏死和凋亡。作为一种新兴的治疗技术，光动力治疗具有侵袭性小，系统毒性低以及治愈能力快等优点，能够以微创的光敏化反应快速治愈疾病。由于大多数光敏剂疏水性强，靶组织递送效率低。为了提高靶组织内药物量，一般需要较高的给药剂量，导致正常组织中光敏剂含量过高。
传统的PDT递送系统存在许多缺点，特别是在正常组织皮肤滞留时间长、排泄慢，选择性差，从而易产生副反应，需要较长的避光时间。在杀死肿瘤细胞的同时也对肿瘤周围的正常组织以及眼睛，皮肤，血液等造成严重的光毒性。临床上，给药后，患者均需要进行一周以上的严格避光，顺应性差。因此，如何降低光动力治疗的光毒性，提高患者顺应性，是目前光动力治疗在临床应用上亟待解决的重要科学问题。
近年来，人们开始将智能响应型递送系统应用于光动力治疗，构建具有信号激活效应的肿瘤智能响应型光动力递送系统，能够在正常组织中即使在光照下也能关闭光动力效应，而只有到达肿瘤组织后，在肿瘤内特殊响应因子或者外源刺激因子的作用下激活光动力效应，达到降低光毒性的效果。然而，目前报道的光动力递送系统对体内的疾病信号响应性差、激活效应较低，需要开发更加敏感且具有高信号激活效应的新型智能响应型光动力递送系统。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明人进行了深入研究，从而实现了本发明。本发明提供具有酸响应型光动力治疗信号激活效应的pH敏感缀合物、包含该缀合物的胶束、胶束组合物，及其制备方法和医药用途。本发明的pH敏感缀合物中，标记分子(例如光敏剂和荧光淬灭剂)共价修饰在pH敏感两亲性聚合物疏水链段。由一种或多种该缀合物形成的胶束可以在正常组织关闭荧光和光动力效应以降低对正常组织光毒性，而在疾病组织特异性激活荧光和光动力效应，发挥疾病组织荧光成像和光动力治疗，实现高效疾病组织特异性响应的光动力治疗的同时显著降低甚至完全关闭对正常组织的光毒性。本发明的pH敏感缀合物胶束可以直接发挥肿瘤、皮肤病和眼科疾病等的荧光成像和光动力治疗作用，也可以与光热治疗、化学治疗和免疫治疗等组合使用而发挥药效。
为实现上述目的，本发明涉及以下方面。
[1].pH敏感缀合物，其包含亲水链段和疏水链段。
[2].根据[1]所述的pH敏感缀合物，其中，亲水链段选自聚环氧乙烷、聚乙二醇、聚丙烯酸甲酯磷脂酰胆碱和聚乙烯吡咯烷酮中的一种或更多种。
[3].根据[1]或[2]所述的pH敏感缀合物，其中，疏水链段具有下式1所示结构:
其中，R’、R”、R”’、X1、X2、X3分别选自-H、C1-C12烷基、C1-C12环烷基、C1-C12取代烷基、C1-C12取代环烷基，R””是由聚合反应产生的端基，选自卤素、硫醇和硫酯；
R1、R2、R3、R4四者可以相同也可以不同，分别选自C1-C16烷基，C1-C16环烷基、C1-C16芳香基、C1-C16杂芳香基以及取代的上述基团，或者，R1和R2、R3和R4也可以分别合在一起形成-(C1-C16)烷基-、-(C1-C16)烷基氧基-、或-(C1-C16)烷基氨基-；
a、b、c分别为1～10的整数；
x和y分别为整数，x和y之和为20～200的整数；
z为1～10的整数；x，y，z三部分可以按任意顺序排列；
L为连接臂；F为标记分子；各个L以及各个F各自可以不同。
[4].根据[3]所述的pH敏感缀合物，其中，X1、X2、X3分别为氢；R’、R”、R”’可以相同或不同，分别为C1-C6烷基；R1、R2、R3、R4可以相同也可以不同，分别为C1-C6烷基；R””为溴；a、b、c分别为1～5的整数；x和y分别为整数，x和y之和为60～100的整数；其他符号如[3]所述。
[5].根据[3]-[4]中任一项所述的pH敏感缀合物，其中，标记分子选自光敏剂、荧光淬灭剂、光热探针、化疗药物和免疫治疗药物。
[6].根据[3]-[4]中任一项所述的pH敏感缀合物，其中，标记分子是光敏剂。
[7].根据[3]-[4]中任一项所述的pH敏感缀合物，其中，标记分子是荧光淬灭剂或光热探针。
[8].根据[1]-[7]中任一项所述的pH敏感缀合物，其具有以下式2所示结构:
其中，Y1选自-H、C1-C12烷基、C1-C12环烷基、C1-C12取代烷基、C1-C12取代环烷基，或
或金属螯合基团；
n为1～500的整数；
Y2和Y3分别选自-H、C1-C12烷基、C1-C12环烷基、C1-C12取代烷基或C1-C12取代环烷基；
其它符号如[1]-[7]中任一项所定义。
[9].根据[8]中所述的pH敏感缀合物，其中，Y1为C1-C6烷基；n为50～150的整数；Y2和Y3可以相同或不同，分别为C1-C6烷基；其他符号如[8]中所定义。
[10].根据[1]-[9]中任一项所述的pH敏感缀合物，其具有下式3所示结构：
其中，R1’、R2’选自如下的结构：
x和y之和为80；
F和L分别如[1]-[9]中任一项所定义；
R””为溴。
[11].根据[1]-[10]中任一项所述的pH敏感缀合物，其中，标记分子选自卟啉类及其衍生物类光敏剂以及非卟啉类光敏剂。
[12].根据[1]-[11]中任一项所述的pH敏感缀合物，其中，L为酰胺键或者酯健。
[13].制备根据[1]-[12]中任一项所述的pH敏感缀合物的方法，该方法包括：将标记分子键合至pH敏感两亲性聚合物的疏水链段。
[14].pH敏感缀合物胶束，其包括一种或多种[1]-[13]中任一项所述的pH敏感缀合物。
[15].根据[14]所述的pH敏感缀合物胶束，其包括标记分子为光敏剂的所述缀合物和标记分子为荧光淬灭剂的所述缀合物。
[16].根据[15]所述的pH敏感缀合物胶束，其中，光敏剂为二氢卟吩Ce6，荧光淬灭剂为QSY21。
[17].根据[15]-[16]所述的pH敏感缀合物胶束，其中，标记分子为光敏剂的所述缀合物与标记分子为荧光淬灭剂的所述缀合物的摩尔比为100:1～1:100，优选10:1～1:10，更优选1:1。
[18].根据[14]所述的pH敏感缀合物胶束，其中，标记分子为光敏剂，并且该胶束中物理包埋有荧光淬灭剂。
[19].胶束组合物，其包含[14]-[18]中任一项所述的pH敏感缀合物胶束。
[20].根据[14]-[18]中任一项所述的pH敏感缀合物胶束在制备用于治疗选自下述疾病的药物中的用途：恶性肿瘤、炎性疾病、增生性关节炎症、眼科疾病和皮肤病。
[21].根据[14]-[18]中任一项所述的pH敏感缀合物胶束与其他药物组合用于制备治疗选自下述疾病的药物中的用途：恶性肿瘤、炎性疾病、增生性关节炎症、眼科疾病和皮肤病。
附图说明
图1为合成例2中合成的pH敏感聚合物PEG5k-P(EPA40-DPA40-AMA3)的核磁共振氢谱，各峰归属及比例证明了聚合物的成功合成。
图2为合成例2中合成的pH敏感聚合物PEG5k-P(EPA80-AMA3)的核磁共振氢谱，各峰归属及比例证明了聚合物的成功合成。
图3为合成例2中合成的pH敏感聚合物PEG5k-P(DBA80-AMA3)的核磁共振氢谱，各峰归属及比例证明了聚合物的成功合成。
图4为实施例1中PEG5k-P(EPA40-DPA40)-Ce6缀合物连接及纯化后的薄层色谱检测结果。反应前游离探针Ce6随着溶剂展开；反应1小时后，在原点处有部分探针吸附，说明已有光敏剂连接在聚合物上；反应24小时后，大部分光敏剂均在原点处，连接良好；经纯化后，溶剂展开前沿无游离探针信号，纯化良好。
图5为实施例2中制备的UPS-Ce6/Q胶束在pH 7.4和5.4条件下，通过动态光散射测得的粒径和表面ζ电位。在pH 7.4条件下，胶束粒径为28.2nm，表面电性为-3.8mW；在pH 5.4条件下，胶束解散为4.8nm，表面电性为+14.2mW。
图6为实施例2中制备的UPS-Ce6/Q胶束在pH 7.4和5.4条件下的透射电子显微镜结果。在pH 7.4条件下，胶束呈圆球形；在pH 5.4条件下，胶束解散为无规则单体形式。
图7为实施例2中不同光敏剂的胶束在不同pH的PBS缓冲液中的荧光光谱及信号激活效应。UPS-Ce6/Q胶束在pH高于6.5时，基本无荧光信号，处于关闭状态；而当pH低于6.5，荧光迅速激活，在0.2个pH单位内实现215倍的荧光信号激活效应。其他三种胶束则只能达到1～5倍的信号激活。
