CN116917325A - 用于治疗癌症的被掩蔽的ctla4和pd1/pdl1抗体的组合 - Google Patents

用于治疗癌症的被掩蔽的ctla4和pd1/pdl1抗体的组合 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于治疗癌症的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，抗体、双特异性抗体和嵌合受体)与PD‑1信号传导剂(例如，PD‑1抑制剂或PD‑L1抑制剂)的组合，以及包含所述可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白和PD‑1信号传导剂的组合物和试剂盒。

Description

用于治疗癌症的被掩蔽的CTLA4和PD1/PDL1抗体的组合
申请的交叉引用
本申请要求2021年3月1日提交的美国临时申请号63/155,168的优先权和权益，所述专利的内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及可活化的被掩蔽的抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)结合蛋白(例如，抗CTLA4抗体)和与使用所述结合蛋白与PD-1信号传导剂(例如，PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂)的组合有关的方法。
背景技术
在美国，癌症是排名第二的主要死亡原因，引起比随后的五种主要原因(慢性呼吸道疾病、中风、事故、阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)和糖尿病)更多的死亡。尽管已经取得长足进步，尤其在靶向疗法方面，但这一领域中仍有大量工作要做。免疫疗法和这一领域的分支，免疫肿瘤学，正在产生用于治疗恶性病的可行且令人振奋的治疗选项。具体而言，现在认识到癌症的一个特点是免疫逃避，并且已进行了大量努力来识别靶标并开发针对这些靶标的疗法，以重新活化免疫系统来识别和治疗癌症。抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)抗体伊匹单抗(Ipilimumab)已使得患有III/IV期恶性黑素瘤的患者长期存活。伊匹单抗是一种免疫检查点拮抗剂，其通过阻断CTLA4来中断T细胞的抑制，并可能导致T调节细胞(Treg)耗竭。[Korman,A.等人,2005.《肿瘤免疫疗法：抗CTLA4抗体的临床前和临床活性(Tumor immunotherapy:preclinical and clinical activity of anti-CTLA4antibodies)》.《对研究药物的当前观点(Current Opinion in Investigational Drugs)》6:582-591；Quezada等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》,206(8):1717-1725,2009；Selby等人,《癌症免疫研究(Cancer Immunol Res.)》,1(1)；32-42,2013。]不幸的是，伊派利单抗引起T细胞依赖性免疫反应的全身性(非肿瘤特异性)活化，其引起可危及生命且通常限制剂量和治疗持续时间的免疫相关副作用(Weber,J.S.等人,2008.《转移性黑素瘤患者中的伊派利单抗的I/II期研究(Phase I/II study of ipilimumab for patients withmetastatic melanoma)》.《临床肿瘤学杂志(Journal of Clinical Oncology)》26:5950-5956)。这些副作用包括小肠结肠炎、皮炎、垂体炎、葡萄膜炎、肝炎、肾炎和死亡。小肠结肠炎是最常见的主要毒性(影响约20％的患者)。与免疫介导的不良反应相关的严重安全性风险促使FDA批准对伊派利单抗实施风险评估和缓解策略(Risk Evaluation andMitigation Strategy；REMS)。最近，已证实当与单独的伊派利单抗相比时，伊派利单抗和靶向PD1的第二免疫检查点调节剂(例如，尼沃单抗(nivolumab))的共同施用可显著提高黑素瘤的免疫疗法的功效。然而，这一增益与3/4级副作用的发生率增加相关联，所述副作用影响超过50％的接受组合治疗的患者(Wolchok,J.D.等人,2013.《晚期黑素瘤中的尼沃单抗加伊派利单抗(Nivolumab plus Ipilimumab in Advanced Melanoma)》.《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》)。
这些结果说明需要研发可有效靶向肿瘤而不引起与全身性免疫活化相关联的副作用的抗CTLA4蛋白质治疗剂。本文中提供用于解决这一需求的抗CTLA结合蛋白、其组合物以及其使用方法。
本文中所引用的所有参考文献，包含专利申请案、专利案公开案和科学文献，都以全文引用的方式并入本文中，就像各个参考文献特别地且单独地被指示为以引用的方式并入一般。
发明内容
本文提供了将可活化的被掩蔽的抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)结合蛋白与PD-1信号传导剂(例如，PD-1或PD-L1抑制剂)组合使用的方法，以及包含它们的组合物。
在一方面，本发明提供了一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用有效剂量的：(a)被掩蔽的抗CTLA4抗体，其包含选自由SEQ ID NO:1-46组成的群组的掩蔽肽以及可裂解肽接头；和(b)PD-1或PD-L1抑制剂。
在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体包含可裂解肽接头，所述接头包含选自由SEQ ID NO:47-88、464-469和479-508组成的群组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，可裂解肽接头包含连接至可裂解肽接头氨基端的选自由SEQID NO:89-112和415-420组成的群组的间隔区，和连接至可裂解肽接头羧基端的选自由SEQID NO:89-112和415-420组成的群组的间隔区。
在一些实施方案中，可裂解肽接头包含选自由SEQ ID NO:454-462组成的群组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体包含选自由SEQ ID NO:113-231和444-453组成的群组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体是人源化抗体、嵌合抗体、人抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体包含含有NYFMN的重链可变区(vH)CDR1、含有RVDPEQGRADYAEKFKK的vH CDR2、含有RAMDNYGFAY的vH CDR2、含有SANSALSYMY的轻链可变区(vL)CDR1、含有GTSNLAS的vL CDR2、含有HHWSNTQWT的vL CDR3。
在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体的有效剂量在约0.1-10mg/kg、0.1-15mg/kg、0.1-20mg/kg、0.3-10mg/kg、0.3-15mg/kg、0.3-20mg/kg之间。
在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体的有效剂量选自0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg和20mg/kg。
在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体的有效剂量为1-100mg、10-100mg、20-100mg、30-100、50-100、4-100mg、4-200mg、4-300mg、4-400mg、4-500mg、4-600mg、4-700mg、4-800mg、4-900mg、10-100mg、10-200mg、10-300mg、10-400mg、10-500mg、10-600mg、10-700mg、10-800mg、10-900mg、10-1000mg、100-300mg、300-500mg、500-700mg、700-900mg或800-1000mg。
在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体以低剂量施用。在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体以0.01-1mg/kg之间的剂量施用。在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体以0.01-3mg/kg之间的剂量施用。在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体以选自以下的剂量施用：0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、3mg/kg。
在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体包含含有氨基酸取代S239D或I332E或两者的重链恒定结构域，其中氨基酸残基根据Kabat中的EU索引编号。
在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体包含与SEQ ID NO:324具有至少90％同一性的vH。
在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体包含与SEQ ID NO:322具有至少90％同一性的vL。
在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体是非岩藻糖基化的或缺乏岩藻糖的。
在一些实施方案中，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段与药剂结合。在一些实施方案中，所述药剂是微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂或DNA合成抑制剂。在一些实施方案中，所述药剂是美登木素生物碱、瑞奥西汀(auristatin)、吡咯并苯并二氮杂(PBD)二聚体、卡奇霉素(calicheamicin)、倍癌霉素(duocarmycin)、吲哚-邻苯并二氮杂/>二聚体或依喜替康(exatecan)衍生物Dxd。
在一些实施方案中，PD-1或PD-L1抑制剂是抗体。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂是PD-1抗体。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自尼沃单抗、派姆单抗(pembrolizumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、多塔利单抗(dostarlimab)。
在一些实施方案中，PD-1抗体的有效剂量在1-10mg/kg之间。
在一些实施方案中，PD-1抗体的有效剂量是10mg/kg。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体以4-400mg、4-500mg、4-600mg、4-700mg、4-800mg、4-900mg或4-1000mg的有效剂量施用。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体以200mg的有效剂量施用。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体以1000mg的有效剂量施用。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体每周、每隔一周、每3周、每4周、每6周或每月施用一次。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体每3周施用一次。
在一些实施方案中，PD-1/PD-L1抑制剂是PD-L1抗体。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体选自阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体以200-2000mg之间的有效剂量施用。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体每周、每隔一周、每3周、每4周、每6周或每月施用一次。
在一些实施方案中，PD1或PD-L1抑制剂和被掩蔽的抗CTLA4抗体被配制用于静脉内施用。
在一些实施方案中，PD1或PD-L1抑制剂和被掩蔽的抗CTLA4抗体被配制在一起。
在一些实施方案中，PD1或PD-L1抑制剂和被掩蔽的抗CTLA4抗体分开配制。
在一些实施方案中，PD1或PD-L1抑制剂与被掩蔽的抗CTLA4抗体同时施用。
在一些实施方案中，癌症是白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、骨髓瘤、乳腺癌、神经母细胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌、睾丸癌或皮肤鳞状细胞癌(CSCC)。
在一些实施方案中，癌症是小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)。
在一些实施方案中，癌症为黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、胸膜间皮瘤、肾癌、肝癌或结肠直肠癌。
在一些实施方案中，本文中提供与CTLA4结合的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含第一链和第二链，并且掩蔽肽包含选自SEQ ID NO:1-46的氨基酸序列，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至抗体或其抗原结合片段的第一链或第二链的氨基端或羧基端。在一些实施方案中，第一链是轻链；且第二链是重链。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段含有两个第一链和两个第二链。在一些实施方案中，第一链是或包含轻链可变结构域；且第二链是或包含重链可变结构域。在任何这类实施方案中的一些中，抗原结合片段是dAb、Fab、Fab′-SH、Fv、scFv或(Fab′)2片段。在任何这类实施方案中的一些中，掩蔽肽的氨基端或羧基端连接至包含可裂解肽的接头。在任何这类实施方案中的一些中，包含可裂解肽的接头含有间隔接头和可裂解肽。在任何这类实施方案中的一些中，可裂解肽含有选自SEQ ID NO:47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在任何这类实施方案中的一些中，间隔接头直接连接至可裂解肽的N端和/或C端。在任何这类实施方案中的一些中，间隔接头含有选自SEQ ID NO:89-112和415-420的氨基酸序列。在任何这类实施方案中的一些中，至少一个氨基酸，但不超过20个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在任何这类实施方案中的一些中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。
在任何这类实施方案中的一些中，被掩蔽的抗体在N端至C端方向或在C端至N端方向含有：a)掩蔽肽；b)可裂解肽；和c)结合CTLA4的抗体或其抗原结合片段。在任何这类实施方案中的一些中，被掩蔽的抗体在掩蔽肽与可裂解肽之间含有间隔接头；并且被掩蔽的抗体在可裂解肽与结合CTLA4的抗体或其抗原结合片段之间含有间隔接头。
在任何这类实施方案中的一些中，抗体是鼠类抗体。在任何这类实施方案中的一些中，抗体是人类化抗体、嵌合抗体或人类抗体。在任何这类实施方案中的一些中，抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在任何这类实施方案中的一些中，IgG1含有氨基酸取代，S298A、E333A和K334A；S239D和I332E；S239D、A330L和I332E；P247I和A339D或A339Q；D280H、K290S(在存在或不存在S298D或S298V的情况下)；F243L、R292P和Y300L；F243L、R292P、Y300L和P396L；F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；G236A、S239D和I332E；K326A和E333A；K326W和E333S；或K290E或K290N、S298G、T299A和/或K326E；其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。
在任何这类实施方案中的一些中，抗体或其抗原结合片段含有轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区含有(i)包含SEQ ID NO:402或408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:403或409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:404或410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区含有(i)包含SEQ ID NO:405或411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:406或412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:407或413的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施方案中的一些中，抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列的重链可变区。
在任何这类实施方案中的一些中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQID NO:403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO:406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:407的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:404的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:407的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施方案中的一些中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQID NO:433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:444的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO:436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:437的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施方案中的一些中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:434的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:437的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施方案中的一些中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQID NO:409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO:412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:413的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施方案中的一些中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:410的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:413的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施方案中的一些中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQID NO:439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO:442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:443的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施方案中的一些中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:440的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:443的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施方案中的一些中，抗体含有包含选自SEQ ID NO:237-318的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO:319或320的氨基酸序列的重链。在任何这类实施方案中的一些中，抗体或抗原结合片段含有包含选自SEQ ID NO:321或322的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO:323或324的氨基酸序列的重链可变区。在任何这类实施方案中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO:323的氨基酸序列的重链可变区。在任何这类实施方案中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列的重链可变区。
在任何这类实施方案中的一些中，抗体含有包含选自SEQ ID NO:327-341的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO:366-380、421和478的氨基酸序列的重链。在任何这类实施方案中的一些中，抗体含有包含选自SEQ ID NO:327、334或342-365的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO:366或380-397的氨基酸序列的重链。在任何这类实施方案中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO:327的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:366的氨基酸序列的重链。在任何这类实施方案中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO:327的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:478的氨基酸序列的重链。在任何这类实施方案中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ IDNO:334的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:380的氨基酸序列的重链。在任何这类实施方案中的一些中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:421的氨基酸序列的重链。
在任何这类实施方案中的一些中，可裂解肽是蛋白酶的底物，其与表达CTLA4的细胞或组织共定位在一个区域中。在任何这类实施方案中的一些中，可裂解肽被一种或多种选自由以下组成的群组的酶切割：ABHD12,ADAM12,ABHD12B,ABHD13,ABHD17A,ADAM19,ADAM20,ADAM21,ADAM28,ADAM30,ADAM33,ADAM8,ABHD17A,ADAMDEC1,ADAMTS1,ADAMTS10,ADAMTS12,ADAMTS13,ADAMTS14,ADAMTS15,ADAMTS16,ADAMTS17,ADAMTS18,ADAMTS19,ADAMTS2,ADAMTS20,ADAMTS3,ADAMTS4,ABD17B,ADAMTS5,ADAMTS6,ADAMTS7,ADAMTS8,ADAMTS9,ADAMTSL1,ADAMTSL2,ADAMTSL3,ABHD17C,ADAMTSL5,ASTL,BMP1,CELA1,CELA2A,CELA2B,CELA3A,CELA3B,ADAM10,ADAM15,ADAM17,ADAM9,ADAMTS4,CTSE,CTSF,ADAMTSL4,CMA1,CTRB1,CTRC,CTSO,CTRl,CTSA,CTSW,CTSB,CTSC,CTSD,ESP1,CTSG,CTSH,GZMA,GZMB,GZMH,CTSK,GZMM,CTSL,CTSS,CTSV,CTSZ,HTRA4,KLK10,KLK11,KLK13,KLK14,KLK2,KLK4,DPP4,KLK6,KLK7,KLKB1,ECE1,ECE2,ECEL1,MASP2,MEP1A,MEP1B,ELANE,FAP,GZMA,MMP11,GZMK,HGFAC,HPN,HTRA1,MMP11,MMP16,MMP17,MMP19,HTRA2,MMP20,MMP21,HTRA3,HTRA4,KEL,MMP23B,MMP24,MMP25,MMP26,MMP27,MMP28,KLK5,MMP3,MMP7,MMP8,MMP9,LGMN,LNPEP,MASP1,PAPPA,PAPPA2,PCSK1,NAPSA,PCSK5,PCSK6,MME,MMP1,MMP10,PLAT,PLAU,PLG,PRSS1,PRSS12,PRSS2,PRSS21,PRSS3,PRSS33,PRSS4,PRSS55,PRSS57,MMP12,PRSS8,PRSS9,PRTN3,MMP13,MMP14,ST14,TMPRSS10,TMPRSS11A,TMPRSS11D,TMPRSS11E,TMPRSS11F,TMPRSS12,TMPRSS13,MMP15,TMPRSS15,MMP2,TMPRSS2,TMPRSS3,TMPRSS4,TMPRSS5,TMPRSS6,TMPRSS7,TMPRSS9,NRDC,OVCH1,PAMR1,PCSK3,PHEX,TINAG,TPSAB1,TPSD1,和TPSG1。
在任何这类实施方案中的一些中，可裂解肽被一种或多种选自由以下组成的群组的酶切割：:ADAM17,HTRA1,PRSS1,FAP,GZMK,NAPSA,MMP1,MMP2,MMP9,MMP10,MMP7,MMP12,MMP28,ADAMTS9、HGFAC和HTRA3。在任何这类实施方案中的一些中，抗体或其抗原结合片段与药剂结合。在任何这类实施方案中的一些中，药物是微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂或DNA合成抑制剂。在任何这类实施方案中的一些中，药剂是美登木素生物碱、瑞奥西汀、吡咯并苯并二氮杂(PBD)二聚体、卡奇霉素、倍癌霉素、吲哚-邻苯并二氮杂/>二聚体或依喜替康衍生物Dxd。
在任何这类实施方案中的一些中，本文中所提供的被掩蔽的抗体呈现约20至约10,000的最佳遮挡率。在另一实施方案中，最佳遮挡率是约20至约1,000。在另一实施方案中，最佳遮挡率是约80至约100。
在任何这类实施方案中的一些中，被掩蔽的抗体包含SEQ ID NO:421的氨基酸序列，且包含选自由SEQ ID NO:358和422-431组成的群组的氨基酸序列。
本文中还提供被掩蔽的双特异性抗体，其含有特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链、特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链以及包含选自SEQ ID NO:1-46的氨基酸序列的掩蔽肽，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至第一对的轻链或重链的氨基端或羧基端。在一些实施方案中，掩蔽肽的氨基端或羧基端连接至包含可裂解肽的接头。在任何这类实施方案中的一些中，包含可裂解肽的接头含有间隔接头和可裂解肽。
在任何这类实施方案中的一些中，可裂解肽含有选自SEQ ID NO:47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在任何这类实施方案中的一些中，间隔接头直接连接至可裂解肽的N端或C端。在任何这类实施方案中的一些中，间隔接头含有选自SEQ ID NO:89-112和415-420的氨基酸序列。在任何这类实施方案中的一些中，至少一个氨基酸，但不超过20个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在任何这类实施方案中的一些中，所述至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。
在任何这类实施方案中的一些中，按N至C端或C至N端方向，第一对的轻链或重链含有：a)掩蔽肽；b)可裂解肽；和c)轻链或重链。在任何这类实施方案中的一些中，第一对含有掩蔽肽与可裂解肽之间的间隔接头；且第一对含有可裂解肽与轻链或重链之间的间隔接头。
在任何这类实施方案中的一些中，双特异性抗体是鼠类抗体。在任何这类实施方案中的一些中，双特异性抗体是人类化抗体、嵌合抗体或人类抗体。在任何这类实施方案中的一些中，双特异性抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在任何这类实施方案中的一些中，IgG1含有氨基酸取代，如S298A、E333A和K334A；S239D和I332E；S239D、A330L和I332E；P247I和A339D或A339Q；D280H、K290S(在存在或不存在S298D或S298V的情况下)；F243L、R292P和Y300L；F243L、R292P、Y300L和P396L；F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；G236A、S239D和I332E；K326A和E333A；K326W和E333S；或K290E或K290N、S298G、T299A和/或K326E；其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。
在任何这类实施方案中的一些中，第一对含有轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区含有(i)包含SEQ ID NO:402或408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:403或409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:404或410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区含有(i)包含SEQ ID NO:405或411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:406或412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:407或413的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施方案中的一些中，第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:407的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQID NO:404的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:407的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施方案中的一些中，第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:444的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:437的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施方案中的一些中，第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQID NO:432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:434的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:437的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施方案中的一些中，第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:413的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施方案中的一些中，第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQID NO:408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:410的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:413的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施方案中的一些中，第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:443的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施方案中的一些中，第一对包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQID NO:438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:440的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:443的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施方案中的一些中，第一对含有包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列的重链可变区。在任何这类实施方案中的一些中，第一对含有包含选自SEQ ID NO:237-318的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO:319或320的氨基酸序列的重链。在任何这类实施方案中的一些中，第一对含有包含选自SEQ ID NO:321或322的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含选自SEQ IDNO:323或324的氨基酸序列的重链可变区。在任何这类实施方案中的一些中，第一对包含有包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO:323的氨基酸序列的重链可变区。在任何这类实施方案中的一些中，第一对包含有包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列的重链可变区。
在任何这类实施方案中的一些中，第一对含有包含选自SEQ ID NO:327-341的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO:366-380、421和478的氨基酸序列的重链。在任何这类实施方案中的一些中，第一对含有包含选自SEQ ID NO:327、334或342-365的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO:366或380-397的氨基酸序列的重链。在任何这类实施方案中的一些中，第一对包含有包含SEQ ID NO:327的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ IDNO:366的氨基酸序列的重链。在任何这类实施方案中的一些中，第一对包含有包含SEQ IDNO:327的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:478的氨基酸序列的重链。在任何这类实施方案中的一些中，第一对包含有包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ IDNO:380的氨基酸序列的重链。在任何这类实施方案中的一些中，第一对包含有包含SEQ IDNO:334的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:421的氨基酸序列的重链。
在任何这类实施方案中的一些中，可裂解肽是蛋白酶的底物，其与表达CTLA4的细胞或组织共定位在一个区域中。在一些任何此类实施方案中，可裂解肽被一种或多种选自由以下组成的群组的酶切割：:ABHD12,ADAM12,ABHD12B,ABHD13,ABHD17A,ADAM19,ADAM20,ADAM21,ADAM28,ADAM30,ADAM33,ADAM8,ABHD17A,ADAMDEC1,ADAMTS1,ADAMTS10,ADAMTS12,ADAMTS13,ADAMTS14,ADAMTS15,ADAMTS16,ADAMTS17,ADAMTS18,ADAMTS19,ADAMTS2,ADAMTS20,ADAMTS3,ADAMTS4,ABD17B,ADAMTS5,ADAMTS6,ADAMTS7,ADAMTS8,ADAMTS9,ADAMTSL1,ADAMTSL2,ADAMTSL3,ABHD17C,ADAMTSL5,ASTL,BMP1,CELA1,CELA2A,CELA2B,CELA3A,CELA3B,ADAM10,ADAM15,ADAM17,ADAM9,ADAMTS4,CTSE,CTSF,ADAMTSL4,CMA1,CTRB1,CTRC,CTSO,CTRl,CTSA,CTSW,CTSB,CTSC,CTSD,ESP1,CTSG,CTSH,GZMA,GZMB,GZMH,CTSK,GZMM,CTSL,CTSS,CTSV,CTSZ,HTRA4,KLK10,KLK11,KLK13,KLK14,KLK2,KLK4,DPP4,KLK6,KLK7,KLKB1,ECE1,ECE2,ECEL1,MASP2,MEP1A,MEP1B,ELANE,FAP,GZMA,MMP11,GZMK,HGFAC,HPN,HTRA1,MMP11,MMP16,MMP17,MMP19,HTRA2,MMP20,MMP21,HTRA3,HTRA4,KEL,MMP23B,MMP24,MMP25,MMP26,MMP27,MMP28,KLK5,MMP3,MMP7,MMP8,MMP9,LGMN,LNPEP,MASP1,PAPPA,PAPPA2,PCSK1,NAPSA,PCSK5,PCSK6,MME,MMP1,MMP10,PLAT,PLAU,PLG,PRSS1,PRSS12,PRSS2,PRSS21,PRSS3,PRSS33,PRSS4,PRSS55,PRSS57,MMP12,PRSS8,PRSS9,PRTN3,MMP13,MMP14,ST14,TMPRSS10,TMPRSS11A,TMPRSS11D,TMPRSS11E,TMPRSS11F,TMPRSS12,TMPRSS13,MMP15,TMPRSS15,MMP2,TMPRSS2,TMPRSS3,TMPRSS4,TMPRSS5,TMPRSS6,TMPRSS7,TMPRSS9,NRDC,OVCH1,PAMR1,PCSK3,PHEX,TINAG,TPSAB1,TPSD1和TPSG1。在任何这类实施方案中的一些中，可裂解肽被一种或多种选自由以下组成的群组的酶切割：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC和HTRA3。在任何这类实施方案中的一些中，双特异性抗体与药剂结合。在任何这类实施方案中的一些中，药物是微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂或DNA合成抑制剂。在任何这类实施方案中的一些中，药剂是美登木素生物碱、瑞奥西汀、吡咯并苯并二氮杂(PBD)二聚体、卡奇霉素、倍癌霉素、吲哚-邻苯并二氮杂/>二聚体或依喜替康衍生物Dxd。
在任何这类实施方案中的一些中，本文提供的第一对和第二对被掩蔽的双特异性抗体各自表现出最佳的遮挡率，其可以彼此相同或不同。在一些实施方案中，最佳遮挡率是约20至约10,000。在另一实施方案中，最佳遮挡率是约20至约1,000。在另一实施方案中，最佳遮挡率是约80至约100。
本文中还提供被掩蔽的嵌合受体，其含有结合于CTLA4的配体结合结构域，其包含第一链和第二链；掩蔽肽，其包含选自SEQ ID NO:1-46的氨基酸序列、跨膜结构域；和细胞内信号传导结构域，其包含信号传导结构域，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至配体结合结构域的第一链或第二链的氨基端或羧基端。
在一些实施方案中，第一链是轻链可变结构域；且第二链是重链可变结构域。在一些实施方案中，掩蔽肽的氨基端或羧基端连接至包含可裂解肽的接头。在任何这类实施方案中的一些中，包含可裂解肽的接头含有间隔接头和可裂解肽。在任何这类实施方案中的一些中，可裂解肽含有选自SEQ ID NO:47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在任何这类实施方案中的一些中，间隔接头直接连接至可裂解肽的N端或C端。在任何这类实施方案中的一些中，间隔接头含有选自SEQ ID NO:89-112和415-420的氨基酸序列。在任何这类实施方案中的一些中，至少一个氨基酸，但不超过20个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在任何这类实施方案中的一些中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在任何这类实施方案中的一些中，按N至C端或C至N端方向，配体结合结构域的第一链或第二链含有：a)掩蔽肽；b)可裂解肽；和c)第一链或第二链。在任何这类实施方案中的一些中，配体结合结构域含有掩蔽肽与可裂解肽之间的间隔接头；且配体结合结构域含有可裂解肽与第一链或第二链之间的间隔接头。
在任何这类实施方案中的一些中配体结合结构域含有第一链和第二链，其中第一链含有(i)包含SEQ ID NO:402或408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:403或409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:404或410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中第二链含有(i)包含SEQ ID NO:405或411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO:406或412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:407或413的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施方案中的一些中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO:402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或第二链包含(i)包含SEQ ID NO:405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:407的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO:402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:404的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO:405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQID NO:406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:407的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施方案中的一些中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO:432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:444的氨基酸序列的CDR-L3；和/或第二链包含(i)包含SEQ ID NO:435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:437的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施方案中的一些中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO:432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ IDNO:434的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO:435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:437的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施方案中的一些中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO:408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或第二链包含(i)包含SEQ ID NO:411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:413的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施方案中的一些中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO:408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ IDNO:410的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO:411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:413的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施方案中的一些中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO:438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或第二链包含(i)包含SEQ ID NO:441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:443的氨基酸序列的CDR-H3。在任何这类实施方案中的一些中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO:438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ IDNO:440的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO:441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO:442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:443的氨基酸序列的CDR-H3。
在任何这类实施方案中的一些中，第一链含有SEQ ID NO:232的氨基酸序列；和/或第二链含有SEQ ID NO:233的氨基酸序列。在任何这类实施方案中的一些中，第一链含有选自SEQ ID NO:321或322的氨基酸序列；和/或第二链含有选自SEQ ID NO:323或324的氨基酸序列。在任何这类实施方案中的一些中，第一链包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列，且第二链包含SEQ ID NO:323的氨基酸序列。在任何这类实施方案中的一些中，第一链包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列，且第二链包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列。在任何这类实施方案中的一些中，可裂解肽是蛋白酶的底物，其与表达CTLA4的细胞或组织共定位在一个区域中。
在任何这类实施方案中的一些中，可裂解肽被一种或多种选自由以下组成的群组的酶切割：ABHD12,ADAM12,ABHD12B,ABHD13,ABHD17A,ADAM19,ADAM20,ADAM21,ADAM28,ADAM30,ADAM33,ADAM8,ABHD17A,ADAMDEC1,ADAMTS1,ADAMTS10,ADAMTS12,ADAMTS13,ADAMTS14,ADAMTS15,ADAMTS16,ADAMTS17,ADAMTS18,ADAMTS19,ADAMTS2,ADAMTS20,ADAMTS3,ADAMTS4,ABD17B,ADAMTS5,ADAMTS6,ADAMTS7,ADAMTS8,ADAMTS9,ADAMTSL1,ADAMTSL2,ADAMTSL3,ABHD17C,ADAMTSL5,ASTL,BMP1,CELA1,CELA2A,CELA2B,CELA3A,CELA3B,ADAM10,ADAM15,ADAM17,ADAM9,ADAMTS4,CTSE,CTSF,ADAMTSL4,CMA1,CTRB1,CTRC,CTSO,CTRl,CTSA,CTSW,CTSB,CTSC,CTSD,ESP1,CTSG,CTSH,GZMA,GZMB,GZMH,CTSK,GZMM,CTSL,CTSS,CTSV,CTSZ,HTRA4,KLK10,KLK11,KLK13,KLK14,KLK2,KLK4,DPP4,KLK6,KLK7,KLKB1,ECE1,ECE2,ECEL1,MASP2,MEP1A,MEP1B,ELANE,FAP,GZMA,MMP11,GZMK,HGFAC,HPN,HTRA1,MMP11,MMP16,MMP17,MMP19,HTRA2,MMP20,MMP21,HTRA3,HTRA4,KEL,MMP23B,MMP24,MMP25,MMP26,MMP27,MMP28,KLK5,MMP3,MMP7,MMP8,MMP9,LGMN,LNPEP,MASP1,PAPPA,PAPPA2,PCSK1,NAPSA,PCSK5,PCSK6,MME,MMP1,MMP10,PLAT,PLAU,PLG,PRSS1,PRSS12,PRSS2,PRSS21,PRSS3,PRSS33,PRSS4,PRSS55,PRSS57,MMP12,PRSS8,PRSS9,PRTN3,MMP13,MMP14,ST14,TMPRSS10,TMPRSS11A,TMPRSS11D,TMPRSS11E,TMPRSS11F,TMPRSS12,TMPRSS13,MMP15,TMPRSS15,MMP2,TMPRSS2,TMPRSS3,TMPRSS4,TMPRSS5,TMPRSS6,TMPRSS7,TMPRSS9,NRDC,OVCH1,PAMR1,PCSK3,PHEX,TINAG,TPSAB1,TPSD1和TPSG1。在任何这类实施方案中的一些中，可裂解肽被一种或多种选自由以下组成的群组的酶切割：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC和HTRA3。
在任何这类实施方案中的一些中，本文中所提供的被掩蔽的嵌合受体呈现约20至约10,000的最佳遮挡率。在另一实施方案中，最佳遮挡率是约20至约1,000。在另一实施方案中，最佳遮挡率是约80至约100。
还提供编码根据前述实施方案中的任一个的被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体的核酸。还提供包含根据前述实施方案的核酸的载体。在一些实施方案中，载体是表达载体。还提供包含前述核酸实施方案的宿主细胞。
还提供用于制备被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体的方法，其包含在产生所述被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体的条件下培养前述宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞具有α1,6-岩藻糖基转移酶(Fut8)敲除。在一些实施方案中，其中宿主细胞过表达β1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnT-III)。在一些实施方案中，宿主细胞另外地过表达高尔基体μ-甘露糖苷酶II(ManII)。任何这类实施方案中的一些还包括回收由宿主细胞产生的被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体。在一些实施方案中，通过上述方法产生被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体。
还提供一种组合物，其含有根据前述实施方案中的任一个的被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体。一些实施方案涵盖包含根据前述实施方案的被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体或被掩蔽的嵌合受体的组合物。在一些实施方案中，组合物是医药组合物。
还提供一种试剂盒，其含有根据前述实施方案中的任一个的被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体、被掩蔽的嵌合受体或组合物。
还提供用于治疗或预防受试者中的赘生性疾病的方法，所述方法包含向受试者给予有效量的根据前述实施方案中的任一个的被掩蔽的抗体、被掩蔽的双特异性抗体、被掩蔽的嵌合受体或组合物。在一个实施方案中，赘生性疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症是白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、乳癌、神经母细胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌或睾丸癌。
应理解，本文中所描述的各种实施方案的一种、一些或所有特性可以组合以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些和其它方面将变得对所属领域的技术人员显而易见。通过以下详细说明进一步描述本发明的这些和其它实施方案。
附图说明
图1A和1B示出了在小鼠中各自以0.3mg/kg(图1A)和1mg/kg(图1B)施用同种型对照、抗体A和伊匹单抗后肿瘤体积变化的示例性结果。
图2A和2B示出了在小鼠中施用同种型对照、单独0.3mg/kg抗体A、单独10mg/kg抗PD-1和0.3mg/kg抗体A与10mg/kg抗PD-1的组合后，肿瘤体积变化(图2A)和体重百分比变化(图2B)的示例性结果。
图3A和3B示出了在小鼠中施用同种型对照、单独1mg/kg抗体A、单独10mg/kg抗PD-1和1mg/kg抗体A与10mg/kg抗PD-1的组合后，肿瘤体积变化(图3A)和体重百分比变化(图3B)的示例性结果。
图4A-4D示出了施用抗体A、伊匹单抗和抗体A与抗PD-1抗体的组合后小鼠存活百分比的示例性结果。同种型对照、抗体A和伊匹单抗，各自为0.3mg/kg(图4A)或1mg/kg(图4B)；同种型对照、单独0.3mg/kg抗体A、单独10mg/kg抗PD-1和0.3mg/kg抗体A与10mg/kg抗PD-1的组合(图4C)；同种型对照、单独1mg/kg抗体A、单独10mg/kg抗PD-1和1mg/kg抗体A与10mg/kg抗PD-1的组合(图4D)。
图5A-5C示出了在施用同种型对照、单独1mg/kg抗体A、单独10mg/kg抗PD-1和1mg/kg抗体A与10mg/kg抗PD-1的组合后免疫活化的示例性结果。测量肿瘤中的CD8/Treg比率(图5A)、肿瘤引流淋巴结(TDLN)中的CD4+ICOS+(图5B)和外周血中的CD4+Ki-67+(图5C)。
具体实施方式
如检查点抑制剂等治疗剂在癌症中显示前所未有的反应，但其用途受到免疫相关不良事件(irAE)和其它毒性(例如，垂体炎)限制。本文中提供蛋白质治疗剂，其在目标位点处，例如在肿瘤微环境中，在由蛋白酶活化之后特异性结合CTLA4，以实现增加的持久反应率和显著改良的安全性概况。本文中所提供的蛋白质治疗剂被工程改造成通过利用癌症的一个特点，即高局部活性蛋白酶浓度来使药理学活性精确靶向肿瘤微环境。使用肿瘤微环境的这一特征将全身性惰性分子转化成局部活性药物。药物在肿瘤微环境中的活化显著降低了与以活性形式向受试者施用的药物相关的全身毒性。
I.定义.
