CN116930380A - 一种多臂胺类聚乙二醇纯度的检测方法 - Google Patents

一种多臂胺类聚乙二醇纯度的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及多臂胺类聚乙二醇的检测方法，将多臂胺类聚乙二醇待测品溶解，加入二苯基环辛炔‑琥珀酰亚胺酯进行衍生，加入碱性试剂进行衍生，得到衍生化产物；采用液相色谱法检测所述衍生化产物，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，采用体积比0.05～0.2％三氟乙酸水溶液为流动相A，体积比0.05～0.2％三氟乙酸甲醇为流动相B进行洗脱，使用电喷雾检测器进行检测，计算得出胺类聚乙二醇纯度。本发明可以通过十八烷基硅烷键合硅胶柱更好的分离产品及杂质，采用衍生法处理胺类聚乙二醇，用液相色谱法检测，使其能更准确的检测胺类聚乙二醇的纯度。从而更好的解决样品纯度检测问题及杂质控制问题，为产品的研究提供了帮助。

Description

一种多臂胺类聚乙二醇纯度的检测方法
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种多臂胺类聚乙二醇纯度的检测方法。
背景技术
聚乙二醇(PEG)水凝胶在医疗器械和再生医学方面尤其是在药物的缓释控释，在2维和3维细胞培养以及伤口的缝合和愈合方面有非常广泛的应用。聚乙二醇水凝胶由可交联的胺类聚乙二醇制备而成，作为合成聚乙二醇水凝胶的原料，可交联的胺类聚乙二醇的纯度影响着制备的水凝胶的品质，因此，提供一种检测可交联的胺类聚乙二醇的方法十分重要。
液相色谱法(HPLC)是一类常用的分离分析技术，在聚合物的分离表征方面发挥着越来越重要的作用。现有技术开发了多种针对聚乙二醇的检测方法，比如GB/T17830-1999《聚乙氧基化非离子表面活性剂中聚乙二醇含量的测定高效液相色谱法》，采用示差折光检测器进行测定；现有技术(聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子平均修饰度高效液相色谱法蒸发光散射检测方法的建立及验证[J].中国生物制品学杂质，2018，31(7):758-762)公开了采用HPLC-ELSD法测定经过蛋白酶K消化降解的重组人粒细胞刺激因子中游离的PEG和总PEG含量，色谱方法采用C4色谱柱，以0.1％三氟乙酸水溶液为流动相A，0.1％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B，线性梯度洗脱，但是前述方法难以针对性的检测胺类聚乙二醇纯度。
现有技术(Multi-arm PEG-maleimide conjugation intermediatecharacterization and hydrolysis study by a selective HPLC method)公开了表征多臂聚乙二醇-马来酰亚胺的方法，采用HPLC-DAD/CAD法，在相同的色谱条件下，比较了小分子马来氨酸和马来酰亚胺，以及高分子量(40kDa)聚合物PEG-NH2、PEG-OH和PEG-马来酰亚胺的保留行为。此方法能区分相同高分子量的聚乙二醇PEG-NH2、PEG-OH和PEG-马来酰亚胺，同时，现有技术没有披露如何能将多臂胺类聚乙二醇和未知杂质进行分离，难以针对性地检测多臂胺类聚乙二醇纯度的纯度。
因此，亟需开发针对性地检测多臂胺类聚乙二醇纯度方法，更好的解决多臂胺类聚乙二醇样品纯度检测问题及杂质控制问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种多臂胺类聚乙二醇纯度的检测方法，该方法可实现对原料药的质量控制。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面提供一种多臂胺类聚乙二醇纯度的检测方法，将多臂胺类聚乙二醇待测品溶解，加入二苯基环辛炔-琥珀酰亚胺酯、加入碱性试剂进行衍生，得到衍生化产物；
