JP2023547621A - 抗ｓｉｇｌｅｃ－８抗体製剤 - Google Patents

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Abstract

本開示は、皮下投与のためのヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合するモノクローナル抗体を含む医薬組成物（例えば、液体製剤）、及びそれに関連する製品を提供する。このような要求及びその他の要求を満たすため、本開示は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合するモノクローナル抗体を含む皮下投与用の医薬組成物（例えば、液体製剤）及びキットに特に関する。これらは、特定の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の溶解度がｐＨ及び特定の緩衝液組成に依存する、という本明細書における実証例に少なくとも一部基づいたものである。【選択図】図９

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年１０月２２日に出願された米国仮出願第６３／１０４，４３６号に基づく利益を主張するものであり、当該出願の全容を参照により本明細書に援用するものである。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物、すなわち、配列表のコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：７０１７１２００１３４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年１０月１３日、サイズ：９３，１２５ＫＢ）の全容を参照によって本明細書に援用する。
本開示は、皮下投与のためのヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合するモノクローナル抗体を含む医薬組成物（例えば、液体製剤）、及びそれに関連する製品に関する。
Ｓｉｇｌｅｃ－８は、好酸球、マスト細胞、及び好塩基球によって特異的に発現されるシアル酸結合免疫グロブリン様レクチンである。マスト細胞とならんで、好酸球は、特定の組織部位での感染を制御するなど、有益な機能的役割を果たす炎症反応を促進することができる。チャーグシュトラウス症候群、関節リウマチ、アレルギー性喘息など、いくつかの疾患が好酸球の活性化に関連していることが示されている（Ｗｅｃｈｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１２，１３０（３）：５６３－７１）。現在、好酸球及びマスト細胞の活動などの炎症に関与する免疫細胞の活動を制御できる治療法が必要とされている。ヒトＳｉｇｌｅｃ－８を認識する抗体が、米国特許第８，２０７，３０５号、米国特許第８，１９７，８１１号、米国特許第７，８７１，６１２号、及び米国特許第７，５５７，１９１号に記載されている。ヒト化抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が、米国特許第９，５４６，２１５に記載されている。
商業的使用のために抗体を製剤化するには、製品の安定性と溶解性を与える緩衝液、ｐＨ、及び必要に応じて用いられる賦形剤の組み合わせを特定する必要がある。皮下投与では、製剤化によって製品の高濃度での凝集を防止する必要がさらにある。こうした凝集により、製品が大量に蓄積して針が詰まり、及び／またはより大きなゲージの針が必要になり、投与に伴う痛みまたは不快感が増加する可能性がある。現在の高濃度の市販製品（例えば、皮下投与用）は、一般的には、５．５～６．３のｐＨ条件及び５～９％の糖濃度のヒスチジン緩衝液に、さらに必要に応じて用いられる賦形剤を加えて製剤化される。商業的使用に成功する製剤は、製品の濁度または凝集体形成の増加をほとんどまたはまったくともなうことなく、所定の時間にわたって高濃度の抗体を溶液中で維持できなければならない。
理論に束縛されることを望むものではないが、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の皮下投与は、例えば、投与関連反応の速度及び／または重症度を低下させるのに有利であると考えられる。したがって、抗体の長期安定性及び溶解性を与える、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の皮下投与に適した液体製剤が求められている。
特許出願、特許公報、及び科学文献を含む、本明細書に引用されるすべての参考文献は、恰もそれぞれの個々の参考文献が具体的かつ個別に参照により援用されることが示されているものと同様にして、参照によりそれらの全容を本明細書に援用するものである。
米国特許第８，２０７，３０５号明細書 米国特許第８，１９７，８１１号明細書 米国特許第７，８７１，６１２号明細書 米国特許第７，５５７，１９１号明細書 米国特許第９，５４６，２１５号明細書
Ｗｅｃｈｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１２，１３０（３）：５６３－７１
このような要求及びその他の要求を満たすため、本開示は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合するモノクローナル抗体を含む皮下投与用の医薬組成物（例えば、液体製剤）及びキットに特に関する。これらは、特定の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の溶解度がｐＨ及び特定の緩衝液組成に依存する、という本明細書における実証例に少なくとも一部基づいたものである。驚くべきことに、高濃度のアルギニンの存在下で塩析効果が観察され、塩化ナトリウムの存在下でも観察された。しかしながら、緩衝液、ｐＨ、及び必要に応じて用いられる糖賦形剤の他の組み合わせによって、許容される溶解度と長期安定性を備えた皮下製剤に必要な高い抗体濃度がもたらされた。