在详细描述本发明之前，应理解，本发明不限于具体组合物或生物系统，其当然可以变化。还应理解，本文中所用的术语仅仅是为了描述具体实施方案，并且不打算作为限制。除非上下文另有明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中所使用的单数形式“一(a/an)”和“所述”包括多个指示物。因此，举例来说，对“抗体”的参考任选地包括两种或更多种这类抗体的组合等。
如本文中所使用，术语“约”是指所属技术领域的技术人员易于知晓的相应值的常见偏差范围。本文中提到“约”一个值或参数包括(且描述)针对所述值或参数本身的实施方案。
应理解，本文中所描述的本发明的各方面和实施方案包括“包含”各方面和实施方案、“由各方面和实施方案组成”和“基本上由各方面和实施方案组成”。
术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双功能抗体和单链分子)以及抗体片段(例如，Fab、F(ab')2和Fv)。在本文中，术语“免疫球蛋白”(Ig)可以与“抗体”互换地使用。
基本的4链抗体单位是一种异源四聚糖蛋白，其由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成。IgM抗体由5个基本的异源四聚体单位和称为J链的附加多肽组成，并含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包含2-5个基本的4链单位，它们可以聚合以与J链组合形成多价聚集体。在IgG的情况下，4链单位通常为约150,000道尔顿。各L链通过一个共价二硫键连接至H链，而视H链同种型而定，两条H链通过一个或多个二硫键彼此连接。每个H链和L链也有规则间隔的链内二硫桥。每个H链在N端具有可变结构域(VH)，随后是α链和γ链各自的三个恒定结构域(CH)以及μ和ε同种型的四个CH结构域。每个L链在N端具有可变区(VL)，随后在另一端具有恒定区。VL与VH对准且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对准。特定氨基酸残基被认为形成在轻链可变结构域与重链可变结构域之间的界面。VH和VL配对在一起形成了单一的抗原结合位点。关于不同类别的抗体的结构和性质，参见例如《基础和临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)》,第8版,Daniel P.Sties,Abba I.Terr和TristramG.Parsolw(编),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994,第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的L链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而指定为称为κ和λ的两种明显不同类型中的一种。取决于其重链的恒定结构域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以指定为不同种类或同种型。存在五种类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其分别具有称为a、δ、ε、γ和m的重链。基于CH序列和功能中的相对较小差异而将γ和α类别进一步分成子类别，例如，人类表达以下子类别：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。IgG1抗体可以称为异型的多种多态变体形式存在(评述于Jefferis和Lefranc 2009.mAbs第1卷第4期1-7中)，其都适用于本发明。人类群体中的常见异型变体是由字母a、f、n、z标示的变体。
“被分离的”抗体是已从其生产环境的组分鉴别、分离和/或回收(例如，天然地或以重组方式)的抗体。在一些实施方案中，被分离的多肽与其生产环境中的所有其它组分无关。其生产环境中的污染物组分(如由重组转染细胞产生)是将通常干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的材料，且可以包含酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，多肽被纯化：(1)达到大于抗体的95重量％，如通过例如劳里法(Lowry method)测定，并且在一些实施方案中，达到大于99重量％；(1)通过使用旋杯式测序仪，达到足以获得至少15个N末端残基或内部氨基酸序列的程度，或(3)使用考马斯(Coomassie)蓝或银染色，在非还原或还原条件下通过SDS-PAGE，达到均质。被分离的抗体包含在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常通过至少一个纯化步骤制备被分离的多肽。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即，除可以少量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)以外，包括所述群体的各个抗体是相同的。在一些实施方案中，单克隆抗体在重链和/或轻链处具有C末端切割。例如，在重链和/或轻链的C末端处，1、2、3、4或5个氨基酸残基切割。在一些实施方案中，C末端切割从重链去除C末端赖氨酸。在一些实施方案中，单克隆抗体在重链和/或轻链处具有N末端切割。例如，在重链和/或轻链的N末端处，1、2、3、4或5个氨基酸残基切割。在一些实施方案中，可以通过重组技术来制备单克隆抗体的截短形式。在一些实施方案中，单克隆抗体针对单一抗原位点具有高特异性。在一些实施方案中，单克隆抗体针对多个抗原位点具有高特异性(如双特异性抗体或多特异性抗体)。修饰语“单克隆”表明抗体的特性是由基本同源的抗体群体获得，并且不应理解为需要通过任何具体方法产生抗体。举例来说，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过各种技术制备，包括例如融合瘤方法、重组DNA方法、噬菌体呈现技术以及用于在具有一部分或所有编码人类免疫球蛋白序列的人类免疫球蛋白基因座或基因的动物中产生人类或人类样抗体的技术。
术语“裸抗体”是指未与细胞毒性部分或放射性标记结合的抗体。
术语“亲本抗体”是指在修饰之前的抗体，所述修饰是如用掩蔽肽掩蔽抗体。
术语“被掩蔽的抗体”是指被修饰成包含掩蔽肽且在一些实施方案中，允许在优选环境中活化或去除掩蔽肽的其它组分的抗体。
“抗体-药物结合物”或“ADC”是指与一种或多种异源分子结合的抗体，所述异源分子包括(但不限于)细胞毒性剂。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“完全抗体”可以互换地用于指相对于抗体片段，呈基本上完整形式的抗体。具体地说，完全抗体包含具有包含Fc区的重链和轻链的抗体。恒定结构域可以是原生序列恒定结构域(例如，人类原生序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可以具有一种或多种效应功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分、完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗原结合抗体片段的实例包括结构域抗体(dAb)、Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双功能抗体；线抗体(参见美国专利案第5,641,870号，实例2；Zapata等人,《蛋白质工程(Protein Eng.)》8(10):1057-1062[1995])；单链抗体分子，和由抗体片段形成的多特异性抗体。单重链抗体或单轻链抗体可以被工程改造，或在重链的情况下，可以从被工程改造成产生单重链分子的骆驼、鲨鱼、库或小鼠分离。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，以及残余的“Fc”片段，此名称反映易于结晶的能力。Fab片段由完整的L链连同H链的可变区结构域(VH)以及一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。关于抗原结合，每个Fab片段都是单价的，即它具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大的F(ab’)2片段，其大致相当于具有不同抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于，CH1结构域的羧基端具有少数额外残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。在本文中，Fab'-SH是关于Fab'的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离硫醇基。F(ab')2抗体片段最初是以其间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对形式产生。还已知抗体片段的其它化学偶合。
Fc片段包括通过二硫键保持在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应功能是由Fc区中的序列和聚糖决定，所述区域也是由在某些类型的细胞上发现的Fc受体(FcR)识别。
“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这一片段是由紧密非共价缔合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。由这两个结构域的折叠得到六个高变环(H链和L链各3个环)，这些高变环提供用于抗原结合的氨基酸残基且使抗体具有抗原结合特异性。然而，尽管单个可变结构域(或Fv的一半，其仅包含三个对抗原具有特异性的HVR)具有识别和结合抗原的能力，但亲和力低于整个结合位点。
“单链Fv”，又简称为“sFv”或“scFv”，是包含连接成单一多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施方案中，sFv多肽还包含VH与VL结构域之间的多肽接头，其使得sFv能够形成抗原结合的所需结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun,《单克隆抗体的药理学(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)》,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
本发明的抗体的“功能片段”包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合或可变区或抗体中保留或具有被修饰的FcR结合能力的Fv区域。抗体片段的实例包括由抗体片段形成的线抗体、单链抗体分子和多特异性抗体。
本文中的单克隆抗体特定地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类别或子类别的抗体中的相应序列一致或同源，而所述链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或子类别的抗体中的相应序列一致或同源，以及这类抗体的片段，只要其呈现所需生物活性即可(美国专利案第4,816,567号；Morrison等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,81:6851-6855(1984))。在本文中，相关嵌合抗体包括抗体，其中抗体的抗原结合区是来源于通过例如用相关抗原对猕猴进行免疫接种而产生的抗体。如本文中所使用，“人类化抗体”用作“嵌合抗体”的子集。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有来源于非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人类化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的HVR的残基由来自非人类物种(供体抗体)，如小鼠、大鼠、兔或具有所需特异性、亲和力和/或能力的非人类灵长类动物的HVR的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基替换。此外，人类化抗体可以包含未在受体抗体或供体抗体中发现的残基。可以进行这些修饰以进一步改善抗体性能，如结合亲和力。通常，人类化抗体将包含基本上全部的至少一个且通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人类免疫球蛋白序列的高变环，且全部或基本上全部的FR区是人类免疫球蛋白序列的FR区，但FR区可以包括一个或多个改良抗体性能(如结合亲和力、异构化、免疫原性等)的单独FR残基取代。在一些实施方案中，FR中的这些氨基酸取代的数目在H链中不超过6个，且在L链中不超过3个。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。关于进一步细节，参见例如Jones等人,《自然》321:522-525(1986)；Riechmann等人,《自然》332:323-329(1988)；以及Presta,《结构生物学评论(Curr.Op.Struct.Biol.)》2:593-596(1992)。还参见例如Vaswani和Hamilton,《过敏性哮喘与免疫学年鉴(Ann.Allergy,Asthma&Immunol.)》1:105-115(1998)；Harris,《生物化学学会学报(Biochem.Soc.Transactions)》23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,《生物技术新观点(Curr.Op.Biotech.)》5:428-433(1994)；以及美国专利案第6,982,321号和第7,087,409号。在一些实施方案中，人类化抗体是针对单一抗原位点。在一些实施方案中，人类化抗体是针对多个抗原位点。替代性人类化方法描述于美国专利案第7,981,843号和美国专利申请公开案第2006/0134098号中。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。因此，如本文中所使用的术语“可变区”和“可变结构域”可以互换地使用。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体中可变性最高的部分(相对于相同类别的其它抗体)且含有抗原结合位点。重链和轻链的可变结构域可以使用任何可用的方法或编号方案确定，且可以包括如例如WO 2018/207701中所描述的可变结构域，其内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，重链和/或轻链的可变结构域可能不具有可变结构域的羧基端(即，第四构架结构域的羧基端)上的一个或多个氨基酸残基，所述一个或多个氨基酸残基可能基于某些编号方案而包括于所述可变结构域的描述中。在一些实施方案中，重链和/或轻链的可变结构域可以包括可变结构域的羧基端(即，第四构架结构域的羧基端)上的一个或多个氨基酸残基，所述一个或多个氨基酸残基可能基于某些编号方案而不包括于所述可变结构域的描述中。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域中在序列方面具有高可变性和/或形成以结构方式定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)且三个在VL中(L1、L2、L3)。在原生抗体中，H3和L3显示六HVR中最高的多样性，且尤其相信H3在赋予抗体优良的特异性方面起到独特作用。参见例如Xu等人,《免疫学(Immunity)》13:37-45(2000)；Johnson和Wu,《分子生物学方法(Methods in MolecularBiology)》248:1-25(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在的骆驼科抗体在不存在轻链的情况下是有功能的和稳定的。参见例如Hamers-Casterman等人,《自然》363:446-448(1993)，以及Sheriff等人,《自然-结构与分子生物学(Nature Struct.Biol.)》3:733-736(1996)。
正在使用许多HVR描述且涵盖于本文中。作为Kabat互补决定区(CDR)的HVR是基于序列可变性且是最常用的(Kabat等人,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)》,第5版,公共卫生服务部(Public HealthService),国立卫生研究院(National Institute of Health),Bethesda,MD(1991))。而Chothia HVR是指结构环的位置(Chothia和Lesk,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917(1987))。“Contact”HVR是基于可用的复杂晶体结构的分析。这些HVR的残基如下所示。
除非另有说明，否则可变结构域残基(HVR残基和构架区残基)根据Kabat等人,见上文编号。
“构架”或“FR”残基是除如本文中所定义的HVR残基以外的可变结构域残基。
表述“根据Kabat编号的可变结构域残基”或“根据Kabat编号的氨基酸位置”以及其变化形式是指Kabat等人,见上文中的用于抗体编译中的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用这种编号系统，实际线形氨基酸序列可以含有更少或额外的氨基酸，对应于可变结构域中的FR或HVR的缩短或其中的插入。举例来说，重链可变结构域可以包括在H2的残基52之后的单一氨基酸插入物(残基52a，根据Kabat)和在重链FR残基82之后的被插入的残基(例如，残基82a、82b和82c等，根据Kabat)。可以通过抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源区域处的比对来确定既定抗体的残基的Kabat编号。
用于本文目的的“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架的氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列，或其可含有预先存在的氨基酸序列变化。在一些实施方案中，预先存在的氨基酸变化的数量为10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”被定义为在比对序列且视需要引入空位以实现最大序列一致性百分比且不将任何保守性取代视为序列一致性的一部分之后，候选序列中的与参考多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列一致性百分比的目的的比对可以由所属领域的技术内的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。所属领域的技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包含在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比(或者可以表述为给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B具有或包含一定氨基酸序列同一性百分比)计算如下：
100乘以分数X/Y
被该程序的A和B比对中的序列评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的氨基酸序列同一性百分比将不等于B与A的氨基酸序列同一性百分比。
“结合到”、“特异性结合到”或“特异于”特定多肽或特定多肽上的表位的抗体是与特定多肽或特定多肽上的表位结合而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合的抗体。在一些实施方案中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)与非相关、非CTLA4多肽的结合小于抗体与CTLA4的结合约10％，如通过所属领域中已知的方法(例如，酶联结免疫吸附分析法(ELISA))所测量。在一些实施方案中，与CTLA4(例如，鼠CTLA4和/或人CTLA4)结合的结合蛋白(例如，抗体)的平衡解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤2nM、≤1nM、≤0.7nM、≤0.6nM、≤0.5nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
如本文所提供的术语“CTLA4”或“CTLA4蛋白”包括保持CTLA4蛋白活性(例如，与CTLA4相比在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％内)的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)的任何重组或天然存在的形式或其变体或同源物。在一些方面，与天然存在的CTLA4多肽相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如50、100、150或200个连续氨基酸部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，CTLA4如由NCBI序列参考GI：83700231鉴别的蛋白质，其同源物或功能性片段。在一些实施方案中，CTLA4是人类CTLA4。在一些实施方案中，CTLA4是小鼠CTLA4。
抗体“效应功能”是指可由抗体的Fc区(原生序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)引起的生物活性且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；依赖抗体性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性的一种形式，其中分泌的Ig结合到存在于某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FCR)上，使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合到带有抗原的靶细胞上并随后用细胞毒素杀死靶细胞。抗体将细胞毒性细胞“武装”起来且是通过这种机制杀伤目标细胞所需的。用于介导ADCC的原生细胞，即NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的Fc表达概述于以下文献中的第464页中的表3中：Ravetch和Kinet,《免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)》9:457-92(1991)。在一些实施方案中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)在不具有将Fc聚糖海藻糖基化以具有增强的ADCC的能力的细胞中被工程改造或表达。为了评估相关分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC分析法，如美国专利案第5,500,362号或第5,821,337号中描述的分析法。适用于这类分析法的效应细胞包括周边血液单核细胞(PBMC)和自然杀手(NK)细胞。或者或另外，相关分子的ADCC活性可以在体内，例如在如Clynes等人,《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》,95:652-656(1998)中所公开的动物模型中评估。改变ADCC活性和其它抗体特性的其它Fc变体包括以下文献中所公开的变体：Ghetie等人,《自然生物技术(Nat Biotech.)》15:637-40,1997；Duncan等人,《自然》332:563-564,1988；Lund等人.,《免疫学杂志(J.Immunol)》147:2657-2662,1991；Lund等人,《分子免疫学(Mol Immunol)》29:53-59,1992；Alegre等人,《移植术(Transplantation)》57:1537-1543,1994；Hutchins等人.,《美国国家科学院院刊(ProcNatl.Acad Sci USA)》92:11980-11984,1995；Jefferis等人,《免疫学快报(ImmunolLett.)》44:111-117,1995；Lund等人.,FASEB J9:115-119,1995；Jefferis等人,《免疫学快报》54:101-104,1996；Lund等人,《免疫学杂志》157:4963-4969,1996；Armour等人.,《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol)》29:2613-2624,1999；Idusogie等人,《免疫学杂志》164:4178-4184,200；Reddy等人,《免疫学杂志》164:1925-1933,2000；Xu等人.,《细胞免疫学(Cell Immunol)》200:16-26,2000；Idusogie等人,《免疫学杂志》166:2571-2575,2001；Shields等人.,《生物化学杂志(J Biol Chem)》276:6591-6604,2001；Jefferis等人,《免疫学快报》82:57-65.2002；Presta等人,《生物化学学会学报(Biochem Soc Trans)》30:487-490,2002；Lazar等人,《美国国家Acad.院刊》103:4005-4010,2006；美国专利案第5,624,821号；第5,885,573号；第5,677,425号；第6,165,745号；第6,277,375号；第5,869,046号；第6,121,022号；第5,624,821号；第5,648,260号；第6,194,551号；第6,737,056号；第6,821,505号；第6,277,375号；第7,335,742号；和第7,317,091号。
在本文中，术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区，包括原生序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的界限可能变化，但人类IgG重链Fc区通常定义为从Cys226位置或从Pro230处的氨基酸残基延伸至其羧基端。适用于本发明的抗体的原生序列Fc区包括人类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
如本文中所使用，“结合亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合搭配物(例如，抗原)之间的非共价相互作用的强度。在一些实施方案中，结合蛋白(例如，抗体)对CTLA4的亲和力通常可以由平衡解离常数(KD)表示。亲和力可以通过所属领域中已知的常用方法，包括本文中所描述的方法来测量。
如本文中所使用，“结合亲合力”是指分子(例如，抗体)的多个结合位点与其结合搭配物(例如，抗原)的结合强度。
在本文中，编码抗体的“被分离的”核酸分子是被鉴别且从至少一种污染核酸分子分离的核酸分子，其与所述至少一种污染核酸分子通常在其生产环境中相关联。在一些实施方案中，被分离的核酸与和生产环境相关联的所有组分都无关。在本文中，编码多肽和抗体的被分离的核酸分子呈与其在自然界中被发现的形式或环境不同的形式。因此，被分离的核酸分子与细胞中天然存在的编码本文中的多肽和抗体的核酸不同。
术语“医药配制物”是指呈允许活性成分的生物活性有效，并且不含对将被施用所述配制物的受试者具有不可接受的毒性的其它组分的制剂。这类配制物是无菌的。
如本文中所使用，“载剂”包括医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，其对暴露于所使用的剂量和浓度的所述载剂的细胞或哺乳动物无毒性。生理学上可接受的载剂通常是水性pH值缓冲溶液。生理学上可接受的载剂的实例包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
如本文中所使用的，术语“治疗”是指被设计成在临床病理学过程期间改变所治疗的个体或细胞的天然过程的临床介入。合乎需要的治疗作用包含降低疾病进展率、改善或减轻疾病病况以及缓解或改善预后。例如，如果与病症(例如，赘生性疾病)相关联的一种或多种症状得到缓解或消除，那么成功地“治疗”个体。例如，如果治疗引起罹患疾病的个体的生活质量提高、降低治疗疾病所需的其它药物的剂量、降低疾病的复发频率、减轻疾病的严重程度、延缓疾病的发展或进展和/或延长个体的存活期，那么成功地“治疗”个体。
如本文中所使用的，“与…结合”或“与…组合”是指施用除一种治疗方法以外的另一种治疗方法。因此，“与…结合”或“与…组合”是指在向个体施用一种治疗方法之前、期间或之后施用另一种治疗方法。
如本文中所使用的，术语“预防”包含提供与个体中的疾病的发生或复发相关的防治。个体可能易患病症、对病症敏感或具有产生病症的风险，但尚未被诊断患有病症。在一些实施方案中，使用本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体)延缓病症的发展。
如本文中所使用，“具有产生病症的风险”的个体在本文中所描述的治疗方法之前可能具有或可能不具有可检测的疾病或疾病症状，且可能显示或可能不显示可检测的疾病或疾病症状。“具有风险”表示个体具有一种或多种风险因素，所述风险因素是与疾病的发展相关的可测量的参数，如所属领域中已知。具有这些风险因素中的一种或多种的个体与不具有这些风险因素中的一种或多种的个体相比具有更高的产生病症的可能性。
“有效量”是指至少在必需的剂量和时段下有效实现所需或所指示的作用，包含治疗性或预防性结果的量。可以按一次或多次施用的方式来提供有效量。“治疗有效量”至少是实现具体病症的可测量的改善所需的最小浓度。在本文中，治疗有效量可以根据如疾病病况、患者的年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也可以是其中治疗有益作用超过抗体的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”是指在必需的剂量和时段下有效实现所需预防性结果的量。通常但未必，因为预防性剂量是在疾病之前或在疾病的较早阶段用于受试者，所以预防有效量小于治疗有效量。
“慢性”施用是指以与急性模式相反的连续模式给予(一种或多种)药剂，以便将初始治疗作用(活性)维持长期时段。“间歇性”施用是在不中断的情况下非连续地进行，但实际性质是循环性的治疗。
如本文中所使用的，“个体”或“受试者”是哺乳动物。出于治疗的目的，“哺乳动物”包含人类、家养和农场动物以及动物园、运动或宠物动物，如犬、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
II.治疗方法
本文提供了用于治疗或预防受试者的疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的本文所述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)或其组合物)和PD-1信号传导剂(例如，PD-1或PD-L1抑制剂)。在一些实施方案中，受试者(例如，人患者)已被诊断为患有肿瘤病症(例如，癌症)或处于发展这种病症的风险中。
对于疾病的预防或治疗，活性剂的适当剂量将取决于如上文所定义的所治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和过程、所给予的药剂是否是用于预防性或治疗剂目的、先前疗法、个体的临床病史和对药剂的反应以及主治医生的判断。所述活性剂适合一次或通过一系列治疗向受试者施用。在本文所述的方法的一些实施方案中，施用可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)和PD-1信号传导剂(例如，PD-1或PD-L1抑制剂)之间的间隔为约一个月或更长。在一些实施方案中，施用之间的间隔为约两个月、约三个月、约四个月、约五个月、约六个月或更长时间。在本文所述的方法的一些实施方案中，施用可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)和PD-1信号传导剂(例如，PD-1或PD-L1抑制剂)之间的间隔为约每3周。在本文所述的方法的一些实施方案中，施用可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)和PD-1信号传导剂(例如，PD-1或PD-L1抑制剂)之间的间隔为每周、每2周、每3周、每4周、每5周或每6周。在一些实施方案中，PD-1信号传导剂(例如，PD-1或PD-L1抑制剂)每3周施用一次。
如本文所用，施用之间的间隔是指一次施用抗体与下一次施用抗体之间的时间。如本文中所使用，约一个月的间隔包括四周。在一些实施方案中，施用之间的间隔是约两周、约三周、约四周、约八周、约十二周、约十六周、约二十周、约二十四周或更长。
在一些实施方案中，治疗包括抗体的多次施用，其中施用之间的间隔可以变化。举例来说，第一次施用与第二次施用之间的间隔是约一个月，且后续施用之间的间隔是约三个月。在一些实施方案中，第一次施用与第二次施用之间的间隔是约一个月，第二次施用与第三次施用之间的间隔是约两个月且后续施用之间的间隔是约三个月。
在一些实施方案中，本文所述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)以固定剂量施用。在一些实施方案中，本文所述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)以每剂量约25mg至约500mg的剂量向受试者施用。
在一些实施方案中，根据疾病的类型和严重程度，向受试者施用本文所述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)。在一些实施方案中，通过一次或多次单独施用或通过连续输注，以约1g/kg至20mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg、0.1mg/kg-15mg/kg)的剂量施用可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体。
在一些实施方案中，本文所述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)以约0.1mg/kg至约10mg/kg或约1.0mg/kg至约10mg/kg的剂量向受试者施用。在一些实施方案中，本文所述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)以约0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3.0mg/kg、3.5mg/kg、4.0mg/kg、4.5mg/kg、5.0mg/kg、5.5mg/kg、6.0mg/kg、6.5mg/kg、7.0mg/kg、7.5mg/kg、8.0mg/kg、8.5mg/kg、9.0mg/kg、9.5mg/kg、10.0mg/kg、11.0mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16.0mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg或20mg/kg中任一者的剂量向受试者施用。
在一些实施方案中，本文所述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)以约0.1mg/kg与10mg/kg之间、约0.1mg/kg与20mg/kg之间、约1mg/kg与10mg/kg之间、约3mg/kg与10mg/kg之间、约0.3mg/kg与15mg/kg之间或约0.3mg/kg与10mg/kg之间的剂量向受试者施用。
本文预期的治疗方法是用本文所述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)和PD-1信号传导剂(例如，PD-1或PD-L1抑制剂)治疗病症或疾病。可用本发明的制剂治疗的病症或疾病包括白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、骨髓瘤、乳腺癌、神经母细胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌(例如，默克尔细胞癌(Merkel cellcarcinoma))或睾丸癌。
在一些实施方案中，癌症是小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)。
在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗或预防癌症的方法，其通过施用本文所述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)和PD-1信号传导剂(例如，PD-1或PD-L1抑制剂)来进行。如本文所用，术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、赘生物或恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌肿瘤、癌和肉瘤。可用本文提供的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)和PD-1信号传导剂(例如，PD-1或PD-L1抑制剂)、药物组合物或方法治疗的示例性癌症包括淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑瘤、宫颈癌、结肠癌、食管癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳腺癌(例如，三阴性、ER阳性、ER阴性、化学疗法抗性、赫赛汀(Herceptin)抗性、HER2阳性、阿霉素抗性、他莫昔芬抗性、导管癌、小叶癌、原发性、转移性)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌、肉瘤)、多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如头癌、颈癌或食管癌)、结肠直肠癌、白血病、急性髓系白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性淋巴瘤。其他实例包括甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或髓母细胞瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌、膀胱癌、恶性前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖系统癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺肿瘤、甲状腺髓样癌(medullary thyroid cancer)、甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma)、黑素瘤、结肠直肠癌、甲状腺乳头状癌、肝细胞癌、乳头佩吉特氏病(Paget’s Disease of the Nipple)、叶状肿瘤、小叶癌、导管癌、胰腺星状细胞癌、肝星状细胞癌或前列腺癌。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗或预防白血病的方法，其通过施用本文所述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)和PD-1信号传导剂(例如，PD-1或PD-L1抑制剂)来进行。术语“白血病”泛指造血器官的进行性恶性疾病，并且通常以血液和骨髓中白细胞及其前体的异常增殖和发育为特征。白血病的临床分类通常基于(1)急性或慢性疾病的持续时间和特征；(2)涉及的细胞类型；髓样(髓性)、淋巴样(淋巴性)或单核细胞性；和(3)白血病或非白血病(亚白血病)血液中异常细胞数量增加或不增加。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示例性白血病包括例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血病性白血病、白细胞性白血病、嗜碱性粒细胞白血病(basophylic leukemia)、母细胞性白血病、牛白血病、慢性粒细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸性粒细胞性白血病、格罗斯白血病(Gross'leukemia)、毛细胞性白血病、成血细胞性白血病、血母细胞性白血病、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、淋巴球性白血病(lymphogenous leukemia)、淋巴细胞白血病(lymphoid leukemia)、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小成髓细胞性白血病、单核细胞性白血病、原始粒细胞性白血病(myeloblasticleukemia)、髓细胞性白血病、髓性粒细胞性白血病、髓细胞单核细胞性白血病、奈格列白血病(Naegeli leukemia)、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、里德细胞性白血病(Rieder cell leukemia)、希林氏白血病(Schilling'sleukemia)、干细胞性白血病、亚白血性白血病或未分化细胞性白血病。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗或预防肉瘤的方法，其通过施用本文所述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)和PD-1信号传导剂(例如，PD-1或PD-L1抑制剂)来进行。术语“肉瘤”通常是指由类似胚胎结缔组织的物质构成的肿瘤，并且通常由包埋在纤维状或均质物质中的紧密堆积的细胞构成。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的肉瘤包括软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、阿贝美氏肉瘤(Abemethy'ssarcoma)、脂肪肉瘤(adipose sarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色瘤肉瘤、绒毛膜癌、胚胎肉瘤、维尔姆斯氏瘤肉瘤(Wilms'tumor sarcoma)、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、筋膜肉瘤、纤维母细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、霍奇金肉瘤、特发性多发性色素出血性肉瘤、B细胞成免疫细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞成免疫细胞肉瘤、延森氏肉瘤(Jensen's sarcoma)、卡波济氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、枯否细胞肉瘤(Kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤、白血病肉瘤、恶性间叶瘤肉瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤、劳斯肉瘤(Rous sarcoma)、浆液囊肉瘤、滑膜肉瘤或毛细血管扩张肉瘤(telangiectaltic sarcoma)。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗或预防黑素瘤的方法，其通过施用本文所述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)和PD-1信号传导剂(例如，PD-1或PD-L1抑制剂)来进行。术语“黑素瘤”是指由皮肤和其他器官的黑色素细胞系统引起的肿瘤。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的黑素瘤包括例如肢端雀斑样痣黑素瘤、无色素性黑素瘤、良性幼年黑素瘤、Cloudman氏黑素瘤、S91黑素瘤、Harding-Passey黑素瘤、幼年黑素瘤、恶性雀斑样黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤、指甲下黑素瘤(subungal melanoma)或浅表扩散性黑素瘤。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗或预防上皮癌的方法，其通过施用本文所述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)和PD-1信号传导剂(例如，PD-1或PD-L1抑制剂)来进行。术语“上皮癌(carcinoma)”是指由上皮细胞构成的恶性新生物，其倾向于浸润周围组织并引起转移。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示例性上皮癌包括例如甲状腺髓样癌、家族性甲状腺髓样癌、腺泡癌、腺泡状癌、腺样囊性癌(adenocystic carcinoma)、腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma)、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、基底上皮细胞癌(carcinoma basocellulare)、基底细胞癌(basaloid carcinoma)、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑样癌、胆管细胞癌、绒膜上皮癌、胶样癌、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌(carcinoma cutaneum)、圆柱上皮癌、柱状细胞癌、导管癌(duct carcinoma)、导管癌(ductal carcinoma)、硬癌、胚胎癌、髓样癌、表皮样癌(epiermoid carcinoma)、腺样上皮癌、外植癌、溃疡性癌、纤维瘤、胶样癌(gelatiniforni carcinoma)、胶状癌(gelatinouscarcinoma)、巨细胞癌(giant cell carcinoma)、巨细胞癌(carcinomagigantocellulare)、腺癌、颗粒细胞癌、毛发基质癌(hair-matrix carcinoma)、多血癌、肝细胞癌、许特耳氏细胞癌(Hurthle cell carcinoma)、透明细胞癌(hyaline carcinoma)、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、克龙派切尔癌(Krompecher'scarcinoma)、库尔奇茨基细胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma)、豆状癌(carcinoma lenticulare)、脂肪瘤癌、小叶癌、淋巴上皮癌、髓样癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、软癌、粘液癌(mucinous carcinoma)、粘液癌(carcinoma muciparum)、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum)、粘液癌(mucous carcinoma)、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌、骨样癌、乳头状癌、门静脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、脑样癌、肾脏肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭状细胞癌、髓样癌(carcinomaspongiosum)、鳞状细胞癌(squamous carcinoma)、鳞状细胞癌(squamous cellcarcinoma)、串状癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectodes)、过渡细胞癌、结节性皮癌(carcinomatuberosum)、小管癌(tubular carcinoma)、结节性皮癌(tuberous carcinoma)、疣状癌(verrucous carcinoma)或绒毛状癌。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗或预防转移性癌症的方法，其通过施用本文所述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)和PD-1信号传导剂(例如，PD-1或PD-L1抑制剂)来进行。如本文所用，术语“转移”、“转移性”和“转移性癌症”可互换使用，并且是指肿瘤疾病或病症(例如癌症)从一个器官或另一个不相邻器官或身体部分扩散。癌症发生在起源部位，例如乳房，所述部位被称为原发性肿瘤，例如原发性乳腺癌。原发性肿瘤或起始部位中的一些癌细胞获得了穿透和浸润局部区域中的周围正常组织的能力，和/或穿透淋巴系统或血管系统的壁，通过系统循环到身体内的其它部位和组织的能力。由原发性肿瘤的癌细胞形成的第二临床上可检测的肿瘤称为转移性或继发性肿瘤。当癌细胞转移时，推测转移性肿瘤及其细胞与原始肿瘤的细胞相似。因此，如果肺癌转移至乳房，那么乳房部位的继发性肿瘤由异常的肺细胞而不是异常的乳房细胞组成。乳房中的继发性肿瘤被称为转移性肺癌。因此，短语转移性癌症是指其中受试者患有或曾经患有原发性肿瘤且患有一种或多种继发性肿瘤的疾病。短语非转移性癌症或患有非转移性癌症的受试者是指其中受试者患有原发性肿瘤但不患有一种或多种继发性肿瘤的疾病。例如，转移性肺癌是指受试者患有原发性肺肿瘤或具有原发性肺肿瘤病史，并且在第二个位置或多个位置(例如，在乳房中)具有一个或多个继发性肿瘤的疾病。