采用液相色谱法检测所述衍生化产物，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，采用体积比0.05～0.2％三氟乙酸水溶液为流动相A，体积比0.05～0.2％三氟乙酸甲醇为流动相B，进行洗脱，使用电喷雾检测器进行检测，计算得出多臂胺类聚乙二醇纯度。
所述流动相A可以为体积比0.05、0.1、0.15、0.2％的三氟乙酸水溶液；在本发明的一些具体实施例中，所述流动相A为体积比0.1的三氟乙酸水溶液。
进一步的，所述多臂胺类聚乙二醇，可以为3臂、4臂、6臂、8臂胺类聚乙二醇中任一种，优选为4臂胺类聚乙二醇。
进一步的，所述多臂胺类聚乙二醇分子量为18000～22000Da，包括但不限于18000Da、19000Da、20000Da、21000Da或22000Da。
进一步的，所述衍生的时间为0.5～2h，包括但不限于0.5、1.0、1.5、2.0h；优选为0.5h。
进一步的，所述二苯基环辛炔-琥珀酰亚胺酯与待测品质量比为大于等于2：1，包括但不限于2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1或8:1，优选为5:1。
进一步的，所述碱性试剂为胺类试剂，包括：甲胺、苯胺、乙二胺、二异丙胺、三乙醇胺、三乙胺或溴化四丁基铵中任一种，优选的，所述碱性试剂为三乙胺。
进一步的，所述洗脱为梯度洗脱，所述洗脱程序为：
0min，流动相A与流动相B体积之比为90：10；
0～2min，流动相A与流动相B体积之比按线性渐变为25：75，进行线性洗脱；
2～15min，流动相A与流动相B体积之比按线性渐变为20：80，进行线性洗脱；
15～22min，流动相A与流动相B体积之比为15：85，进行线性洗脱；
22～23min，流动相A与流动相B体积之比按线性渐变为10：90，进行线性洗脱；
23～25min，流动相A与流动相B体积之比为10：90，进行等度洗脱；
25～26min，流动相A与流动相B体积之比为90：10，进行线性洗脱；
26～35min，流动相A与流动相B体积之比为90：10，进行等度洗脱。
进一步的，所述色谱柱温度为38～42℃，包括但不限于38℃、39℃、40℃、41℃或42℃；和/或，所述色谱柱参数为4.6×100mm，2.5μm，
进一步的，所述方法的流动相的流速为0.8～2.0mL/min；包括但不限于0.8mL/min、0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min、1.2mL/min、1.3mL/min、1.4mL/min、1.5mL/min、1.6mL/min、1.7mL/min、1.8mL/min、1.9mL/min或2.0mL/min。
进一步的，所述液相色谱法的进样量为2～10μL，包括但不限于2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL或10μL、优选为5μL。
进一步的，所述液相色谱法采用外标法，通过高低浓度计算方法，在线性范围内更准确的检测了产品纯度。
本发明的有益效果：
(1)本发明针对多臂胺类聚乙二醇进行纯度检测，采用二苯基环辛炔-琥珀酰亚胺酯为衍生剂，其衍生后分子量差异大，增加了多臂胺类聚乙二醇检测的准确度。
(2)本发明的方法在系统适应性、专属性、检测性和定量性、线性范围、重复性等方面符合标准且具有较高耐用性。
附图说明
图1所示为空白溶液液相色谱图；
图2所示为4ARM胺类PEG样品定量限色谱图；
图3所示为4ARM胺类PEG样品溶液色谱图；
图4所示为4ARM胺类PEG对照品溶液线性关系图；
图5所示为不同衍生试剂的色谱图对比；
图6所示为不同衍生时间的对比；
图7A所示为主峰峰纯度图的光谱视图；
图7B所示为主峰峰纯度图的纯度视图，最小峰纯度相似度：1.0000，最小峰纯度阈值：0.99971；最小峰纯度指数：28；
图8为实施例4考察不同色谱柱分离效果的色谱叠加图。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
本发明中，术语“固定相”是将在色谱分离中固定不动、对样品产生保留的一相。
本发明中，术语“流动相”是指色谱过程中携带待测组分向前移动的物质。与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的另一相。