したがって、本開示の特定の態様は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合するモノクローナル抗体及びヒスチジンまたは酢酸ナトリウムを約１０ｍＭ～約２５ｍＭの濃度で含む医薬組成物（例えば、液体製剤）に関する。いくつかの実施形態では、液体製剤のｐＨは、５．０～６．３である。いくつかの実施形態では、抗体は、（１）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域と、（１）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、約７０ｍｇ／ｍｌ～約２１０ｍｇ／ｍｌの濃度である。いくつかの実施形態では、抗体は、約１００ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌの濃度である。いくつかの実施形態では、抗体は、約１２５ｍｇ／ｍｌ～約１７５ｍｇ／ｍｌの濃度である。いくつかの実施形態では、抗体は、約１３５ｍｇ／ｍｌ～約１６５ｍｇ／ｍｌの濃度である。いくつかの実施形態では、抗体は、約１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。
いくつかの実施形態では、製剤は、Ｌ－ヒスチジンまたはＬ－ヒスチジン塩酸塩を約１５ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、液体製剤のｐＨは、６．０である。
いくつかの実施形態では、製剤は、酢酸ナトリウムを約１５ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、液体製剤のｐＨは、約５．２～約５．８である。いくつかの実施形態では、液体製剤のｐＨは、５．５である。
いくつかの実施形態では、製剤は、スクロースを約５％～約９％の濃度で含む。いくつかの実施形態では、製剤は、スクロースを約５％～約７．５％の濃度で含む。いくつかの実施形態では、製剤は、スクロースを約５％の濃度で含む。
いくつかの実施形態では、製剤は、トレハロースを約４％～約１０％の濃度で含む。いくつかの実施形態では、製剤は、トレハロース約５％～約７．５％の濃度で含む。いくつかの実施形態では、製剤は、トレハロースを６．６％の濃度で含む。いくつかの実施形態では、トレハロースは、トレハロース二水和物である。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるいくつかの実施形態では、製剤は、ポリソルベート８０を約０．０２２５％～約０．０２７５％（ｗ／ｖ）の濃度で含む。いくつかの実施形態では、ポリソルベート８０は、約０．０２５％（ｗ／ｖ）の濃度である。
いくつかの実施形態では、製剤は、１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体と、１５ｍＭのＬ－ヒスチジンまたはＬ－ヒスチジン塩酸塩と、１７５ｍＭのトレハロース二水和物と、０．０２５％のポリソルベート８０（ｗ／ｖ）を含み、液体製剤のｐＨは６．０である。いくつかの実施形態では、製剤は、１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体と、１５ｍＭの酢酸ナトリウムと、１７５ｍＭのトレハロース二水和物と、０．０２５％のポリソルベート８０（ｗ／ｖ）を含み、液体製剤のｐＨは５．５である。いくつかの実施形態では、製剤は、１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体と、１５ｍＭのＬ－ヒスチジンまたはＬ－ヒスチジン塩酸塩と、５％のスクロースと、０．０２５％のポリソルベート８０（ｗ／ｖ）を含み、液体製剤のｐＨは６．０である。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるいくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６または２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む重鎖Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域は、非フコシル化されている。いくつかの実施形態では、製剤中の抗体のＦｃ領域に結合したＮ結合型グリカンの約５０％未満がフコースを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域は、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含み、ただし、アミノ酸残基はＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７６または７７のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７７のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するように操作されている。いくつかの実施形態では、抗体の重鎖の少なくとも１つまたは２つが非フコシル化されている。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の実施形態のいずれか１つの製剤を封入した容器を含む製品またはキットに関する。いくつかの実施形態では、容器はガラスバイアルである。いくつかの実施形態では、製品またはキットは、製剤を皮下投与するための説明書をさらに含む。
本明細書に記載されるさまざまな実施形態の特性の１つ、一部、またはすべてを組み合わせることで本開示の他の実施形態を形成し得る点は理解されよう。本開示のこれら及び他の態様は、当業者には明らかとなるであろう。本開示のこれら及び他の実施形態は、以下の発明を実施するための形態によってさらに説明される。
ｐＨ７．２の１５ｍＭリン酸カリウム緩衝液中で抗体を濃縮する際の濁度の推移を示す。抗体濃度１７．０ｍｇ／ｍＬ（左）または１１０．０ｍｇ／ｍＬ（右）の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体製剤の濁度を示す。 ｐＨ６．４の１５ｍＭのＬ－ヒスチジン緩衝液中で抗体を濃縮する際の濁度の推移を示す。抗体濃度１１．０ｍｇ／ｍＬ（左）または１８５．０ｍｇ／ｍＬ（右）の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体製剤の濁度を示す。 ｐＨ６．０の１５ｍＭのコハク酸カリウム緩衝液中で抗体を濃縮する際の濁度の推移を示す。抗体濃度１８．０ｍｇ／ｍＬ（左）または１７０．０ｍｇ／ｍＬ（右）の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体製剤の濁度を示す。 ｐＨ５．６の１５ｍＭのコハク酸カリウム緩衝液中で抗体を濃縮する際の濁度の推移を示す。抗体濃度１０．０ｍｇ／ｍＬ（左）または１６５．０ｍｇ／ｍＬ（右）の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体製剤の濁度を示す。 ｐＨ５．０の１５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中で抗体を濃縮する際の濁度の推移を示す。