在一些实施方案中，可受益于本文所述的被掩蔽的CTLA4结合蛋白与PD-1信号传导剂(例如，PD-1或PD-L1抑制剂)的组合的疾病或病症包括由CTLA4或CTLA4活性或功能和/或PD-1信号传导活性或功能(全部或部分)引起的疾病(例如，糖尿病、癌症(例如，前列腺癌、肾癌、转移癌、黑素瘤、去势抵抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如，头癌、颈癌或食管癌)、结肠直肠癌、白血病、急性髓系白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤))或者由所述活性或功能(全部或部分)引起的所述疾病的症状。
本文描述了治疗受试者中的病症(例如，受益于抗PD-1疗法的施用的病症)的方法。例如，本文所述的抗PD-1疗法可以例如作为与可活化的CTLA-4抗体的组合疗法施用，施用时间足以实现临床益处或根据医师确定的方案施用(例如，抗PD-1疗法以医师确定的剂量和治疗周期数施用)。
在实施方案中，本文所述的方法可用于治疗T细胞功能障碍性病症(例如，癌症)。在实施方案中，本文所述的方法可用于减少受试者的肿瘤或抑制肿瘤细胞的生长。
在实施方案中，本文所述的方法可用于增加受试者的T细胞活化或T细胞效应子功能。
在实施方案中，本文所述的方法可用于在受试者中诱导免疫反应。
在实施方案中，本文所述的方法可用于增强受试者的免疫反应或增加免疫细胞的活性。
本发明方法可用于治疗任何类型的自身免疫性疾病(即由机体攻击并损伤自身组织的免疫系统过度活动引起的疾病或病症)，例如MacKay I.R.和Rose N.R.编辑,《自身免疫性疾病(The Autoimmune Diseases)》,第五版,马萨诸塞州沃尔瑟姆学术出版社(Academic Press,Waltham,MA)(2014)中所述的那些。可用本发明方法治疗的自身免疫性疾病的实例包括但不限于多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎、硬皮病、克罗恩氏病(Crohn’sdisease)、银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)和溃疡性结肠炎。当本发明方法治疗自身免疫性疾病时，PD-1抗体剂可以与抗炎剂组合使用，所述抗炎剂包括例如皮质类固醇(例如泼尼松和氟替卡松)和非甾体抗炎药(NSAID)(例如阿司匹林、布洛芬和萘普生)。
PD-1在多种癌症中异常表达(参见例如Brown等人,《免疫学杂志》,170:1257-1266(2003)；以及Flies等人,《耶鲁生物学与医学杂志(Yale Journal of Biology andMedicine)》,84:409-421(2011))，并且PD-L1在一些肾细胞癌患者中的表达与肿瘤侵袭性相关。本发明方法可用于治疗本领域已知的任何类型的癌症。
在实施方案中，癌症为腺癌、肺腺癌、急性髓系白血病(“AML”)、急性淋巴母细胞性白血病(“ALL”)、肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、B细胞衍生性白血病、B细胞衍生性淋巴瘤、膀胱癌、脑癌(brain cancer)、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌(TNBC))、输卵管癌、睾丸癌、脑癌(cerebral cancer)、宫颈癌、绒毛膜癌、慢性髓细胞性白血病、CNS肿瘤、结肠腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、弥漫型内因性桥脑神经胶细胞瘤(DIPG)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(“DLBCL”)、胚胎性横纹肌肉瘤(ERMS)、子宫内膜癌、上皮癌、食管癌、尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、滤泡性淋巴瘤(“FL”)、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、神经胶质瘤、头颈癌、血液学癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤/原发性纵隔B细胞淋巴瘤、肾癌、肾透明细胞癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、默克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、间皮瘤、单核细胞白血病、多发性骨髓瘤、骨髓瘤、神经母细胞衍生性CNS肿瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、非小细胞肺癌(NSCLC)、口腔癌、骨肉瘤、卵巢癌(ovarian cancer)、卵巢癌(ovarian carcinoma)、胰腺癌、腹膜癌、原发性腹膜癌、前列腺癌、复发性或难治性经典霍奇金淋巴瘤(cHL)、肾细胞癌、直肠癌、唾液腺癌(例如唾液腺肿瘤)、肉瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、肛门生殖器区域的鳞状细胞癌(例如肛门、阴茎、子宫颈、阴道或外阴的鳞状细胞癌)、食管鳞状细胞癌、头颈部鳞状细胞癌(SCHNC)、肺鳞状细胞癌、胃癌、T细胞衍生性白血病、T细胞衍生性淋巴瘤、胸腺癌(thymiccancer)、胸腺瘤(thymoma)、甲状腺癌、葡萄膜黑素瘤、尿路上皮细胞癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌或威尔姆斯肿瘤。
在其他实施方案中，癌症是头颈癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC))、肾癌、膀胱癌、黑素瘤、默克尔细胞癌(参见例如Bhatia等人,《最新肿瘤学报告(Curr.Oncol.Rep.)》,13(6):488-497(2011))、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、乳腺癌、前列腺癌、唾液腺肿瘤、胸腺瘤、肾上腺皮质癌、食管癌、胃癌、结肠直肠癌、阑尾癌、尿路上皮细胞癌或鳞状细胞癌(例如，肺鳞状细胞癌；肛门生殖器区域(包括肛门、阴茎、子宫颈、阴道或外阴)的鳞状细胞癌；或食管鳞状细胞癌)。在一些实施方案中，在本公开的上下文中治疗的癌症是黑素瘤、肾细胞癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、胆囊癌、喉癌、肝癌、甲状腺癌、胃癌、唾液腺癌、前列腺癌、胰腺癌或默克尔细胞癌。
在一些实施方案中，患者或患者群体患有血液学癌症。在一些实施方案中，患者患有血液学癌症，诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤(“DLBCL”)、霍奇金淋巴瘤(“HL”)、非霍奇金淋巴瘤(“NHL”)、滤泡性淋巴瘤(“FL”)、急性髓系白血病(“AML”)、急性淋巴母细胞性白血病(“ALL”)或多发性骨髓瘤(“MM”)。在实施方案中，癌症是血源性癌症，例如急性淋巴母细胞性白血病(“ALL”)、急性淋巴母细胞性B细胞白血病、急性淋巴母细胞性T细胞白血病、急性粒细胞白血病(“AML”)、急性早幼粒细胞白血病(“APL”)、急性单核细胞白血病、急性红白血病性白血病、急性巨核细胞白血病、急性粒单核细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、急性未分化白血病、慢性髓细胞白血病(“CML”)、慢性淋巴细胞白血病(“CLL”)、毛细胞白血病和多发性骨髓瘤；急性和慢性白血病，诸如淋巴母细胞性白血病、髓细胞性白血病、淋巴细胞性白血病和髓细胞性白血病。
在实施方案中，癌症是淋巴瘤，诸如霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’smacroglobulinemia)、重链病和真性红细胞增多症。
在实施方案中，癌症是鳞状细胞癌。在实施方案中，癌症是肺鳞状细胞癌。在实施方案中，癌症是食管鳞状细胞癌。在实施方案中，癌症是头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。
在实施方案中，癌症是肛门生殖器区域(例如，肛门、阴茎、子宫颈、阴道或外阴)的鳞状细胞癌。
在实施方案中，癌症是膀胱癌、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌(TNBC))、输卵管癌、胆管癌、结肠腺癌、子宫内膜癌、食管癌、尤文氏肉瘤、胃癌、肾透明细胞癌、肺癌(例如肺腺癌或肺鳞状细胞癌)、间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、前列腺癌、子宫内膜癌或葡萄膜黑素瘤。在实施方案中，癌症是卵巢癌、输卵管癌或腹膜癌。在实施方案中，癌症是乳腺癌(例如，TNBC)。在实施方案中，癌症是肺癌(例如，非小细胞肺癌)。在实施方案中，癌症是前列腺癌。
在实施方案中，癌症是CNS或脑癌，诸如神经母细胞瘤(NB)、神经胶质瘤、弥漫型内因性桥脑神经胶细胞瘤(DIPG)、毛细胞性星形细胞瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、前庭神经鞘瘤、腺瘤、转移性脑瘤、脑膜瘤、脊髓瘤或髓母细胞瘤。在实施方案中，癌症是CNS肿瘤。
在一些实施方案中，患者或患者群体患有实体瘤。在实施方案中，癌症是实体瘤，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆斯肿瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮癌、皮肤癌、黑素瘤、神经母细胞瘤(NB)或视网膜母细胞瘤。在一些实施方案中，肿瘤是晚期实体瘤。在一些实施方案中，肿瘤是转移性实体瘤。在一些实施方案中，患者患有MSI-H实体瘤。
在一些实施方案中，待通过本发明的方法治疗的患者或患者群体患有或易患癌症，诸如头颈癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、肾癌、膀胱癌、黑素瘤、默克尔细胞癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌、子宫内膜癌、卵巢癌、输卵管癌、乳腺癌、前列腺癌、唾液腺肿瘤、胸腺瘤、肾上腺皮质癌、食管癌、胃癌、结肠直肠癌、阑尾癌、尿路上皮细胞癌或鳞状细胞癌(例如，肺鳞状细胞癌；肛门生殖器区域(包括肛门、阴茎、子宫颈、阴道或外阴)的鳞状细胞癌；或食管鳞状细胞癌)。在一些实施方案中，待通过本发明的方法治疗的患者或患者群体患有或易患肺癌(例如，NSCLC)、肾癌、黑素瘤、宫颈癌、结肠直肠癌或子宫内膜癌(例如，MSS子宫内膜癌或MSI-H子宫内膜癌)。
在一些实施方案中，癌症是妇科癌症(即女性生殖系统的癌症，诸如卵巢癌、输卵管癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌或原发性腹膜癌或乳腺癌)。在一些实施方案中，女性生殖系统的癌症包括但不限于卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌和乳腺癌。
在实施方案中，癌症是卵巢癌(例如，浆液性卵巢癌或透明细胞性卵巢癌)。在实施方案中，癌症是输卵管癌(例如，浆液性输卵管癌或透明细胞性输卵管癌)。在实施方案中，癌症是原发性腹膜癌(例如，浆液性原发性腹膜癌或透明细胞性原发性腹膜癌)。
在一些实施方案中，卵巢癌是上皮癌。上皮癌占卵巢癌的85％至90％。尽管历史上认为卵巢癌开始于卵巢表面，但新的证据表明至少一些卵巢癌开始于部分输卵管的特殊细胞中。输卵管是连接女性卵巢和子宫的小管，是女性生殖系统的一部分。在正常女性生殖系统中，有两条输卵管，分别位于子宫的两侧。开始于输卵管的癌细胞可能很早就转移到卵巢表面。术语“卵巢癌”通常用于描述开始于卵巢、输卵管和腹腔内层(称为腹膜)的上皮癌。在一些实施方案中，癌症是或包括生殖细胞肿瘤。生殖细胞肿瘤是一种类型的卵巢癌，发生在卵巢的排卵细胞中。在一些实施方案中，癌症是或包括间质肿瘤。间质肿瘤发生在将卵巢保持在一起的结缔组织细胞中，有时正是产生称为雌激素的女性激素的组织。在一些实施方案中，癌症是或包括颗粒细胞瘤。颗粒细胞瘤可能分泌雌激素，从而导致诊断时不寻常的阴道出血。在一些实施方案中，妇科癌症与同源重组修复缺陷/同源修复缺陷(“HRD”)和/或BRCA1/2突变相关。在一些实施方案中，妇科癌症是铂敏感性妇科癌症。在一些实施方案中，妇科癌症对基于铂的疗法有反应。在一些实施方案中，妇科癌症已对基于铂的治疗产生抗性。在一些实施方案中，妇科癌症曾一度对基于铂的治疗表现出部分或完全反应(例如，对最后一种基于铂的治疗或倒数第二种基于铂的治疗表现出部分或完全反应)。在一些实施方案中，妇科癌症现在对基于铂的治疗有抗性。
在实施方案中，癌症是乳腺癌。通常，乳腺癌开始于称为小叶的泌乳腺细胞中或开始于导管中。不太常见的乳腺癌可能开始于基质组织。这些组织包括乳房的脂肪和纤维结缔组织。随着时间的推移，乳腺癌细胞可以侵入附近组织，诸如腋下淋巴结或肺部，这一过程称为转移。乳腺癌的阶段、肿瘤的大小及其生长速度都是决定所提供的治疗类型的全部因素。治疗选项包括手术切除肿瘤、药物治疗(包括化学疗法和激素疗法)、放射疗法和免疫疗法。预后和存活率差异很大；五年相对存活率在98％至23％之间变化，其取决于发生的乳腺癌类型。乳腺癌是世界上第二常见的癌症，2012年有大约170万新病例，是第五大最常见的癌症死亡原因，有大约521,000人死亡。在这些病例中，大约15％是三阴性乳腺癌，其不表达雌激素受体、孕激素受体(PR)或HER2。在一些实施方案中，三阴性乳腺癌(TNBC)的特征在于乳腺癌细胞为雌激素受体表达阴性(<1％的细胞)、孕激素受体表达阴性(<1％的细胞)和HER2阴性的。
在实施方案中，癌症是ER阳性乳腺癌、ER阴性乳腺癌、PR阳性乳腺癌、PR阴性乳腺癌、HER2阳性乳腺癌、HER2阴性乳腺癌、BRCA1/2阳性乳腺癌、BRCA1/2阴性癌症或三阴性乳腺癌(TNBC)。在实施方案中，癌症是三阴性乳腺癌(TNBC)。
在一些实施方案中，乳腺癌是转移性乳腺癌。在一些实施方案中，乳腺癌是晚期乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是II期、III期或IV期乳腺癌。在一些实施方案中，癌症是IV期乳腺癌。在一些实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌。
在一些实施方案中，待通过本公开的方法治疗的患者或患者群体患有或易患子宫内膜癌(“EC”)。子宫内膜癌是女性生殖道最常见的癌症，占每年每100,000人10–20人。全世界每年子宫内膜癌(EC)新病例估计为约32.5万。此外，EC是绝经后妇女中最常见的癌症。约53％的子宫内膜癌病例发生在发达国家。2015年，美国诊断出约55,000例EC，目前没有批准用于EC的靶向治疗。在1L和2L设置中，需要能够提高晚期和复发性EC的存活率的药剂和方案。预计2016年美国有大约10,170人死于EC。最常见的组织学形式是子宫内膜样腺癌，占诊断病例的约75-80％。其他组织学形式包括子宫乳头状浆液性(低于10％)、透明细胞(4％)、粘液性(1％)、鳞状(低于1％)和混合(约10％)。
从致病角度来看，EC分为两种不同的类型，所谓I型和II型。I型肿瘤是低级和雌激素相关的子宫内膜样癌(EEC)，而II型是非子宫内膜样(NEEC)(主要是浆液性和透明细胞性)癌。世界卫生组织最近更新了EC的病理学分类，确认了EC的九种不同亚型，但是EEC和浆液性癌(SC)占了绝大多数病例。EEC是发生在围绝经期患者中的雌激素相关性癌，在此之前有前驱病变(子宫内膜增生/子宫内膜样上皮内瘤形成)。在显微镜下，低级EEC(EEC 1–2)含有管状腺体，有点类似增生性子宫内膜，结构复杂，腺体融合，呈筛状模式。高级EEC显示出稳定的生长模式。相比之下，SC发生在不存在雌激素过多症的绝经后患者中。在显微镜下，SC显示厚的、纤维化的或水肿的乳头，有明显的肿瘤细胞分层、细胞出芽和带有大的嗜酸性细胞质的间变性细胞。绝大多数EEC是低级肿瘤(1级和2级)，并且当它们局限于子宫时，与良好预后相关。3级EEC(EEC3)是淋巴结转移的频率增加的侵袭性肿瘤。SC非常具有攻击性，与雌激素刺激无关，主要发生在老年女性中。EEC 3和SC被认为是高级别肿瘤。使用1988至2001年的监测、流行病学和最终结果(SEER)项目数据对SC和EEC3进行比较。它们分别占EC的10％和15％，但分别占癌症死亡的39％和27％。
子宫内膜癌也可分为四个分子亚群：(1)超级突变/POLE突变；(2)高频突变的MSI+(例如，MSI-H或MSI-L)；(3)拷贝数低/微卫星稳定(MSS)；和(4)拷贝数高/浆液样。大约28％的病例为MSI高。(Murali,《柳叶刀·肿瘤学(Lancet Oncol.)》(2014)。在一些实施方案中，患者患有2L子宫内膜癌的错配修复缺陷亚型。
在实施方案中，子宫内膜癌是转移性子宫内膜癌。
在实施方案中，患者患有MSS子宫内膜癌。
在实施方案中，患者患有MSI-H子宫内膜癌。
在实施方案中，癌症是肺癌。在实施方案中，肺癌是肺鳞状细胞癌。在实施方案中，肺癌是小细胞肺癌(SCLC)。在实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)，例如鳞状NSCLC。在实施方案中，肺癌是ALK易位的肺癌(例如，ALK易位的NSCLC)。在实施方案中，肺癌是EGFR突变型肺癌(例如，EGFR突变型NSCLC)。
在实施方案中，癌症是结肠直肠(CRC)癌(例如，实体瘤)。在实施方案中，结肠直肠癌是晚期结肠直肠癌。在实施方案中，结肠直肠癌是转移性结肠直肠癌。在实施方案中，结肠直肠癌是MSI-H结肠直肠癌。在实施方案中，结肠直肠癌是MSS结肠直肠癌。在实施方案中，结肠直肠癌是POLE突变型结肠直肠癌。在实施方案中，结肠直肠癌是POLD突变型结肠直肠癌。在实施方案中，结肠直肠癌是高TMB结肠直肠癌。
在实施方案中，癌症是黑素瘤。在实施方案中，黑素瘤是晚期黑素瘤。在实施方案中，黑素瘤是转移性黑素瘤。在实施方案中，黑素瘤是MSI-H黑素瘤。在实施方案中，黑素瘤是MSS黑素瘤。在实施方案中，黑素瘤是POLE突变型黑素瘤。在实施方案中，黑素瘤是POLD突变型黑素瘤。在实施方案中，黑素瘤是高TMB黑素瘤。
在实施方案中，癌症是晚期癌症。
在实施方案中，癌症是转移性癌症。
在实施方案中，癌症是复发性癌症(例如，复发性妇科癌症，诸如复发性上皮性卵巢癌、复发性输卵管癌、复发性原发性腹膜癌或复发性子宫内膜癌)。
可用本文所述的方法治疗的癌症包括与高肿瘤突变负荷(TMB)相关的癌症、微卫星稳定(MSS)的癌症、以微卫星不稳定性为特征的癌症、具有高微卫星不稳定性状态(MSI-H)的癌症、具有低微卫星不稳定性状态(MSI-L)的癌症、与高TMB和MSI-H相关的癌症(例如，与高TMB和MSI-L或MSS相关的癌症)、具有缺陷型DNA错配修复系统的癌症、具有DNA错配修复基因缺陷的癌症、高频突变的癌症、具有同源重组修复缺陷/同源修复缺陷(“HRD”)的癌症、包含聚合酶δ(POLD)突变的癌症和包含聚合酶ε(POLE)突变的癌症。
在一些实施方案中，待治疗的肿瘤的特征在于微卫星不稳定性。在一些实施方案中，肿瘤的特征在于微卫星不稳定性高状态(MSI-H)。微卫星不稳定性(“MSI”)是或包括某些细胞(诸如肿瘤细胞)的DNA中的变化，其中微卫星(DNA的短重复序列)的重复数目不同于其所遗传的DNA中含有的重复数目。约15％的散发性结肠直肠癌(CRC)存在微卫星(MS)序列长度的广泛改变，称为微卫星不稳定性(MSI)(Boland和Goel,2010)。散发性MSI CRC肿瘤表现出独特的临床病理特征，包括近二倍体核型、在老年群体和女性中发生率更高以及更好的预后(de la Chapelle和Hampel,2010；Popat等人,2005)。MSI也存在于其他肿瘤中，诸如子宫的子宫内膜癌(EC)，最常见的妇科恶性肿瘤(Duggan等人,1994)。最初用于筛查遗传性疾病(林奇综合征(Lynch syndrome))的相同参考Bethesda小组(Umar等人,2004)目前用于检测CRC和EC的MSI。然而，CRC基因组中MSI经常靶向的基因在EC基因组中很少隐藏DNA滑移事件(Gurin等人,1999)。
微卫星不稳定性是由于DNA错配修复(MMR)系统缺陷而导致的复制相关错误修复失败引起的。这种失败使得错配突变在整个基因组中持续存在，但特别是在被称为微卫星的重复DNA区域中，导致突变负载增加。已证明，至少一些以MSI-H为特征的肿瘤对某些抗PD-1剂具有改善的反应(Le等人,(2015)《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》372(26):2509-2520；Westdorp等人,(2016)《癌症免疫学与免疫治疗(CancerImmunol.Immunother.)》65(10):1249-1259)。在一些实施方案中，癌症具有高微卫星不稳定性的微卫星不稳定性(例如，MSI-H状态)。在一些实施方案中，癌症具有低微卫星不稳定性的微卫星不稳定性状态(例如，MSI-低)。在一些实施方案中，癌症具有微卫星稳定的微卫星不稳定状态(例如，MSS状态)。在一些实施方案中，微卫星不稳定性状态通过基于下一代测序(NGS)的分析法、基于免疫组织化学(IHC)的分析法和/或基于PCR的分析法来评估。在一些实施方案中，微卫星不稳定性通过NGS检测。在一些实施方案中，微卫星不稳定性通过IHC检测。在一些实施方案中，微卫星不稳定性通过PCR检测。
在实施方案中，患者患有MSI-L癌症。
在实施方案中，患者患有MSI-H癌症。在一些实施方案中，患者患有MSI-H实体瘤。在实施方案中，MSI-H癌症是MSI-H子宫内膜癌。在实施方案中，MSI-H癌症是实体瘤。在实施方案中，MSI-H癌症是转移性肿瘤。在实施方案中，MSI-H癌症是子宫内膜癌。在实施方案中，MSI-H癌症是非子宫内膜癌。在实施方案中，MSI-H癌症是结肠直肠癌。
在实施方案中，患者患有MSS癌症。在实施方案中，MSS癌症是MSS子宫内膜癌。
在实施方案中，癌症与POLE(DNA聚合酶ε)突变相关(即，癌症是POLE突变型癌症)。在实施方案中，POLE突变是核酸外切酶结构域中的突变。在实施方案中，POLE突变是种系突变。在实施方案中，POLE突变是偶发突变。在实施方案中，MSI癌症也与POLE突变相关。在实施方案中，MSS癌症也与POLE突变相关。在实施方案中，POLE突变使用测序来鉴定。在实施方案中，POLE突变型癌症是子宫内膜癌。在实施方案中，POLE突变型癌症是结肠癌。在实施方案中，POLE突变型癌症是胰腺癌、卵巢癌或小肠癌。
在实施方案中，癌症与POLD(DNA聚合酶δ)突变相关(即，癌症是POLD突变型癌症)。在实施方案中，POLD突变是核酸外切酶结构域中的突变。在实施方案中，POLD突变是体细胞突变。在实施方案中，POLD突变是种系突变。在实施方案中，POLD突变型癌症使用测序来鉴定。在实施方案中，POLD突变型癌症是子宫内膜癌。在实施方案中，POLD突变型癌症是结肠直肠癌。在实施方案中，POLD突变型癌症是脑癌。
在一些实施方案中，患者患有错配修复缺陷(MMRd)癌症。
在实施方案中，MMRd癌症是结肠直肠癌。
微卫星不稳定性可能是由于DNA错配修复(MMR)系统缺陷导致的复制相关错误修复失败引起的。这种失败使得错配突变在整个基因组中持续存在，但特别是在被称为微卫星的重复DNA区域，导致突变负荷增加，这可能会改善对某些抗PD-1剂的反应。Id.在一些实施方案中，MSI-H状态通过基于NGS的分析法和/或基于PCR的MSI分析法来评估。在一些实施方案中，微卫星不稳定性通过下一代测序检测。在实施方案中，微卫星不稳定性使用免疫组织化学(IHC)测试检测。
在实施方案中，癌症(例如，MMRd癌症)的特征在于高肿瘤突变负荷(即，癌症是高TMB癌症)。在一些实施方案中，癌症与高TMB和MSI-H相关。在一些实施方案中，癌症与高TMB和MSI-L或MSS相关。在一些实施方案中，癌症是与高TMB相关的子宫内膜癌。在一些相关实施方案中，子宫内膜癌与高TMB和MSI-H相关。在一些相关实施方案中，子宫内膜癌与高TMB和MSI-L或MSS相关。在实施方案中，高TMB癌症是结肠直肠癌。在实施方案中，高TMB癌症是肺癌(例如，小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)，诸如鳞状NSCLC或非鳞状NSCLC)。在实施方案中，高TMB癌症是黑素瘤。在实施方案中，高TMB癌症是尿路上皮癌。
在实施方案中，患者患有肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)表达升高的癌症，即患者患有高TIL癌症。在实施方案中，高TIL癌症是乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌(TNBC)或HER2阳性乳腺癌)。在实施方案中，高TIL癌症是转移性癌症(例如转移性乳腺癌)。
在实施方案中，免疫相关基因表达特征可以预测如本文所述的癌症对抗PD-1疗法的反应。例如，包含与IFN-γ信号传导相关的基因的基因组(gene panel)可以用于识别将受益于抗PD-1治疗的癌症患者。示例性基因组描述于在Ayers等人,《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》,127(8):2930-2940,2017中。在实施方案中，癌症患者患有为乳腺癌(例如TNBC)或卵巢癌的癌症。在实施方案中，癌症患者患有为膀胱癌、胃癌、胆囊癌、食管癌或头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的癌症。在实施方案中，癌症患者患有为肛门癌或结肠直肠癌的癌症。
在一些实施方案中，患者患有表达PD-L1的肿瘤。在一些实施方案中，在患者或患者群体中评估PD-L1状态。在一些实施方案中，在用抗PD-1抗体剂治疗之前、期间和/或之后，评估档案或新鲜的治疗前活检物中的突变负荷和基线基因表达谱。在一些实施方案中，评估患者中TIM-3和/或LAG-3的状态和/或表达。
在一些实施方案中，癌症患者群体中的至少一些患者先前没有用一种或多种不同的癌症治疗方式进行治疗。
在一些实施方案中，患者先前已用一种或多种不同的癌症治疗方式(例如，手术、放射疗法、化学疗法或免疫疗法中的一种或多种)进行治疗。在实施方案中，受试者先前已用两种或更多种不同的癌症治疗方式(例如，手术、放射疗法、化学疗法或免疫疗法中的一种或多种)进行治疗。在实施方案中，受试者先前已用细胞毒性治疗进行治疗。在实施方案中，受试者先前已接受化学疗法。在实施方案中，受试者先前已用两种不同的癌症治疗方式(例如，手术、放射疗法、化学疗法或免疫疗法中的一种或多种)进行治疗。在实施方案中，受试者先前已用三种不同的癌症治疗方式(例如，手术、放射疗法、化学疗法或免疫疗法中的一种或多种)进行治疗。
在本文所述方法的实施方案中，方法还包括施用手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法、抗血管生成剂或抗炎剂中的一种或多种。在实施方案中，方法还包括施用化学疗法。
在一些实施方案中，癌症患者群体中的至少一些患者先前已接受化学疗法(例如，基于铂的化学疗法)。例如，已接受两种癌症治疗的患者可以被鉴定为2L癌症患者(例如，2LNSCLC患者)。在实施方案中，患者已接受两种或更多种癌症治疗(例如，2L+癌症患者，诸如2L+子宫内膜癌患者)。在实施方案中，患者先前没有用抗PD-1疗法进行治疗。在实施方案中，患者先前接受至少一种癌症治疗(例如，患者先前接受至少一种或至少两种癌症治疗)。在实施方案中，患者先前接受至少一种转移性癌症治疗(例如，患者先前接受一种或两种转移性癌症治疗)。
在实施方案中，受试者对用抑制
PD-1的药剂的治疗有抗性。
在实施方案中，受试者是用抑制PD-1的药剂的治疗难治的。
在实施方案中，本文所述的方法使受试者对用抑制PD-1的药剂的治疗敏感。
在实施方案中，受试者包含耗尽的免疫细胞(例如，耗尽的免疫细胞是耗尽的T细胞)。
在本文所述的方法的实施方案中，受试者是动物(例如，哺乳动物)。在实施方案中，受试者是人。在实施方案中，受试者是非人哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)。因此，本文所述的方法可用于人类治疗和兽医。
在实施方案中，PD-1抑制剂(例如，抗PD-1抗体)静脉内(例如，通过静脉输注)施用。
测量肿瘤反应
在一些实施方案中，临床益处是完全反应(“CR”)、部分反应(“PR”)或疾病稳定(“SD”)。在一些实施方案中，临床益处对应于至少SD。在一些实施方案中，临床益处对应于至少PR。在一些实施方案中，临床益处对应于CR。在一些实施方案中，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的患者实现临床益处。在一些实施方案中，至少5％的患者实现临床益处。在一些实施方案中，至少5％的患者实现SD。在一些实施方案中，至少5％的患者实现至少PR。在一些实施方案中，至少5％的患者实现CR。在一些实施方案中，至少20％的患者实现临床益处。在一些实施方案中，至少20％的患者实现SD。
在一些实施方案中，临床益处(例如，SD、PR和/或CR)根据实体瘤反应评估标准(RECIST)来确定。在一些实施方案中，临床益处(例如，SD、PR和/或CR)根据RECIST指南来确定。
在一些实施方案中，肿瘤反应可以通过例如RECIST v 1.1指南来测量。指南由E.A.Eisenhauer等人在“实体瘤的新反应评估标准：修订的RECIST指南(版本1.1)(Newresponse evaluation criteria in solid tumors:Revised RECIST guideline(version1.1.))”，《欧洲癌症杂志(Eur.J.of Cancer)》，45:228-247(2009)，其以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，RECIST指南可以用作与疾病状态相关的所有协议指南的基础。在一些实施方案中，RECIST指南用于评估肿瘤对治疗的反应和/或疾病进展的日期。
RECIST指南首先要求估计基线时的总体肿瘤负荷，将其用作后续测量值的比较。肿瘤可以通过使用本领域已知的任何成像系统，例如通过CT扫描或X射线来测量。可测量的疾病被定义为存在至少一种可测量的病变。在主要终点为肿瘤进展(进展时间或在固定日期进展的比例)的研究中，方案必须规定是否仅限患有可测量疾病的患者进入，或者是否仅患有不可测量疾病的患者也符合条件。
当基线时存在多于一个可测量病变时，代表所有受累器官的最多总共五个病变(每个器官最多两个病变)的所有病变应被识别为目标病变，并将在基线时进行记录和测量(这意味着在患者仅具有一个或两个受累器官部位的情况下，将分别记录最多两个和四个病变)。
靶标病变应根据其大小(直径最大的病变)进行选择，代表所有受累器官，但此外还应为使其本身倾向于可再现性重复测量的那些器官。
淋巴结值得特别注意，因为它们是正常的解剖结构，即使不涉及肿瘤，也可以通过成像查看。被定义为可测量的并可被识别为靶标病变的病理淋巴结必须满足CT扫描的P15mm短轴的标准。仅这些淋巴结的短轴将对基线总和有贡献。淋巴结的短轴是放射科医生通常用来判断淋巴结是否被实体瘤累及的直径。淋巴结大小通常被报道为获得图像的平面中的两个维度(对于CT扫描，这几乎总是轴向平面；对于MRI，采集平面可以是轴向的、矢状的或冠状的)。这些度量中较小的是短轴。
例如，报道为20mm·30mm的腹部淋巴结具有20mm的短轴，并且被认为是恶性的可测量的淋巴结。在本实施例中，应记录20mm作为淋巴结测量值。所有其他病理性淋巴结(短轴P10mm但<15mm的那些)应视为非靶病变。短轴<10mm的淋巴结被认为是非病理性的，并且不应记录或追踪。
将计算所有靶标病变的直径总和(非淋巴结病变有最长轴，淋巴结病变有短轴)，并报道为基线直径总和。如果淋巴结被包括在总和中，则如上文所述，仅短轴被添加到总和中。基线总直径将用作参考，以进一步表征疾病可测量维度中的任何客观肿瘤消退。
包括病理性淋巴结在内的所有其他病变(或疾病部位)应被识别为非靶病变，并且也应在基线时记录。不需要进行测量，并且这些病变应按照“存在”、“不存在”或在极少数情况下“明确进展”进行跟踪。此外，可以将涉及同一器官的多个非靶病变记录为病例记录表中的单个项目(例如，“多个增大的盆腔淋巴结”或“多个肝转移”)。
在一些实施方案中，肿瘤反应可以通过例如免疫相关性RECIST(irRECIST)指南来测量，所述指南包括免疫相关性反应标准(irRC)。在irRC中，测量了可测量的病变，对于非淋巴结病变，其至少一个维度的最小尺寸为10mm(通过CT或MRI扫描的最大直径)，并且对于淋巴结病变，其尺寸大于或等于15mm，或者通过胸部X射线为至少20mm。
在一些实施方案中，免疫相关反应标准包括CR(所有病变完全消失(可测量或不可测量，并且没有新的病变))；PR(肿瘤负荷相对于基线减少50％或更多)；SD(在不存在PD的情况下不符合CR或PR标准)；或PD(肿瘤负荷相对于最低点增加25％或更多)。irRECIST的详细描述可见于Bohnsack等人,(2014)ESMO,摘要4958以及Nishino等人,(2013)《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》19(14):3936-43。
在一些实施方案中，肿瘤反应可以通过irRECIST或RECIST版本1.1评估。在一些实施方案中，肿瘤反应可以通过irRECIST和RECIST版本1.1来评估。
III.可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白
在一方面，提供了一种可活化的被掩蔽的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)结合蛋白，其包含(i)CTLA4结合结构域；(ii)CTLA4结合结构域掩蔽肽(在本文中也称为“掩蔽肽”)；和(iii)包含将掩蔽肽连接至CTLA4结合结构域的可裂解肽的接头。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的CTLA4结合蛋白是被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的CTLA4结合蛋白是结合于CTLA4的被掩蔽的双特异性抗体。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的CTLA4结合蛋白是结合于CTLA4的被掩蔽的嵌合受体。
本文中所提供的可活化的被掩蔽的CTLA4结合蛋白可以结合于来自各种物种的CTLA4，举例来说，一些结合于人类CTLA4和/或小鼠CTLA4，或食蟹猕猴CTLA4。在一些实施方案中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白具有以下特征中的一种或多种：(1)结合CTLA4(例如，人类CTLA4)；(2)在将掩蔽肽连接至结合蛋白的肽接头的蛋白酶裂解(例如，活化)之后以更高的亲和力结合CTLA4；和(3)在肿瘤位点处体内结合CTLA4。
在一个方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的CTLA4结合蛋白，其尤其适用于治疗其中CTLA4起作用的赘生性疾病。如本文所提供的可活化的被掩蔽的CTLA4结合蛋白包括能够与表达于细胞(例如，癌细胞或T细胞)表面上的CTLA4蛋白质相互作用(例如，结合)的结合结构域。在一些实施方案中，结合结构域通过包含可裂解肽的接头连接至掩蔽肽，使得掩蔽肽防止CTLA4结合结构域与CTLA4蛋白质结合。在可裂解肽的裂解之后，掩蔽肽被释放，由此允许结合结构域与CTLA4蛋白质相互作用。
在一些实施方案中，本文中还提供被掩蔽的CTLA4结合蛋白(例如，被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)，其包含(a)CTLA4结合蛋白(例如，包含第一链和第二链的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)；和(b)掩蔽肽。在一些实施方案中，CTLA4结合蛋白是包含第一链和第二链的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，且掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至抗体或其抗原结合片段的第一链或第二链的氨基端或羧基端。在一些实施方案中，第一链是或包含重链且第二链是或包含轻链；或第一链是或包含轻链且第二链是或包含重链。在一些实施方案中，第一链是或包含重链可变区且第二链是或包含轻链可变区；或第一链是或包含轻链可变区且第二链是或包含重链可变区。在一些实施方案中，以氨基端至羧基端方向，包含可裂解肽的接头包含：间隔接头、可裂解肽和间隔接头。在一些实施方案中，掩蔽肽的C端连接至包含可裂解肽的接头的N端，且包含可裂解肽的接头的C端连接至第一链(例如，轻链或轻链可变区)的N端。
CTLA4结合蛋白
如本文提供的术语“CTLA4结合蛋白”是指包含CTLA4结合结构域的多肽，所述结合结构域能够结合CTLA4蛋白或者以其他方式表现出对CTLA4蛋白的亲和力。在一些实施方案中，CTLA4结合蛋白是抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体、抗原结合片段、单链抗体等。在一些实施方案中，CTLA4结合蛋白是结合CTLA4的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段是抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。因此，在一些实施方案中，CTLA4结合蛋白是抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，CTLA4结合蛋白是结合CTLA4的嵌合抗原受体的组分。
术语“CTLA4结合结构域”是指重组表达的多肽结构域，其能够与细胞中或细胞上发现的CTLA4蛋白结合或以其他方式表现出对所述蛋白质的亲和力。用于确定CTLA4结合结构域与CTLA4的结合程度的方法是本领域中众所周知的。
在一些实施方案中，抗体是人类化抗体、嵌合抗体或人类抗体。在一些实施方案中，本文所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。在一些实施方案中，本文所述的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段是抗体片段(包括抗原结合片段)，例如dAb、Fab、Fab′-SH、Fv、scFv或(Fab′)2片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是二聚体。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是同二聚体。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是异二聚体。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是包含第一链和第二链的异二聚体，例如包含重链和轻链的异二聚体。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含第一链和第二链。在一些实施方案中，第一链是或包含重链且第二链是或包含轻链；或第一链是或包含轻链且第二链是或包含重链。在一些实施方案中，第一链是或包含重链可变区且第二链是或包含轻链可变区；或第一链是或包含轻链可变区且第二链是或包含重链可变区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含第一链和第二链(例如，轻链和重链)。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含两条第一链和两条第二链(例如两条轻链和两条重链)。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:402或408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ IDNO:403或409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:404或410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:405或411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:406或412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:407或413的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:404的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:407的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQID NO:402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:404的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:407的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ IDNO:434的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:437的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQID NO:432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:434的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:437的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:413的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQID NO:408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:410的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:413的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:440的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:443的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含(i)包含SEQID NO:438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:440的氨基酸序列的CDR-L3；且重链可变区包含(i)包含SEQ ID NO:441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:443的氨基酸序列的CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:232的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:233的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQID NO:232的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:233的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ ID NO:323的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列的轻链可变区；和包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列的VL结构域内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，且包含有包含SEQ ID NO:323的氨基酸序列的VH结构域内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列的VL结构域内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，且包含有包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列的VH结构域内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含有包含选自SEQ ID NO:321或322的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含选自SEQ ID NO:323或324的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQID NO:321的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:323的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ IDNO:321的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:323的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:322的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:324的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:322的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQID NO:324的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列的轻链可变区；和/或包含SEQ IDNO:324的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列的轻链可变区；和包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列的重链可变区。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含与SEQ IDNO:334的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或包含重链，所述重链包含与SEQ ID NO:421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链，所述轻链包含与SEQ ID NO:334的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含重链，所述重链包含与SEQ ID NO:421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的轻链；和/或包含有包含SEQ ID NO:421的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的轻链；且包含有包含SEQ ID NO:421的氨基酸序列的重链。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含有包含选自SEQ ID NO:237-318的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO:319或320的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含有包含选自SEQ ID NO:327-341的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO:366-380、421和478的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含有包含选自SEQ ID NO:327、334或342-365的氨基酸序列的轻链；和/或包含选自SEQ ID NO:366或380-397的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段具有IgG1同种型，其包含增强如本文所述的效应子功能的氨基酸取代。