本发明中，术语“CAD检测器”是指电喷雾式检测器；
本发明中，术语“PEG”是指“聚乙二醇”；
本发明中，术语“C18”是指十八烷基键合硅胶为固定相的色谱柱；
本发明中，术语“LOQ”是指定量限；
本发明中，术语“4ARM胺类PEG”是指四臂胺类聚乙二醇，其结构通式为其分子量为18000～22000Da；
本发明中，术语“S/N”为信噪比，一般检测方法中，定量限的S/N要求大于10；
本发明中，术语“DNBC”是指二硝基苯甲酰氯；
本发明中，术语“DBCO-NHS”是指二苯基环辛炔-羟基琥珀酰亚胺。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1色谱条件
仪器方法：
仪器：岛津LC-40D xs高效液相色谱仪；
检测器：电喷雾检测器(CAD)，检测条件：Filter:10.0sec；Range:200PA；Temperature:35℃；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XselectPeptideCSH，C18，4.6×100mm，2.5μm，)；
流动相A：采用体积比0.1％三氟乙酸水溶液作为流动相A；
流动相B：采用体积比0.1％三氟乙酸甲醇溶液作为流动相B。
按如下表进行梯度洗脱：
表1洗脱程序
流速：1.0mL/min。
柱温：40℃。
进样量：2μL。
工作站：Labsolution。
空白溶液的制备：10mg二苯基环辛炔-琥珀酰亚胺酯(DBCO-NHS)置于10mL容量瓶中，加入适量二甲基亚砜溶解，加入50μL三乙胺，用二甲基亚砜定容至刻度，配制的空白溶液采用上述方法检测，谱图见图1。
对照品储备液：精密称定约100mg4ARM胺类PEG，置于10mL容量瓶中，加入适量二甲基亚砜溶解，再加入二甲基亚砜定容至刻度，摇匀，得到10mg/mL储备液1，准确移取1mL对照品储备液1置于10mL容量瓶中，加入二甲基亚砜定容至刻度，得到1mg/mL对照品储备液2。
所述4ARM胺类PEG的分子量为18000～22000，结构式通式如下：
线性对照品溶液：分别准确移取1mg/mL对照品储备液0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.5mL、0.8mL、1mL、2mL、3mL至预先装有10mg二苯基环辛炔-琥珀酰亚胺酯(DBCO-NHS)的10mL容量瓶中，加入适量二甲基亚砜溶解，各加入50μL三乙胺，用二甲基亚砜定容至刻度，摇匀，得到0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.08mg/mL、0.08mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL线性对照品溶液，静置半小时后上机待测。
样品溶液：精密称取50mg4ARM胺类PEG于10mL容量瓶中，加入10mg二苯基环辛炔-琥珀酰亚胺酯(DBCO-NHS)，加入50μL三乙胺，用二甲基亚砜定容至刻度，充分混匀溶解，作为100％供试品溶液，静置半小时后进样。准确量取上述100％供试品溶液1mL至100mL容量瓶中，加入空白衍生溶液定容至刻度，作为1％供试品溶液。
高低浓度法计算得到4ARM胺类PEG的纯度。
实施例2：不同衍生剂的筛选
本实施例参考实施例1的仪器方法进行检测，考察了分别经过同等添加量的DNBC、3-甲氧基-4-硝基苯甲酸-N-琥珀亚胺酯、DBCO-NHS三种衍生试剂的衍生过后的4ARM胺类PEG检测结果。
4ARM胺类PEG样品溶液的配制如下：精密称取30mg 4ARM胺类PEG于10mL容量瓶中，加入6mg衍生试剂，加入50μL三乙胺，用二甲基亚砜定容至刻度，充分混匀溶解，静置半小时后进样。
