CN116953231A - 采用改良抗体结合试验检测狂犬病疫苗效力的方法 - Google Patents

采用改良抗体结合试验检测狂犬病疫苗效力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及狂犬病疫苗效力检测方法领域，特别是采用改良抗体结合试验检测狂犬病疫苗效力的方法，包括以下等步骤：S1.生长液的配制：取199水溶液和胎牛血清，按9:1的体积比混合，得到生长液；S2.狂犬病疫苗效力检定用国家标准品溶液的配制：将狂犬病疫苗效力检定用国家标准品复溶后，再进行系列稀释；S3.供试品溶液的制备：取S1中的生长液，将狂犬病疫苗供试品做3倍系列稀释，得到供试品溶液；本发明疫苗中间产品的测定结果可指导疫苗的生产过程；结合疫苗的生产工艺，采用生产用的狂犬病毒CTN毒株与Vero细胞的感染性更好，适应性更强，与NIH法测定的结果有较高的相近度。

Description

采用改良抗体结合试验检测狂犬病疫苗效力的方法
技术领域
本发明涉及狂犬病疫苗效力检测方法领域，特别是采用改良抗体结合试验检测狂犬病疫苗效力的方法。
背景技术
目前常用检测狂犬病疫苗效价的方法是小鼠中和试验法(NIH法)，该方法：
(1)需使用大量的小鼠进行实验操作，有违动物伦理规则，试验应该减少动物的痛苦，保护动物，尊重其生命；
(2)实验检验周期较长(需28天)，实验过程需2次免疫，1次脑内攻击，攻击后需连续观察14天小鼠精神与死亡状态，检验周期长，不利于指导生产；
(3)由于小鼠个体存在差异以及操作的复杂性，导致实验准确度低、重复性较差；
(4)实验中使用脑腔注射小鼠0.3mL，操作难度大同时有生物安全风险危机操作人员；
NIH法是药典规定的一种法定的测定方法，但基于上述缺点，寻找一种新的测定疫苗效价的方法用于冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液及成品的检测，准确快速的获得效价结果利于指导半成品配制及成品放行进入包装阶段，提高批签发申报进度。
发明内容
本发明的目的在于提供采用改良抗体结合试验检测狂犬病疫苗效力的方法，解决以上问题。
为达到以上目的，提供以下技术方案：
采用改良抗体结合试验检测狂犬病疫苗效力的方法，包括以下步骤：
S1.生长液的配制：取199水溶液和胎牛血清，按9:1的体积比混合，得到生长液；
S2.狂犬病疫苗效力检定用国家标准品溶液的配制：将狂犬病疫苗效力检定用国家标准品复溶后，再进行系列稀释；
S3.供试品溶液的制备：取所述S1中的生长液，将狂犬病疫苗供试品做3倍系列稀释，得到供试品溶液；
S4.狂犬病人免疫球蛋白国家标准品溶液的稀释：取一定浓度的狂犬病人免疫球蛋白国家标准品复溶稀释；
S5.狂犬病病毒CTN毒株的稀释：取狂犬病毒毒株，用所述S1中的生长液稀释备用；
S6.狂犬病毒荧光抗体工作液的制备：稀释并混匀狂犬病毒荧光抗体和伊文思蓝染色液；
S7.效力测定：分别将狂犬病疫苗效力检定用国家标准品溶液及供试品溶液加入不同的细胞培养孔中，分别加入狂犬病人免疫球蛋白国家标准品溶液，并接种细胞培养，对细胞荧光染色后进行观察；
S8.效力计算：分别建立标准品和供试品的计算模型，测定供试品效价。
优选地，所述步骤S2具体为：
将狂犬病疫苗效力检定用国家标准品以1mL灭菌注射用水复溶，再用生长液进行2.8倍稀释备用，再用生长液将稀释后的狂犬病疫苗效力检定用国家标准品溶液做3倍系列稀释。
优选地，所述步骤S4具体为：
取浓度为37IU/mL的狂犬病人免疫球蛋白国家标准品，以1mL灭菌注射用水复溶，按复溶后的狂犬病人免疫球蛋白国家标准品：生长液＝1:200的体积比进行稀释。
优选地，所述步骤S6具体为：
将狂犬病毒荧光抗体按狂犬病毒荧光抗体：0.01mol/L PBS缓冲液＝1:200的体积比进行稀释，将伊文思蓝染色液按伊文思蓝染色液：0.01mol/L PBS缓冲液＝1：50的体积比进行稀释并将二者充分混匀。
优选地，所述步骤S7具体为：
将步骤S2处理后的狂犬病疫苗效力检定用国家标准品溶液及步骤S3处理后的供试品溶液分别加入不同的细胞培养孔中，将步骤S4处理后的狂犬病人免疫球蛋白国家标准品溶液按50μL/孔分别加入标准品及供试品的培养孔中，在37℃、5.0％二氧化碳条件下中和1h后，每孔加入8×105个/mL的细胞悬液50μL，于37℃、5.0％二氧化碳条件下培养至细胞单层达80％以上，并取不接狂犬病毒的细胞对照孔作为阴性对照，排干细胞培养孔中的液体，每孔加入预冷的50μL 80％丙酮溶液，置2～8℃固定30min，弃丙酮溶液，待干燥后每孔以50μL/孔加入狂犬病毒荧光抗体工作液，37℃下孵育1h，弃去细胞培养孔中的液体，用0.01mol/L PBS缓冲液洗孔1～2次，并将细胞培养孔于倒置荧光显微镜下观察。