图8为实施例2中制备的UPS-Ce6/Q胶束在pH 7.4和5.4条件下，用660nm激光照射不同时间后产生单线态氧的电子顺磁自旋共振光谱。在pH7.4条件下激光照射10分钟内均未检测到单线态氧的生成；而在pH 5.4条件下，激光照射1分钟即能够明显检测到单线态氧的生成，且随着照射时间延长，产生的单线态氧增多。
图9为实施例2中制备的UPS-Ce6/Q胶束在不同pH条件下，用660nm激光照射不同时间后，采用对-亚硝基二甲基苯胺检测产生的单线态氧水平及信号激活。在pH高于6.5时，基本无单线态氧生成，处于关闭状态；而当pH低于6.5，单线态氧产生量显著升高，在0.2个pH单位内实现358倍的信号激活。同时，单线态氧的信号激活与荧光信号激活行为具有良好的一致性。
图10为MTT法检测实施例2中制备的UPS-Ce6/Q胶束在细胞水平的光动力药效。在660nm激光照射下，UPS-Ce6/Q胶束能够产生高效的细胞杀伤效果，6μg/mL可抑制90％以上A549细胞。通过质子泵抑制剂巴伐洛霉素A1抑制内吞细胞器酸化阻碍UPS的胞内活化，以及单线态氧清除剂维生素C均能有效降低胞内单线态氧生成，从而拮抗UPS-Ce6/Q胶束对肿瘤细胞的光动力杀伤作用。
图11为实施例2中不同光敏剂的胶束在自然光照射下产生的单线态氧水平。在自然光照下UPS-Ce6/Q在24h内基本不产生单线态氧，而其他三种胶束均有不同程度的单线态氧生成。因此，在自然光照下，pH敏感缀合物胶束UPS-Ce6/Q在24小时内能够维持稳定的关闭状态。
图12为实施例2中不同光敏剂的胶束在自然光照射和660nm激光照射下的溶血性。无论是在自然光照下还是在激光照射下，UPS-Ce6/Q胶束均未发生溶血现象，而其他三种胶束均产生不同程度的红细胞破裂。因此，在激光照射和自然光照射下，pH敏感缀合物胶束UPS-Ce6/Q均未显示明显光毒性，安全性良好。
图13为实施例2中制备的四种不同光敏剂的胶束在体内动物水平对荷A549肿瘤的裸鼠模型的光动力药效。单独制剂及单独光照对肿瘤基本无生长抑制效果，而四种胶束介导的光动力均能显著抑制肿瘤的生长。其中由于稳定性差导致物理包载胶束UPS@Ce6的抑瘤效果最差，而Always-On及UPS-Ce6均能达到80％以上的肿瘤生长抑制。加入QSY21后，pH敏感缀合物胶束UPS-Ce6/Q介导的肿瘤PDT消融效果显著增强，可达95％的肿瘤生长抑制。因此，UPS-Ce6/Q具有良好的体内光动力肿瘤消融效果。
图14为实施例8中制备的UPS-Ce6/ICG缀合物胶束在不同pH的PBS中Ce6和ICG的荧光光谱和信号激活。UPS-Ce6/ICG缀合物胶束能够使Ce6和ICG分别达到良好的信号激活。其中，通过ICG的异源荧光共振能量转移效应使Ce6达到104倍信号激活，而ICG通过同源荧光共振能量转移效应也可达到60倍信号激活。
图15为实施例8中制备的UPS-Ce6/ICG缀合物胶束在808nm激光器以0.5、1.0和2.0W/cm2功率密度照射下的光热升温效应。PBS对照组在光照10分钟内无升温现象，而UPS-Ce6/ICG在不同浓度下均产生显著升温现象，且随着激光功率增强稳定越高，2W/cm2光照最高可达16℃升温。因此，UPS-Ce6/ICG缀合物胶束具有良好的光热效应。
图16为采用流式细胞术检测实施例10中制备的EGFR单克隆抗体西妥昔Fab片段修饰的主动靶向缀合物胶束Fab’-UPS-Ce6/Q对A549细胞的主动靶向细胞摄取。Fab修饰后，细胞摄取量显著增强，为未修饰Fab的UPS-Ce6/Q胶束摄取量的36倍，靶向性良好。
图17为实施例10中制备的主动靶向缀合物胶束Fab’-UPS-Ce6/Q对A549细胞的主动靶向光动力细胞杀伤效应。未修饰Fab’的被动靶向缀合物胶束UPS-Ce6/Q在三个浓度下对A549细胞基本不产生光动力细胞杀伤作用；而表面修饰西妥昔单抗的Fab’靶向配体的Fab’-UPS-Ce6/Q缀合物胶束的光动力细胞杀伤效果显著增强，在1.5μg/mL时即可达到60％以上细胞抑制率，而在6μg/mL时仅8.7％细胞存活，光动力效果良好。因此，Fab’-UPS-Ce6/Q缀合物胶束具有主动靶向光动力细胞杀伤效应。
图18为实施例12中光动力治疗-化疗联合的pH敏感缀合物胶束UPS-Ce6/Q/DOX对胰腺癌BxPC3细胞的化疗细胞杀伤效果。在无激光照射下，缀合物胶束UPS-Ce6/Q/DOX显示良好的细胞毒性，半数致死量为0.085μg/mL。
具体实施方式
本发明提供pH敏感缀合物，其包含亲水链段和疏水链段。
其中，所述的亲水链段选自聚环氧乙烷(PEO)或聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酸甲酯磷脂酰胆碱(PMPC)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种或几种，优选聚环氧乙烷(PEO)或聚乙二醇(PEG)。
所述的疏水链段具有以下式1所示结构:
其中，R’、R”、R”’、X1、X2、X3分别选自-H、C1-C12烷基、C1-C12环烷基、C1-C12取代烷基、C1-C12取代环烷基。R’、R”、R”’优选C1-C6烷基，更优选甲基，X1、X2、X3优选-H。
R””是由聚合反应产生的端基，选自卤素、硫醇和硫酯(-S-CO-R)，优选卤素，更优选Br；
R1、R2、R3、R4分别选自C1-C16烷基，C1-C16环烷基、C1-C16芳香基、C1-C16杂芳香基以及取代的上述基团，或者，R1和R2、R3和R4也可以分别合在一起形成-(C1-C16)烷基-、-(C1-C16)烷基氧基-、或-(C1-C16)烷基氨基-，优选-(C2-C16)烷基-、-(C2-C16)烷基氧基-、或-(C2-C16)烷基氨基-。R1、R2、R3、R4优选C1-C6烷基，更优选2～4个碳。四者可以相同也可以不同，可以是乙基、丙基和丁基等直链烷基，也可以是异丙基等支链烷基。R1和R2、R3和R4也可以分别合在一起形成亚戊烷、亚己烷和亚庚烷等亚烷基，例如，C1-16亚烷基，C2-16亚烷基，优选C1-8亚烷基，C2-8亚烷基。
a、b、c分别为1～10的整数，优选1～5，例如优选1～4的整数，更优选为2；
x和y之和为20～200的整数，优选60～150，例如，40～100，更优选为80；
z为1～10的整数，优选为1～5，更优选为3；
x，y，z三部分可以按任意顺序排列；
L为连接臂，没有特别限定。L可选自化学稳定的酰胺键、酯键，氧化还原敏感的二硫键，pH敏感的乙缩醛键、原酸酯键、腙键、亚胺键，以及各种酶敏感基团。其中，酶敏感基团选自蛋白酶敏感底物、肽酶敏感底物和脂酶敏感底物，优选基质金属蛋白酶敏感底物、组织组织蛋白酶底物、成纤维细胞活化蛋白α敏感底物、氨肽酶敏感底物、二肽酶敏感底物或磷脂酶A2敏感底物，更优选GPLG多肽、GFLG多肽、ERGETGPAC多肽及包含上述序列的线状多肽。L优选为酰胺键或酯健。
F为标记分子，可选自光敏剂、荧光淬灭剂、光热探针、化疗药物和免疫治疗药物等，各个F可以相同也可以不同。
其中，所述的光敏剂选自卟啉类及其衍生物类光敏剂以及非卟啉类光敏剂。其中，卟啉类及其衍生物类光敏剂选自结构中含有羧基、氨基、巯基、羟基与氰基等可进行化学连接的功能化官能团的卟啉、卟吩、菌绿素和酞菁等光敏剂，优选二氢卟吩e6、焦脱镁叶绿酸a、血卟啉单甲醚、原卟啉IX、维替泊芬、光克洛、单天冬胺酰基卟吩等光敏剂，更优选二氢卟吩e6、焦脱镁叶绿酸a。非卟啉类光敏剂选自结构中含有羧基、氨基、巯基、羟基与氰基等可进行化学连接的功能化官能团的阳离子型光敏剂、醌类光敏剂、姜黄素类光敏剂和BODIPY类光敏剂。
所述的荧光淬灭剂为能作为荧光受体分子与光敏剂发生荧光共振能力转移(FRET)效应，且结构中含有羧基、氨基、巯基、羟基与氰基等可进行化学连接的功能化官能团的金属材料和有机小分子。
其中，有机小分子选自有机光淬灭剂和高波长荧光分子。有机光淬灭剂优选自DABCYL、DABSYL、QSY、QXL、ATTO、BHQ，更优选QSY21和BHQ3。高波长荧光分子优选600～700nm波段荧光分子，更优选Cy7.5、ICG。淬灭剂也可选自结构中含有羧基、氨基、巯基、羟基与氰基等可进行化学连接的功能化官能团的单线态氧清除剂，优选类胡萝卜素。