抗体濃度１７．０ｍｇ／ｍＬ（左）または１９０．０ｍｇ／ｍＬ（右）の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体製剤の濁度を示す。 異なる賦形剤を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体製剤の濁度の比較を示す。すべての試料で、ｐＨ７．２の１５ｍＭリン酸カリウム緩衝液を使用した。（左から右に）：コントロール製剤中の１１０ｍｇ／ｍＬ抗体、３２０ｍＭのアルギニンを含む製剤中の８５ｍｇ／ｍＬ抗体、５４０ｍＭのスクロースを含む製剤中の７０ｍｇ／ｍＬ抗体、及び５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む製剤中の８０ｍｇ／ｍＬ抗体を示す。 異なる賦形剤を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体製剤の濁度の比較を示す。すべての試料で、ｐＨ６．４の１５ｍＭヒスチジン緩衝液を使用した。（左から右に）：コントロール製剤中の１８５ｍｇ／ｍＬ抗体、１００ｍＭのアルギニンを含む製剤中の１６５ｍｇ／ｍＬ抗体、２６０ｍＭのスクロースを含む製剤中の１５０ｍｇ／ｍＬ抗体、及び１４０ｍＭの塩化ナトリウムを含む製剤中の１６５ｍｇ／ｍＬ抗体を示す。 異なる賦形剤を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体製剤の濁度の比較を示す。すべての試料で、ｐＨ５．６の１５ｍＭコハク酸ナトリウム緩衝液を使用した。（左から右に）：コントロール製剤中の１６５ｍｇ／ｍＬ抗体、１００ｍＭのアルギニンを含む製剤中の１５０ｍｇ／ｍＬ抗体、２６０ｍＭのスクロースを含む製剤中の１３０ｍｇ／ｍＬ抗体、及び１４０ｍＭの塩化ナトリウムを含む製剤中の１５０ｍｇ／ｍＬ抗体を示す。 抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の皮下投与の第１相試験の結果を示す。健康な志願者に以下のコホートに従って投与を行った：プラセボをＳＣ投与ＳＣ、０．３ｍｇ／ｋｇの抗Ｓｉｇｌｅｃ－８をＳＣ投与、１．０ｍｇ／ｋｇの抗Ｓｉｇｌｅｃ－８をＳＣ投与、３．０ｍｇ／ｋｇの抗Ｓｉｇｌｅｃ－８をＳＣ投与、５．０ｍｇ／ｋｇの抗Ｓｉｇｌｅｃ－８をＳＣ投与、３００ｍｇの抗Ｓｉｇｌｅｃ－８をＳＣ投与、１．０ｍｇ／ｋｇの抗Ｓｉｇｌｅｃ－８をＩＶ投与、及び３．０ｍｇ／ｋｇの抗Ｓｉｇｌｅｃ－８をＩＶ投与。各コホートの志願者数をｎで示す。すべてのコホートで、血中好酸球量の中央値（×１０３／ｍＬ）をベースライン、投与後１時間、投与後３時間、投与後１５日目、投与後３５日目、投与後５６日目、及び投与後８５日目に測定した。ＳＣ：皮下注射、ＩＶ：静脈内注入、ＰＢＯ：プラセボ。
Ｉ．定義
本開示は、特定の組成物または生体系に限定されず、言うまでもなく変化し得る点は理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、あくまで特定の実施形態を説明する目的のものに過ぎず、これを限定しようとするものではない点も理解されるべきである。本明細書及び付属の請求項で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容による明確な別段の定めがない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「分子」への言及は、２つ以上のそのような分子の組み合わせなどを任意に含む。
本明細書に使用される「約」という用語は、本技術分野の当業者であれば容易に理解している、それぞれの値に対する通例的な誤差範囲を指す。本明細書で「約」の値またはパラメータを参照することは、その値またはパラメータをそれ自体で対象とする実施形態を含む（かつ記載する）。
本開示の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」を含むことが理解される。
「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体を含む）、ポリエピトープ性（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、及び一本鎖分子、ならびに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）が含まれる。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書において「抗体」と交換可能に使用される。
塩基性４鎖抗体単位は、２つの同一軽（Ｌ）鎖及び２つの同一重（Ｈ）鎖で構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、５つの基本的なヘテロ四量体ユニットと併せて、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドからなり、１０個の抗原結合部位を含有しているが、一方でＩｇＡ抗体は、２～５個の基本的な４本鎖ユニットから構成されており、このユニットは、重合してＪ鎖と組み合わさった多価集合体を形成することができる。ＩｇＧの場合、４鎖単位は、一般に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つのジスルフィド共有結合によってＨ鎖に連結されており、一方で、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて、１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結されている。各Ｈ鎖及びＬ鎖はまた、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、これに続いて、α及びγ鎖のそれぞれでは３個の定常ドメイン（ＣＨ）、ならびにμ及びεアイソタイプでは４個のＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、続いてその反対側の端部に定常ドメインを有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの間に界面を形成すると考えられる。ＶＨ及びＶＬの組合せが、共に単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ．Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｏｌｗ（ｅｄｓ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４の７１ページ及び第６章を参照されたい。