如图5所示，DBCO-NHS为衍生剂时，主峰附近杂质峰最少，对定量的干扰最小，而当采用3-甲氧基-4-硝基苯甲酸-N-琥珀亚胺酯作为衍生试剂时主峰附近还有杂质峰，可能影响定量，当采用DNBC作为衍生试剂时，色谱峰主峰前面出现包峰，有可能是主峰的相近的胺类杂质共洗脱造成的，杂质未能很好的分离，说明采用DNBC作为衍生剂定量仍不如DBCO-NHS作为衍生剂准确，因此选择DBCO-NHS为衍生剂。综上，选用苯环多的衍生剂效果更好，采用苯环多的衍生剂衍生后分子量差异大，因此最终选用了DBCO-NHS。
(由于本实施例主要考察衍生试剂——DNBC、3-甲氧基-4-硝基苯甲酸-N-琥珀亚胺酯和DBCO-NHS的种类对检测结果的影响，三种衍生试剂用量相等，因此，本实施例中三种衍生试剂统一称为衍生试剂)
实施例3：衍生时间的考察
参考实施例1的仪器方法进行检测，考察了4ARM胺类PEG样品的衍生时间，本实施例检测未衍生的样品，以及不同衍生时间的样品来考察最合适的衍生时间：
4ARM胺类PEG样品溶液的配制如下：精密称取50mg 4ARM胺类PEG于10mL容量瓶中，加入10mg二苯基环辛炔-琥珀酰亚胺酯(DBCO-NHS)，加入50μL三乙胺，用二甲基亚砜定容至刻度，充分混匀溶解，静置半小时后进样。
如图6所示，样品分别在衍生0.5h、1h、2h后进样，未衍生的样品峰的保留时间在3.5～4min之间，衍生的样品峰保留时间在14.5～15min之间，衍生和未衍生的样品峰保留时间差异较大，通过谱图叠加对比，发现衍生后的样品在未衍生样品峰处，无残留峰，并且，通过谱图叠加对比，衍生0.5h、1h、2h后保留时间均为14.5～15min，叠加后发现衍生0.5h、1h、2h后峰面积并无增加，因此可以认为0.5h内已经衍生完全，因此，衍生时间选择0.5h以上即可。
(为了清楚比较衍生时间，本发明将5组色谱图进行叠加，图5的色谱图为示意图，表示本发明的趋势)
实施例4不同色谱柱的考察
采用实施例1的色谱方法，对实施例1中的同一种样品进行分离，与实施例1的区别仅在于色谱柱的不同，考察了键合相为二甲基丁基硅烷(C4)、二甲基联苯(Biphenyl)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18)色谱柱的分离效果，具体的考察了如下色谱柱：
十八烷基硅烷键合硅胶(C18)：
Waters XselectPeptideCSH，C18，4.6×100mm，粒径2.5μm，孔径
二甲基丁基硅烷(C4)：
SHIMESENAnkylo C4-300S，C4，4.6×250mm，粒径5μm，孔径
HALO C41000A、C4，4.6×250mm，粒径2.7μm，孔径
Waters Symmetry 300TM C4粒径5μm,4.6mm×250mm，孔径
HALO Biphenyl 90A，4.6×250mm，粒径5μm，孔径
4ARM胺类PEG样品溶液的配制如下：精密称取50mg 4ARM胺类PEG于10mL容量瓶中，加入10mg二苯基环辛炔-琥珀酰亚胺酯(DBCO-NHS)，加入50μL三乙胺，用二甲基亚砜定容至刻度，充分混匀溶解，静置半小时后进样。
分别采用上述5种色谱柱对等量的4ARM胺类PEG样品进行分离，采用实施例1所述的仪器方法检测，结果如图8所示，在保留时间15min附近时，出现4ARM胺类PEG的色谱峰，发现键合相为十八烷基硅烷键合硅胶(C18)色谱柱分离效果最好，能够分离出杂质峰，其他色谱柱不能分离4ARM胺类PEG中的杂质。
(为了清楚比较这几中色谱柱的分离效果，本发明将5组色谱图进行叠加，图8的色谱图为示意图，表示本发明的趋势)
实施例5方法验证
对实施例1的方法进行验证，线性对照品溶液如实施例1方法配制，线性关系为图4和表2所示，线性方程为y＝4,617,842.2007x-20,059.4296，说明4ARM胺类PEG在0.010032～0.30096mg/mL(质量浓度为0.2％～6％)范围内，响应关系呈线性，R2＝0.9996，满足线性要求。
图1所示为空白溶液(实施例1配制)，采用实施例1所述的方法检测，从图中可以看出，本实施例的空白溶液无干扰。
图2所示为本发明定量限的色谱图，定量限为0.01mg/mL，保留时间为14.854min，面积为30810，高度为1368，S/N为14.45。
表2 4ARM胺类PEG线性结果