所述的光热探针为在近红外窗口(650～950nm)具有较强吸收和较高光热转换效率的近红外探针，可选自ICG、Cy7.5、IR780、IR783、MHI-148、IR808、IR825或PccBu4，优选ICG和Cy7.5。
所述的化疗药物在某些实施例中为疏水性的，可选择阿霉素、表阿霉素、顺铂、柔红霉素、紫杉醇、多西他赛、喜树碱、羟基喜树碱和一甲基澳瑞他汀E中的一种或多种。
所述的免疫治疗药物可选择小分子免疫检查点抑制剂，如吲哚胺-(2,3)-双加氧酶抑制剂IDOi、PD-L1表达抑制剂JQ1等，或toll样受体激动剂，如R848、CpG等。
在一些实施方式中，连接臂L为酰胺键，标记分子为光敏剂或淬灭剂，例如，光敏剂为二氢卟吩Ce6，焦脱镁叶绿酸a，维替泊芬，或光克洛；淬灭剂为QSY21或BHQ-3。
在一些实施方式中，本发明提供的pH敏感缀合物具有以下式2所示结构。
其中，Y1选自-H、C1-C12烷基、C1-C12环烷基、C1-C12取代烷基、C1-C12取代环烷基，或
或金属螯合基团；
n为1～500的整数，优选50～250，更优选113；
Y2和Y3分别选自-H、C1-C12烷基、C1-C12环烷基、C1-C12取代烷基或C1-C12取代环烷基，
其它符号如式1所定义。
优选地，Y1为C1-C6烷基；n为50～150的整数；Y2和Y3可以相同或不同，分别为C1-C6烷基；其他符号如式1所定义。
在一些实施方式中，本发明提供的pH敏感缀合物具有以下式3所示结构：
其中R1’、R2’选自如下结构：
其它符号如式1所定义。
本发明的另一方面是提供上述pH敏感缀合物的制备方法，该方法包括将标记分子键合至pH敏感两亲性聚合物的疏水链段。
例如，本发明的pH敏感缀合物可通过如下方法进行合成。可以采用选择原子转移自由基聚合反应和可逆加成-断裂链转移聚合反应，优选原子转移自由基聚合反应，具体包括如下步骤：
步骤一：聚乙二醇大分子引发剂的合成
将一端为Y1且另一端为羟基的聚乙二醇溶于二氯甲烷，随后向反应液中加入1-5倍摩尔当量的三乙胺和4-二甲氨基吡啶。溶解后，在低温下逐滴加入1-5倍摩尔当量的溴化试剂
反应24-72小时后，用10％NaHCO3溶液洗涤数次，随后用饱和氯化钠溶液洗涤数次。有机相用冰乙醚沉淀，纯化数次，干燥即得聚乙二醇大分子引发剂。
步骤二：pH敏感两亲性聚合物的合成
将步骤一中得到的溴端基的聚乙二醇大分子引发剂与各丙烯酸酯单体以特定摩尔比的比例混合，然后加入体积比＝10:1-1:10的N,N-二甲基甲酰胺-异丙醇混合溶剂，加入聚乙二醇大分子引发剂1-1.5摩尔当量的催化剂配体五甲基二乙烯三胺。冻融循环3次，随后加入1-1.5个聚乙二醇大分子引发剂摩尔当量的催化剂溴化亚铜，在无水无氧条件下，30-90℃之间任意一个恒定温度反应1-24小时。随后，反应产物用四氢呋喃稀释，并用中性氧化铝柱进行纯化，蒸馏水透析、冷冻干燥得到pH敏感两亲性聚合物。
其中，X1、X2、X3、Y1、Y2、Y3、R1、R2、R3、R4、R’、R”、R”’、R””、n、x、y、z、a、b、c和L如上所述。
步骤三：标记分子的连接
将含羧基的标记分子、二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以特定摩尔比的比例混合，加入适量N,N-二甲基甲酰胺溶解，室温反应1-24小时；加入特定摩尔比的步骤二得到的pH敏感两亲性聚合物，于任意一个恒定温度反应1-24小时；采用凝胶渗透色谱除去游离标记分子，纯化得pH敏感缀合物。
本发明的另一方面提供包含一种或多种本发明的pH敏感缀合物的胶束。
本发明的胶束可以包含标记分子为光敏剂的所述缀合物，以及任选地选自荧光淬灭剂、光热探针、化疗药物和免疫治疗药物中的一种或多种。
其中，当存在时，荧光淬灭剂、光热探针、化疗药物和免疫治疗药物可以以物理包埋在胶束内核的形式存在，也可以以缀合物的形式存在，当以缀合物的形式时，是荧光淬灭剂、光热探针、化疗药物和免疫治疗药物作为标记分子连接的本发明的缀合物。标记分子为光敏剂的所述缀合物与其他缀合物的比例没有特别限制，例如可以为，标记分子为光敏剂的所述缀合物与其他缀合物的摩尔比可以为，100:1～1:100，优选10:1～1:10，更优选1:1。
优选地，本发明的胶束包括标记分子为光敏剂的所述缀合物和标记分子为荧光淬灭剂或光热探针的缀合物，其中，光敏剂可以为之前所述的那些，例如为二氢卟吩Ce6；荧光淬灭剂可以为之前所述的那些，例如为QSY21。
更优选地，本发明的胶束包括标记分子为光敏剂的所述缀合物和标记分子为荧光淬灭剂的缀合物。其中，例如，光敏剂为二氢卟吩Ce6，淬灭剂为QSY21；光敏剂为焦脱镁叶绿酸a，淬灭剂为QSY21；光敏剂为维替泊芬，淬灭剂为QSY21；光敏剂为二氢卟吩Ce6，淬灭剂为BHQ-3；光敏剂为光克洛，淬灭剂为BHQ-3。
本发明的pH敏感缀合物胶束中，标记分子为光敏剂的所述缀合物与标记分子为荧光淬灭剂的所述缀合物的摩尔比可以为，100:1～1:100，优选10:1～1:10，更优选1:1。
在本发明的胶束中，荧光淬灭剂可以是作为标记分子而化学连接于pH敏感缀合物，也可以是直接物理包载于胶束疏水内核。在某些实施方式中，所述pH敏感缀合物胶束粒径约10～200nm。在某些实施方式中，所述pH敏感缀合物胶束粒径约20～100nm。在某些实施方式中，所述pH敏感缀合物胶束粒径约30～50nm。
在某些实施方式中，所述pH敏感缀合物胶束的pH响应锐度小于1个pH单位。在某些实施方式中，所述pH敏感缀合物胶束的pH响应锐度小于0.5个pH单位。在某些实施方式中，所述pH敏感缀合物胶束的pH响应锐度小于0.25个pH单位。在某些实施方式中，所述pH敏感缀合物胶束的pH转变点约4～8。在某些实施方式中，所述pH敏感缀合物胶束的pH转变点约5～6。在某些实施方式中，所述pH敏感缀合物胶束的pH转变点约6～7。在某些实施方式中，所述pH敏感缀合物胶束的pH转变点约7～8。在某些实施方式中，所述pH敏感缀合物胶束的pH转变点约6.3～6.9。在某些实施方式中，所述pH敏感缀合物胶束的pH转变点约5.2～6.2。
在某些实施方式中，所述pH敏感缀合物胶束还可进一步在胶束表面修饰靶向模块。在某些实施方式中，所述靶向模块可与VEGFR2特异性结合。在某些实施方式中，所述靶向模块可选择VEGFR2特异性单克隆抗体或Fab片段，优选西妥昔单抗Fab片段。在某些实施方式中，所述靶向模块可与整合素αvβ3受体特异性结合。在某些实施方式中，所述靶向模块可选择cRGDfK多肽。
作为本发明的pH敏感缀合物胶束的制备方法，可以采用本领域常用制剂制备方法，如薄膜超声法、逆向蒸发法、乙醇注入法、去溶剂法等，优选去溶剂法。
例如，本发明的pH敏感缀合物胶束的制备方法，包括以下步骤：1)将分别连接有各种标记分子的pH敏感缀合物加入有机溶剂完全溶解；2)在探头超声条件下，将1)步骤所得溶液快速加入超纯水中，进行超声；3)以超纯水超滤或透析，以除去有机溶剂；4)将胶束浓缩，弃去沉淀不溶部分，即得到胶束。
特别地，本发明提供了包含标记分子为光敏剂的缀合物和标记分子为淬灭剂的缀合物的胶束及其制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：1)分别称取标记分子为光敏剂的pH敏感缀合物和标记分子为淬灭剂的pH敏感缀合物，加入甲醇完全溶解；2)在探头超声条件下，将1)步骤所得溶液快速加入超纯水中，进行超声；3)转移至超滤管或透析袋中，以超纯水超滤或透析，以除去甲醇；4)将胶束浓缩液定量至一定浓度，离心弃去沉淀不溶部分，即得到胶束。
优选，在上述本发明的胶束中，用于形成pH敏感缀合物的pH敏感两亲性聚合物为PEG5k-P(EPA40-DPA40-AMA3)，结构如下：
所述的光敏剂为二氢卟吩Ce6，荧光淬灭剂为QSY21。
本发明的步骤1)所述的有机溶剂优选：甲醇、四氢呋喃、乙腈、乙醇、丙酮及其混合液，更优选甲醇。光敏剂修饰的pH敏感缀合物和淬灭剂修饰的pH敏感缀合物的摩尔比例可为100:0～1:100，优选10:1～1:10，更优选1:1。