在一些实施方案中，CTLA4结合结构域包含双特异性抗体的抗原结合臂的轻链和重链。在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含(i)包含SEQ ID NO:402或408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:403或409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ IDNO:404或410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中重链包含(i)包含SEQ ID NO:405或411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:406或412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:407或413的氨基酸序列的CDR-H3。在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含(i)包含SEQ ID NO:402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:404的氨基酸序列的CDR-L3；且重链包含(i)包含SEQ IDNO:405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:407的氨基酸序列的CDR-H3。在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含(i)包含SEQ ID NO:432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:434的氨基酸序列的CDR-L3；且重链包含(i)包含SEQ IDNO:435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:437的氨基酸序列的CDR-H3。在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含(i)包含SEQ ID NO:408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:410的氨基酸序列的CDR-L3；且重链包含(i)包含SEQ IDNO:411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:413的氨基酸序列的CDR-H3。在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含(i)包含SEQ ID NO:438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:440的氨基酸序列的CDR-L3；且重链包含(i)包含SEQ IDNO:441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:443的氨基酸序列的CDR-H3。
在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含有包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列的VL结构域内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，且重链包含有包含SEQ ID NO:323的氨基酸序列的VH结构域内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含有包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列的VL结构域内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，且重链包含有包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列的VH结构域内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链与SEQ ID NO:232的氨基酸序列具有94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性；和/或重链包含与SEQ ID NO:233的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。。在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含与SEQ ID NO:321的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或重链包含与SEQ ID NO:323的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含与SEQ ID NO:322的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或重链包含与SEQ ID NO:324的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。
在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列；和/或重链包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含选自SEQ ID NO:321或322的氨基酸序列；和/或重链包含选自SEQ ID NO:323或324的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含选自SEQ ID NO:237-318的氨基酸序列；和/或重链包含选自SEQ ID NO:319或320的氨基酸序列。
在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含与选自由SEQ ID NO:327-341组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或重链与选自由SEQ ID NO:366-380、421和478组成的群组的氨基酸序列具有94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性。在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含选自SEQ ID NO:327-341的氨基酸序列；和/或重链包含选自SEQ ID NO:366-380、421和478的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含选自SEQ ID NO:327、334或342-365的氨基酸序列；和/或重链包含选自SEQ ID NO:366、380-397、421和478的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含与SEQ ID NO:334的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或重链包含与SEQ ID NO:421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施方案中，轻链包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列，且重链包含SEQ IDNO:421的氨基酸序列。在双特异性抗体的一些实施方案中，CTLA4是人类CTLA4。在双特异性抗体的一些实施方案中，CTLA4是鼠类CTLA4。在一些实施方案中，双特异性抗体是鼠类抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体是人类化抗体、嵌合抗体或人类抗体。在一些实施方案中，双特异性抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在一些实施方案中，双特异性抗体具有IgG1同种型，其包含增强如本文中所描述的效应功能的氨基酸取代。
在一些实施方案中，CTLA4结合结构域包含结合于CTLA4的第一链和第二链，如用于嵌合受体中的配体结合结构域的一部分。在嵌合受体的一些实施方案中，第一链是轻链可变结构域。在一些实施方案中，第二链是重链可变结构域。在嵌合受体的一些实施方案中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO:402或408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:403或409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:404或410的氨基酸序列的CDR-L3；和/或其中第二链包含(i)包含SEQ ID NO:405或411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:406或412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:407或413的氨基酸序列的CDR-H3。在嵌合受体的一些实施方案中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO:402的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:403的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ IDNO:404的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO:405的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:406的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:407的氨基酸序列的CDR-H3。在嵌合受体的一些实施方案中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO:432的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:433的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ IDNO:434的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO:435的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:436的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:437的氨基酸序列的CDR-H3。在嵌合受体的一些实施方案中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO:408的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:409的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ IDNO:410的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO:411的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:412的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:413的氨基酸序列的CDR-H3。在嵌合受体的一些实施方案中，第一链包含(i)包含SEQ ID NO:438的氨基酸序列的CDR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的CDR-L2，和(iii)包含SEQ IDNO:440的氨基酸序列的CDR-L3；且第二链包含(i)包含SEQ ID NO:441的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:442的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:443的氨基酸序列的CDR-H3。
在嵌合受体的一些实施方案中，第一链包含有包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列的VL结构域内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，且第二链包含有包含SEQ ID NO:323的氨基酸序列的VH结构域内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。在嵌合受体的一些实施方案中，第一链包含有包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列的VL结构域内所包含的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，且第二链包含有包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列的VH结构域内所包含的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
在嵌合受体的一些实施方案中，第一链包含与SEQ ID NO:232的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或第二链包含与SEQ ID NO:233的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在嵌合受体的一些实施方案中，第一链包含与SEQ ID NO:321的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或第二链包含与SEQ ID NO:323的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在嵌合受体的一些实施方案中，第一链包含与SEQ ID NO:322的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或第二链包含与SEQ ID NO:324的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在嵌合受体的一些实施方案中，第一链包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列；和/或第二链包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列。在嵌合受体的一些实施方案中，第一链包含选自SEQ ID NO:321或322的氨基酸序列；和/或第二链包含选自SEQ ID NO:323或324的氨基酸序列。在嵌合受体的一些实施方案中，第一链包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列，且第二链包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列。
掩弊肽
如本文提供的CTLA4结合结构域掩蔽肽(也称为“掩蔽肽”)是指能够结合CTLA4结合结构域或以其他方式表现出对CTLA4结合结构域的亲和力的肽。当结合于CTLA4结合结构域时，掩蔽肽阻断、遮挡、抑制(例如，降低)或以其它方式阻止(例如，掩蔽)CTLA4结合结构域对其同源受体或蛋白质(即，CTLA4)的活性或结合。用于确定CTLA4结合结构域与CTLA4蛋白质的结合程度的方法是所属领域中众所周知的。
在实施方案中，掩蔽肽的长度是至少4个氨基酸。在一些实施方案中，掩蔽肽是线形肽。在一些实施方案中，线形肽是4聚体至24聚体。在实施方案中，掩蔽肽是环状肽。在实施方案中，环状肽是3聚体至12聚体，如由2个半胱氨酸之间的氨基酸数目定义。在实施方案中，环状肽是3聚体至20聚体。当掩蔽肽是环化肽时，环化肽是由连接两个半胱氨酸氨基酸残基的二硫键形成。在一些实施方案中，半胱氨酸氨基酸残基是末端半胱氨酸(即，位于或靠近掩蔽肽的N端和/或C端)。在实施方案中，二硫化物键连接N端半胱氨酸与C端半胱氨酸。
在一些实施方案中，掩蔽肽连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链或重链的N端。在一些实施方案中，掩蔽肽连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或重链可变区的N端。在一些实施方案中，掩蔽肽连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链或重链的C端。在一些实施方案中，掩蔽肽连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或重链可变区的C端。
在一些实施方案中，掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链或重链的N端。在一些实施方案中，掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链的N端。在一些实施方案中，掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或重链可变区的N端。在一些实施方案中，掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的N端。在一些实施方案中，掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链或重链的C端。在一些实施方案中，掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或重链可变区的C端。
在一些实施方案中，掩蔽肽包含与SEQ ID NO:1-46的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。因此，在实施方案中，掩蔽肽包含与CNLIVEGHC(SEQ ID NO:1),MQTRCKEYPRWCEHWL(SEQ ID NO:2),CKHAPYALC(SEQ ID NO:3),CPFPAKILC(SEQ ID NO:4),CPGKGLPSC(SEQ ID NO:5),NWLGEWLPPGKV(SEQ ID NO:6),QFIECPNFPRQCPGKN(SEQ ID NO:7),VRQQCSLNPGRCPYLV(SEQ ID NO:8),VWQECHTAPQLCPGKI(SEQ ID NO:9),DSYTCRGPTWMCAGNM(SEQ ID NO:10),FNHDCSGHWMRCLDQQ(SEQ ID NO:11),NKSPCRPKMVACYGIL(SEQ ID NO:12),PTPQCWNQYYECWIPS(SEQ ID NO:13),SQKCPWTKETCMHYM(SEQ ID NO:14),WHLSMYPKPPAE(SEQ ID NO:15),WHTDGFYTRLPA(SEQ ID NO:16),CIHAPYAKC(SEQ ID NO:17),CPAKIGQEC(SEQ ID NO:18),CPFPALELC(SEQ ID NO:19),CTKPAKALC(SEQ ID NO:20),DTATCYTTTGWCEGMV(SEQ ID NO:21),NSDNCGPAKSTCMYND(SEQID NO:22),PPGKCTQPHRCPPLN(SEQ ID NO:23),DDPVCWDSNPTCQTIA(SEQ ID NO:24),ISDQCSVLFLSCNTRV(SEQ ID NO:25),ACHFPHPEGC(SEQ ID NO:26),CLPPFPTKC(SEQ ID NO:27),CPDHVFPKC(SEQ ID NO:28),CWLPKPDMC(SEQ ID NO:29),CWSWPSKAC(SEQ ID NO:30),CYPFGKYEC(SEQ ID NO:31),ALTPAKWLPADD(SEQ ID NO:32),DDKECDWMHFACTGPQ(SEQ IDNO:33),DEMKCAWSLEMCVRTS(SEQ ID NO:34),DPILCPNTRMSCDNQT(SEQ ID NO:35),GNALYDSPGTML(SEQ ID NO:36),KNYECREVMPPCEPNT(SEQ ID NO:37),NSYTSPYWLPDS(SEQ IDNO:38),SLTPPYWIPREW(SEQ ID NO:39),SPLTPHDRPSFL(SEQ ID NO:40),TADVFSSSRYTR(SEQID NO:41),TDLQCPPSSPICQIEH(SEQ ID NO:42),TKCHCDGNCVMCYQMQ(SEQ ID NO:43),TLAYETPLLWLP(SEQ ID NO:44),TNWHCNNDGSSCNVRA(SEQ ID NO:45),或CNLIVQGHC(SEQ IDNO:46)的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，掩蔽肽包含与选自SEQ ID NO:1-46的氨基酸序列具有约90％同源性的氨基酸序列。举例来说，掩蔽肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有约90％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，掩蔽肽包含与选自SEQ ID NO:1-46的氨基酸序列具有约80％同源性的氨基酸序列。举例来说，掩蔽肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有约80％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，掩蔽肽包含与选自SEQ ID NO:1-46的氨基酸序列具有约70％同源性的氨基酸序列。举例来说，掩蔽肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有约70％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，掩蔽肽氨基酸序列是选自SEQ ID NO:1-46的氨基酸序列。举例来说，掩蔽肽氨基酸序列是SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一些实施方案中，掩蔽肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，掩蔽肽包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在一些实施方案中，掩蔽肽包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，掩蔽肽包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过20个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过30个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过40个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQID NO:398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:401)。在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端，所述掩蔽肽包含与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1-46。在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过50个氨基酸直接连接至选自由以下组成的群组的掩蔽肽的N端：SEQ ID NO:1-46。在一些实施方案中，至少一个氨基酸但不超过50个氨基酸直接连接至选自由SEQ ID NO:1-46组成的群组的掩蔽肽的N端，其中至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施方案中，至少一个氨基酸但不超过50个氨基酸直接连接至选自由SEQ ID NO:1-46组成的群组的掩蔽肽的N端，其中至少一个氨基酸是丙氨酸(A)。
接头
在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白包含接头，例如间隔接头。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白包含超过一个接头，例如第一间隔接头和第二间隔接头。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白包含有包含可裂解肽的接头。如本文中所使用，“包含可裂解肽的接头”是指共价键结至CTLA4结合结构域且共价键结至掩蔽肽的可以酶促方式裂解的接头。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头是以重组方式表达。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头是通过使用例如结合化学反应使连接至接头的功能性(反应性)基团与掩蔽肽反应而形成的接头。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头是通过使用例如结合化学反应使连接至接头的功能性(反应性)基团与CTLA4结合结构域反应而形成的接头。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头将掩蔽肽连接至CTLA4结合结构域的N端(例如，轻链的N端)。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头将掩蔽肽连接至CTLA4结合结构域的C端(例如，轻链的C端)。
在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头与掩蔽肽融合，如当核酸编码接头和掩蔽肽且由细胞以编码接头和掩蔽肽的氨基酸序列形式表达时。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头与CTLA4结合结构域融合，如当核酸编码接头和CTLA4结合结构域且由细胞以编码接头和CTLA4结合结构域的氨基酸序列形式表达时。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头将掩蔽肽连接至CTLA4结合结构域的N端(例如，轻链的N端)。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头将掩蔽肽连接至CTLA4结合结构域的C端(例如，轻链的C端)。
在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头是包括一个或多个甘氨酸残基、丝氨酸残基、丙氨酸残基、组氨酸残基和/或脯氨酸残基的柔性接头。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头含有直接连接至可裂解肽的N端和/或C端的间隔接头。在一些实施方案中，间隔接头包含一个或多个甘氨酸残基、丝氨酸残基、丙氨酸残基、组氨酸残基和/或脯氨酸残基。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头包含间隔接头和可裂解肽。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头包含第一间隔接头、可裂解肽和第二间隔接头。因此，在一些实施方案中，被掩蔽的CTLA4结合蛋白(例如，被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)包含有包含可裂解肽的接头，该接头包含连接至可裂解肽的N端的间隔接头(例如，第一间隔接头或间隔接头1)，和连接至可裂解肽的C端的间隔接头(例如，第二间隔接头或间隔接头2)，其中各间隔接头包含选自由SEQ ID NO:89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头的C端连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变结构域，并且包含可裂解肽的接头的N端连接至掩蔽肽。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头的C端连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变结构域，并且包含可裂解肽的接头的N端连接至掩蔽肽。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头的N端连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变结构域，并且包含可裂解肽的接头的C端连接至掩蔽肽。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头的N端连接至抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变结构域，并且包含可裂解肽的接头的C端连接至掩蔽肽。
在一些实施方案中，间隔接头包含选自SEQ ID NO:89-112和415-420的氨基酸序列。在一些实施方案中，间隔接头直接连接至可裂解肽的N端且包含选自SEQ ID NO:89-100的氨基酸序列。在一些实施方案中，间隔接头直接连接至可裂解肽的C端且包含选自SEQ IDNO:101-112和415-420的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的掩蔽肽直接连接至间隔接头的N端。因此，在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头在N端至C端方向包含：1)间隔接头(例如，包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:89-112和415-420的氨基酸序列的间隔接头)；2)可裂解肽，诸如本文所述的可裂解肽(例如，包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:47-88、464-469和479-508的氨基酸序列的可裂解肽)；和3)间隔接头(例如，包含选自氨基酸序列SEQID NO:89-112和415-420的氨基酸序列的间隔接头)。
在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头在N端至C端方向包含：1)间隔接头，其包含选自由SEQ ID NO:89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列；2)可裂解肽，其包含选自由SEQ ID NO:47-88、464-469和479-508组成的群组的氨基酸序列；和3)间隔接头，其包含选自由SEQ ID NO:89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的接头包含：1)包含SEQ IDNO:420的氨基酸序列的间隔接头；2)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的间隔接头。
在一些实施方案中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的接头包含：1)包含SEQ IDNO:96的氨基酸序列的间隔接头；2)包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的间隔接头。
在一些实施方案中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的接头包含：1)包含SEQ IDNO:415的氨基酸序列的间隔接头；2)包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的间隔接头。
在一些实施方案中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的接头包含：1)包含SEQ IDNO:416的氨基酸序列的间隔接头；2)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的间隔接头。
在一些实施方案中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的接头包含：1)包含SEQ IDNO:417的氨基酸序列的间隔接头；2)包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的间隔接头。
在一些实施方案中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的接头包含：1)包含SEQ IDNO:418的氨基酸序列的间隔接头；2)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的间隔接头。
在一些实施方案中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的接头包含：1)包含SEQ IDNO:417的氨基酸序列的间隔接头；2)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的间隔接头。
在一些实施方案中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的接头包含：1)包含SEQ IDNO:418的氨基酸序列的间隔接头；2)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的间隔接头。
在一些实施方案中，按N端至C端方向，包含可裂解肽的接头包含：1)包含SEQ IDNO:419的氨基酸序列的间隔接头；2)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的可裂解肽；和3)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的间隔接头。
在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头包含与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO:454-462。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO:454-462。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头包含SEQ ID NO:454的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含可裂解肽的接头包含SEQ ID NO:455的氨基酸序列。
可以通过所属领域中众所周知的各种方法使接头与掩蔽肽和/或CTLA4结合蛋白结合。术语“结合”和“结合化学反应”是指由已知的反应性基团在相对温和条件下进行的反应。这些反应包括(但不限于)亲核取代(例如，胺和醇与酰基卤化物、活性酯发生的反应)、亲电取代(例如，烯胺反应)和对碳-碳和碳-杂原子多重键进行的加成反应(例如，迈克尔反应(Michael reaction)、狄尔斯-阿德尔加成反应(Diels-Alder addition))。这些和其它适用的反应论述于例如March,《高级有机化学(Advanced Organic Chemistry)》,第3版,John Wiley&Sons,New York,1985；Hermanson,《生物结合技术(BioconjugateTechniques)》,Academic Press,San Diego,1996；和Feeney等人,《蛋白质修饰(Modification of Proteins)》；《化学进展(Advances in Chemistry Series)》,第198卷,American Chemical Society,Washington,D.C.,1982。
用于本文结合化学的有用反应性官能团包括例如：(a)羧基及其各种衍生物，包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰基卤、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯酯、烷基酯、烯基酯、炔基酯和芳族酯；(b)可以转化成酯、醚、醛等的羟基；(c)卤代烷基，其中卤化物可以随后被亲核基团置换，所述亲核基团例如胺、羧酸根阴离子、硫醇阴离子、碳负离子或烷氧基离子，从而导致新基团共价附接在卤素原子的位置上；(d)能够参与第尔斯-阿尔德反应(Diels-Alder reaction)的亲二烯基团，例如马来酰亚胺基；(e)醛基或酮基，使得可以通过形成羰基衍生物例如亚胺、腙、缩氨基脲或肟，或通过诸如格氏加成(Grignardaddition)或烷基锂加成的机制来进行后续衍生；(f)磺酰基卤化物基团，用于随后与胺反应，例如形成磺酰胺；(g)硫醇基团，其可转化为二硫化物，与酰基卤反应，或与金属诸如金键合；(h)胺或巯基，其可以例如被酰化、烷基化或氧化；(i)烯烃，其可以经历例如环加成、酰化、迈克尔加成等；(j)环氧化物，其可以与例如胺和羟基化合物反应；(k)亚磷酰胺和其他可用于核酸合成的标准官能团；(i)金属硅氧化物结合；和(l)金属与反应性磷基团(例如膦)的键合，以形成例如磷酸二酯键。
可以选择反应性官能团使得其不影响或干扰本文中所描述的组合物的化学稳定性。或者，可以通过保护基团的存在来保护反应性官能团不参与交联反应。
在一些实施方案中，可以通过本领域众所周知的多种方法将接头工程改造以与掩蔽肽和/或CTLA4结合蛋白融合举例来说，核酸可以被工程改造成编码具有掩蔽肽和/或CTLA4结合蛋白的接头，以在由宿主细胞以重组方式表达时产生融合蛋白质。
可裂解肽
在一些实施方案中，本文中所提供的被掩蔽的CTLA4结合蛋白(例如，被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)包含可裂解肽。在一些实施方案中，可裂解肽包含于包含可裂解肽的接头内。本文中所提供的包含可裂解肽的接头可以包括可裂解肽内的蛋白酶裂解位点。如本文中所使用，“裂解位点”是指在本文中所描述的CTLA4结合蛋白中发现的用于接头(例如，上文所描述的包含可裂解肽的接头)的一部分的裂解的可识别位点。因此，裂解位点可以在如本文中所描述的可裂解肽(包括其实施方案)的序列中发现。在一些实施方案中，裂解位点是由裂解剂识别和裂解的氨基酸序列。例示性裂解剂包括蛋白质、酶、DNA酶、RNA酶、金属、酸和碱基。可裂解肽可以是任何包括蛋白酶裂解位点的肽。例示性可裂解肽展示于表1中。
表1.代表性可裂解肽
因此，在一些实施方案中，可裂解肽包含选自由SEQ ID NO:47-88、464-469和479-508组成的群组的氨基酸序列。在一些实施方案中，可裂解肽包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些实施方案中，可裂解肽包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。在一些实施方案中，可裂解肽包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在一些实施方案中，可裂解肽包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列。在一些实施方案中，可裂解肽包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在一些实施方案中，可裂解肽包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。在一些实施方案中，可裂解肽包含SEQID NO:51的氨基酸序列。在一些实施方案中，可裂解肽包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
在一些实施方案中，蛋白酶裂解位点是肿瘤相关蛋白酶裂解位点。如本文提供的“肿瘤相关蛋白酶切割位点”是蛋白酶识别的氨基酸序列，其表达对肿瘤细胞或其肿瘤细胞环境具有特异性。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点是由选自由以下组成的群组的一种或多种酶识别的切割位点：ABHD12、ADAM12、ABHD12B、ABHD13、ABHD17A、ADAM19、ADAM20、ADAM21、ADAM28、ADAM30、ADAM33、ADAM8、ABHD17A、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS10、ADAMTS12、ADAMTS13、ADAMTS14、ADAMTS15、ADAMTS16、ADAMTS17、ADAMTS18、ADAMTS19、ADAMTS2、ADAMTS20、ADAMTS3、ADAMTS4、ABD17B、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS7、ADAMTS8、ADAMTS9、ADAMTSL1、ADAMTSL2、ADAMTSL3、ABHD17C、ADAMTSL5、ASTL、BMP1、CELA1、CELA2A、CELA2B、CELA3A、CELA3B、ADAM10、ADAM15、ADAM17、ADAM9、ADAMTS4、CTSE、CTSF、ADAMTSL4、CMA1、CTRB1、CTRC、CTSO、CTRl、CTSA、CTSW、CTSB、CTSC、CTSD、ESP1、CTSG、CTSH、GZMA、GZMB、GZMH、CTSK、GZMM、CTSL、CTSS、CTSV、CTSZ、HTRA4、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14、KLK2、KLK4、DPP4、KLK6、KLK7、KLKB1、ECE1、ECE2、ECEL1、MASP2、MEP1A、MEP1B、ELANE、FAP、GZMA、MMP11、GZMK、HGFAC、HPN、HTRA1、MMP11、MMP16、MMP17、MMP19、HTRA2、MMP20、MMP21、HTRA3、HTRA4、KEL、MMP23B、MMP24、MMP25、MMP26、MMP27、MMP28、KLK5、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、LGMN、LNPEP、MASP1、PAPPA、PAPPA2、PCSK1、NAPSA、PCSK5、PCSK6、MME、MMP1、MMP10、PLAT、PLAU、PLG、PRSS1、PRSS12、PRSS2、PRSS21、PRSS3、PRSS33、PRSS4、PRSS55、PRSS57、MMP12、PRSS8、PRSS9、PRTN3、MMP13、MMP14、ST14、TMPRSS10、TMPRSS11A、TMPRSS11D、TMPRSS11E、TMPRSS11F、TMPRSS12、TMPRSS13、MMP15、TMPRSS15、MMP2、TMPRSS2、TMPRSS3、TMPRSS4、TMPRSS5、TMPRSS6、TMPRSS7、TMPRSS9、NRDC、OVCH1、PAMR1、PCSK3、PHEX、TINAG、TPSAB1、TPSD1和TPSG1。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点是由选自由以下组成的群组的一种或多种酶识别的切割位点：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC和HTRA3。