图3所示为4ARM胺类PEG样品溶液色谱图，样品溶液为实施例1配制的100％供试品溶液和1％供试品溶液，排除掉低于定量限的杂质峰后，采用高低浓度法计算：
具体的，本发明的高低浓度法为：100％供试品溶液和1％供试品溶液同时进样，100％供试品溶液计算的是除主峰以外的含量，1％用于计算主峰，即主峰×100为主峰峰面积，具体公式如下：
总峰面积＝1％主峰面积×100+SUM(各杂质峰面积)；
杂质含量＝杂质峰面积/总峰面积；
主峰含量＝1-SUM(杂质含量)；
计算结果如表3所示。
表3 4ARM胺类PEG杂质含量
其中峰10为4ARM胺类PEG的色谱峰，其余峰为杂质峰，图3可以看出，本发明方法可以很好的将4ARM胺类PEG和其他胺类杂质进行分离，能够很好的检测4ARM胺类PEG的纯度。
综上所述，本发明能准确检测4ARM胺类PEG的纯度，在系统适应性、专属性、检测性和定量性、线性范围、重复性等方面符合标准且具有较高耐用性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种多臂胺类聚乙二醇纯度的检测方法，其特征在于，将多臂胺类聚乙二醇待测品溶解，加入二苯基环辛炔-琥珀酰亚胺酯、加入碱性试剂进行衍生，得到衍生化产物；
采用液相色谱法检测所述衍生化产物，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，采用体积比0.05～0.2％三氟乙酸水溶液为流动相A，体积比0.05～0.2％三氟乙酸甲醇为流动相B进行洗脱，使用电喷雾检测器进行检测，计算得出多臂胺类聚乙二醇纯度。
2.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述多臂胺类聚乙二醇包括3臂、4臂、6臂、8臂胺类聚乙二醇中任一种，优选为4臂胺类聚乙二醇。
3.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述多臂胺类聚乙二醇分子量为18000～22000Da。
4.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述衍生的时间为0.5～2h；优选为0.5h。
5.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述二苯基环辛炔-琥珀酰亚胺酯与待测品质量比大于等于2：1，优选为5:1。
6.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述碱性试剂为胺类试剂，包括：甲胺、苯胺、乙二胺、二异丙胺、三乙醇胺、三乙胺或溴化四丁基铵中任一种，优选的，所述碱性试剂为三乙胺。
7.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述洗脱为梯度洗脱，所述洗脱程序为：
0min，流动相A与流动相B体积之比为90：10；
0-2min，流动相A与流动相B体积之比按线性渐变为25：75，进行线性洗脱；
2～15min，流动相A与流动相B体积之比按线性渐变为20：80，进行线性洗脱；
15～22min，流动相A与流动相B体积之比为15：85，进行线性洗脱；
22～23min，流动相A与流动相B体积之比按线性渐变为10：90，进行线性洗脱；
23～25min，流动相A与流动相B体积之比为10：90，进行等度洗脱；
25～26min，流动相A与流动相B体积之比为90：10，进行线性洗脱；
26～35min，流动相A与流动相B体积之比为90：10，进行等度洗脱。
8.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述色谱柱温度为38～42℃；和/或，所述色谱柱参数为4.6×100mm，2.5μm，
9.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述方法的流动相的流速为0.8～2.0mL/min。
10.如权利要求1所述的纯度检测方法，其特征在于，所述液相色谱法的进样量为2～10μL，优选为5μL。
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