优选的，本发明的上述pH敏感两亲性光敏剂/淬灭剂缀合物胶束的制备方法，包括以下步骤：
PEG5k-P(EPA40-DPA40)-Ce6/PEG5k-P(EPA40-DPA40)-QSY2(UPS-Ce6/Q)胶束的制备。
PEG5k-P(EPA40-DPA40)-Ce6与PEG5k-P(EPA40-DPA40)-QSY21的摩尔比为1:1。
分别称取5mg PEG5k-P(EPA40-DPA40)-Ce6和PEG5k-P(EPA40-DPA40)-QSY21聚合物，溶于1mL无水甲醇中；2)在探头超声条件下，将其快速加入10mL超纯水中，以45W功率连续超声30s；3)转移至100kD超滤管中，以超纯水超滤4次(4500rpm，10min)，以除去甲醇；4)将胶束浓缩液用天平定量至5mg/mL，再次以10,000rpm离心10min，弃去沉淀不溶部分，即得到胶束。
本发明提供pH敏感缀合物胶束可应用于各种疾病，包括增生性疾病和非增生性疾病。其中，增生性疾病选自恶性肿瘤、炎性疾病和增生性关节炎症，优选恶性肿瘤，更优选皮肤、眼睛等浅表肿瘤和腔道肿瘤；非增生性肿瘤优选皮肤病和眼科疾病，皮肤病选自尖锐湿疣、血管畸形、寻常痤疮、病毒性皮肤病、皮脂腺增生、鲜红斑痣、光子嫩肤等，眼科疾病选自黄斑部脉络膜新生血管性疾病、息肉样脉络膜血管病变、中心性浆液性脉络膜视网膜病变等。也可用于肿瘤光动力和光热联合治疗、肿瘤光动力和化学联合治疗以及肿瘤光动力和免疫联合治疗的应用。
所述的光热治疗，即将部分荧光淬灭剂替换为在近红外窗口(650～950nm)具有较强吸收和较高光热转换效率的近红外探针，可选自ICG、Cy7.5、IR780、IR783、MHI-148、IR808、IR825或PccBu4，优选ICG和Cy7.5。光敏剂修饰的pH敏感两亲性聚合物与光热探针修饰的pH敏感两亲性聚合物的摩尔比例可为100:1～1:100，优选10:1～1:10，更优选1:1。
所述的化学治疗，可将化疗药物直接物理包载于胶束内核，也可将部分荧光淬灭剂替换为化疗药物。在某些实施方式中，所述的化疗药物为疏水性的。在某些实施方式中，所述的化疗药物可选择阿霉素、表阿霉素、顺铂、柔红霉素、紫杉醇、多西他赛、喜树碱、羟基喜树碱或一甲基澳瑞他汀E。
所述的免疫治疗，可将免疫治疗药物直接物理包载于胶束内核，也可将部分荧光淬灭剂替换为免疫治疗药物。所述的免疫治疗药物，可选择小分子免疫检查点抑制剂，如吲哚胺-(2,3)-双加氧酶抑制剂IDOi、PD-L1表达抑制剂JQ1等，或toll样受体激动剂，如R848、CpG等。
本发明还提供pH敏感缀合物胶束在肿瘤治疗领域的应用。
本发明提供pH敏感缀合物胶束用于肿瘤荧光成像和光动力治疗的方法，包括a)给予一定剂量上述pH敏感光敏剂/淬灭剂缀合物胶束；b)不同时间检测胶束解散后的荧光分布；c)依据荧光信号诊断肿瘤位置，并于特定时间采用特定波长和功率光源进行照射肿瘤局部。在某些实施方式中，上述方法用于肿瘤手术切除后的诊断和监测。在某些实施方式中，上述方法用于肿瘤手术切除后残余肿瘤光动力清扫。在某些实施方式中，上述肿瘤为实体瘤。
本发明提供pH敏感缀合物胶束用于肿瘤光动力和光热联合治疗的方法，包括a)给予一定剂量上述pH敏感光敏剂/光热探针缀合物胶束；b)不同时间检测胶束解散后的荧光分布；c)依据荧光信号诊断肿瘤位置，并于特定时间采用光热探针的激发波长以特定功率照射肿瘤局部，进行光热治疗；d)采用光敏剂的激发波长以特定功率照射肿瘤局部，进行光动力治疗。在某些实施方式中，上述光热治疗用于肿瘤的热消融。在某些实施方式中，上述光热治疗用于增强肿瘤氧分压。在某些实施方式中，上述光热治疗用于促进胶束的肿瘤蓄积和分布。
本发明提供pH敏感缀合物胶束用于肿瘤光动力和化学联合治疗的方法，包括a)给予一定剂量上述pH敏感光敏剂/化疗药物缀合物胶束；b)不同时间检测胶束解散后的荧光分布；c)依据荧光信号诊断肿瘤位置，并于特定时间采用特定波长和功率光源进行照射肿瘤局部，进行光动力治疗。在某些实施方式中，上述方法用于多药耐药肿瘤的治疗。
本发明提供pH敏感缀合物胶束用于肿瘤光动力和免疫疗法联合治疗的方法，包括a)给予一定剂量上述pH敏感光敏剂/免疫治疗药物缀合物胶束；b)不同时间检测胶束解散后的荧光分布；c)依据荧光信号诊断肿瘤位置，并于特定时间采用特定波长和功率光源进行照射肿瘤局部，进行光动力治疗。在某些实施方式中，上述方法用于高转移性和易复发性肿瘤的治疗。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、本发明具有pH响应的信号激活效应，能够实现上百倍的荧光和光动力开光效应。
2、本发明能够在血液循环和正常组织中保持关闭状态，不产生荧光信号和光动力效应，显著降低甚至完全消除对正常组织的光毒性；在疾病组织中迅速响应酸性微环境及细胞内酸性环境而解散，激活荧光信号和光动力效应，产生良好的疾病组织荧光成像和高效的光动力消融效果。
3、本发明可通过简单的修饰，将多种治疗策略相结合，达到协同的抗肿瘤效果。例如，光动力治疗和光热治疗联合、光动力治疗和化疗联合、光动力治疗和免疫治疗联合。
实施例
本发明通过以下具体的合成例和实施例来对本发明进行说明和解释，但本发明不受这些具体实例的限定。
在本文中，除非另有说明，各个符号分别代表以下含义：
PEG5k-OH：/>
PEG5k-Br：
EPA：单体结构为
DPA：单体结构为
iDPA：单体结构为
DBA:单体结构为
AMA：单体结构为用于连接标记分子
QSY21-NHS：琥珀酰亚胺功能化的荧光淬灭剂
BHQ3-NHS：琥珀酰亚胺功能化的荧光淬灭剂
ICG-NHS：琥珀酰亚胺功能化的光热探针
MTT：细胞活性检测试剂3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮
合成例1：聚乙二醇大分子引发剂的合成
精密称取PEG5k-OH(20g，4mmol)于圆底烧瓶并用250mL二氯甲烷溶解，随后向反应液中加入5倍当量的三乙胺和4-二甲氨基吡啶。搅拌、超声溶解。低温下加入5倍当量的2-溴异丁酰溴，室温下反应24小时。反应完毕后，用旋转蒸发仪将反应液浓缩至约50mL。将反应液转移至分液漏斗，用10％碳酸氢钠溶液洗涤3次，随后用饱和氯化钠溶液洗涤3次。将有机相滴加到冰乙醚中，析出沉淀。抽滤，收集固体，真空干燥。重复乙醚沉淀操作3次，即得到16.3g大分子引发剂PEG5k-Br，产率81.5％
合成例2：各种pH敏感两亲性聚合物的合成
1.pH敏感两亲性聚合物PEG5k-P(EPA40-DPA40-AMA3)的合成
称取合成例1中的PEG5k-Br(250mg，0.05mmol)于反应瓶中，加入40倍当量的EPA单体、40倍当量的DPA单体和3倍当量的AMA单体，加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)、异丙醇(1mL)使其全部溶解。加入催化量的五甲基二乙烯三胺。冻融循环3次，随后加入1个PEG5k-Br当量的溴化亚铜，反应液变为蓝绿色。40℃反应约12小时后，加入约10mL四氢呋喃终止反应，并用中性Al2O3柱进行纯化。将反应液转移至10kDa的透析袋中，用超纯水透析。24小时后，把透析袋中的液体转移到样品瓶中，冷冻干燥，即可得到pH敏感两亲性聚合物PEG5k-P(EPA40-DPA40-AMA3)，产率为93.7％。采用核磁共振氢谱鉴定产物，各峰归属如图1所示。
2.pH敏感两亲性聚合物PEG5k-P(EPA80-AMA3)的合成
称取合成例1中的PEG5k-Br(250mg，0.05mmol)于反应瓶中，加入80倍当量的EPA单体和3倍当量的AMA单体，加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)、异丙醇(1mL)使其全部溶解。加入催化量的五甲基二乙烯三胺。冻融循环3次，随后加入1个PEG-Br当量的溴化亚铜，反应液变为蓝绿色。40℃反应约12小时后，加入约10mL四氢呋喃终止反应，并用中性Al2O3柱进行纯化。将反应液转移至10kDa的透析袋中，用超纯水透析。24小时后，把透析袋中的液体转移到样品瓶中，冷冻干燥，即可得到pH敏感两亲性聚合物PEG5k-P(EPA80-AMA3)，产率为89.4％。采用核磁共振氢谱鉴定产物，各峰归属如图2所示。