优选地，所述细胞悬液为Vero细胞悬液。
优选地，所述步骤S8具体为：
建立标准品的ED50计算模型：
标准品ED50＝(A1-0.5)/[(A1-B1)×lg(C1)+lg(n1)]
式中：A1-标准品高于50％荧光灶比例孔的荧光灶百分比；B1-标准品低于50％荧光灶比例孔的荧光灶百分比；C1-标准品用含10％胎牛血清生长液做系列稀释的稀释倍数；n1-标准品小于50％的稀释倍数；
建立供试品的ED50计算模型：
供试品ED50＝(A2-0.5)/[(A2-B2)×lg(C2)+lg(n2)]
式中：A1-供试品高于50％荧光灶比例孔的荧光灶百分比；B1-供试品低于50％荧光灶比例孔的荧光灶百分比；C1-供试品用含10％胎牛血清生长液做系列稀释的稀释倍数；n1-供试品小于50％的稀释倍数；
建立供试品的效价计算模型：
lg(供试品效价(单位：IU/mL))＝(供试品ED50-标准品ED50)×(狂犬病疫苗效力检定用国家标准品效价(单位：IU/mL)/2.8)×稀释倍数。
本发明的有益效果为：
1、本发明可在体外快速检测出灭活的狂犬病疫苗及疫苗中间产品的效价；
2、本发明可对疫苗生产内控标准以指示，测定中间产品狂犬疫苗原液效价，保证疫苗成品质量，满足法规要求，且和动物实验结果相接近；
3、本发明由体外试验(细胞培养法结合免疫荧光制剂法)代替体内试验(动物试验)，且周期短，能快速检出结果且结果稳定，保护动物，保护人员安全成为了一种新的发展趋势；
4、本发明疫苗中间产品的测定结果可指导疫苗的生产过程；结合疫苗的生产工艺，采用生产用的狂犬病毒CTN毒株与Vero细胞的感染性更好，适应性更强，与NIH法测定的结果有较高的相近度。
附图说明
图1为冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的两种效价方法比对结果图；
图2为人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液的两种效价方法比对结果图；
图3为冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)2名实验人员的改良抗体结合试验效价方法比对结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
取不同种类、不同批次的供试品疫苗分别采用改良抗体结合试验和NIH法测定效价，采用改良抗体结合试验的供试品在96孔板中做3倍系列稀释，加入狂犬病中和抗体，37℃中和1h，加入狂犬病毒悬液，37℃中和1h，接种Vero细胞悬液，37℃、5.0％二氧化碳培养24h，倒置荧光显微镜观察荧光染色结果，结果如图1所示；图1可看出，疫苗1、2、3、6、7、8、9、10两种方法测定的效价值标准偏差<0.5，疫苗4、5两种方法测定的效价值标准偏差
<0.6。
实施例2：
取不同种类、不同批次的供试品原液分别采用改良抗体结合试验和NIH法测定效价，采用改良抗体结合试验的供试品在96孔板中做3倍系列稀释，加入狂犬病中和抗体，37℃中和1h，加入狂犬病毒悬液，37℃中和1h，接种Vero细胞悬液，37℃、5.0％二氧化碳培养24h，倒置荧光显微镜观察荧光染色结果，结果如图2所示；图2可看出，原液1、2、3、4、6、7、8、9、10两种方法测定的效价值标准偏差<0.5，原液5两种方法测定的效价值标准偏差<0.6。
实施例3：
取不同种类、不同批次的供试品疫苗通过不同人员采用改良抗体结合试验测定效价，为确保试验的准确性与可靠性，需要操作人员保证操作的一致性；采用改良抗体结合试验的供试品在96孔板中做3倍系列稀释，加入狂犬病中和抗体，37℃中和1h，加入狂犬病毒悬液，37℃中和1h，接种Vero细胞悬液，37℃、5.0％二氧化碳培养24h，倒置荧光显微镜观察荧光染色结果，结果如图3所示；图3可看出，疫苗1、4、6、8不同人员测定的效价值标准偏差<0.5，疫苗2、3、5、7、9、10不同人员测定的效价值标准偏差<0.05。
结合实施例1-3的数据分析，改良抗体结合试验法效价测定结果与NIH法结果标准偏差均小于1；即得出两种效价测定结果相近，两种效价测定方法的精密度和准确度也较高，不同人员应用改良抗体结合试验法测定的效价结果重复性良好；而改良抗体结合试验法耗时短，仅需要24h即可推算出供试品的效价值，大大的缩短了检验周期，快速检出原液结果也更好的指导车间半成品生产。