在实施方案中，蛋白酶切割位点是基质金属蛋白酶(MMP)切割位点、含有去整合素和金属蛋白酶结构域(ADAM)的金属蛋白酶切割位点、前列腺特异性抗原(PSA)蛋白酶切割位点、尿激酶型纤溶酶原活化剂(uPA)蛋白酶切割位点、膜型丝氨酸蛋白酶1(MT-SP1)蛋白酶切割位点、蛋白裂解酶蛋白酶切割位点(ST14)或豆荚蛋白蛋白酶切割位点。在实施方案中，基质金属蛋白酶(MMP)切割位点是MMP9切割位点、MMP13切割位点或MMP2切割位点。在实施方案中，含有解整合素和金属蛋白酶结构域(ADAM)的金属蛋白酶裂解位点是ADAM9金属蛋白酶裂解位点、ADAM10金属蛋白酶裂解位点或ADAM17金属蛋白酶裂解位点。蛋白酶切割位点可以由特定氨基酸序列来指定。
在一些实施方案中，可裂解肽被选自由以下组成的群组的一种或多种酶切割：ABHD12,ADAM12,ABHD12B,ABHD13,ABHD17A,ADAM19,ADAM20,ADAM21,ADAM28,ADAM30,ADAM33,ADAM8,ABHD17A,ADAMDEC1,ADAMTS1,ADAMTS10,ADAMTS12,ADAMTS13,ADAMTS14,ADAMTS15,ADAMTS16,ADAMTS17,ADAMTS18,ADAMTS19,ADAMTS2,ADAMTS20,ADAMTS3,ADAMTS4,ABD17B,ADAMTS5,ADAMTS6,ADAMTS7,ADAMTS8,ADAMTS9,ADAMTSL1,ADAMTSL2,ADAMTSL3,ABHD17C,ADAMTSL5,ASTL,BMP1,CELA1,CELA2A,CELA2B,CELA3A,CELA3B,ADAM10,ADAM15,ADAM17,ADAM9,ADAMTS4,CTSE,CTSF,ADAMTSL4,CMA1,CTRB1,CTRC,CTSO,CTRl,CTSA,CTSW,CTSB,CTSC,CTSD,ESP1,CTSG,CTSH,GZMA,GZMB,GZMH,CTSK,GZMM,CTSL,CTSS,CTSV,CTSZ,HTRA4,KLK10,KLK11,KLK13,KLK14,KLK2,KLK4,DPP4,KLK6,KLK7,KLKB1,ECE1,ECE2,ECEL1,MASP2,MEP1A,MEP1B,ELANE,FAP,GZMA,MMP11,GZMK,HGFAC,HPN,HTRA1,MMP11,MMP16,MMP17,MMP19,HTRA2,MMP20,MMP21,HTRA3,HTRA4,KEL,MMP23B,MMP24,MMP25,MMP26,MMP27,MMP28,KLK5,MMP3,MMP7,MMP8,MMP9,LGMN,LNPEP,MASP1,PAPPA,PAPPA2,PCSK1,NAPSA,PCSK5,PCSK6,MME,MMP1,MMP10,PLAT,PLAU,PLG,PRSS1,PRSS12,PRSS2,PRSS21,PRSS3,PRSS33,PRSS4,PRSS55,PRSS57,MMP12,PRSS8,PRSS9,PRTN3,MMP13,MMP14,ST14,TMPRSS10,TMPRSS11A,TMPRSS11D,TMPRSS11E,TMPRSS11F,TMPRSS12,TMPRSS13,MMP15,TMPRSS15,MMP2,TMPRSS2,TMPRSS3,TMPRSS4,TMPRSS5,TMPRSS6,TMPRSS7,TMPRSS9,NRDC,OVCH1,PAMR1,PCSK3,PHEX,TINAG,TPSAB1,TPSD1,和TPSG1。在一些实施方案中，可裂解肽被选自由以下组成的群组的一种或多种酶切割：ADAM17、HTRA1、PRSS1、FAP、GZMK、NAPSA、MMP1、MMP2、MMP9、MMP10、MMP7、MMP12、MMP28、ADAMTS9、HGFAC和HTRA3。
在实施方案中，可裂解肽是5聚体(即，长度是5个氨基酸的肽)、6聚体(即，长度是6个氨基酸的肽)、7聚体(即，长度是7个氨基酸的肽)、8聚体(即，长度是8个氨基酸的肽)、9聚体(即，长度是9个氨基酸的肽)、10聚体(即，长度是10个氨基酸的肽)、11聚体(即，长度是11个氨基酸的肽)、12聚体(即，长度是12个氨基酸的肽)或13聚体(即，长度是13个氨基酸的肽)。
因此，在一些实施方案中，按N端至C端方向，掩蔽肽和包含可裂解肽的接头包含：1)掩蔽肽(例如，包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:1-46的氨基酸序列的掩蔽肽)，2)间隔接头(例如，包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:89-112和415-420的氨基酸序列的间隔接头)，3)可裂解肽，如本文中所描述的可裂解肽(例如，包含选自氨基酸序列SEQ ID NO:47-88、464-469和479-508的氨基酸序列的可裂解肽)，和4)间隔接头(例如，包含选自氨基酸序列SEQID NO:89-112和415-420的氨基酸序列的间隔接头)。在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过20个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过30个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过40个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:401)。
在一些实施方案中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白包含有包含掩蔽肽、间隔接头和可裂解肽的肽，其中所述肽包含选自SEQ ID NO:113-231的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白包含有包含掩蔽肽、间隔接头和可裂解肽的肽，其中所述肽包含选自SEQ ID NO:113-193的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白包含有包含掩蔽肽、间隔接头和可裂解肽的肽，其中所述肽包含选自SEQ ID NO:194-206的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白包含有包含掩蔽肽、间隔接头和可裂解肽的肽，其中所述肽包含选自SEQ ID NO:207-231的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白包含有包含掩蔽肽、第一间隔接头、可裂解肽和第二间隔接头的肽，其中所述肽包含与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO:113-231、444、446-448和450-453。在一些实施方案中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白包含有包含掩蔽肽、第一间隔接头、可裂解肽和第二间隔接头的肽，其中所述肽包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO:113-231、444、446-448和450-453。在一些实施方案中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白包含有包含掩蔽肽、第一间隔接头、可裂解肽和第二间隔接头的肽，其中所述肽包含与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列：SEQ ID NO:444、446-448和450-453。在一些实施方案中，本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白包含有包含掩蔽肽、第一间隔接头、可裂解肽和第二间隔接头的肽，其中所述肽包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO:444、446-448和450-453。
例示性被掩蔽的CTLA4结合蛋白
以下描述含有如上文所描述的某些特征的被掩蔽的CTLA4结合蛋白的某些例示性实施方案。这些实施方案仅是例示性的且不应解释为限制性。
在一些实施方案中，本文中提供被掩蔽的抗体，其包含a)结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含第一链和第二链，和b)包含选自SEQ ID NO:1-46的氨基酸序列的掩蔽肽，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至抗体或其抗原结合片段的第一链或第二链的氨基端或羧基端。在一些实施方案中，结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段是本文中所描述的任何抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含两个第一链和两个第二链。在一些实施方案中，第一链是轻链且第二链是重链。在一些实施方案中，第一链是轻链可变结构域且第二链是重链可变结构域。在一些实施方案中，可裂解肽包含选自SEQ ID NO:47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在一些实施方案中，间隔接头直接连接至可裂解肽的N端和/或C端。在一些实施方案中，间隔接头包含选自SEQ ID NO:89-112和415-420的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过20、30、40或50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施方案中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:401)。
在一些实施方案中，本文中还提供被掩蔽的抗体，其包含a)结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含第一链和第二链，和b)包含选自SEQ ID NO:1-46的氨基酸序列的掩蔽肽，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至抗体或其抗原结合片段的第一链和第二链的氨基端。在一些实施方案中，结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段是本文中所描述的任何抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含两个第一链和两个第二链。在一些实施方案中，第一链是轻链且第二链是重链。在一些实施方案中，第一链是轻链可变结构域且第二链是重链可变结构域。在一些实施方案中，可裂解肽包含选自SEQ ID NO:47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在一些实施方案中，间隔接头直接连接至可裂解肽的N端和/或C端。在一些实施方案中，间隔接头包含选自SEQ ID NO:89-112和415-420的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过20、30、40或50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施方案中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:401)。
在一些实施方案中，本文进一步提供一种被掩蔽的抗体，其包含结合至CTLA4(例如，人类CTLA4)的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含第一链和第二链，和b)包含选自SEQ ID NO:1-46的氨基酸序列的掩蔽肽，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至抗体或其抗原结合片段的第一链和第二链的羧基端。在一些实施方案中，结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段是本文中所描述的任何抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含两个第一链和两个第二链。在一些实施方案中，第一链是轻链且第二链是重链。在一些实施方案中，第一链是轻链可变结构域且第二链是重链可变结构域。在一些实施方案中，可裂解肽包含选自SEQ ID NO:47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在一些实施方案中，间隔接头直接连接至可裂解肽的N端和/或C端。在一些实施方案中，间隔接头包含选自SEQ ID NO:89-112和415-420的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过20、30、40或50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施方案中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:401)。
在一些实施方案中，本文中还提供掩蔽抗体，其包含a)结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的抗体或其抗原结合片段，和b)包含选自SEQ ID NO:1-46的氨基酸序列的掩蔽肽，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至抗体的第一链的C端或N端且掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至抗体的第二链的C端或N端。在一些实施方案中，结合于CTLA4的抗体或其抗原结合片段是本文中所描述的任何抗CTLA4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，a)抗体的第一链是轻链且抗体的第二链是轻链；b)抗体的第一链是重链且抗体的第二链是重链；或c)抗体的第一链是轻链且抗体的第二链是重链。因此，在一些实施方案中，被分离的抗体包含两条轻链中的每一条的C端和/或N端以及两条重链中的每一条的C端和/或N端上的掩蔽肽。在一些实施方案中，可裂解肽包含选自SEQ ID NO:47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在一些实施方案中，间隔接头直接连接至可裂解肽的N端和/或C端。在一些实施方案中，间隔接头包含选自SEQ ID NO:89-112和415-420的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过20、30、40或50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施方案中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:401)。
在一些实施方案中，本文中还提供被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含：a)抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，所述轻链可变区包含有包含SEQID NO:438的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQID NO:440的氨基酸序列的CDR-L3；和重链可变区，所述重链可变区包含有包含SEQ ID NO:441的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:442的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:443的氨基酸序列的CDR-H3；b)掩蔽肽，其包含选自由SEQ ID NO:1-46组成的群组的氨基酸序列；和c)可裂解肽，其包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：SEQ ID NO:47-88、464-469和479-508。在一些实施方案中，可裂解肽包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些实施方案中，可裂解肽包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过20、30、40或50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施方案中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL(SEQID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:401)。在一些实施方案中，掩蔽肽连接至可裂解肽，且可裂解肽连接至轻链可变区或重链可变区。在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段进一步包含将掩蔽肽连接至可裂解肽的间隔接头，所述间隔接头包含选自由SEQ ID NO:89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列，且进一步包含将可裂解肽连接至轻链可变区或重链可变区的间隔接头，所述间隔接头包含选自由SEQ ID NO:89-112和415-420组成的群组的氨基酸序列。在一些实施方案中，将掩蔽肽连接至可裂解肽的间隔接头包含SEQ ID NO:420的氨基酸序列，且将可裂解肽连接至轻链可变区或重链可变区的间隔接头包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列。在一些实施方案中，将掩蔽肽连接至可裂解肽的间隔接头包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列，且将可裂解肽连接至轻链可变区或重链可变区的间隔接头包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列，且重链可变区包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列。在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO:421的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的轻链，以及包含选自SEQ ID NO:113-231和444-453的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:421的氨基酸序列，并且包含选自由SEQ ID NO:358和422-431组成的群组的氨基酸序列。
在一个方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列的轻链可变区和/或包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列的重链可变区。在另一方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含选自SEQ ID NO:237-318的氨基酸序列的轻链和/或包含选自SEQ IDNO:319或320的氨基酸序列的重链。
在一个方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含选自SEQ ID NO:321或322的氨基酸序列的轻链可变区和/或包含选自SEQ IDNO:323或324的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，本文中提供被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列的轻链可变区，和包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列的重链可变区。在另一方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含选自SEQ ID NO:327-341的氨基酸序列的轻链和/或包含选自SEQ ID NO:366-380、421和478的氨基酸序列的重链。在另一方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含选自SEQID NO:327、334或342-365的氨基酸序列的轻链和/或包含选自SEQ ID NO:366或380-397的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，本文中提供被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO:334的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:421的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，本文中提供被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有包含SEQ ID NO:327的氨基酸序列的轻链，和包含SEQ ID NO:478的氨基酸序列的重链。
在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:233的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:323或324的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列相对于参考序列含有取代、插入或缺失，但包含所述氨基酸序列的抗体保留结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的能力。在一些实施方案中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)存在于HVR外部的区域中(即，在FR中)。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含选自SEQ ID NO:323或324的氨基酸序列的重链可变结构域。
在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:232的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:321或322的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列相对于参考序列含有取代、插入或缺失，但包含所述氨基酸序列的抗体保留结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的能力。在一些实施方案中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)存在于HVR外部的区域中(即，在FR中)。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含有包含选自SEQ ID NO:321或322的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，本文提供了一种可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含有a)包含掩蔽肽、包含可裂解肽的接头和轻链的氨基酸序列；和包含重链的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含掩蔽肽、包含可裂解肽的接头和轻链的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:358、422、424-426和428-431组成的群组。在一些实施方案中，包含重链的氨基酸序列包含SEQ ID NO:421的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含有掩蔽肽、包含可裂解肽的接头和轻链的氨基酸序列是选自由以下组成的群组：SEQ ID NO:358、422、424-426和428-431；且包含重链的氨基酸序列包含SEQ ID NO:421的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与选自由SEQ ID NO:358和422-431组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；和/或包含与SEQ ID NO:421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含与选自由SEQ ID NO:358和422-431组成的群组的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的的氨基酸序列；且包含与SEQ ID NO:421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的的氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含选自由SEQ ID NO:358和422-431组成的群组的氨基酸序列；和/或包含SEQ ID NO:421的氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含选自由SEQ ID NO:358和422-431组成的群组的氨基酸序列；且包含SEQ ID NO:421的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:422的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQ ID NO:421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:422的氨基酸序列，和SEQ ID NO:421的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:358的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQ ID NO:421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:358的氨基酸序列，和SEQ ID NO:421的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中提供被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:423的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQ IDNO:421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:423的氨基酸序列，和SEQ ID NO:421的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:424的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQ ID NO:421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:424的氨基酸序列，和SEQ ID NO:421的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:425的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQ ID NO:421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:425的氨基酸序列，和SEQ ID NO:421的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:426的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQ ID NO:421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:426的氨基酸序列，和SEQ ID NO:421的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中提供被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:427的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQ IDNO:421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:427的氨基酸序列，和SEQ ID NO:421的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:428的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQ ID NO:421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:428的氨基酸序列，和SEQ ID NO:421的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:429的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQ ID NO:421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:429的氨基酸序列，和SEQ ID NO:421的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:430的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQ ID NO:421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:430的氨基酸序列，和SEQ ID NO:421的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQ ID NO:431的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列；且包含与SEQ ID NO:421的氨基酸序列具有或具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:431的氨基酸序列，和SEQ ID NO:421的氨基酸序列。
存在五种类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其分别具有称为a,δ,ε,γ和μ的重链。γ和α类别进一步分成子类别，例如，人类表达以下子类别：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。IgG1抗体可以称为异型的多种多态变体形式存在(评述于Jefferis和Lefranc 2009.mAbs第1卷第4期1-7中)，其都适用于本文中的一些实施方案中。人类群体中的常见异型变体是由字母a、f、n、z或其组合标示的变体。在本文中的一些实施方案中，抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在一些实施方案中，本文中所提供的可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段具有IgG1同种型(例如，人类IgG1同种型)。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含有包含SEQ ID NO:235或236的氨基酸序列的重链恒定结构域。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含有包含SEQ ID NO:326的氨基酸序列的重链恒定结构域。在一些实施方案中，本文中所提供的抗体包含有包含SEQ ID NO:463的氨基酸序列的重链恒定结构域。
在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段在用蛋白酶诸如本文所述的蛋白酶切割时结合CTLA4。在一些实施方案中，可裂解肽是蛋白酶的底物，其与表达CTLA4的细胞或组织共定位在一个区域中。
在本发明的一个方面，提供了编码可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。在某些实施方案中，提供了包含编码可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的载体。在某些实施方案中，提供包含这类载体的宿主细胞。在本发明的另一方面中，提供一种组合物，其包含本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或本文中所描述的编码可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体的聚核苷酸。在某些实施方案中，本发明的组合物是医药配制物，其用于治疗其中CTLA4起作用的赘生性疾病，如本文中所列举的赘生性疾病。
在一些实施方案中，本文中所提供的CTLA4结合蛋白是能够结合于CTLA4的双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在一些实施方案中，一种结合特异性是针对CTLA4且另一种是针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合于CTLA4的两个不同表位。
在一些方面中，本文中提供被掩蔽的双特异性抗体，其包含a)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；b)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；和c)包含选自SEQID NO:1-46的氨基酸序列的掩蔽肽，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至第一对的轻链和/或重链的氨基端。在一些方面中，本文中提供被掩蔽的双特异性抗体，其包含a)特异性结合于CTLA4的第一对的轻链和重链；b)特异性结合于抗原的第二对的轻链和重链；和c)包含选自SEQ ID NO:1-46的氨基酸序列的掩蔽肽，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至第一对的轻链和/或重链的羧基端。在一些实施方案中，抗原是与CTLA4不同的抗原。在一些实施方案中，第一对或第二对的轻链是本文中所描述的任何轻链。在一些实施方案中，第一对或第二对的重链是本文中所描述的任何轻链。在一些实施方案中，第一对的轻链包含有包含SEQ ID NO:438的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:440的氨基酸序列的CDR-L3；且第一对的重链包含有包含SEQ IDNO:441的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:442的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ IDNO:443的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，第二对的轻链包含有包含SEQ ID NO:438的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的CDR-L2和包含SEQ ID NO:440的氨基酸序列的CDR-L3；且第二对的重链包含有包含SEQ ID NO:441的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:442的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:443的氨基酸序列的CDR-H3。在一些实施方案中，抗原是针对CTLA4的不同表位。在一些实施方案中，可裂解肽包含选自SEQ ID NO:47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在一些实施方案中，间隔接头直接连接至可裂解肽的N端和/或C端。在一些实施方案中，间隔接头包含选自SEQ ID NO:89-112和415-420的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过20、30、40或50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施方案中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:401)。
本文中所涵盖的用于被掩蔽的双特异性抗体的双特异性抗体包括鼠类双特异性抗体、人类化双特异性抗体、嵌合双特异性抗体和人类双特异性抗体。在本文中的一些实施方案中，双特异性抗体具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在一些实施方案中，本文中所提供的双特异性抗体具有IgG1同种型(例如，人类IgG1同种型)。在一些实施方案中，抗体具有包含氨基酸取代的IgG1同种型或由不具有或具有降低的将Fc聚糖海藻糖基化的能力以增强如本文中所描述的效应功能的细胞表达。在一些实施方案中，本文中所提供的被掩蔽的双特异性抗体包含有包含SEQ ID NO:235或236的氨基酸序列的重链恒定结构域。在一些实施方案中，本文中所提供的被掩蔽的双特异性抗体包含有包含SEQ ID NO:326的氨基酸序列的重链恒定结构域。在一些实施方案中，本文中所提供的被掩蔽的双特异性抗体包含有包含SEQ ID NO:463的氨基酸序列的重链恒定结构域。
在一个方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含有包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列的轻链可变区和/或包含SEQ IDNO:233的氨基酸序列的重链可变区。在另一方面中,本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含有包含选自SEQ ID NO:237-318的氨基酸序列的轻链和/或包含选自SEQ ID NO:319或320的氨基酸序列的重链。
在一个方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含有包含选自SEQ ID NO:321或322的氨基酸序列的轻链可变区和/或包含选自SEQ ID NO:323或324的氨基酸序列的重链可变区。在另一方面中,本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含有包含选自SEQ ID NO:327-341的氨基酸序列的轻链和/或包含有包含选自SEQ ID NO:366-380、421和478的氨基酸序列的重链。在另一方面中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含有包含选自SEQ ID NO:327、334或342-365的氨基酸序列的轻链和/或包含有包含选自SEQ ID NO:366或380-397的氨基酸序列的重链。
在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含重链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:233的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:323或324的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列相对于参考序列含有取代、插入或缺失，但包含所述氨基酸序列的抗体保留结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的能力。在一些实施方案中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)存在于HVR外部的区域中(即，在FR中)。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体包含有包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体包含有包含选自SEQ ID NO:323或324的氨基酸序列的重链可变结构域。
在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:232的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文中提供可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体，其包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与选自SEQ ID NO:321或322的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列相对于参考序列含有取代、插入或缺失，但包含所述氨基酸序列的抗体保留结合于CTLA4(例如，人类CTLA4)的能力。在一些实施方案中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)存在于HVR外部的区域中(即，在FR中)。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体包含有包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体包含有包含选自SEQ ID NO:321或322的氨基酸序列的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，本文中所提供的CTLA4结合蛋白是能够结合于CTLA4的嵌合受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))。CAR是将针对所需抗原(例如，CTLA4)的基于抗体的特异性与T细胞受体活化细胞内结构域组合以产生呈现特异性抗肿瘤细胞活性的嵌合蛋白质的分子。在一个实施方案中，本文中提供嵌合受体，其被工程改造成包含具有本文中所描述的CTLA4结合结构域的细胞外结构域与T细胞抗原受体复合物ζ链(例如，CD3ζ)的细胞内信号传导结构域的融合物。CTLA4结合结构域被工程改造使得其通过包含可裂解肽的接头连接至掩蔽肽，如本文中所描述的掩蔽肽。当在T细胞中表达时，本文中所提供的可活化的被掩蔽的嵌合受体在由识别可裂解肽的蛋白酶裂解后能够基于抗原结合特异性来重新引导抗原识别。在一些实施方案中，CTLA4结合结构域优选与来自共刺激性分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。在一些实施方案中，CTLA4结合结构域与选自以下群组的一个或多个细胞内结构域融合：CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域和其任何组合。
在一些方面中，本文中提供被掩蔽的嵌合受体，其包含a)结合于CTLA4的配体结合结构域，其包含第一链和第二链；b)掩蔽肽，其包含选自SEQ ID NO:1-46的氨基酸序列，c)跨膜结构域；和d)包含信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至配体结合结构域的第一链和/或第二链的氨基端。在一些实施方案中，第一链是轻链可变结构域且第二链是重链可变结构域。在本文中所描述的可活化的被掩蔽的嵌合受体的一些实施方案中，第一链包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列；和/或第二链包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一链包含选自SEQ ID NO:321或322的氨基酸序列；和/或第二链包含选自SEQ ID NO:323或324的氨基酸序列。
在一些方面中，本文中提供被掩蔽的嵌合受体，其包含a)结合于CTLA4的配体结合结构域，其包含第一链和第二链；b)掩蔽肽，其包含选自SEQ ID NO:1-46的氨基酸序列，c)跨膜结构域；和d)包含信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，其中掩蔽肽通过包含可裂解肽的接头连接至配体结合结构域的第一链和/或第二链的羧基端。在一些实施方案中，第一链是轻链可变结构域且第二链是重链可变结构域。在本文中所描述的可活化的被掩蔽的嵌合受体的一些实施方案中，第一链包含SEQ ID NO:232的氨基酸序列；和/或第二链包含SEQ ID NO:233的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一链包含选自SEQ ID NO:321或322的氨基酸序列；和/或第二链包含选自SEQ ID NO:323或324的氨基酸序列。