3.pH敏感两亲性聚合物PEG5k-P(DBA80-AMA3)的合成
称取合成例1中的PEG5k-Br(250mg，0.05mmol)于反应瓶中，加入80倍当量的DBA单体和3倍当量的AMA单体，加入N,N-二甲基甲酰胺(1mL)、异丙醇(1mL)使其全部溶解。加入催化量的五甲基二乙烯三胺。冻融循环3次，随后加入1个PEG-Br当量的溴化亚铜，反应液变为蓝绿色。40℃反应约12小时后，加入约10mL四氢呋喃终止反应，并用中性Al2O3柱进行纯化。将反应液转移至10kDa的透析袋中，用超纯水透析。24小时后，把透析袋中的液体转移到样品瓶中，冷冻干燥，即可得到pH敏感两亲性聚合物PEG5k-P(DPA80-AMA3)，产率为89.4％。采用核磁共振氢谱鉴定产物，各峰归属如图3所示。
实施例1：pH敏感缀合物的制备
本实施例中将标记分子与pH敏感两亲性聚合物连接，制备pH敏感缀合物。
所述pH敏感两亲性聚合物具有以下结构：
亲水链段是PEG5k，疏水链段侧链R1’和R2’基团结构为下式A中所示。
标记分子分别为光敏剂、荧光淬灭剂、光热探针。其中，光敏剂选自卟啉类二氢卟酚e6(Ce6)、焦脱镁叶绿酸a(PPa)和光克洛(HPPH)(下式B中所示)，荧光淬灭剂选自QSY21和BHQ-3(下式C)，光热探针为吲哚菁绿(ICG)。
所述的连接臂L为酰胺键，与标记分子F连接后，所述的pH敏感缀合物具有以下结构：
光敏剂与聚合物连接制备pH敏感缀合物：精密称取适量光敏剂、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺(1:1.1:1.2，摩尔比)，以0.2mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解于棕色反应瓶中，于室温下反应12小时；随后，称取等同1/3.6摩尔当量光敏剂的合成例2中合成的聚合物PEG5k-P(EPA40-DPA40-AMA3)，0.2mL无水N,N-二甲基甲酰胺完全溶解后，加入上述反应液中，室温下继续反应24小时；采用凝胶渗透色谱纯化反应液，经冷冻干燥后得到的最终产物即为PEG5k-P(EPA40-DPA40)-Ce6，产率89.7％，Ce6的载药量为6.3％。反应过程及纯化后，产物的薄层色谱检测结果如图4所示：反应前游离光敏剂随着溶剂展开；反应1小时后，在原点处有部分光敏剂吸附，说明已有光敏剂连接在聚合物上；反应24小时后，大部分光敏剂均在原点处，连接良好；经纯化后，溶剂展开前沿无游离光敏剂信号，纯化良好。对各种聚合物(式A)和各种光敏剂(式B)形成的各种缀合物的光敏剂的连接率、相对荧光量子产率和相对单线态氧产率的表征结果如表1、表2和表3所示。各种聚合物-光敏剂缀合物的各项指标良好。
表1不同聚合物-Ce6缀合物的连接表征
表2不同聚合物-PPa缀合物的连接表征
表3不同聚合物-HPPH缀合物的连接表征
荧光淬灭剂与聚合物连接制备pH敏感缀合物：精密称取适量QSY21-NHS或BHQ3-NHS和合成例2中合成的聚合物PEG5k-P(EPA40-DPA40-AMA3)(3.6:1摩尔比)，以0.2mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解于棕色反应瓶中，于室温下反应24小时；采用凝胶渗透色谱纯化反应液，经冷冻干燥后得到的最终产物即为PEG5k-P(EPA40-DPA40)-QSY21和PEG5k-P(EPA40-DPA40)-BHQ3。QSY21的产率92.5％，载药量为7.8％；BHQ3的产率89.7％，载药量为6.7％
光热探针与聚合物连接制备pH敏感缀合物：精密称取适量ICG-NHS和合成例2中合成的聚合物PEG5k-P(EPA40-DPA40-AMA3)(3.6:1摩尔比)，以0.2mL甲醇溶解于棕色反应瓶中，于室温下反应24小时；采用凝胶渗透色谱纯化反应液，经冷冻干燥后得到的最终产物即为PEG5k-P(EPA40-DPA40)-ICG，产率93.4％，ICG的载药量为7.2％。
实施例2：pH敏感缀合物胶束的制备
本实施例采用去溶剂法制备了各种pH敏感缀合物的胶束。
PEG5k-P(EPA40-DPA40)-Ce6胶束(以下也称为UPS-Ce6胶束)：精密称取5mg实施例1制备的PEG5k-P(EPA40-DPA40)-Ce6缀合物，溶于1mL无水甲醇中；在探头超声条件下，将其快速加入10mL超纯水中，以45W功率连续超声30秒；转移至100kD超滤管中，以超纯水超滤4次，以除去甲醇；将纳米粒子浓缩液用天平定量至5mg/mL，再次以10,000rpm离心10分钟，弃去沉淀不溶部分，即得UPS-Ce6胶束。
PEG5k-P(EPA40-DPA40)-Ce6/Q胶束(以下也称为UPS-Ce6/Q胶束)：精密称取实施例1中制备的PEG5k-P(EPA40-DPA40)-Ce6和PEG5k-P(EPA40-DPA40)-QSY21缀合物各2.5mg，共同溶于1mL无水甲醇中；在探头超声条件下，将其快速加入10mL超纯水中，以45W功率连续超声30秒；转移至100kD超滤管中，以超纯水超滤4次，以除去甲醇；将纳米粒子浓缩液用天平定量至5mg/mL，再次以10,000rpm离心10分钟，弃去沉淀不溶部分，即得UPS-Ce6/Q胶束。
PEG5k-P(EPA40-DPA40)-Ce6常亮式胶束(以下也称为Always-On胶束)：精密称取PEG5k-P(EPA40-DPA40)-Ce6缀合物和PEG5k-P(EPA40-DPA40)聚合物各2.5mg，分别溶于500μL无水甲醇后，以1:2比例混合；在探头超声条件下，将其快速加入10mL超纯水中，以45W功率连续超声30秒；转移至100kD超滤管中，以超纯水超滤4次，以除去甲醇；将纳米粒子浓缩液用天平定量至5mg/mL，再次以10,000rpm离心10分钟，弃去沉淀不溶部分，即得Always-On胶束。
PEG5k-P(EPA40-DPA40)物理包载Ce6的胶束(以下也称为UPS@Ce6胶束)：精密称取空白PEG5k-P(EPA40-DPA40)聚合物和做为标记分子的游离Ce6各2.5mg，分别溶于500μL无水甲醇后，以100:6混合；在探头超声条件下，将其快速加入10mL超纯水中，以45W功率连续超声30秒；转移至100kD超滤管中，以超纯水超滤4次，以除去甲醇；将纳米粒子浓缩液用天平定量至5mg/mL，再次以10,000rpm离心10分钟，弃去沉淀不溶部分，即得UPS@Ce6胶束。
将UPS-Ce6/Q胶束分别用pH＝7.4和5.4的PBS缓冲液稀释至100μg/mL，采用动态光散射法和透射电子显微镜分别测定在不同pH条件下的粒径、表面电位和形态。结果如图5和图6所示，在pH 7.4条件下，胶束呈粒径为28nm的圆球形，表面略带负电；而在pH 5.4条件下，胶束解散为5nm左右的单体形式，带正电荷。因此，UPS-Ce6/Q胶束具有良好的酸响应性。
实施例3：UPS-Ce6/Q的信号激活表征
1.荧光信号激活：
将实施例2中制备的各种胶束依次用一系列每隔0.2个pH单位的PBS缓冲液(取转变点上下各4～5个pH)分别稀释至聚合物浓度为0.1mg/mL,稳定1小时后，采用荧光光谱仪(F-7000，HITACHI)，检测样品荧光光谱及强度，计算荧光信号激活倍数，绘制曲线。检测条件：激发波长λex 400nm；发射波长λem 650-750nm。如图7所示：UPS-Ce6/Q胶束在pH高于6.5时，基本无荧光信号，处于关闭状态；而当pH低于6.5，荧光信号迅速激活，在0.2个pH单位内实现215倍的荧光信号激活。实施例2中的其他三种胶束则只能达到1～5倍的信号激活。
2.单线态氧产生信号激活
采用四甲基-4-哌啶酮(TEMP)电子自旋共振法检测产生的单线态氧。用重水配制pH＝7.4和5.4的PBS缓冲液，分别稀释实施例2中得到的各种胶束至聚合物浓度为0.1mg/mL。在各样品中加入5μM四甲基-4-哌啶酮(TEMP)检测试剂(Sigma-Aldrich)，混合均匀后检测其电子自旋共振光谱(ESP300，Bruker)；用660nm激光50mW/cm2照射不同时间后，稳定30s，再次检测其电子自旋共振光谱。如图8所示，UPS-Ce6/Q胶束在pH 7.4条件下激光照射10分钟内未检测到单线态氧的生成；而在pH 5.4条件下，激光照射1分钟即能够明显检测到单线态氧的生成，且随着照射时间延长，产生的单线态氧增多。