Claims (7)

1.采用改良抗体结合试验检测狂犬病疫苗效力的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.生长液的配制：取199水溶液和胎牛血清，按9:1的体积比混合，得到生长液；
S2.狂犬病疫苗效力检定用国家标准品溶液的配制：将狂犬病疫苗效力检定用国家标准品复溶后，再进行系列稀释；
S3.供试品溶液的制备：取所述S1中的生长液，将狂犬病疫苗供试品做3倍系列稀释，得到供试品溶液；
S4.狂犬病人免疫球蛋白国家标准品溶液的稀释：取一定浓度的狂犬病人免疫球蛋白国家标准品复溶稀释；
S5.狂犬病病毒CTN毒株的稀释：取狂犬病毒毒株，用所述S1中的生长液稀释备用；
S6.狂犬病毒荧光抗体工作液的制备：稀释并混匀狂犬病毒荧光抗体和伊文思蓝染色液；
S7.效力测定：分别将狂犬病疫苗效力检定用国家标准品溶液及供试品溶液加入不同的细胞培养孔中，分别加入狂犬病人免疫球蛋白国家标准品溶液，并接种细胞培养，对细胞荧光染色后进行观察；
S8.效力计算：分别建立标准品和供试品的计算模型，测定供试品效价。
2.根据权利要求1所述的采用改良抗体结合试验检测狂犬病疫苗效力的方法，其特征在于：所述步骤S2具体为：
将狂犬病疫苗效力检定用国家标准品以1mL灭菌注射用水复溶，再用生长液进行2.8倍稀释备用，再用生长液将稀释后的狂犬病疫苗效力检定用国家标准品溶液做3倍系列稀释。
3.根据权利要求1所述的采用改良抗体结合试验检测狂犬病疫苗效力的方法，其特征在于：所述步骤S4具体为：
取浓度为37IU/mL的狂犬病人免疫球蛋白国家标准品，以1mL灭菌注射用水复溶，按复溶后的狂犬病人免疫球蛋白国家标准品：生长液＝1:200的体积比进行稀释。
4.根据权利要求1所述的采用改良抗体结合试验检测狂犬病疫苗效力的方法，其特征在于：所述步骤S6具体为：
将狂犬病毒荧光抗体按狂犬病毒荧光抗体：0.01mol/L PBS缓冲液＝1:200的体积比进行稀释，将伊文思蓝染色液按伊文思蓝染色液：0.01mol/L PBS缓冲液＝1：50的体积比进行稀释并将二者充分混匀。
5.根据权利要求1所述的采用改良抗体结合试验检测狂犬病疫苗效力的方法，其特征在于：所述步骤S7具体为：
将步骤S2处理后的狂犬病疫苗效力检定用国家标准品溶液及步骤S3处理后的供试品溶液分别加入不同的细胞培养孔中，将步骤S4处理后的狂犬病人免疫球蛋白国家标准品溶液按50μL/孔分别加入标准品及供试品的培养孔中，在37℃、5.0％二氧化碳条件下中和1h后，每孔加入8×105个/mL的细胞悬液50μL，于37℃、5.0％二氧化碳条件下培养至细胞单层达80％以上，并取不接狂犬病毒的细胞对照孔作为阴性对照，排干细胞培养孔中的液体，每孔加入预冷的50μL 80％丙酮溶液，置2～8℃固定30min，弃丙酮溶液，待干燥后每孔以50μL/孔加入狂犬病毒荧光抗体工作液，37℃下孵育1h，弃去细胞培养孔中的液体，用0.01mol/L PBS缓冲液洗孔1～2次，并将细胞培养孔于倒置荧光显微镜下观察。
6.根据权利要求5所述的采用改良抗体结合试验检测狂犬病疫苗效力的方法，其特征在于：所述细胞悬液为Vero细胞悬液。
7.根据权利要求1所述的采用改良抗体结合试验检测狂犬病疫苗效力的方法，其特征在于：所述步骤S8具体为：
建立标准品的ED50计算模型：
标准品ED50＝(A1-0.5)/[(A1-B1)×lg(C1)+lg(n1)]
式中：A1-标准品高于50％荧光灶比例孔的荧光灶百分比；B1-标准品低于50％荧光灶比例孔的荧光灶百分比；C1-标准品用含10％胎牛血清生长液做系列稀释的稀释倍数；n1-标准品小于50％的稀释倍数；
建立供试品的ED50计算模型：
供试品ED50＝(A2-0.5)/[(A2-B2)×lg(C2)+lg(n2)]
式中：A1-供试品高于50％荧光灶比例孔的荧光灶百分比；B1-供试品低于50％荧光灶比例孔的荧光灶百分比；C1-供试品用含10％胎牛血清生长液做系列稀释的稀释倍数；n1-供试品小于50％的稀释倍数；
建立供试品的效价计算模型：
lg(供试品效价(单位：IU/mL))＝(供试品ED50-标准品ED50)×(狂犬病疫苗效力检定用国家标准品效价(单位：IU/mL)/2.8)×稀释倍数。
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