在本文中所描述的可活化的被掩蔽的嵌合受体的一些实施方案中，可裂解肽包含选自SEQ ID NO:47-88、464-469和479-508的氨基酸序列。在一些实施方案中，间隔接头直接连接至可裂解肽的N端和/或C端。在一些实施方案中，间隔接头包含选自SEQ ID NO:89-112和415-420的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一个氨基酸，但不超过20、30、40或50个氨基酸直接连接至掩蔽肽的N端。在一些实施方案中，至少一个氨基酸是丙氨酸(A)或甘氨酸-丙氨酸(GA)。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是可检测的标签。在一些实施方案中，直接连接至掩蔽肽的N端的所述至少一个氨基酸是YPYDVPDYA(SEQ ID NO:398)、DYKDDDDK(SEQ ID NO:399)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO:400)或GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:401)。
本文所述的示例性可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体是抗体A。抗体A包含以下CDR序列：
抗体A IMGT Kabat
HCDR1 GYTFTNYF NYFMN
HCDR2 VDPEQGRAD RVDPEQGRADYAEKFKK
HCDR3 RRAMDNYGFAY RAMDNYGFAY
LCDR1 SALSYM SANSALSYMY
LCDR2 GTS GTSNLAS
LCDR3 HHWSNTQ HHWSNTQWT
抗体A可变轻链：
EIVLTQSPDF QSVTPKEKVT ITCSANSALS YMYWYQQKPD QSPKLWVHGT SNLASGVPSRFSGSGSGTDF TLTINSLEAE DAATYYCHHW SNTQWTFGGG TKVEIK
抗体A轻链
ACPGKGLPSCGGGSSGGSGVPLSLYSGGEIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSANSALSYMYWYQQKPDQSPKLWVHGTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHHWSNTQWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC抗体A可变重链：
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFT NYFMNWVRQA PGQGLEWMGR VDPEQGRADYAEKFKKRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRA MDNYGFAYWG QGTLVTVSS
抗体A重链：
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFT NYFMNWVRQA PGQGLEWMGR VDPEQGRADYAEKFKKRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRA MDNYGFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP DVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPEEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
在一些实施方案中，可活化的CTLA4结合蛋白包含抗体A。
1.结合亲和力
免疫结合相互作用(如抗体与所述抗体对其具有特异性的抗原之间)的强度或亲和力可以由所述相互作用的平衡解离常数(KD)来表示，其中KD越小表示亲和力越大。蛋白质的免疫结合特性可以使用在所属领域中众所周知的方法定量。举例来说，一种方法包含测量抗原结合蛋白(例如，抗体)/抗原复合物形成和解离速率，其中这些速率取决于复合物搭配物的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同等地影响所述速率的几何参数。可以通过计算浓度以及实际缔合和解离速率来确定“结合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)。Koff/Kon的比能够消除所有与亲和力无关的参数且等于平衡解离常数KD。参见Davies等人,《生物化学年刊(Annual Rev Biochem.)》59:439-473,(1990)。
在一些方面，与不包含可裂解肽的亲本抗CTLA4结合蛋白相比，本文所述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)在被蛋白酶切割后以约相同或更高的亲和力结合CTLA4。在某些实施方案中，本文提供的抗CTLA4结合蛋白的平衡解离常数(KD)为≤1μM、≤150nM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在一些实施方案中，本文提供的抗CTLA4结合蛋白(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)以约50pM至约5nM的平衡解离常数(KD)结合靶蛋白(例如，CTLA4蛋白)。用于评估结合亲和力的分析是本领域众所周知的。
在一些方面，提供了表现出所需遮挡率的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)。如本文中所使用，术语“遮挡率”是指(a)在第一组条件下的参数的最大检测水平与(b)在第二组条件下的参数的最小检测值的比率。例如，在可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的情况下，遮挡率是指以下的比率：(a)在至少一种能够切割可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的可裂解肽的蛋白酶存在下与可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段结合的靶蛋白(例如，CTLA4蛋白)的最大检测水平，与(b)在蛋白酶不存在下与可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段结合的靶蛋白(例如，CTLA4蛋白)的最小检测水平。可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的遮挡率可以计算为在由蛋白酶裂解之前的可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的解离常数与在由蛋白酶裂解之后的可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的解离常数的比率。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的更大遮挡率表明，在存在能够切割可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的可裂解肽的蛋白酶的情况下，与不存在蛋白酶的情况相比，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段所结合的靶蛋白(例如，CTLA4蛋白)更大程度地出现(例如，主要出现)。在一些实施方案中，本文中提供具有最佳遮挡率的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段的最佳遮挡率表明，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段具有可用于本文设想的方法或组合物的所需性质。在一些实施方案中，本文提供的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白表现出约20至约10,000，例如约80至约100的最佳遮挡率。在另一个实施方案中，遮挡率为约20至约7,500、约20至约5,000、约20至约2,500、约20至约2,000、约20至约1,000、约20至约900、约20至约800、约20至约700、约20至约600、约20至约500、约20至约400、约20至约300、约20至约200、约20至约100、约20至约50、约30至约100、约40至约100、约50至约100、约60至约100、约70至约100、约80至约100或约100至约1,000。在一些实施方案中，本文提供的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白表现出约80至约100的最佳遮挡率。在一些实施方案中，本文提供的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白表现出约20至约1,000的最佳遮挡率。在用蛋白酶切割之前和/或切割之后，可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白与靶蛋白(例如CTLA4蛋白)的结合可以使用本领域公知的技术，例如通过ELISA来测定。
在一些方面，本文所述的掩蔽肽与抗CTLA4结合蛋白(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)结合的亲和力低于抗CTLA4结合蛋白与靶蛋白(例如，CTLA4蛋白)之间的亲和力。在某些实施方案中，本文提供的掩蔽肽与抗CTLA4结合蛋白(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)结合的平衡解离常数(KD)为≤1mM、≤1μM、≤150nM、≤100nM、≤50nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-5M或更小，例如10-5M至10-13M，例如10-5M至10-7M)。在一些实施方案中，本文提供的掩蔽肽与抗CTLA4结合蛋白(例如，抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)结合的平衡解离常数(KD)为约50nM至约50μM。用于评估结合亲和力的分析是本领域众所周知的，例如ELISA和表面等离子共振(SPR)。
2.生物活性分析法
在一些方面，本文所述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白减小了体内鼠肿瘤模型中的肿瘤体积。
IV.Pd1程序性死亡1(PD-1)
程序性死亡1(PD-1)(也称为程序性细胞死亡1)是268个氨基酸的I型跨膜蛋白，最初通过经历细胞凋亡的小鼠T细胞系的消减杂交来鉴定(Ishida等人,《欧洲分子生物学学会杂志(Embo J.)》,11:3887-95(1992))。PD-1是T细胞调节因子CD28/CTLA-4家族的成员，并且在活化的T细胞、B细胞和髓系细胞上表达(Greenwald等人,《免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)》,23:515-548(2005)；以及Sharpe等人,《自然免疫学(Nat.Immunol.)》,8:239-245(2007))。PD-1是CD28受体家族的抑制性成员，所述家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和骨髓细胞上表达(Agata等人,见上文；Okazaki等人(2002)《当前免疫学观点(Curr.Opin.Immunol)》14:391779-82；Bennett等人(2003)《免疫学杂志》170:711-8)。
已鉴定了PD-1的两种配体，即PD配体1(PD-L1)和PD配体2(PD-L2)，这两种配体都属于B7蛋白超家族(Greenwald等人,见上文)。PD-Ll在多种细胞类型中表达，包括肺、心脏、胸腺、脾和肾的细胞(参见例如Freeman等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》,192(7):1027-1034(2000)；以及Yamazaki等人,《免疫学杂志》,169(10):5538-5545(2002))。PD-L1表达在巨噬细胞和树突细胞(DC)上响应于脂多糖(LPS)和GM-CSF治疗而上调，并且在T细胞和B细胞上通过T细胞和B细胞受体发出信号后上调。PD-L1也在多种鼠肿瘤细胞系中表达(参见例如Iwai等人,《美国国家科学院院刑》,99(9):12293-12297(2002)；和Blank等人,《癌症研究》,64(3):1140-1145(2004))。相比之下，PD-L2表现出更受限制的表达模式，并且主要由抗原呈递细胞(例如，树突细胞和巨噬细胞)和一些肿瘤细胞系表达(参见例如Latchman等人,《自然免疫学》,2(3):261-238(2001))。PD-L1在肿瘤中的高表达，无论是在肿瘤细胞、基质或肿瘤微环境中的其他细胞上，都与临床预后不良相关，可能是通过抑制肿瘤中的效应T细胞并上调调节T细胞(Treg)来实现的。
PD-1负调节T细胞活化，并且这种抑制功能与胞质结构域中免疫受体基于酪氨酸的开关基序(ITSM)相关(参见例如Greenwald等人,见上文；以及Parry等人,《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》,25:9543-9553(2005))。PD-1缺乏会导致自身免疫。例如，已显示C57BL/6Pd-1敲除小鼠发展了狼疮样综合征(参见例如Nishimura等人,《免疫力(Immunity)》,11:141-1151(1999))。在人类中，PD-1基因中的单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮、1型糖尿病、类风湿性关节炎和多发性硬化进展的较高发病率相关(参见例如Nielsen等人,《组织抗原(Tissue Antigens)》,62(6):492-497(2003)；Bertsias等人,《类风湿性关节炎(Arthritis Rheum.)》,60(1):207-218(2009)；Ni等人,《人类遗传学(Hum.Genet.)》,121(2):223-232(2007)；Tahoori等人,《临床与实验风湿病学(Clin.Exp.Rheumatol.)》,29(5):763-767(2011)；以及Kroner等人,《神经学年鉴(Ann.Neurol.)》,58(1):50-57(2005))。异常的PD-1表达还与几种病理学中的T细胞功能障碍有关，例如肿瘤免疫逃避和慢性病毒感染(参见例如Barber等人,《自然》,439:682-687(2006)；和Sharpe等人,见上文)。
最新研究表明，PD-1诱导的T细胞抑制也在抗肿瘤免疫抑制中发挥作用。例如，PD-L1在多种人类和小鼠肿瘤上表达，并且PD-1与肿瘤上的PD-L1的结合导致T细胞抑制和肿瘤免疫逃避和保护(Dong等人,《自然医学(Nat.Med.)》,8:793-800(2002))。肿瘤细胞表达PD-L1与它们在体外对抗肿瘤T细胞裂解的抗性直接相关(Dong等人,见上文；以及Blank等人,《癌症研究》,64:1140-1145(2004))。PD-1基因敲除小鼠对肿瘤攻击具有抗性(Iwai等人,《国际免疫学(Int.Immunol.)》,17:133-144(2005))，并且来自PD-1敲除小鼠的T细胞当被过继性转移至荷瘤小鼠时在肿瘤排斥中高度有效(Blank等人,见上文)。使用单克隆抗体阻断PD-1抑制信号可以增强小鼠的宿主抗肿瘤免疫(Iwai等人,见上文；以及Hirano等人,《癌症研究》,65:1089-1096(2005))，并且肿瘤中的高水平PD-L1表达与许多人类癌症类型的不良预后有关(Hamanishi等人,《美国国家科学院院刊》,104:3360-335(2007)；Brown等人,J.Immunol.,170:1257-1266(2003)；以及Flies等人,《耶鲁生物学与医学杂志》,84(4):409-421(2011))。
鉴于上述情况，已开发了用于抑制PD-1活性以治疗各种类型的癌症和用于免疫增强(例如，治疗感染性疾病)的策略(参见例如Ascierto等人,《临床癌症研究(Clin.Cancer.Res)》,19(5):1009-1020(2013))。在这方面，已开发了靶向PD-1的单克隆抗体用于治疗癌症(参见例如Weber,《肿瘤学学术讨论(Semin.Oncol.)》,37(5):430-4309(2010)；以及Tang等人,《最新肿瘤学报告(Current Oncology Reports)》,15(2):98-104(2013))。例如，在I期临床试验中，尼沃单抗(也称为BMS-936558)在非小细胞肺癌、黑素瘤和肾细胞癌中产生完全或部分反应(参见例如Topalian,《新英格兰医学杂志(New EnglandJ.Med.)》,366:2443-2454(2012))，并且目前处于III期临床试验中。MK-3575是针对PD-1的人源化单克隆抗体，其在I期临床试验中显示出抗肿瘤活性的证据(参见例如Patnaik等人,2012美国临床肿瘤学会(ASCO)年会,摘要#2512)。此外，最新证据表明，靶向PD-1的疗法可以增强针对病原体诸如HIV的免疫反应(参见例如Porichis等人,《当前HIV/AIDS报告(Curr.HIV/AIDS Rep.)》,9(1):81-90(2012))。然而，尽管有这些进步，这些潜在疗法在人类中的功效可能是有限的。
抑制PD-1信号传导的药剂
本公开提供了治疗癌症的方法，其包括根据可实现临床益处的方案施用递送程序性死亡-1蛋白(PD-1)信号传导剂的组合物。
用于本发明治疗中的抑制PD-1信号传导的药剂包括结合并阻断T细胞上的PD-1受体而不触发抑制性信号转导的药剂、结合PD-1配体以防止其结合PD-1的药剂、两者都进行的药剂以及防止编码PD-1或PD-1天然配体的基因表达的药剂。结合PD-1天然配体的化合物包括PD-1本身，以及PD-1的活性片段，并且在B7-H1配体的情况下，还包括B7.1蛋白和片段。此类拮抗剂包括蛋白质、抗体、反义分子和小有机物。
本公开至少部分描述了PD-1剂(例如，PD-1剂或PD-L1剂)以及与其相关的各种组合物和方法。在一些实施方案中，PD-1信号传导剂(例如，抗PD-1抗体剂)结合PD-1的表位，所述表位阻断PD-1与其任何一种或多种推定配体的结合。
在一些实施方案中，用于本公开的组合疗法中的抑制PD-1信号传导的药剂是抗体剂。在一些实施方案中，PD-1抗体剂结合PD-1的表位，所述表位阻断PD-1与其任何一种或多种推定配体的结合。在一些实施方案中，PD-1抗体剂结合PD-1的表位，所述表位阻断PD-1与其两种或更多种推定配体的结合。在实施方案中，PD-1抗体剂结合PD-1蛋白的表位，所述表位阻断PD-1与PD-Ll和/或PD-L2的结合。本公开的PD-1抗体剂可以包含任何合适类别的重链恒定区(Fc)。在一些实施方案中，PD-1抗体剂包含基于野生型IgG1、IgG2或IgG4抗体或其变体的重链恒定区。
在一些实施方案中，抑制PD-1信号传导的药剂是单克隆抗体或其片段。在一些实施方案中，抑制PD-1信号传导的抗体剂是PD-1抗体或其片段。靶向PD-1的单克隆抗体已经过临床研究测试和/或在美国获得上市许可。靶向PD-1信号传导的抗体剂的实例包括例如下表2中列出的任何抗体剂：
表2.抗PD-1抗体剂
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在一些实施方案中，抑制PD-1信号传导的抗体剂是阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、BGB-A317、BI 754091、CX-072、德瓦鲁单抗、FAZ053、IBI308、INCSHR-1210、JNJ-63723283、JS-001、MEDI-0680、MGA-012、尼沃单抗、PDR001、派姆单抗、PF-06801591、西米普利单抗、多塔利单抗、WO2014/179664中公开的任何抗体或其衍生物。在一些实施方案中，抑制PD-1信号传导的抗体剂是选自由以下组成的群组的PD-1抗体：BGB-A317、BI 754091、CX-072、FAZ053、IBI308、INCSHR-1210、JNJ-63723283、JS-001、LY3300054、MEDI-0680、MGA-012、尼沃单抗、PD-L1 millamolecule、PDR001、派姆单抗、PF-06801591、西米普利单抗和多塔利单抗。在一些实施方案中，抑制PD-1信号传导的抗体剂是选自由尼沃单抗、派姆单抗和多塔利单抗组成的群组的PD-1抗体。
在一些实施方案中，PD-1信号传导剂是派姆单抗、尼沃单抗、阿替利珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗、多塔利单抗、PDR-001、替雷利珠单抗(BGB-A317)、西米普利单抗(REGN2810)、LY-3300054、JNJ-63723283、MGA012、BI-754091、IBI-308、卡瑞利珠单抗(camrelizumab，HR-301210)、BCD-100、JS-001、CX-072、BGB-A333、AMP-514(MEDI-0680)、AGEN-2034、CS1001、Sym-021、SHR-1316、PF-06801591、LZM009、KN-035、AB122、杰诺单抗(genolimzumab，CBT-501)、FAZ-053、CK-301、AK 104或GLS-010或WO2014/179664中公开的任何PD-1抗体。在实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在实施方案中，PD-1抑制剂是PD-1信号传导剂(例如，抗体、抗体结合物或其抗原结合片段)。在实施方案中，PD-1抑制剂是PD-L1或PD-L2结合剂，是德瓦鲁单抗、阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、BGB-A333、SHR-1316、FAZ-053、CK-301或PD-L1 millamolecule或其衍生物。
在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体剂)结合PD-1的表位，所述表位阻断PD-1与其两种或更多种推定配体的结合。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体剂)结合PD-1蛋白的表位，所述表位阻断PD-1与PD-Ll和/或PD-L2的结合。本公开的PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体剂)可以包含任何合适类别的重链恒定区(Fc)。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体剂)包含基于野生型IgG1、IgG2或IgG4抗体或其变体的重链恒定区。在一些实施方案中，PD-1结合剂是单克隆抗体。
在一些实施方案中，PD-1结合剂是或包含免疫球蛋白G4(IgG4)人源化单克隆抗体(mAb)。在一些实施方案中，PD-1结合剂包含人IGHG4*01多肽。在一些实施方案中，PD-1结合剂包含IgG重链区内的一个或多个突变。在一些实施方案中，PD-1结合剂包含在重链恒定区中具有一个或多个突变的IgG4重链恒定区。在一些实施方案中，PD-1结合剂包含在铰链区中具有一个或多个突变的IgG4重链恒定区。可以设想，在一些实施方案中，IgG4铰链区的突变可以防止与其他IgG4分子的半分子交换。在一些实施方案中，IgG4铰链区中的一个或多个突变可包括丝氨酸至脯氨酸稳定突变，其防止与其他IgG4分子的半分子交换。在一些实施方案中，IgG4铰链区中的一个或多个突变可包括S228P突变。参见例如《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》2015；290(9):5462-5469。不希望受到理论束缚，设想的是，这种点突变用于稳定抗体重链的铰链。
在一些实施方案中，PD-1结合剂是尼沃单抗、派姆单抗、阿替利珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗或WO2014/179664中公开的任何抗体。
派姆单抗是一种抗PD-1单克隆抗体(“mab”)(也称为MK-3475、SCH 9000475、Keytruda)。派姆单抗是一种免疫球蛋白G4/κ同种型人源化mAb。派姆单抗的机制包括mAb与淋巴细胞的PD-1受体结合，以阻断PD-1与体内其他细胞(包括某些癌症的肿瘤细胞)产生的PD-L1和PD-L2配体的相互作用。
与派姆单抗类似，尼沃单抗(也称为BMS-936558、Opdivo)于2014年首次获得FDA批准，用于治疗无法手术切除或在适当情况下用伊匹单抗和BRAF抑制剂治疗后转移的黑素瘤。
在一些实施方案中，PD-1抗体剂如国际专利申请公开WO2014/179664中所公开，所述专利的全部内容并入本文。
在一些实施方案中，PD-1剂选自表2中提供的PD-1剂。
示例性PD-1剂描述在表3中。
在实施方案中，PD-1剂是表3的编号1-94的PD-1剂中的任一种。
在一些实施方案中，抑制PD-1信号传导的药剂与人PD-1结合。在一些实施方案中，抑制PD-1信号传导的药剂与人PD-L1结合。
示例性PD-L1剂描述在表4中。
在实施方案中，PD-L1剂是表4的编号1-89的PD-L1剂中的任一种。
表3：PD-1剂
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在一些实施方案中，PD-1信号传导剂是表4中提供的PD-L1抑制剂。
表4：PD-L1抑制剂
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在一些实施方案中，PD-1结合剂被糖基化，并且一个或多个位点。如本文所用，“聚糖”是糖蛋白的糖聚合物(部分)组分。术语“聚糖”包括游离的聚糖，包括从糖蛋白中裂解或释放的聚糖。在一些实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含本文所述的重链、轻链和/或抗体剂的一种或多种糖型。在一些实施方案中，聚糖N-连接至Fc区。在一些实施方案中，PD-1结合剂在Asn297(Kabat编号)处被糖基化。
术语“糖型”在本文中是指糖蛋白的特定形式。也就是说，当糖蛋白包含具有与不同聚糖或聚糖组连接的可能性的特定多肽时，则糖蛋白的每个不同版本(即，其中多肽连接至特定聚糖或聚糖组)被称为“糖型”在一些实施方案中，提供的组合物包含如本文所述的重链、轻链和/或抗体剂中的一种或多种的多种糖型。
在一些实施方案中，PD-1结合剂以高亲和力与人和食蟹猴PD-1结合。在一些实施方案中，PD-1结合剂的结合可以通过表面等离子共振(SPR)来表征。在一些实施方案中，SPR测量可以证明或证实PD-1信号传导剂与人和/或食蟹猴PD-1Fc融合物的结合。在一些实施方案中，PD-1结合剂以快速缔合速率、缓慢解离速率和高亲和力结合人和食蟹猴PD-1。
在一些实施方案中，PD-1结合剂在阻断PD-1/PD-L1或PD-L2相互作用中的拮抗活性可以使用基于流式细胞术的分析法来证实或分析，所述分析法测量了表达为小鼠IgG1Fc融合蛋白(PD-L1 mFc或PD-L2 mFc)的标记的PD-L1和PD-L2与PD-1表达细胞的结合。在一些实施方案中，与IgG4同种型对照相比，PD-1结合剂可以有效地阻断PD-1/PD-L1和PD-1/PD-L2结合。
在一些实施方案中，PD-1结合剂可以有效地中和PD-1活性(例如，可以抑制PD-1与PD-L1和PD-L2的结合)。在一些实施方案中，可以在混合淋巴细胞反应(MLR)中证实或测定PD-1结合剂的功能性拮抗剂活性，所述混合淋巴细胞反应证明在添加PD-1结合剂后白介素(IL)-2的产生增加。在一些实施方案中，可以使用原代人CD4+T细胞作为应答物并使用人树突细胞作为刺激物来进行MLR分析。
在一些实施方案中，PD-1信号传导剂由包含一个或多个核酸序列的载体表达，所述核酸序列编码PD-1结合免疫球蛋白重链可变结构域多肽和/或PD-1结合免疫球蛋白轻链可变结构域多肽。在一些实施方案中，PD-1信号传导剂由包含一个或多个核酸序列的载体表达，所述核酸序列编码PD-1结合免疫球蛋白重链多肽和/或PD-1结合免疫球蛋白轻链多肽。载体可以是例如质粒、附加体、粘粒、病毒载体(例如逆转录病毒或腺病毒)或噬菌体。合适的载体和载体制备方法是本领域中众所周知的(参见例如Sambrook等人,《分子克隆实验室手册(Molecular Cloning,a Laboratory Manual)》,第3版,纽约州冷泉港的冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)(2001)，以及Ausubel等人,《分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,纽约州纽约市的格林出版公司和约翰·威利父子公司(Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,New York,N.Y.)(1994))。
在一些实施方案中，用于表达PD-1结合剂的载体还包含提供编码序列在宿主细胞中的表达的表达控制序列，诸如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、转录终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等。示例性表达控制序列是本领域已知的，并描述于例如Goeddel,《基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology)》,第185卷,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(Academic Press,San Diego,Calif.)(1990)。
包含编码本公开的PD-1结合剂的核酸的载体可以被引入到能够表达由其编码的多肽的宿主细胞，包括任何合适的原核细胞或真核细胞。宿主细胞的一些优选品质包括容易和可靠的生长、相当快的生长速率、具有良好表征的表达系统和/或容易/有效的转化或转染。
在一些实施方案中，利用哺乳动物细胞。许多合适的哺乳动物宿主细胞是本领域已知的，并且许多可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,VA))获得。合适的哺乳动物细胞的实例包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(ATCC编号CCL61)、CHO DHFR细胞(Urlaub等人,《美国国家科学院院刊》97:4216-4220(1980))、人胚胎肾(HEK)293或293T细胞(ATCC编号CRL1573)和3T3细胞(ATCC编号CCL92)。其他合适的哺乳动物细胞系是猴COS-1(ATCC编号CRL1650)和COS-7细胞系(ATCC编号CRL1651)以及CV-1细胞系(ATCC编号CCL70)。
其他示例性哺乳动物宿主细胞包括灵长类细胞系和啮齿类细胞系，包括转化的细胞系。正常二倍体细胞、来源于原代组织体外培养的细胞株以及原代外植体也是合适的。其他合适的哺乳动物细胞系包括但不限于小鼠神经母细胞瘤N2A细胞、HeLa、小鼠L-929细胞和BHK或HaK仓鼠细胞系，所有这些细胞均可从ATCC获得。用于选择合适的哺乳动物宿主细胞的方法和用于对细胞进行转化、培养、扩增、筛选和纯化的方法是本领域已知的
在一些实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。例如，哺乳动物细胞可以是人淋巴细胞系或淋巴衍生的细胞系，诸如前B淋巴细胞来源的细胞系。人淋巴样细胞系的实例包括但不限于RAMOS(CRL-1596)、Daudi(CCL-213)、EB-3(CCL-85)、DT40(CRL-2111)、18-81(Jack等人,《美国国家科学院院刊》85:1581-1585(1988))、Raji细胞(CCL-86)及其衍生物。
在一些实施方案中，PD-1结合剂被配制成药物组合物，其含有单克隆抗体或其抗原结合部分的一种或组合，与药学上可接受的载剂一起配制。抗PD-1抗体剂可以单独配制或与其他药物(例如作为佐剂)组合配制。例如，PD-l-结合剂可以与用于治疗或预防本文公开的疾病(例如，癌症)的其他药物组合施用。
治疗组合物通常在制造和储存条件下必须是无菌且稳定的。组合物可以配制为溶液剂、微乳剂、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、就分散体而言通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。在很多情况下，组合物中包含等渗剂(例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠))可能是有用的。可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来产生注射用组合物的延长吸收。
无菌注射用溶液剂可以通过以下方式来制备：将所需量的活性化合物与上文列举的成分中的一种或组合一起掺入适当的溶剂中，根据需要，然后进行无菌微过滤。一般而言，分散体通过将活性化合物掺入无菌媒介物来制备，所述分散体含有基本分散介质和所需的上文列举的其他成分。在无菌粉末的情况下制备无菌注射溶液，此类制备方法可以包括真空干燥和冷冻干燥(冻干)以从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何额外所需成分的粉末。
在一些实施方案中，治疗组合物被配制成无菌液体。在一些实施方案中，组合物不含可见颗粒。在一些实施方案中，组合物在缓冲液(例如，柠檬酸盐缓冲液)中配制。在一些实施方案中，组合物包含PD-1结合剂和两种或更多种下列物质：柠檬酸盐、精氨酸、氯化钠和聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，将本公开的治疗组合物(例如，PD-1结合剂)无菌填充到透明玻璃瓶中。在一些实施方案中，这种玻璃瓶用氯丁基弹性体塞子塞住，所述塞子与含氟聚合物层压在一起，并用铝外密封件密封。
在一些实施方案中，PD-1信号传导剂储存在2-8℃下。在一些实施方案中，本公开的药物产品不含防腐剂。
通用方案
如本文所述，所提供的方法包括根据实现临床益处的方案向患者、受试者或受试者群体施用PD-1信号传导剂。
所提供的方法可以提供各种益处(例如，临床益处)。在实施方案中，本文所述的方法实现了临床益处。在实施方案中，临床益处是疾病稳定(SD)。在实施方案中，临床益处是部分反应(PR)。在实施方案中，临床益处是完全反应(CR)。
在实施方案中，组合疗法实现了向患者施用的每种疗法的临床益处。例如，组合治疗可以改善用PD-1抑制剂(例如，本文所述的任何抗PD-1抗体)获得的临床益处。
在实施方案中，患者或受试者是动物。在实施方案中，患者或受试者是人。
在一些实施方案中，所述方案包含至少一个胃肠外剂量(parental dose)的PD-1结合剂。在一些实施方案中，所述方案包括多个胃肠外剂量。
在一些实施方案中，胃肠外剂量是PD-1信号传导剂的量，其在约5至约5000mg的范围内(例如，约5mg、约10mg、约50mg、约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约2000mg、约3000mg、约4000mg、约5000mg或由任何两个前述值限定的范围)。在一些实施方案中，PD-1信号传导剂的胃肠外剂量是500mg或1000mg。
在一些实施方案中，剂量是相对于体重的量。在一些实施方案中，PD-1信号传导剂的胃肠外剂量在约0.01mg/kg至100mg/kg动物或人体重的范围内；然而，低于或高于该示例性范围的剂量也在本发明的范围内。每日肠胃外剂量可以是约0.01mg/kg至约50mg/kg总体重(例如，约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约12mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg或由任何两个前述值限定的范围)。
在一些实施方案中，递送PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)的组合物以约1、3或10mg/kg的剂量向患者施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每两周递送约1、3或10mg/kg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每三周递送约1、3或10mg/kg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每四周递送约1、3或10mg/kg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每三周递送约1mg/kg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每三周递送约3mg/kg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每三周递送约10mg/kg剂量的方案施用。
在一些实施方案中，递送PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)的组合物以约400mg的剂量向患者施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每两周递送约400mg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每三周递送约400mg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每四周递送约400mg剂量的方案施用。
在一些实施方案中，递送PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)的组合物以约500mg的剂量向患者施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每两周递送约500mg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每三周递送约500mg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每四周递送约500mg剂量的方案施用。
在一些实施方案中，递送PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)的组合物以约800mg的剂量向患者施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每三周递送约800mg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每四周递送约800mg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每六周递送约800mg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每八周递送约800mg剂量的方案施用。
在一些实施方案中，递送PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)的组合物以约1,000mg的剂量向患者施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每三周递送约1,000mg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每四周递送约1,000mg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每五周递送约1,000mg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每六周递送约1,000mg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每七周递送约1,000mg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每八周递送约1,000mg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每九周递送约1,000mg剂量的方案施用。
在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每三周递送约500mg剂量的方案施用。在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据每六周递送约1000mg剂量的方案施用。
在一些实施方案中，PD-1-结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据以下方案施用：在前2-6个给药周期(例如，前3、4或5个给药周期)中递送第一剂量的PD-1-结合剂，然后在后续给药周期中递送第二剂量的PD-1-结合剂，直到治疗中断(例如，由于疾病进展或副作用或按照医生的指导)。在一些实施方案中，第一组2-6个给药周期(例如，前3、4或5个给药周期)的持续时间不同于后续给药周期的持续时间。在实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据以下方案施用：在前三个给药周期中每三周一次递送第一剂量的PD-1结合剂，然后在剩余给药周期中每六周或更长时间一次递送第二剂量的PD-1结合剂(例如，在剩余给药周期中每六周一次递送第二剂量的PD-1结合剂)。在实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据以下方案施用：在前四个给药周期中每三周一次递送第一剂量的PD-1结合剂，然后在剩余给药周期中每六周或更长时间一次递送第二剂量的PD-1结合剂(例如，在剩余给药周期中每六周一次递送第二剂量的PD-1结合剂)。在实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据如下方案施用：在前五个给药周期中每三周一次递送第一剂量的PD-1结合剂，然后在剩余给药周期中每六周一次递送第二剂量的PD-1结合剂(例如，在剩余给药周期中每六周一次递送第二剂量的PD-1结合剂)。在一些实施方案中，PD-1-结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据以下方案施用：在前2-6个给药周期(例如，前3、4或5个给药周期)中每三周一次递送第一剂量的PD-1-结合剂，然后每六周一次递送第二剂量的PD-1-结合剂，直到治疗中断(例如，由于疾病进展或副作用或按照医生的指导)。在一些实施方案中，PD-1-结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据以下方案施用：在前3、4或5个给药周期(例如，前4个给药周期)中每三周一次递送第一剂量的PD-1结合剂，然后每六周或更长时间一次递送第二剂量的PD-1结合剂，直到治疗中断(例如，由于疾病进展或副作用或按照医生的指导)。在实施方案中，方法包括每六周一次递送第二剂量的PD-1信号传导剂，直到治疗中断。
在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)的第一剂量和/或第二剂量为约100mg至约2,000mg(例如，约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg或约2000mg)。在一些实施方案中，第一剂量和第二剂量是相同的。在一些实施方案中，第一剂量和第二剂量是不同的。在实施方案中，第一剂量是约500mg PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)。在实施方案中，第一剂量是约1000mg PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)。
在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据包括以下的方案施用：每3周施用约500mg的剂量，共施用四次，然后在约500mg的第四次剂量后每六周施用至少一次约1,000mg的剂量。在一些实施方案中，在第一次约1000mg剂量后，每六周施用额外约1,000mg剂量，直到没有获得进一步的临床益处。在一些特定的实施方案中，PD-1信号传导剂(例如，抗PD1抗体)根据包括以下的给药方案施用：500mg持续4个周期Q3W，接着1000mgQ6W。
在一些实施方案中，PD-1结合剂(例如，抗PD-1抗体)根据包括以下的方案施用：每3周施用400mg的剂量，共施用四次，然后在第四次400mg剂量后每六周施用至少一次800mg的剂量。在一些实施方案中，在第一次800mg剂量后，每六周施用额外800mg剂量，直到没有获得进一步的临床益处。在一些特定的实施方案中，PD-1信号传导剂(例如，抗PD1抗体)根据包括以下的给药方案施用：400mg持续4个周期Q3W，接着800mg Q6W。
治疗或预防作用可以通过对接受治疗的患者进行定期评估来监测。对于几天或更长时间的重复施用，根据病状，可以重复治疗，直到出现所需的疾病症状抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的，并且是在本发明的范围内。
可以通过组合物的单次快速施用、组合物的多次快速施用或组合物的连续输注施用来递送所需剂量。
在一些实施方案中，向对先前治疗表现出反应的患者或受试者群体施用PD-1信号传导剂。在一些实施方案中，患者或受试者群体对先前癌症治疗表现出反应。
在一些实施方案中，向对先前治疗未表现出反应的患者或受试者群体施用PD-1信号传导剂。在一些实施方案中，患者或受试者群体没有接受先前癌症治疗或没有对先前癌症治疗表现出反应。
在实施方案中，受试者对用抑制PD-1的药剂的治疗有抗性。在实施方案中，受试者是用抑制PD-1的药剂的治疗难治的。在实施方案中，本文所述的方法使受试者对用抑制PD-1的药剂的治疗敏感。
组合疗法
本文提供了方法，其包括施用第一种治疗剂(例如，免疫检查点抑制剂)与一种或多种额外治疗剂的组合。
在实施方案中，本文所述的抗PD-1疗法与一种或多种额外疗法(例如，本文所述的疗法)组合施用。也就是说，用抗PD-1疗法治疗受试者，并且向受试者施用一种或多种额外疗法，使得受试者接受每种疗法。
在实施方案中，额外疗法是手术。在实施方案中，额外疗法是放射疗法。在实施方案中，额外疗法是化学疗法。在实施方案中，额外疗法是免疫疗法。
在一些实施方案中，PD-1信号传导剂与额外治疗剂，例如另一种抗体剂(例如，结合检查点抑制剂和/或化学治疗剂的抗体剂)同时或依次施用。在一些实施方案中，在施用额外治疗剂之前、期间或之后施用PD-1信号传导剂。在一些实施方案中，在施用化学疗法剂之前、期间或之后施用PD-1信号传导剂。
抗PD-1抗体剂可以单独施用或与其他药物(例如，作为佐剂)组合施用。例如，PD-l结合剂可以与用于治疗或预防本文公开的疾病(例如，癌症)的其他药剂组合施用。在这方面，PD-l结合剂可以与至少一种其他抗癌剂组合使用，所述其他抗癌剂包括例如本领域已知的任何化学疗法剂、电离辐射、小分子抗癌剂、癌症疫苗、生物疗法(例如其他单克隆抗体、杀癌病毒、基因疗法和过继性T细胞转移)和/或手术。