采用对-亚硝基二甲基苯胺(RNO)脱色法评价单线态氧产生的信号激活。将实施例2中的各种胶束依次用一系列每隔0.2个pH单位的PBS缓冲液(取转变点上下各4～5个pH)分别稀释至聚合物浓度为0.1mg/mL,稳定1小时后，在各样品中加入RNO检测试剂(10mM，北京伊诺凯公司)，混合均匀后检测440nm吸光度；用660nm激光50mW/cm2照射2min后，稳定30s，再次检测其OD值。通过吸光度差值，计算单线态氧产生量及信号激活。如图9所示，UPS-Ce6/Q胶束在pH高于6.5时，基本无单线态氧生成，处于关闭状态；而当pH低于6.5，单线态氧产生量显著升高，在0.2个pH单位内实现358倍的信号激活。同时，单线态氧的信号激活与荧光信号激活行为具有良好的一致性。
实施例4：其它pH敏感缀合物胶束的制备与表征
采用实施例2中相同的方法，对实施例1中的不同聚合物、光敏剂和荧光淬灭剂缀合物进行组合，构建了一系列其它缀合物胶束，所用的聚合物、光敏剂和荧光淬灭剂如下：
聚合物：PEG5k-P(DBA80-AMA3)、PEG5k-P(DBA60-DPA20-AMA3)、PEG5k-P(DBA40-DPA40-AMA3)、PEG5k-P(DBA20-DPA60-AMA3)、PEG5k-P(DPA80-AMA3)、PEG5k-P(EPA20-DPA60-AMA3)、PEG5k-P(EPA40-DPA40-AMA3)、PEG5k-P(EPA60-DPA20-AMA3)、PEG5k-P(EPA80-AMA3)、PEG5k-P(iDPA80-AMA3)
光敏剂：Ce6、PPa、HPPH
荧光淬灭剂：QSY21、BHQ3
具体的胶束组成如表4所示，其中，光敏剂是缀合于聚合物上，荧光淬灭剂可以缀合于聚合物上，也可以物理包载于缀合物形成的胶束中。各个胶束荧光和单线态氧产生的信号激活表征结果如表4所示。各pH敏感缀合物胶束的荧光和单线态氧产生的信号激活均良好，均能够达到几十倍甚至上百倍的信号激活。
表4不同缀合物胶束的信号激活表征
实施例5：UPS-Ce6/Q光动力细胞杀伤效应评价
将非小细胞肺癌A549细胞(中国医学科学院基础研究所)以40,000cells/孔密度接种于24孔细胞培养板中，每孔500μL完全培养液(DMEM高糖培养液，10％胎牛血清)，于37℃、5％CO2恒温孵箱培养12小时，至细胞汇合度达约50％；弃去原培养液，以PBS清洗2遍后，加入200μL无酚红DMEM培养液稀释的实施例2中的UPS-Ce6/Q胶束，使最终Ce6浓度分别为1.5、3、6μg/mL，于37℃、5％CO2恒温孵箱避光孵育2h；弃去胶束，用PBS清洗一次后，加入200μL空白无酚红DMEM培养液，在避光条件下用660nm激光器(长春镭仕光电有限公司)、直径20mm准直器(长春镭仕光电有限公司)以50mW/cm2功率照射5分钟；随后，加入500μL完全培养液，继续培养24小时后，弃去原培养液，每孔加入500μL新鲜配制的MTT溶液(500μg/mL)，于孵箱中继续孵育2小时；弃去药液，每孔加入500μL DMSO，置于平板振荡器上振荡0.5小时以充分溶解细胞内产生的甲瓒；每孔吸取150μL液体于96孔板中，以酶标仪(Multiskan FC，Thermo Fisher)检测各孔在540nm处的吸光度(OD)值；同时，设置质子泵抑制剂Bafilomycin A1和单线态氧清除剂维生素C(Vitamin C)拮抗光动力UPS-Ce6/Q效应。结果如图10所示，在660nm激光照射下，UPS-Ce6/Q胶束能够产生高效的细胞杀伤效果，6μg/mL可抑制90％以上A549细胞。通过质子泵抑制剂巴伐洛霉素A1抑制内吞细胞器酸化阻碍UPS的胞内活化，以及单线态氧清除剂维生素C均能有效降低胞内单线态氧生成，从而拮抗UPS-Ce6/Q胶束对肿瘤细胞的光动力杀伤作用。
实施例6：UPS-Ce6/Q的光毒性评价
1.自然光照下胶束的单线态氧产生
将实施例2中制备的各种胶束分别用pH 7.4的PBS缓冲液稀释至Ce6浓度为6μg/mL，加入RNO检测试剂(实施例3中所述的)并置于自然光照下进行照射。分别于0、0.5、1、2、3、6、12和24h检测各样品的吸光度值，计算单线态氧的生成。结果如图11所示，在自然光照下UPS-Ce6/Q在24h内基本不产生单线态氧，而实施例2中制备的其他三种胶束均有不同程度的单线态氧生成。因此，在自然光照下，pH敏感两亲性聚合物胶束UPS-Ce6/Q在24小时内能够维持稳定的关闭状态。
2.溶血实验
取新鲜小鼠全血于肝素化离心管中，以4000rpm离心10分钟；弃去上清，加入PBS重悬，清洗三次；最终分离得到红细胞，用细胞计数仪计数；以PBS(pH＝7.4)稀释红细胞至1×107细胞/mL，用于溶血实验；将实施例2中的各种胶束的分别以上述红细胞悬液稀释至Ce6浓度为6μg/mL，同时设置空白PBS和水分别作为阴性对照和阳性对照组；分别将样品用660nm激光照射(100mW/cm2，5分钟)或者自然光照射(2小时)；4000rpm离心样品10分钟，拍照；上清用转移至96孔板中，用酶标仪检测540nm处吸光度，以蒸馏水组作为100％溶血，计算各样品溶血率；细胞沉淀用倒置荧光显微镜进行观察，拍照。结果如图12所示，无论是在自然光照下还是在激光照射下，UPS-Ce6/Q胶束均未发生溶血现象，而其他三种胶束均产生不同程度的红细胞破裂。因此，在激光照射和自然光照射下，pH敏感两亲性聚合物胶束UPS-Ce6/Q均未显示明显光毒性，安全性良好。
实施例7：UPS-Ce6/Q的体内抗肿瘤药效学评价
建立荷A549肿瘤裸鼠模型(维通利华，nu/nu裸鼠，雌性，远交系，18～20g)，待肿瘤生长至50～100mm3，随机分成7组，每组8只，分别给予不同的胶束及处理方式，具体分组及给药方案如下：
(1)PBS：第0天、第2天尾静脉注射200μL PBS；
(2)IR：第0天、第2天尾静脉注射200μL PBS；
(3)UPS-Ce6/Q：第0天、第2天尾静脉注射2mg/kg UPS-Ce6/Q制剂；
(4)UPS@Ce6+IR：第0天、第2天尾静脉注射2mg/kg UPS@Ce6制剂；
(5)Always-On+IR：第0天、第2天尾静脉注射2mg/kg Always-On制剂；
(6)UPS-Ce6+IR：第0天、第2天尾静脉注射2mg/kg UPS-Ce6制剂；
(7)UPS-Ce6/Q+IR：第0天、第2天尾静脉注射2mg/kg UPS-Ce6/Q制剂；
其中，(2)、(4)、(5)、(6)、(7)五组给药3h后给予660nm激光照射，功率密度400mW/cm2，照射10分钟，从给药前一天开始，每隔一天采用游标游标卡尺测量各组小鼠肿瘤长径(a)和短径(b)，利用下式计算肿瘤体积V和相对肿瘤体积(RTV)，绘制相对肿瘤体积-时间变化图。
其中V0为第0天肿瘤体积。
结果如图13所示，单独UPS-Ce6/Q制剂(3)及单独光照对肿瘤基本无生长抑制效果，而四种制剂(4)、(5)、(6)、(7)介导的有光照的光动力均能显著抑制肿瘤的生长。其中由于稳定性差导致物理包载制剂(4)的抑瘤效果最差，而Always-On及UPS-Ce6均能达到80％以上的肿瘤生长抑制。而加入有QSY21的UPS-Ce6/Q，其肿瘤PDT消融效果显著增强，可达95％的肿瘤生长抑制。因此，UPS-Ce6/Q具有良好的体内光动力肿瘤消融效果。
实施例8：pH敏感缀合物胶束UPS-Ce6/ICG制备与表征
精密称取实施例2中制备的PEG5k-iPDPA80-Ce6缀合物和PEG5k-iPDPA80-ICG缀合物各2.5mg，共同溶于1mL无水甲醇中；在探头超声条件下，将其快速加入10mL超纯水中，以45W功率连续超声30秒；转移至100kD超滤管中，以超纯水超滤4次，以除去甲醇；将纳米粒子浓缩液用天平定量至5mg/mL，再次以10,000rpm离心10分钟，弃去沉淀不溶部分，即得UPS-Ce6/ICG胶束。将其依次用一系列每隔0.2个pH单位的PBS缓冲液(取转变点上下各4～5个pH)分别稀释至聚合物浓度为0.1mg/mL,稳定1小时后，采用荧光光谱仪，分别检测样品Ce6和ICG荧光光谱及强度，计算荧光信号激活效应，绘制曲线。结果如图14所示，UPS-Ce6/ICG胶束能够使Ce6和ICG分别达到良好的信号激活。其中，通过ICG的异源荧光共振能量转移效应使Ce6达到104倍信号激活，而ICG通过同源荧光共振能量转移效应也可达到60倍信号激活。
实施例9：UPS-Ce6/ICG的光热效应评价
将实施例8中的胶束用PBS缓冲液稀释至0.1mg/mL，用808nm激光器分别以0.5W/cm2、1.0m2、2.0W/cm2照射10分钟，以PBS为对照，采用红外热感相机(Fotric 226，美国FOTRIC公司)实时记录升温情况。结果如图15所示，PBS对照组在光照10分钟内无升温现象，而UPS-Ce6/ICG在不同浓度下均产生显著升温现象，且随着激光功率增强稳定越高，2W/cm2光照最高可达16℃升温。因此，UPS-Ce6/ICG胶束具有良好的光热效应。
实施例10：EGFR主动靶向缀合物胶束Fab’-UPS-Ce6/Q的制备与靶向性评价
pH敏感的聚合物-光敏剂缀合物胶束表面靶向配体的修饰采用巯基和马来酰亚胺的反应。
马来酰亚胺功能化的pH敏感聚合物合成如下图所示。
将马来酰亚胺功能化的pH敏感聚合物与PEG5k-iPDPA80-Ce6和PEG5k-iPDPA80-QSY21聚合物(0.1:1:1，摩尔比)混合，按实施例2的方法制备胶束MAL-UPS-Ce6/Q。随后，加入EGF受体单克隆抗体西妥昔单抗的巯基化Fab片段Fab’-SH，通过巯基和马来酰亚胺的反应修饰于MAL-UPS-Ce6/Q表面，构建主动靶向胶束Fab’-UPS-Ce6/Q。
图16为采用流式细胞术检测A549细胞对Fab修饰主被动胶束的摄取情况，结果显示Fab修饰后，Fab’-UPS-Ce6/Q细胞摄取量显著增强，为未修饰Fab的实施例3中的UPS-Ce6/Q胶束的摄取量的36倍，靶向性良好。
实施例11：Fab’-UPS-Ce6/Q光动力细胞杀伤效应评价
将非小细胞肺癌A549细胞以40,000cells/孔密度接种于24孔细胞培养板中，每孔500μL完全培养液，于37℃、5％CO2恒温孵箱培养12小时，至细胞汇合度达约50％；弃去原培养液，以PBS清洗2遍后，加入200μL无酚红完全DMEM培养液稀释的实施例10中的Fab’-UPS-Ce6/Q或者实施例3中的UPS-Ce6/Q胶束，使最终Ce6浓度分别为1.5、3、6μg/mL，于37℃、5％CO2恒温孵箱避光孵育2h；弃去制剂，用PBS清洗一次后，加入200μL空白无酚红DMEM培养液，在避光条件下用660nm激光器、直径20mm准直器以100mW/cm2功率照射5分钟；随后，加入500μL完全培养液，继续培养24小时后，弃去原培养液，每孔加入500μL新鲜配制的MTT溶液(500μg/mL)，于孵箱中继续孵育2小时；弃去药液，每孔加入500μL DMSO，置于平板振荡器上振荡0.5小时以充分溶解细胞内产生的甲瓒；每孔吸取150μL液体于96孔板中，以酶标仪检测各孔在540nm处的吸光度(OD)值，计算细胞存活率。结果如图17所示，未修饰Fab’的被动胶束UPS-Ce6/Q在三个浓度下对A549细胞基本不产生光动力细胞杀伤作用；而表面修饰西妥昔单抗的Fab’靶向配体的Fab’-UPS-Ce6/Q胶束的光动力细胞杀伤效果显著增强，在1.5μg/mL时即可达到60％以上细胞抑制率，而在6μg/mL时仅8.7％细胞存活，光动力效果良好。因此，Fab’-UPS-Ce6/Q具有主动靶向光动力细胞杀伤效应。
实施例12:pH敏感缀合物PEG5k-PC7A80-SS-DOX的合成及光动力-化疗联合胶束UPS-Ce6/Q/DOX的制备
1.还原敏感阿霉素前药的合成
还原敏感阿霉素前药合成的反应下图所示。
称取45mg盐酸阿霉素(DOX·HCl)、40mg本实验室合成的还原敏感连接臂于反应瓶，加入1mL无水N,N-二甲基甲酰胺、40μL无水三乙胺使之完全溶解。室温下反应24小时后，用硅胶柱层析进行纯化，以三氯甲烷、甲醇为洗脱剂，比例为1:0～4:1。真空干燥，得到粉末状固体，即为还原敏感阿霉素前药DOX-SS-COOH。
2.还原敏感阿霉素修饰的pH敏感缀合物PEG5k-PC7A80-SS-DOX合成
精密称取适量还原敏感阿霉素前药DOX-SS-COOH、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺(1:1.1:1.2，摩尔比)，以0.2mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解于棕色反应瓶中，于室温下反应12小时；随后，称取等同1/4摩尔当量DOX-SS-COOH的聚合物PEG5k-P(C7A80-AMA3)，0.2mL无水N,N-二甲基甲酰胺完全溶解后，加入上述反应液中，室温下继续反应24小时；采用凝胶渗透色谱纯化反应液，经冷冻干燥后得到的最终缀合物即为PEG5k-PC7A80-SS-DOX，产率78.5％，DOX的载药量为9.4％。
3.pH敏感缀合物光动力-化疗联合胶束组合物UPS-Ce6/Q/DOX的制备
精密称取PEG5k-PC7A80-Ce6、PEG5k-PC7A80-QSY21和PEG5k-PC7A80-SS-DOX缀合物各2.5mg，共同溶于1mL无水甲醇中；在探头超声条件下，将其快速加入10mL超纯水中，以45W功率连续超声30秒；转移至100kD超滤管中，以超纯水超滤4次，以除去甲醇；将纳米粒子浓缩液用天平定量至5mg/mL，再次以10,000rpm离心10分钟，弃去沉淀不溶部分，即得UPS-Ce6/Q/DOX胶束组合物。
实施例13:UPS-Ce6/Q/DOX胶束的化疗药效评价
将胰腺癌BxPC3细胞(中国医学科学院基础研究所)以2000cells/孔的密度接种于96孔板中，每孔200μL培养液；培养过夜待细胞贴壁后，弃去原培养液，加入200μL以新鲜DMEM完全培养液配制的系列浓度梯度的UPS-Ce6/Q/DOX胶束组合物，DOX浓度梯度为0.000977、0.003906、0.015625、0.0625、0.25、1、4、16μg/mL，并设置不含药物的完全培养液组及空白背景组；孵育48h后，弃去药液，每孔加入200μL新鲜配制的MTT溶液(0.5mg/mL)，于孵箱中继续孵育4h；4h后每孔加入100μL DMSO，并于平板振荡器上振荡30min以充分溶解甲瓒；用酶标仪检测各孔在540nm处的吸光度值，计算细胞存活率和半数致死量。结果如图18所示，UPS-Ce6/Q/DOX胶束组合物在避光条件下显示优异的细胞杀伤效果，半数致死量为0.085μg/mL，说明UPS-Ce6/Q/DOX胶束在无激光照射下具有良好的化疗抗肿瘤药效。
以上实验中，本发明仅仅是示例性的选取部分实施例中制备的pH敏感缀合物胶束用于试验，本发明并不限定于此。需要说明的是，本发明的其他载药pH敏感缀合物胶束同样具有高效低毒的光动力治疗效果，同样也可以与光热、化疗、免疫治疗相组合，发挥有益效果。
本发明如上所述进行了记载。本发明在其范围中包含各种方式的变化，这些变化并不偏离本发明的范围。此外，所有的对本领域技术人员而言明显地认为是本发明的变形这样的情形，都包括在所附权利要求的范围内。
Claims (28)
1.pH敏感缀合物，其包含亲水链段和疏水链段，其中所述亲水链段为聚乙二醇，所述疏水链段具有下式1所示的结构:
其中，R’、R”、R”’分别为C1-C6烷基，X1、X2、X3分别为-H，R””为Br；
R1、R2、R3、R4分别为C1-C6烷基或者R1和R2、R3和R4分别合在一起形成C1-C16亚烷基；
a、b、c分别为1～5的整数；
x和y分别为整数，x和y之和为60～100的整数；
z为1～5的整数；x，y，z三部分可以按任意顺序排列；