PD-1信号传导剂与额外治疗剂同时或依次施用，在本文中被称为“组合治疗”在组合治疗中，可以在向有需要的受试者施用额外治疗剂之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用PD-1信号传导剂。在一些实施方案中，PD-1信号传导剂和额外治疗剂间隔1分钟、间隔10分钟、间隔30分钟、间隔小于1小时，间隔1小时至2小时、间隔2小时至3小时、间隔3小时至4小时、间隔4小时至5小时、间隔5小时至6小时、间隔6小时至7小时、间隔7小时至8小时、间隔8小时至9小时、间隔9小时至10小时、间隔10小时至11小时、间隔11小时至12小时、间隔不超过24小时或间隔不超过48小时。
检查点抑制剂
在实施方案中，额外疗法是免疫疗法。在实施方案中，免疫疗法包括施用一种或多种其他免疫检查点抑制剂(例如，施用一种、两种、三种、四种或更多种其他免疫检查点抑制剂)。
用于抑制的示例性免疫检查点靶标包括：PD-1(例如，经由抗PD-1、抗PD-L1或抗PD-L2疗法)、CTLA-4、TIM-3、TIGIT、LAGs(例如LAG-3)、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、VISTA、BTLA、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GALS、腺苷、TGFR(例如TGFRβ)、B7-H1、B7-H4(VTCN1)、OX-40、CD137、CD40、IDO和CSF-1R。因此，抑制任何这些分子的药剂可以与本文所述的抗PD-1疗法组合使用。
在实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂(例如，抗体、抗体结合物或其抗原结合片段)。在实施方案中，CTLA-4抑制剂是小分子、核酸、多肽(例如，抗体)、碳水化合物、脂质、金属或毒素。在实施方案中，CTLA-4抑制剂是小分子。在实施方案中，CTLA-4抑制剂是CTLA-4结合剂。在实施方案中，CTLA-4抑制剂是抗体、抗体结合物或其抗原结合片段。
在实施方案中，CTLA-4抑制剂是本文所述的CTLA-4抗体。在实施方案中，CTLA-4抑制剂是伊匹单抗(Yervoy)、AGEN1884或曲美木单抗(tremelimumab)。
在实施方案中，检查点抑制剂是小分子、核酸、多肽(例如，抗体)、碳水化合物、脂质、金属、毒素或结合剂。在实施方案中，检查点抑制剂是抗体、抗体结合物或其抗原结合片段。
在实施方案中，免疫检查点抑制剂是抑制TIM-3、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、IDO或CSF1R的药剂。
对于具有生育能力的女性患者，优选患者在施用第一剂量的抗PD-1结合剂之前的72小时内具有阴性血清妊娠试验。还优选的是，具有生育能力的女性患者以及男性患者同意与其伴侣使用两种适当的避孕方法。在一些实施方案中，患者同意从筛查访视开始使用2种避孕方法，直到最后一次剂量的研究疗法后150天。
V.被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白制剂
使用本领域可用的技术制备本文所述的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白，其示例性方法在以下章节中更详细地描述。
1.被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白：抗体片段
本发明包括作为被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白的抗体片段。被掩蔽的抗体片段可以由传统方法(如酶促消化)或重组技术产生。在某些情形下，使用被掩蔽的抗体片段而非完全抗体可能具有优点。关于某些抗体片段的评述，参见Hudson et al.(2003)《自然医学(Nat.Med.)》9:129-134。
已经开发了用于产生抗体片段的各种技术。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化衍生的(参见例如Morimoto等人,《生物化学和生物物理学方法杂志(Journalof Biochemical and Biophysical Methods)》24:107-117(1992)；和Brennan等人,《科学(Science)》,229:81(1985))。然而，这些片段现在可以由重组宿主细胞直接产生。Fab、Fv和ScFv抗体片段都可以在大肠杆菌和其它细胞类型中表达和分泌，由此实现大量的这些被掩蔽的片段的便捷产生。或者，可以从培养基直接回收被掩蔽的Fab'-SH片段且以化学方式偶合以形成F(ab')2片段(Carter等人,《生物技术(Bio/Technology)》10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物直接分离被掩蔽的F(ab')2片段。包含FcRN/救助受体结合表位残基的具有延长的体内半衰期的被掩蔽的Fab和F(ab')2片段描述于美国专利案第5,869,046号中。用于产生被掩蔽的抗体片段的其它技术对于熟练技术人员是显而易见的。在某些实施方案中，被掩蔽的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利案第5,571,894号；和第5,587,458号。Fv和scFv是仅有的具有不含恒定区的完整组合位点的物质；因此，其可以适用于在体内使用期间的降低的非特异性结合。scFv融合蛋白质可以被构造成引起scFv的氨基或羧基端处的效应蛋白质的融合。参见《抗体工程改造(Antibody Engineering)》,Borrebaeck编,见上文。此外，包含通过多肽接头连接的两个scFv的双重scFv可以用作双特异性抗体。或者，包含三个或更多个scFv的多重scFv可以用作多特异性抗体。
本发明包括线抗体(例如，美国专利案第5,641,870号中所描述)或单链免疫球蛋白，其包含通过适当的接头连接的抗体的重链和轻链序列。这类线抗体或免疫球蛋白可以是单特异性或双特异性的。这类单链免疫球蛋白可以二聚化，从而维持与抗体类似的结构和活性，所述抗体最初是四聚体。此外，本发明的抗体可以是具有单一重链可变区且不具有轻链序列的抗体。这类抗体称为单结构域抗体(sdAb)或纳米抗体。这些抗体也包括在根据本发明的抗体的功能片段的含义中。
2.被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白：人源化抗体
本发明包括被掩蔽的人源化抗体。根据本文中所提供的指南来掩蔽人类化抗体。用于将非人类抗体人类化的各种方法是所属领域中已知的。例如，人源化抗体可以具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常称为“输入(import)”残基，其通常从“输入”可变结构域获得。基本上可以根据Winter的方法(Jones等人(1986)《自然》321:522-525；Riechmann等人(1988)《自然》332:323-327；Verhoeyen等人(1988)《科学》239:1534-1536)，通过用高变区序列取代人类抗体的相应序列来进行人类化。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中实质上少于完整的人类可变结构域已由来自非人类物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代。
3.被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白：人类抗体
本发明的人抗CTLA4抗体可通过将选自人类来源的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列与已知的人恒定结构域序列组合来构建。或者，本发明的人单克隆抗CTLA4抗体可以通过杂交瘤方法制备。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和鼠-人异源骨髓瘤细胞系已由例如Kozbor《免疫学杂志》,133:3001(1984)；Brodeur等人,《单克隆抗体产生技术和应用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)》,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,《免疫学杂志》,147:86(1991)描述。
根据本文中所提供的指南来掩蔽人抗体。
4.被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白：双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体是人类或人类化抗体。在某些实施方案中，一种结合特异性是针对CTLA4且另一种是针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合于CTLA4的两个不同表位。双特异性抗体也可以用于将细胞毒性剂定位至表达CTLA4的细胞。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如，F(ab')2双特异性抗体)。根据本文中所提供的指南来掩蔽双特异性抗体。
用于制备双特异性抗体的方法是所属领域中已知的。参见Milstein和Cuello,《自然》,305:537(1983)；1993年5月13日出版的WO 93/08829；Traunecker等人,《欧洲分子生物学会杂志》,10:3655(1991)；Kontermann和Brinkmann,《今日药物发现(Drug DiscoveryToday)》,20(7):838-847.关于产生双特异性抗体的其它详情，参见例如Suresh等人,《酶学方法(Methods in Enzymology)》,121:210(1986)。双特异性抗体包含交联或“异结合”抗体。例如，异结合物中的一种抗体可以与抗生物素蛋白偶合，另一种与生物素偶合。异结合抗体可以使用任何便利的交联方法制备。合适的交联剂以及许多交联技术是本领域中众所周知的且公开于美国专利号4,676,980中，连同许多交联技术。
5.被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白：单结构域抗体
在一些实施方案中，根据本文提供的指南来掩蔽单结构域抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的单一多肽链。在某些实施方案中，单结构域抗体是人类单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,Mass.；参见例如美国专利案第6,248,516B1号)。在一个实施方案中，单结构域抗体由抗体的全部或部分重链可变结构域组成。
6.被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白：抗体变体
在一些实施方案中，考虑了本文所述的被掩蔽的抗体的氨基酸序列修饰。举例来说，可能需要改善被掩蔽的抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将适当的变化引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包含例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，其限制条件为最终构建体具有所期望的特性。可以在制备序列时将氨基酸变化引入标的抗体氨基酸序列。
适用于鉴别抗体中可以作为用于诱变的优选位置的某些残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)《科学》,244:1081-1085所描述。在本文中，鉴别残基或目标残基的群组(例如，带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)且由中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)置换以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后，通过在取代位点处或针对取代位点引入另外的或其它变体来优化这些对取代显示出功能敏感性的氨基酸位置。因此，尽管用于引入氨基酸序列变化的位点是预定的，但突变本身的性质无需是预定的。举例来说，为了分析既定位点处的突变的性能，在目标密码子或区域处进行Ala扫描或随机突变诱发且针对所需活性来筛选被表达的免疫球蛋白。
氨基酸序列插入包含长度在一个残基至含有一百个或更多的残基的多肽范围内的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包含具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N端或C端与酶或多肽的融合，这增加了抗体的血清半衰期。
在一些实施方案中，改善药代动力学的FcRn突变包括但不限于M428L,T250Q/M428L,M252Y/S254T/T256E,P257I/N434H,D376V/N434H,P257I/Q3111,N434A,N434W,M428L/N434S,V259I/V308F,M252Y/S254T/T256E,V259I/V308F/M428L,T307Q/N434A,T307Q/N434S,T307Q/E380A/N434A,V308P/N434A,N434H,V308P。在一些实施方案中，此类突变在低pH下增强抗体与FcRn的结合，但在中性pH下不改变抗体亲和力。
在某些实施方案中，改变本发明的抗体以提高或降低抗体的糖基化程度。多肽的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接是指碳水化合物部分至天冬酰胺残基的侧链的附接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是用于将碳水化合物部分酶促附接至天冬酰胺侧链的识别序列，其中X为除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，这些三肽序列中的任一者存在于多肽中产生了潜在的糖基化位点。O-连接糖基化是指糖(即，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者)与羟氨基酸(最常见地丝氨酸或苏氨酸，但是还可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸)的附接。
抗体糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列方便地完成，从而产生或去除一个或多个上述三肽序列(对于N-连接糖基化位点)。还可以通过原始抗体序列的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的添加、缺失或取代来进行改变(对于O-连接糖基化位点)。
当抗体包含Fc区时，可以改变与其连接的碳水化合物。举例来说，具有成熟的碳水化合物结构的抗体描述于美国专利申请案第US 2003/0157108号(Presta,L.)中，所述成熟的碳水化合物结构不具有连接至抗体的Fc区的海藻糖。还参见US2004/0093621(KyowaHakko Kogyo Co.,Ltd)。在连接至抗体的Fc区的碳水化合物中具有等分N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的抗体论述于Jean-Mairet等人,WO 2003/011878和Umana等人,美国专利案第6,602,684号中。在连接至抗体的Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体报道于Patel等人,WO 1997/30087中。关于具有与Fc区连接的改变的碳水化合物的抗体，还参见WO1998/58964(Raju,S.)和WO1999/22764(Raju,S.)。关于具有被修饰的糖基化的抗原结合分子，还参见US2005/0123546(Umana等人)。
在某些实施方案中，糖基化变体包括Fc区，其中连接至Fc区的碳水化合物结构不具有海藻糖或具有减少的海藻糖。此类变体具有改善的ADCC功能。任选地，Fc区还包含进一步改善ADCC的一个或多个氨基酸取代，例如Fc区位置298、333和/或334的取代(残基的EU编号)。与“无岩藻糖基化(afucosylated)”、“去岩藻糖基化(defucosylated)”或“岩藻糖缺乏”抗体相关的出版物的实例包括：US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；Okazaki等人《分子生物学杂志》336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人,《生物技术与生物工程(Biotech.Bioeng.)》87:614(2004)。产生去海藻糖化抗体的细胞系的实例包括蛋白质海藻糖基化中的Lec13 CHO细胞缺失(Ripka等人,《生物化学与生物物理学集刊(Arch.Biochem.Biophys.)》249:533-545(1986)；美国专利申请案第US2003/0157108 A1号,Presta,L；和WO 2004/056312 A1,Adams等人，尤其实例11)，和基因敲除细胞系，如α-1,6-海藻糖基转移酶基因、FUT8、基因敲除CHO细胞(Yamane-Ohnuki等人,《生物技术与生物工程》87:614(2004))，以及过表达β1,4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnT-III)和高尔基体μ-甘露糖苷酶II(ManII)的细胞。
在本文中的任何实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白可以被工程改造以改善抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白可以在具有α1,6-岩藻糖基转移酶(Fut8)敲除的细胞系中产生。在一些其他实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白可以在过表达β1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnT-III)的细胞系中产生。在其他实施方案中，细胞系另外地过表达高尔基体μ-甘露糖苷酶II(ManII)。在本文中的一些实施方案中，被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白可以在Fc区中包含至少一个改善ADCC活性的氨基酸取代。
在一个实施方案中，改变被掩蔽的抗体以改善其血清半衰期。为了延长抗体的血清半衰期，可以将FcRN/救助受体结合表位并入抗体(尤其抗体片段)中，如例如美国专利案第5,739,277号中所描述。如本文中所使用，术语“救助受体结合表位”是指IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区中负责延长IgG分子的体内血清半衰期的表位(US2003/0190311、美国专利案第6,821,505号；美国专利案第6,165,745号；美国专利案第5,624,821号；美国专利案第5,648,260号；美国专利案第6,165,745号；美国专利案第5,834,597号)。
另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体的抗体分子中的至少一个氨基酸残基由不同残基置换。取代诱变的受关注位点包括高变区，但是还设想了FR改变。保守性取代示于表5的“优选的取代”标题下。如果此类取代导致期望的生物学活性变化，则可以引入表5中称为“示例性取代”的，或如下文根据氨基酸类别进一步描述的更实质性的变化，并筛选产物。
表5.氨基酸取代
原始残基 例示性取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
抗体生物学特性的实质性修饰通过选择在维持以下性质的作用显著不同的置换来实现：置换区域中的多肽主链的结构(例如，折叠或螺旋构象)，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或c)侧链体积。氨基酸可以根据其侧链性质的相似性进行分类(见A.L.Lehninger,《生物化学》,第二版,第73—75页,纽约沃思出版社(Worth Publishers,New York)(1975))：
(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)不带电的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者，可以基于共有的侧链特性将天然存在的残基分成各组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链定向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代需要将这些类别中的一种的成员与另一种类别交换。也可以将这类被取代的残基引入保守性取代位点或其余(非保守性)位点。
一种取代型变体涉及取代亲本抗体(例如，人类化或人类抗体)的一个或多个高变区残基。通常，被选择用于进一步研究的所得变体相对于产生其的亲本抗体将具有被修饰的(例如，改善的)生物学特性。产生这类取代型变体的便利方式涉及使用噬菌体呈现的亲和力成熟。简单来说，使若干高变区位点(例如，6-7个位点)突变以在各位点处产生所有可能的氨基酸取代。由此产生的抗体由丝状噬菌体粒子显示为与包装于各粒子内的噬菌体鞘蛋白(例如，M13的基因III产物)的至少一部分的融合物。接着，针对生物活性(例如，结合亲和力)来筛选噬菌体展示的变体。为了鉴别用于修饰的候选高变区位点，可以进行扫描诱变(例如，丙氨酸扫描)以鉴别显著促进抗原结合的高变区残基。或者或另外，可能有利的是，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴别抗体与抗原之间的接触点。根据所属领域中已知的技术，包括本文中详细描述的技术，这类接触残基和相邻残基是用于取代的候选物。在产生这类变体后，变体集合经历使用所属领域中已知的技术(包括本文中所描述的技术)进行的筛选，且可以选择在一种或多种相关分析法中具有优良特性的抗体以用于进一步研究。
通过所属领域中已知的各种方法制备编码被掩蔽的抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括(但不限于)从天然来源(在天然存在的氨基酸序列变异体的情况下)分离，或通过寡核苷酸介导的(或定点)突变诱发、PCR突变诱发以及抗体的早期制备的变体或非变体型式的盒式突变诱发来制备。
可能需要在本发明的抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，由此产生Fc区变体。Fc区变体可以包含人类Fc区序列(例如，人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，取代)，包括铰链半胱氨酸的氨基酸修饰。
在一些实施方案中，本文中所提供的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段，或可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体)具有IgG1同种型，其具有增强的效应功能。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段是去海藻糖基化的。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体是去海藻糖基化的。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段具有增加的甘露糖部分水平。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段具有增加的等分聚糖部分水平。在一些实施方案中，可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体具有增加的甘露糖部分水平。在一些实施方案中，IgG1包含氨基酸突变。
在一些实施方案中，本文提供的可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段或可活化的被掩蔽的抗CTLA4双特异性抗体具有IgG1同种型(例如，人IgG1同种型)。在一个实施方案中，IgG1包括氨基酸取代S298A、E333A和K334A，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施方案中，IgG1包括氨基酸取代S239D和I332E，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施方案中，IgG1包括氨基酸取代S239D、A330L和I332E，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施方案中，IgG1包括氨基酸取代P247I和A339D或A339Q，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施方案中，IgG1包括氨基酸取代D280H、K290S(在存在或不存在S298D或S298V的情况下)，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施方案中，IgG1包括氨基酸取代F243L、R292P和Y300L，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施方案中，IgG1包括氨基酸取代F243L、R292P、Y300L和P396L，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施方案中，IgG1包括氨基酸取代F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施方案中，IgG1包括氨基酸取代G236A、S239D和I332E，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施方案中，IgG1包括氨基酸取代K326A和E333A，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号的。在一个实施方案中，IgG1包含氨基酸取代K326W和E333S，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。在一个实施方案中，IgG1包含氨基酸取代K290E或K290N、S298G、T299A和/或K326E，其中氨基酸残基是根据如Kabat中的EU索引编号。
根据本说明书和所属领域的教示，经考虑，在一些实施方案中，本发明的抗体与野生型对应抗体相比可以包含一个或多个变化，例如在Fc区中。这些抗体与其野生型对应物相比将仍保留治疗效用所需的实质上相同的特征。举例来说，认为可以在Fc区中进行某些变化，其将引起改变(即，改善或减弱)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如WO99/51642中所描述。关于Fc区变体的其它实例，还参见Duncan和Winter《自然》322:738-40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；以及WO94/29351。WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)描述具有改善或减弱的与FcR的结合的抗体变体。这些专利公开案的内容以引用的方式具体地并入本文中。还参见Shields等人《生物化学杂志(J.Biol.杂志》9(2):6591-6604(2001)。具有增加的半衰期和与新生儿Fc受体(FcRn)的改善的结合(其负责母体IgG向胎儿的转移，Guyer等人,《免疫学杂志》117:587(1976)以及Kim等人,《免疫学杂志》24:249(1994))的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)中。这些抗体包括具有一或多个取代的Fc区，其中所述取代改善Fc区与FcRn的结合。具有改变的Fc区氨基酸序列和增加或降低的C1q结合能力的多肽变体描述于美国专利第6,194,551B1号、WO99/51642中。这些专利公开的内容通过引用具体地并入本文。还参见Idusogie等人,《免疫学杂志》164:4178-4184(2000)。
7.被掩蔽的抗体-药物结合物
本发明还提供被掩蔽的抗体-药物结合物(ADC)，其包含与一种或多种细胞毒性剂结合的本文中所提供的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白，所述细胞毒性剂如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素；细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素。
在一个实施方案中，与抗体-药物结合物结合的一种或多种药物包括(但不限于)类美登素(参见美国专利案第5,208,020号、第5,416,064号和欧洲专利案EP 0 425 235B1)；阿瑞他汀，如单甲基奥利斯坦(monomethylauristatin)药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利案第5,635,483号和第5,780,588号以及第7,498,298号)；海兔毒素(dolastatin)；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利案第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号和第5,877,296号；Hinman等人,《癌症研究(Cancer Res.)》53:3336-3342(1993)；和Lode等人,《癌症研究》58:2925-2928(1998))；蒽环霉素(anthracycline)，如柔红霉素(daunomycin)或小红莓(doxorubicin)(参见Kratz等人,《当前医学化学(Current Med.Chem.)》13:477-523(2006)；Jeffrey等人,《生物有机和医学化学通讯(Bioorganic&Med.Chem.Letters)》16:358-362(2006)；Torgov等人,《生物结合物化学(Bioconj.Chem.)》16:717-721(2005)；Nagy等人,《美国国家科学院院刊》97:829-834(2000)；Dubowchik等人,《生物有机和医学化学通讯》12:1529-1532(2002)；King等人,《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》45:4336-4343(2002)；和美国专利案第6,630,579号)；甲氨蝶呤(methotrexate)；长春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，如多烯紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他赛(larotaxel)、特西他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；新月毒素(trichothecene)；和CC1065。
在另一实施方案中，与抗体-药物结合物结合的一种或多种药物包括(但不限于)微管蛋白聚合抑制剂(例如，类美登素和奥瑞他汀)、DNA损伤剂(例如，吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚体、卡奇霉素、倍癌霉素和吲哚啉并苯并二氮杂二聚体)和DNA合成抑制剂(例如，依昔替康衍生物Dxd)。
在另一实施方案中，抗体-药物结合物包含与酶活性毒素或其片段结合的如本文中所描述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括(但不限于)白喉A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思子毒素A链、莫迪素A链(modeccin A chain)、α-八叠球菌(alpha-sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)蛋白质、康乃馨蛋白质、洋商陆(Phytolaca americana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树素(gelonin)、有丝分裂素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和新月毒素。
在另一实施方案中，抗体-药物结合物包含与放射性原子结合以形成放射性结合物的如本文中所描述的抗体。各种放射性同位素可以用于产生放射性结合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性结合物用于检测时，它可以包含用于闪烁成像研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或者用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)和细胞毒性剂的结合物可以使用多种双功能蛋白偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双功能衍生物(例如己二酸二甲酯HCl)、活性酯(例如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮化合物衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可以如Vitetta等人,《科学》238:1098(1987)中所述制备。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体结合的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可裂解接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等人,《癌症研究(Cancer Res.)》52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文的ADC明确包括但不限于用交联剂试剂制备的此类结合物，所述交联剂试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB，以及SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)，它们可商购获得(例如从美国伊利诺伊州罗克福德市的Pierce生物技术公司(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)商购获得)。
8.载体、宿主细胞和重组方法
关于本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白的重组产生，将编码其的核酸分离且插入可复制的载体中以用于进一步选殖(DNA的扩增)或用于表达。可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合于编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)将编码抗体的DNA容易地分离和测序。许多载体是可用的。载体的选择部分取决于所使用的宿主细胞。通常，宿主细胞是原核或真核(通常哺乳动物)来源的。应了解，任何同种型的恒定区都可以用于这一目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，且这类恒定区可以从任何人类或动物物种获得。
9.使用原核宿主细胞产生结合蛋白
a)载体构建
编码本发明可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白的多肽组分的多核苷酸序列可使用标准重组技术获得。可以从产生抗体的细胞(如融合瘤细胞)分离所需聚核苷酸序列且测序。或者，可以使用核苷酸合成器或PCR技术来合成聚核苷酸。在获得后，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制和表达异源聚核苷酸的重组载体中。所属领域中可用和已知的许多载体可以用于本发明的目的。适当载体的选择将主要取决于插入载体中的核酸的大小以及用载体转化的具体宿主细胞。各载体视其功能(异源聚核苷酸的扩增或表达或其两者)以及其与其所驻存的具体宿主细胞的相容性而含有各种组分。载体组分通常包括(但不限于)：复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物和转录终止序列。
通常，将含有来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质体载体与这些宿主结合使用。载体通常携带复制位点，以及能够在被转化的细胞中提供表型选择的标记序列。举例来说，通常使用pBR322，一种来源于大肠杆菌物种的质体，将大肠杆菌转化。pBR322含有编码安比西林(ampicillin；Amp)和四环素(Tet)抗性的基因且因此提供用于鉴别被转化的细胞的简单方法。pBR322、其衍生物或其它微生物质体或细菌噬菌体也可以含有或被修饰成含有可以由微生物用于表达内源性蛋白质的启动子。用于具体抗体的表达的pBR322衍生物的实例详细地描述于Carter等人，美国专利案第5,648,237号中。
此外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作与这些宿主结合的转化载体。例如，噬菌体诸如λGEM.TM.-11可用于制备重组载体，所述载体可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392。
本发明的表达载体可包含两种或更多种启动子-顺反子对，其编码每种多肽组分。启动子是位于顺反子上游(5′)的调节其表达的非翻译调控序列。原核启动子通常分成两个类别，即诱导性和组成性。诱导型启动子是响应于培养条件的变化(例如，存在或不存在营养物，或温度的变化)而起始在其控制下的顺反子的增加的转录水平的启动子。
由各种潜在的宿主细胞识别的大量启动子是众所周知的。借助于通过限制酶消化从源DNA移出启动子且将被分离的启动子序列插入本发明的载体，所选择的启动子可以可操作地连接至编码轻链或重链的顺反子DNA。原生启动子序列和许多异源启动子都可以用于引导目标基因的扩增和/或表达。在一些实施方案中，利用异源启动子，因为其与原生目标多肽启动子相比通常允许被表达的目标基因的更大的转录和更高的产率。
适合与原核宿主一起使用的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖酶和乳糖启动子系统、色氨酸(Trp)启动子系统和杂交启动子，如tac或trc启动子。然而，在细菌中具有功能性的其它启动子(如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是适用的。其核苷酸序列已被公开，由此使得熟练的工作人员能够使用接头或衔接子将其以可操作地方式接合至编码目标轻链和重链的顺反子(Siebenlist等人,(1980)《细胞(Cell)》20:269)，以提供任何所需的限制位点。
在本发明的一个方面中，重组载体内的各顺反子包含分泌信号序列组分，其引导被表达的多肽跨越膜的易位。通常，信号序列可以是载体的组分，或其可以是插入载体中的目标多肽DNA的一部分。为了本发明的目的而选择的信号序列应该是被宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切割)的序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，信号序列被例如选自由以下组成的群组的原核信号序列取代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或热稳定肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施方案中，表达系统的两个顺反子中使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
在另一方面中，本发明的免疫球蛋白的产生可以在宿主细胞的细胞质中进行，且因此不需要在各顺反子内存在分泌信号序列。在此方面，免疫球蛋白轻链和重链是在存在或不存在掩蔽肽的序列、接头序列等的情况下表达、折叠和组装以在细胞质内形成功能性免疫球蛋白。某些宿主品系(例如，大肠杆菌trxB品系)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，由此允许被表达的蛋白质子单元的适当折叠和组装。Proba和Pluckthun《基因(Gene)》,159:203(1995)。
本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白也可以使用其中可以调节被表达的多肽组分的定量比率，以最大化本发明的被分泌和适当组装的抗体的产率的表达系统来产生。这种调节至少部分通过同时调节多肽组分的翻译强度来实现。
适用于表达本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白的原核宿主细胞包括古细菌属和真细菌属，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例包括埃希氏菌属(例如大肠杆菌)、杆菌属(例如枯草芽孢杆菌)、肠杆菌属、假单胞菌属(例如铜绿假单胞菌)、鼠伤寒沙门氏菌属、粘质沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、志贺氏菌属、根瘤菌属、透明颤菌属或副球菌属。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为用于本发明的宿主。大肠杆菌品系的实例包括品系W3110(Bachmann,《细胞和分子生物学(Cellular and Molecular Biology)》,第2卷(Washington,D.C.:美国微生物学学会(American Society for Microbiology),1987),第1190-1219页；ATCC保藏号27,325)和其衍生物，包括具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR的品系33D3(美国专利案第5,639,635号)。其它品系和其衍生物也是合适的，如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)。这些实例是说明性而非限制性的。用于构建上文提及的任何具有既定基因型的细菌的衍生物的方法是所属领域中已知的且描述于例如Bass等人,《蛋白质(Proteins)》,8:309-314(1990)中。考虑到细菌的细胞中的复制子的复制能力，通常需要选择适当的细菌。例如，当使用众所周知的质体(如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410)供应复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌物种可以适合地用作宿主。典型地，宿主细胞应分泌最少量的蛋白水解酶，并且可能需要在细胞培养物中掺入额外蛋白酶抑制剂。
b)结合蛋白生产
用上述表达载体将宿主细胞转化且在视需要被改良的常规营养培养基中培养以用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
转化意指将DNA引入原核宿主，使得DNA是可复制的(以染色体外元件形式或通过染色体整合体)。取决于所使用的宿主细胞，使用适合于此类细胞的标准技术进行转化。通常将使用氯化钙进行的钙处理用于含有实质性细胞壁屏障的细菌细胞。另一种用于转化的方法使用聚乙二醇/DMSO。所使用的另一种技术是电穿孔。
用于产生本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白的原核细胞是在所属领域中已知且适用于培养所选择的宿主细胞的培养基中生长。合适的培养基的实例包括卢里亚培养液(luria broth；LB)加必要的营养补充剂。在一些实施方案中，培养基还含有基于表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性地允许含有表达载体的原核细胞的生长。例如，向培养基中添加安比西林以用于表达安比西林抗性基因的细胞的生长。
除碳、氮和无机磷酸盐来源以外，也可以包括适当浓度的以单独或与另一种补充剂或培养基(如复合氮来源)的混合物形式引入的任何必要的补充剂。任选地，培养基可以含有一种或多种选自由以下组成的群组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯乙酸、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。
在合适的温度下培养原核宿主细胞。在某些实施方案中，对于大肠杆菌生长，生长温度在约20℃至约39℃、约25℃至约37℃范围内，或是约30℃。主要视宿主生物而定，培养基的pH值可以是在约5至约9范围内的任何pH值。在某些实施方案中，对于大肠杆菌，pH值是约6.8至约7.4，或约7.0。
如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适合启动子激活的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面中，使用PhoA启动子控制多肽的转录。因此，在磷酸盐限制性培养基中培养被转化的宿主细胞以进行诱导。在某些实施方案中，磷酸盐限制性培养基是C.R.A.P.培养基(参见例如Simmons等人,《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》(2002),263:133-147)。如所属领域中已知，根据所使用的载体构建体，可以使用各种其它诱导剂。
在一个实施例中，被表达的本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白被分泌至宿主细胞的周质中且从其中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，通常通过如渗透休克、声波处理或溶解等手段。在破坏细胞后，通过离心或过滤来移出细胞碎片或完整细胞。蛋白质可以例如通过亲和树脂色谱法来进一步纯化。或者，可以将蛋白质运送至培养基中且在其中分离。可以从培养物移出细胞，并且过滤且浓缩培养物上清液以进行所产生的蛋白质的进一步纯化。可以使用通常已知的方法(如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和蛋白质印迹分析法(Western blot assay))进一步分离和鉴别被表达的多肽。
在本发明的一个方面，可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白的生产通过发酵过程大量进行。各种大规模补料分批发酵程序可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，在某些实施方案中具有约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌叶轮来分配氧气和营养物，尤其是葡萄糖。小规模发酵通常是指在体积容量不超过约100升且可以在约1升至约100升范围内的发酵器中发酵。
在发酵过程中，蛋白质表达的诱导通常是在细胞在合适的条件下生长至所需密度(例如，OD550是约180-220)之后起始，在此阶段细胞处于早期固定相。根据所使用的载体构建体，可以使用各种诱导剂，如所属领域中已知和上文所描述。细胞可以在诱导之前生长较短的周期。通常将细胞诱导约12-50小时，但可以使用更长或更短的诱导时间。
为了改善本发明的多肽的产率和质量，可以改良各种发酵条件。举例来说，为了改善所分泌的抗体多肽的适当组装和折叠，可以使用过表达伴随蛋白质(如Dsb蛋白质(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴随蛋白质活性的肽基脯氨酰顺,反-异构酶))的其它载体共同转化宿主原核细胞。已经证明伴随蛋白质可以促进在细菌宿主细胞中产生的异源蛋白质的适当折叠和溶解性。Chen等人(1999)《化学杂志》(J.Biol.Chem.)274:19601-19605；Georgiou等人,美国专利案第6,083,715号；Georgiou等人,美国专利案第6,027,888号；Bothmann和Pluckthun(2000)《生物化学杂志》275:17100-17105；Ramm和Pluckthun(2000)《生物化学杂志》275:17106-17113；Arie等人,(2001)《分子微生物学(Mol.Microbiol.)》39:199-210。
为了最小化被表达的异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋白水解，可以将某些缺失蛋白水解酶的宿主菌株用于本发明。举例来说，宿主细胞品系可以被修饰成实现编码已知细菌蛋白酶(如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI和其组合)的基因中的基因突变。一些大肠杆菌蛋白酶缺失型品系是可用的且描述于例如Joly等人,(1998),见上文；Georgiou等人,美国专利案第5,264,365号；Georgiou等人,美国专利案第5,508,192号；Hara等人,《微生物耐药性(Microbial DrugResistance)》,2:63-72(1996)中。
在一个实施方案中，使用缺失蛋白水解酶且用过表达一种或多种伴随蛋白质的质体转化的大肠杆菌品系作为本发明的表达系统中的宿主细胞。
c)结合蛋白纯化
在一个实施方案中，进一步纯化本文产生的被掩蔽的抗体蛋白，以获得基本上均一的制剂，用于进一步分析和使用。可以使用所属领域中已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序是合适的纯化程序示例：在免疫亲和力或离子交换柱上进行的分级分离、乙醇沉淀、逆相HPLC、在二氧化硅或阳离子交换树脂(如DEAE)上进行的色谱、色谱焦聚、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀和使用例如葡聚糖凝胶G-75的凝胶过滤。
在一个方面中，使用固定在固相上的蛋白质A进行本发明的抗体产物的免疫亲和力纯化。蛋白质A是来自金黄色葡萄球菌的41kD细胞壁蛋白质，其以高亲和力结合于抗体的Fc区。Lindmark等人,(1983)《免疫方法杂志(J.Immunol.Meth.)》62:1-13。固定蛋白质A的固相可以是包括玻璃或二氧化硅表面的柱，或受控微孔玻璃柱或硅酸柱。在一些应用中，柱涂有试剂，如甘油，以可能防止污染物的非特异性粘附。
作为纯化的第一步骤，可以将来源于如上文所描述的细胞培养物的制剂施用于蛋白质A固定的固相上以实现相关抗体与蛋白质A的特异性结合。接着，洗涤固相以去除非特异性结合于固相的污染物。最后，通过洗脱从固相回收感兴趣的抗体。
10.使用真核宿主细胞产生结合蛋白
用于真核宿主细胞的载体通常包含以下非限制性组分中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
用于真核宿主细胞的载体也可以包含信号序列或其他多肽，其在感兴趣的成熟蛋白质或多肽的N端具有特异性切割位点。所选择的异源信号序列可以是由宿主细胞识别且处理(即，由信号肽酶切割)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌引导物(例如，单纯疱疹病毒gD信号)是可用的。用于这类前体区域的DNA在阅读框架中接合至编码抗体的DNA。
a)复制起点
通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分。例如，SV40起点通常可仅因为其含有早期启动子而被使用。
b)选择基因组分
表达和克隆载体可以含有选择基因，也称为可选标志物。典型选择基因编码满足以下条件的蛋白质：(a)赋予针对抗生素或其它毒素(例如，安比西林、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)在相关情况下，补体营养缺陷，或(c)提供不可从复合培养基获得的重要营养物。
选择方案的一个实例利用药物来抑制宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的细胞产生赋予耐药性的蛋白质且由此经受住选择方案。这类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)和潮霉素(hygromycin)。
适用于哺乳动物细胞的可选标记物的另一实例是使得能够鉴别能够吸收编码可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白的核酸的细胞的标记物，如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和金属硫蛋白-II、灵长类动物金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
举例来说，在一些实施方案中，通过在含有DHFR的竞争性拮抗剂甲氨蝶呤(Mtx)的培养基中培养全部转化体来首先鉴别用DHFR选择基因转化的细胞。在一些实施方案中，当使用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是缺失DHFR活性的中国仓鼠卵巢(Chinese hamsterovary；CHO)细胞系(例如，ATCC CRL-9096)。
或者，用编码可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白、野生型DHFR蛋白质和另一种可选标记物(如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共同转化的宿主细胞(具体地说，含有内源性DHFR的野生型宿主)可以通过在含有针对可选标记物(如氨基糖苷抗生素，例如卡那霉素(kanamycin)、新霉素或G418)的选择剂的培养基中的细胞生长来选择。参见美国专利案第4,965,199号。宿主细胞可以包含NS0，包含缺失谷氨酰胺合成酶(GS)的细胞系。使用GS作为哺乳动物细胞的可选标志物的方法描述于美国专利第5,122,464号和美国专利第5,891,693号。
c)启动子组分
表达和克隆载体通常含有启动子，所述启动子被宿主生物体识别，并可操作地连接至编码感兴趣的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白的核酸。真核生物的启动子序列是已知的。例如，几乎所有真核基因都具有富含AT的区域，其位于转录起始位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大部分真核基因的3'端处是AATAAA序列，其可以是用于将聚A尾区添加至编码序列的3'端的信号。在某些实施方案中，可以将任何或所有这些序列适当地插入真核表达载体中。
从哺乳动物宿主细胞中的载体进行的转录例如通过从以下获得的启动子控制：病毒基因组，所述病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)；异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子；热休克启动子，限制条件是此类启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子方便地以还含有SV40病毒复制起点的SV40限制性片段形式获得。人类巨细胞病毒的立即早期启动子方便地以HindIII E限制性片段形式获得。用于使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统公开于美国专利案第4,419,446号。此系统的修饰描述于美国专利第4,601,978号中。还参见Reyes等人,《自然》297:598-601(1982)，其描述在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下在鼠类细胞中表达人类β-干扰素cDNA。或者，劳斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)长末端重复序列可以用作启动子。
d)增强子元件组分
通常通过在载体中插入增强子序列来增加高等真核生物对编码本发明的抗体的DNA的转录。许多增强子序列现在从哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)中已知。然而，典型地，人们将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点(bp 100-270)晚期的SV40增强子、人巨细胞病毒早期启动子增强子、鼠巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期的多瘤增强子和腺病毒增强子。也参见Yaniv,《自然》297:17-18(1982)，其描述了用于活化真核启动子的增强子元件。可以在抗体多肽编码序列的5'或3'位置处将增强子剪接至载体中，但通常位于启动子的5'位点。
e)转录终止组分
真核宿主细胞中使用的表达载体还可以含有转录终止和使mRNA稳定所必需的序列。这类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA的5'且偶尔3'非翻译区获得。这些区域含有在编码抗体的mRNA的非翻译部分中以聚腺苷酸化片段形式转录的核苷酸区段。一种适用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区域。参见WO94/11026和其中公开的表达载体。
f)宿主细胞的选择和转化
适用于在本文中的载体中克隆或表达DNA的宿主细胞包含本文中所描述的高级真核细胞，包含脊椎动物宿主细胞。在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人,《普通病毒學学期刊(J.Gen Virol.)》36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,《美国国家科学院院刊》77:4216(1980))；鼠支持细胞(TM4，Mather,《生殖生物学(Biol.Reprod.)》23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC ccl51)；TRI细胞(Mather等人,《纽约科学院年报(Annals N.Y.Acad.Sci.)》Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞，用于生产可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白，并在常规营养培养基中培养，所述培养基经改良为适于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
g)培养宿主细胞
用于产生本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白的宿主细胞可以在多种培养基中培养。可商购的培养基，如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium)((DMEM)，Sigma)适用于培养宿主细胞。此外，以下文献中描述的任何培养基都可以用作宿主细胞的培养基：Ham等人,《酶学方法(Meth.Enz.)》58:44(1979)；Barnes等人,《生物化学期刊(Anal.Biochem.)》102:255(1980)；美国专利案第4,767,704号；第4,657,866号；第4,927,762号；第4,560,655号；或第5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利案Re.30,985。这些培养基中的任一种可以视需要补充有激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量来源。本领域的技术人员将已知，还可以包含适当浓度的任何其它补充剂。培养条件，如温度、pH值等，是先前与被选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，并且对所属领域的一般技术人员来说将是显而易见的。
i)结合蛋白的纯化
当使用重组技术时，可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白可以在细胞内产生，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内产生抗体，那么作为第一步骤，可以例如通过离心或超滤来去除微粒碎片，即宿主细胞或裂解片段。当将可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白分泌至培养基中时，可以首先使用可商购的蛋白质浓缩过滤器(例如，Amicon或MilliporePellicon超滤单元)浓缩来自这类表达系统的上清液。可以在任一前述步骤中包括蛋白酶抑制剂，如PMSF，以抑制蛋白水解，且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
由细胞制备的抗体组合物可以使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱来纯化，其中亲和色谱是便利的技术。蛋白质A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的物种和同种型。蛋白质A可以用于纯化基于人类γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人,《免疫学方法杂志》62:1-13(1983))。建议将蛋白质G用于所有小鼠同种型和人类γ3(Guss等人,《欧洲分子生物学会杂志》5:15671575(1986))。与亲和配体连接的基质可以是琼脂糖，但也可以使用其它基质。机械上稳定的基质，如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯，与琼脂糖相比可以实现更快的流动速率和更短的处理时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)适用于纯化。取决于待回收的抗体，也可以使用其它蛋白质纯化技术，如在离子交换柱上进行的分级分离、乙醇沉淀、逆相HPLC、在二氧化硅上进行的色谱、在肝素SEPHAROSETM上进行的色谱、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行的色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，包含相关被掩蔽的结合蛋白和污染物的混合物可以经历进一步纯化，例如通过在约2.5-4.5之间的pH值下使用洗脱缓冲液，在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)下进行的低pH值疏水性相互作用色谱。
一般而言，在本领域中已很好地确立用于制备用于研究、测试和临床使用的抗体的各种方法，与上述方法一致和/或被本领域技术人员认为适于感兴趣的特定抗体。
VI.组合物
在一些方面中，本文中还提供包含本文中所描述的任何可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白的组合物(例如，医药组合物)。
通过将具有所需纯度的活性成分与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合来制备用于储存的治疗制剂(《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science andPractice of Pharmacy)》,第20版,宾夕法尼亚州费城加图索的利平科特·威廉斯·威爾金斯出版公司(Lippincott Williams&Wiklins,Pub.,Gennaro Ed.,Philadelphia,Pa.)2000)。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E、焦亚硫酸钠；防腐剂、等渗剂、稳定剂、金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；螯合剂诸如EDTA和/或非离子表面活性剂。
缓冲剂可用于将pH值控制在优化治疗有效性的范围内，尤其是当稳定性依赖于pH时。缓冲剂可以按约20mM至约250mM范围内的浓度存在。适合与本发明一起使用的缓冲剂包括有机和无机酸以及其盐。例如，柠檬酸盐、磷酸盐、丁二酸盐、酒石酸盐、反丁烯二酸盐、葡萄糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。另外，缓冲剂可以包括组氨酸和三甲胺盐，如Tris。
可以添加防腐剂以防止微生物成长，且通常以约0.2％-1.0％(w/v)的范围存在。适合与本发明一起使用的防腐剂包括十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六羟季铵；苯甲烃铵卤化物(例如，氯化物、溴化物、碘化物)、苄索氯铵(benzethonium chloride)；硫柳汞、苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
可以存在张力剂，有时被称为“稳定剂”，以调节或维持组合物中液体的张力。当与大型、带电生物分子(如蛋白质和抗体)一起使用时，其通常被称为“稳定剂”，因为其可以与氨基酸侧链的带电基团相互作用，由此减少分子间和分子内相互作用的可能性。考虑到其它成分的相对量，张力剂可以按约0.1％至约25重量％之间或约1至约5重量％之间的任何量存在。在一些实施方案中，张力剂包含多羟基糖醇、三羟基或更高级糖醇，如甘油、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
其它赋形剂包括可以充当以下中的一种或多种的试剂：(1)膨胀剂，(2)溶解性增强剂，(3)稳定剂，和(4)防止变性或粘附至容器壁的试剂。这类赋形剂包括：多羟基糖醇(上文列举)；氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环多醇(例如，纤维醇)、聚乙二醇；含有硫的还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫基硫酸钠；低分子量蛋白质，如人类血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其它免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖(例如，木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖)；双糖(例如乳糖、麦芽糖、蔗糖)；三糖，如棉籽糖；和多糖，如糊精或聚葡萄糖。
可以存在非离子性表面活性剂或洗涤剂(也称为“湿润剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白质避免搅拌诱导的聚集，其亦允许配制物暴露于剪切表面应力而不引起活性治疗性蛋白质或抗体的变性。非离子性表面活性剂以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml或约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。在一些实施方案中，非离子性表面活性剂以约0.001％至约0.1％w/v，或约0.01％至约0.1％w/v，或约0.01％至约0.025％w/v的范围存在。
适合的非离子表面活性剂包含聚山梨酸酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、多元醇、/>聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(/>等)、聚桂醇400，聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可以使用的阴离子去污剂包含月桂基硫酸钠、十六烷磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子性洗涤剂包含苯扎氯铵或苄索氯铵。
为了将调配物用于体内施用，其必须是无菌的。可以借助于通过无菌过滤膜过滤来是调配物变得无菌。本文中的治疗性组合物通常置放于具有无菌接入端口的容器中，例如具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
施用途径是根据已知的和可接受的方法，如通过在长时段内以合适的方式进行单次或多次推注或输注，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、病灶内或关节内途径进行注射或输注、局部施用、吸入或通过持续释放或延长释放手段。
本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)可以单独或与其它治疗剂组合使用，如在本文中所描述的方法中。术语“与...组合”包括包含在相同或单独制剂中的两种或更多种治疗剂(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白和治疗剂)。在一些实施方案中，“组合”是指“同时”施用，在此情况下，本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白的施用是与一种或多种其它治疗剂的施用同时进行(例如，在相同时间或可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白的施用与一种或多种其它治疗剂的施用之间的间隔小于一小时)。在一些实施方案中，“组合”是指连续施用，在此情况下，本发明的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白的施用是在一种或多种额外治疗剂的施用之前和/或之后进行(例如，在可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白的施用与一种或多种其它治疗剂的施用之间的间隔大于一小时)。本文中所涵盖的药剂包括(但不限于)细胞毒性剂、细胞因子、靶向免疫检查点分子的药剂、靶向免疫刺激性分子的药剂或生长抑制剂。
本文中的配制物还可以含有超过一种视需要用于所治疗的具体适应症的活性化合物，优选具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性化合物。或者或另外，组合物可以包含细胞毒性剂、细胞因子、靶向免疫检查点分子或刺激性分子的药剂或生长抑制剂。这些分子以对预期目的有效的量适当地组合存在。
VII.制品或试剂盒
在另一方面中，提供制品或试剂盒，其包含本文中所描述的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)。制品或试剂盒可以进一步包含结合蛋白在本发明的方法中的使用说明书。因此，在某些实施方案中，制品或试剂盒包含在用于治疗或预防个体中的病症(例如，癌症)的方法中使用可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)的说明，其包含向个体给予有效量的可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)。在某些实施方案中，个体是人类。在一些实施方案中，个体患有选自由以下组成的群组的疾病：白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、乳癌、神经母细胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌或睾丸癌。
制品或试剂盒可以进一步包含容器。合适的容器包括例如瓶子、小瓶(例如，双室小瓶)、注射器(如单室或双室注射器)和试管。容器可以由多种材料形成，如玻璃或塑料。容器收纳调配物。在一些实施方案中，配制物是冻干配制物。
制品或试剂盒可以进一步包含容器上或与容器相关联的标签或包装插页，其可以指示重组和/或使用配制物的说明。标签或包装插页可以进一步指示调配物适用于或意图用于皮下、静脉内或其它施用模式，以用于治疗或预防个体中的病症(例如，癌症)。收纳调配物的容器可以是单次使用式小瓶或多次使用式小瓶，其允许被复原的调配物的重复施用。制品或试剂盒可以进一步包括第二容器，其包含合适的稀释剂。制品或试剂盒可以进一步包括由市售、治疗和使用者观点看来合乎需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明书的包装插页。
在特定实施方案中，本发明提供用于单一剂量施用单元的试剂盒。这类试剂盒包含治疗性抗体的水性配制物的容器，包括单腔室或多腔室预填充注射器。例示性预填充注射器可以从Vetter GmbH,Ravensburg,Germany获得。
本文中的制品或试剂盒任选地进一步包含有包含第二药剂的容器，其中可活化的被掩蔽的抗CTLA4结合蛋白(例如，可活化的被掩蔽的抗CTLA4抗体或其抗原结合片段)是第一药剂，且所述制品或试剂盒进一步包含标签或包装插页上的关于用有效量的第二药剂治疗受试者的说明。
在另一实施方案中，本文中提供制品或试剂盒，其包含用于在自动注射器装置中施用的本文中所描述的配制物。自动注射器可以被描述为在启动后将递送其内含物，而无需患者或管理员采取其它必要措施的注射装置。当递送速率必须恒定并且递送时间大于几分钟时，它们特别适合于治疗制剂的自我给药。
实施例
通过参考以下实例将更充分地理解本发明。然而，其不应被解释为限制本发明的范围。应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅是出于说明目的，并且本领域技术人员根据这些实施例和实施方案将会想到各种修改或变化，并且这些修改或变化将被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。
实施例1.CTLA-4和PD-1信号传导剂在B-hCTLA4小鼠中的体内功效
本实施例在携带晚期MC38肿瘤的B-hCTLA4小鼠中证明了被掩蔽的抗CTLA-4(例如，抗体A)和PD-1信号传导剂(例如，RMPI-14)的体内治疗功效。
将MC38 a鼠结肠癌细胞在无菌条件下维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和10mM HEPES的杜氏改良伊戈尔培养基(Dulbecco's ModifiedEagle's medium，DMEM)中，在37℃潮湿培养箱中在具有5％ CO2的气氛中。当达到50-70％汇合时，将细胞总共传代三次，之后植入体内。
在雌性B-hCTLA4小鼠(13-14周龄)的右翼皮下注射在0.1mL无血清培养基中的MC38肿瘤细胞(0.5×106)，用于肿瘤发育。当平均肿瘤大小达到大约150mm3时，将荷瘤动物随机分成8个研究组，每组8只小鼠。如表6中所总结的，包括同种型对照组(G1：10mg/kg)、2个剂量的抗体A单一疗法(G2：0.3mg/kg，G3：1.0mg/kg)、RMP1-14单一疗法(G4：10mg/kg)、RMP1-14(10mg/kg)与2个剂量的抗体A(G5：0.3mg/kg，G6：1.0mg/kg)的组合疗法以及2个剂量的伊匹单抗单一疗法(G7：0.3mg/kg，G8：1.0mg/kg)。同种型对照、抗体A和伊匹单抗作为单次IV注射给予动物，而RMP1-14通过IP注射Q3D给予三次。
表6.研究组和治疗方案
*本实验中使用的伊匹单抗是从药房获得的临床级制剂
在整个研究过程中，每周测量并记录2-3次肿瘤体积(TV)和体重(BW)。在给药阶段之后，对动物进行监测，直到研究终点(第55天)，并且在每只动物达到TV 2000mm3或任何其他人道终点时对其实施安乐死。记录每只动物的结束日期，用于存活分析(图4A-4D)
在研究的第14天，G1对照组动物的TV(平均值SEM)为1445.78±131.99mm3。在G3(抗体A，1.0mg/kg)、G5(RMP1-14+抗体A，0.3mg/kg)和G6(RMP1-14+抗体A，1.0mg/kg)中观察到与对照相比显著的抗肿瘤功效，在第14天导致TGI分别为61％、82.3％和53％，TV(平均SEM)为648.70±178.44mm3、374.27±125.36mm3和756.14±282.52mm3(P<0.02，P＝0.0002和P<0.015，克鲁斯卡尔-瓦利斯检验(Kruskal Wallis test))。G3(抗体A，1.0mg/kg)治疗也导致8个肿瘤中的1个(12.5％)肿瘤完全消退，并且直到最后观察日(第55天)仍保持无肿瘤状态。上述3种治疗也证明了相对于对照组的显著存活益处(P＝0.00221、0.0008、0.0063；对数秩(曼特尔-考克斯)检验)。
表6.第14天的肿瘤生长抑制。
进行双向ANOVA和Dunnett多重比较的后检验，以确定治疗相对于同种型对照的统计学显著性(*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001)。
在整个研究过程中，各组之间的体重变化是无差异的，表明所有治疗都具有良好的耐受性(图2B和3B)。除了因肿瘤大小终点或严重肿瘤溃疡而实施安乐死的那些，研究期间未发现意外的临床观察或死亡。
在该研究中，甚至当治疗在肿瘤发展后期开始时，通过1.0mg/kg的抗体A单一治疗和RMP1-14与抗体A的组合治疗(均为0.3mg/kg(图2A)和1.0mg/kg(图3A)，观察到了超过同种型对照的显著抗肿瘤功效，这也导致了存活益处。用肿瘤选择性抗CTLA4进行治疗诱导了强抗肿瘤活性。与伊匹单抗相比，抗体A显示出更好的抗肿瘤活性。对照组中的所有小鼠都出现了快速生长的肿瘤，而用抗体A与抗muPD-1阻断抗体的组合的治疗导致了肿瘤生长延迟。在0.3mpk剂量的抗体A下，在MC38肿瘤模型中观察到抗muPD-1(RMP1-14)组合的协同效应。所有的治疗都良好耐受。
实施例2.抗体A与抗PD1的组合导致免疫活化
在本实施例中，在用实施例1中描述的被掩蔽的抗CTLA4抗体A和抗PD1组合治疗后，测量免疫活化。治疗后，测量肿瘤中的CD8/Treg比率(图5A)、肿瘤引流淋巴结(TDLN)中的CD4+ICOS+(图5B)和外周血中的CD4+Ki-67+(图5C)。抗体A与抗PD1的组合增强了肿瘤选择性PD并促进了肿瘤引流淋巴结中的CD4+活化。
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Claims (38)

1.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用：
(a)被掩蔽的抗CTLA4抗体，其包含选自由SEQ ID NO:1-46组成的群组的掩蔽肽以及可裂解肽接头；和
(B)PD-1或PD-L1抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述可裂解肽接头包含选自由SEQ ID NO:47-88、464-469和479-508组成的群组的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述可裂解肽接头包含连接至所述可裂解肽接头的氨基端的选自由SEQ ID NO:89-112和415-420组成的群组的间隔区，和连接至所述可裂解肽接头的羧基端的选自由SEQ ID NO:89-112和415-420组成的群组的间隔区。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可裂解肽接头包含选自由SEQ IDNO:454-462组成的群组的氨基酸序列。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述掩蔽抗体包含选自由SEQ ID NO:113-231和444-453组成的群组的氨基酸序列。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述被掩蔽的抗CTLA4抗体为人源化抗体、嵌合抗体、人抗体或其抗原结合片段。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述被掩蔽的抗CTLA4抗体包含：
包含NYFMN的重链可变区(vH)CDR1、包含RVDPEQGRADYAEKFKK的vH CDR2、包含RAMDNYGFAY的vH CDR2；以及
包含SANSALSYMY的轻链可变区(vL)CDR1、包含GTSNLAS的vL CDR2、包含HHWSNTQWT的vLCDR3。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述被掩蔽的抗CTLA4抗体以约0.1-20mg/kg之间的有效剂量施用。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述被掩蔽的抗CTLA4抗体的有效剂量选自0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg和20mg/kg。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述被掩蔽的抗CTLA4抗体的有效剂量在约1-1000mg之间。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述被掩蔽的抗CTLA4抗体包含有包含氨基酸取代S239D或I332E或两者的重链恒定结构域，其中所述氨基酸残基根据如Kabat中的EU索引编号。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述被掩蔽的抗CTLA4抗体包含与SEQID NO:324具有至少90％同一性的vH。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述被掩蔽的抗CTLA4抗体包含与SEQID NO:322具有至少90％同一性的vL。
14.如前述权利要求所述的方法，其中所述被掩蔽的抗CTLA4抗体是无岩藻糖基化的或岩藻糖缺乏的。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗CTLA4抗体或其抗原结合片段与药剂结合。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述药剂是微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂或DNA合成抑制剂。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述药剂为美登木素生物碱、瑞奥西汀、吡咯并苯并二氮杂(PBD)二聚体、卡奇霉素、倍癌霉素、吲哚-邻苯并二氮杂/>二聚体或依喜替康衍生物Dxd。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PD-1或PD-L1抑制剂是抗体。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述PD-1/PD-L1抑制剂是PD-1抗体。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述抗PD-1抗体选自尼沃单抗、派姆单抗和西米普利单抗。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述PD-1抗体的有效剂量在1-10mg/kg之间。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述PD-1抗体的有效剂量是10mg/kg。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述抗PD-1抗体以4-1000mg的有效剂量施用。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述抗PD-1抗体以200mg的有效剂量施用。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗PD-1抗体每周、每隔一周、每3周、每4周、每5周、每6周、每月施用一次。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗PD-1抗体每3周施用一次。
27.如权利要求18所述的方法，其中所述PD-1/PD-L1抑制剂是PD-L1抗体。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体选自阿替利珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体以200-2000mg之间的有效剂量施用。
30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体每周、每隔一周、每3周、每4周、每6周或每月施用一次。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PD1或PD-L1抑制剂和所述被掩蔽的抗CTLA4抗体被配制用于静脉内施用。
32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PD1或PD-L1抑制剂和所述被掩蔽的抗CTLA4抗体一起配制在同一组合物中。
33.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述PD1或PD-L1抑制剂和所述被掩蔽的抗CTLA4抗体分开配制。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PD1或PD-L1抑制剂与所述被掩蔽的抗CTLA4抗体同时施用。
35.如前述权利要求中任一项的方法，其中所述癌症是白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、骨髓瘤、乳腺癌、神经母细胞瘤、肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌、睾丸癌或皮肤鳞状细胞癌(CSCC)。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述癌症是肺癌。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述肺癌为小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)。
38.如权利要求35所述的方法，其中所述癌症为黑素瘤。
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Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
ATE135397T1 (de) 1988-09-23 1996-03-15 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5891693A (en) 1990-01-25 1999-04-06 Alusuisse Holdings A.G. Recombinant DNA methods vectors and host cells
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
WO1994011026A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
CA2163345A1 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Susan Adrienne Morgan Antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
WO1997038123A1 (en) 1996-04-05 1997-10-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
WO1998058964A1 (en) 1997-06-24 1998-12-30 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
ES2375931T3 (es) 1997-12-05 2012-03-07 The Scripps Research Institute Humanización de anticuerpo murino.
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP2261229A3 (en) 1998-04-20 2011-03-23 GlycArt Biotechnology AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
JP2003512019A (ja) 1999-01-15 2003-04-02 ジェネンテック・インコーポレーテッド 変化したエフェクター機能を有するポリペプチド変異体
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2420835T3 (es) 1999-04-09 2013-08-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de las moléculas inmunofuncionales
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
JP4336498B2 (ja) 2000-12-12 2009-09-30 メディミューン，エルエルシー 延長した半減期を有する分子ならびにその組成物および用途
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED CELL CYTOTOXICITY DEPENDENT OF ANTIBODIES
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
AU2003236019A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Drug containing antibody composition appropriate for patient suffering from Fc Gamma RIIIa polymorphism
CA2481920A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-containing medicament
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
WO2003085119A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede d'amelioration de l'activite d'une composition d'anticorps de liaison avec le recepteur fc$g(g) iiia
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
PL212899B1 (pl) 2002-12-16 2012-12-31 Genentech Inc Humanizowane przeciwcialo, kompozycja zawierajaca to przeciwcialo, wyrób fabryczny, przeciwcialo lub jego fragment do zastosowania w sposobie indukowania apoptozy, izolowany kwas nukleinowy, wektor ekspresji, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciala lub jego fragmentu, plynny preparat i zastosowanie przeciwciala do wytwarzania leku
CA2542046A1 (en) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Fused protein composition
CA2542125A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
HUE031632T2 (en) 2003-11-05 2017-07-28 Roche Glycart Ag Antigen binding molecules with enhanced Fc receptor binding affinity and effector function
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
CA2553692C (en) 2004-01-20 2014-10-07 Kalobios, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
AU2005306502B2 (en) 2004-11-16 2012-11-15 Humanigen, Inc. Immunoglobulin variable region cassette exchange
WO2014179664A2 (en) 2013-05-02 2014-11-06 Anaptysbio, Inc. Antibodies directed against programmed death-1 (pd-1)
EP3535300A1 (en) * 2016-11-03 2019-09-11 Bristol-Myers Squibb Company Activatable anti-ctla-4 antibodies and uses thereof
CN110505882A (zh) * 2017-03-31 2019-11-26 默沙东公司 用pd-1的拮抗剂和抗ctla4抗体的组合治疗癌症的组合物和方法
WO2018207701A1 (ja) 2017-05-09 2018-11-15 日東電工株式会社 光学部材用組成物、光学部材及び画像表示装置
EP3902832A2 (en) * 2018-12-26 2021-11-03 Xilio Development, Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of use thereof

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