L为连接臂，其选自酰胺键、酯键，氧化还原敏感的二硫键，pH敏感的乙缩醛键、原酸酯键、腙键、亚胺键，以及酶敏感基团；F包括选自光敏剂、化疗药物和免疫治疗药物的物质，而且F任选地包括荧光淬灭剂或光热探针；各个L以及各个F各自可以不同，
其中所述光敏剂包括卟啉类及其衍生物类光敏剂和非卟啉类光敏剂，其中卟啉类及其衍生物类光敏剂选自下组：二氢卟吩e6、焦脱镁叶绿酸a、血卟啉单甲醚、原卟啉IX、维替泊芬、光克洛、单天冬胺酰基卟吩，其中非卟啉类光敏剂选自下组：阳离子型光敏剂、醌类光敏剂、姜黄素类光敏剂和BODIPY类光敏剂；
其中所述化疗药物选自下组：阿霉素、表阿霉素、顺铂、柔红霉素、紫杉醇、多西他赛、喜树碱、羟基喜树碱和一甲基澳瑞他汀E；
其中所述免疫治疗药物选自小分子免疫检查点抑制剂或toll样受体激动剂；
其中所述光淬灭剂选自下组：DABCYL、DABSYL、QSY、QXL、ATTO和BHQ；
其中所述光热探针选自下组：ICG、Cy7.5、IR780、IR783、MHI-148、IR808、IR825和PccBu4。
2.根据权利要求1所述的pH敏感缀合物，其中
R’、R”、R”’为甲基；X1、X2、X3为-H；R””是Br；
R1、R2、R3、R4分别为C2-C4烷基或R1和R2、R3和R4分别合在一起形成C1-8亚烷基；
a、b、c分别为1～4的整数；
x和y之和为80；
z为3。
3.根据权利要求1或2所述的pH敏感缀合物，其具有以下式2所示的结构:
其中，Y1选自-H、C1-C12烷基、C1-C12环烷基、C1-C12取代烷基、C1-C12取代环烷基，或
或金属螯合基团；
n为1～500的整数；
Y2和Y3分别选自-H、C1-C12烷基、C1-C12环烷基、C1-C12取代烷基或C1-C12取代环烷基；
其它符号如权利要求1或2所定义。
4.根据权利要求3中所述的pH敏感缀合物，其中Y1为C1-C6烷基；n为50～150的整数；Y2和Y3分别为C1-C6烷基。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的pH敏感缀合物，其具有下式3所示结构：
其中，R1’、R2’选自如下的结构：
x和y之和为80；
F和L分别如权利要求1中所定义。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的pH敏感缀合物，其中，L为酰胺键或者酯键。
7.根据权利要求5所述的pH敏感缀合物，其中，
R1’和R2’基团结构选自下式A中所示：
其中所述光敏剂选自如下式B中所示的卟啉类二氢卟酚e6(Ce6)、焦脱镁叶绿酸a(PPa)和光克洛(HPPH)，所述化疗药物为阿霉素(DOX)，所述荧光淬灭剂选自如下式C中所示的QSY21和BHQ-3，所述光热探针为吲哚菁绿(ICG)：
L为酰胺键。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的pH敏感缀合物，其选自以下缀合物：
PEG5k-PC7A80-Ce6、
PEG5k-PC7A80-SS-DOX、和
PEG5k-iPDPA80-Ce6。
9.制备根据权利要求1-8中任一项所述的pH敏感缀合物的方法，该方法包括：将标记分子F键合至pH敏感两亲性聚合物的疏水链段中。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述pH敏感两亲性聚合物选自：
其中，各符号的定义如权利要求3所述。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述pH敏感两亲性聚合物具有以下结构：
R1’和R2’基团结构为下式A中所示；
所述光敏剂选自如下式B中所示的卟啉类二氢卟酚e6(Ce6)、焦脱镁叶绿酸a(PPa)和光克洛(HPPH)，所述化疗药物为阿霉素(DOX)，所述荧光淬灭剂选自如下式C中所示的QSY21和BHQ-3，所述光热探针为吲哚菁绿(ICG)：
L为酰胺键，
所述pH敏感两亲性聚合物与标记分子F连接后，所述的pH敏感缀合物具有以下结构：
其中，x和y的定义如权利要求1或2中所述。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，pH敏感两亲性聚合物为PEG5k-P(EPA40-DPA40-AMA3)，结构如下：
所述光敏剂为二氢卟吩Ce6，所述荧光淬灭剂为QSY21。
13.pH敏感缀合物胶束，其由一种或多种由权利要求1-8中任一项所述的pH敏感缀合物形成。
14.根据权利要求13所述的pH敏感缀合物胶束，其包括标记分子F为光敏剂的所述缀合物和标记分子F为荧光淬灭剂的所述缀合物。
15.根据权利要求14所述的pH敏感缀合物胶束，其中，所述光敏剂为二氢卟吩Ce6，所述荧光淬灭剂为QSY21。
16.根据权利要求14或15所述的pH敏感缀合物胶束，其中标记分子为光敏剂的所述缀合物与标记分子为荧光淬灭剂的所述缀合物的摩尔比为100:1～1:100。
17.根据权利要求16所述的pH敏感缀合物胶束，其中标记分子为光敏剂的所述缀合物与标记分子为荧光淬灭剂的所述缀合物的摩尔比为10:1-1:10。
18.根据权利要求17所述的pH敏感缀合物胶束，其中标记分子为光敏剂的所述缀合物与标记分子为荧光淬灭剂的所述缀合物的摩尔比为1:1。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的pH敏感缀合物胶束，其中，标记分子为光敏剂，并且该胶束中物理包埋有荧光淬灭剂。
20.根据权利要求14-19中任一项所述的pH敏感缀合物胶束，其选自以下胶束；
PEG5k-P(EPA40-DPA40)-Ce6
PEG5k-P(EPA40-DPA40)-Ce6/Q
PEG5k-P(EPA40-DPA40)-Ce6/ICG
Fab’-PEG5k-P(EPA40-DPA40)-Ce6/Q，和
PEG5k-P(EPA40-DPA40)-Ce6/Q/DOX。
21.根据权利要求14-20中任一项所述的pH敏感缀合物胶束，其中，所述光敏剂缀合于聚合物上，所述荧光淬灭剂缀合于聚合物上或物理包载于缀合物。
22.根据权利要求14-21中任一项所述的pH敏感缀合物胶束，其中pH敏感两亲性聚合物选自：PEG5k-P(DBA80-AMA3)、PEG5k-P(DBA60-DPA20-AMA3)、PEG5k-P(DBA40-DPA40-AMA3)、PEG5k-P(DBA20-DPA60-AMA3)、PEG5k-P(DPA80-AMA3)、PEG5k-P(EPA20-DPA60-AMA3)、PEG5k-P(EPA40-DPA40-AMA3)、PEG5k-P(EPA60-DPA20-AMA3)、PEG5k-P(EPA80-AMA3)、PEG5k-P(iDPA80-AMA3)；
光敏剂选自：Ce6、PPa、HPPH；
荧光淬灭剂选自：QSY21、BHQ3。
23.根据权利要求14-22中任一项所述的pH敏感缀合物胶束，其中，胶束包含标记分子为光敏剂的所述缀合物，以及任选地选自荧光淬灭剂、光热探针、化疗药物和免疫治疗药物中的一种或多种；其中，荧光淬灭剂、光热探针、化疗药物和免疫治疗药物当存在时，以物理包埋在胶束内核的形式存在，或以缀合物的形式存在，当以缀合物的形式时，荧光淬灭剂、光热探针、化疗药物和免疫治疗药物作为缀合物的标记分子。
24.胶束组合物，其包含权利要求13-23中任一项所述的pH敏感缀合物胶束。
25.权利要求13-23中任一项所述的pH敏感缀合物胶束在制备用于治疗选自下述疾病的药物中的用途：恶性肿瘤、炎性疾病、增生性关节炎症、眼科疾病和皮肤病。
26.权利要求1-8中任一项所述的pH敏感缀合物在制备用于治疗选自下述疾病的药物中的用途：恶性肿瘤、炎性疾病、增生性关节炎症、眼科疾病和皮肤病。
27.根据权利要求13-23中任一项所述的pH敏感缀合物胶束与其他药物组合用于制备治疗选自下述疾病的药物中的用途：恶性肿瘤、炎性疾病、增生性关节炎症、眼科疾病和皮肤病。
28.根据权利要求1-8中任一项所述的pH敏感缀合物与其他药物组合用于制备治疗选自下述疾病的药物中的用途：恶性肿瘤、炎性疾病、增生性关节炎症、眼科疾病和皮肤病。
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