脊椎動物種由来のＬ鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κとλと呼ばれる２つの明確に異なる型のいずれかに割り当てることができる。重鎖の定常ドメイン（Ｃ Ｈ ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つのクラスが存在し、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと表記される重鎖を有する。γ及びαクラスは、ＣＨ配列及び機能における比較的わずかな相違に基づいてさらにサブクラスに分類され、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を発現する。ＩｇＧ１抗体は、複数の多型変異体として存在し（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ ２００９．ｍＡｂｓ Ｖｏｌ １ Ｉｓｓｕｅ ４ １－７に概説されている）、これらのいずれもが本開示での使用に適している。ヒト集団における一般的なアロタイプ変異体は、文字ａ、ｆ、ｎ、ｚで表記されるものである。
「単離された」抗体は、その産生環境（例えば、天然または組換え）の成分から特定、分離、及び／または回収されたものである。いくつかの実施形態では、単離されたポリペプチドは、その産生環境からの全ての他の成分との会合を含まない。組換え形質移入細胞に由来する成分などの、その生産環境の混入成分は、一般的に、抗体の研究、診断または治療用途を妨げるであろう物質であり、これには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれ得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、（１）例えば、ローリー法により決定して抗体の９５重量％超まで、及びいくつかの実施形態では、９９重量％超まで、（１）スピニングカップシークエネーターを使用して少なくとも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシー・ブルー、もしくは銀染色を使用する非還元もしくは還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離抗体には、組み換え細胞内でインサイツの抗体が含まれるが、これは、抗体の天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在していないためである。しかしながら、通常、単離ポリペプチドまたは抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用されるとき、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体を指す、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、微量で存在し得る可能性のある自然に発生する変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除き、同一である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、重鎖及び／または軽鎖にＣ末端切断を有する。例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸残基が、重鎖及び／または軽鎖のＣ末端で切断される。いくつかの実施形態では、Ｃ末端切断は、重鎖からＣ末端リシンを除去する。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、重鎖及び／または軽鎖にＮ末端切断を有する。例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸残基が、重鎖及び／または軽鎖のＮ末端で切断される。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を標的とする。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は高度に特異的であり、複数の抗原部位を標的とする（二重特異性抗体または多重特異性抗体など）。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体の集団から得られたものであるという抗体の特性を示し、いずれかの特定の方法による抗体の産生を要するものとして理解されるべきではない。例えば、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ技術、及び、ヒト免疫グロブリン遺伝子座またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部または全体を有する動物でヒトまたはヒト様抗体を産生するための技術を含む、様々な技術によって作製することができる。
「裸の抗体」という用語は、細胞傷害性部分または放射標識に結合されていない抗体を指す。
「完全長抗体」、「インタクト抗体」、または「全抗体」という用語は、抗体断片とは対照的に、その実質的にインタクトな形態にある抗体を指すように、互換的に使用される。具体的には、全抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒトの天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。場合によっては、無傷の抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有し得る。
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部、インタクト抗体の抗原結合領域及び／または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２ 、及びＦｖ断片；ダイアボディ；直線状抗体（米国．米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２（１９９５）を参照のこと）；一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成される多重特異抗体が挙げられる。
抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一な抗原結合フラグメントと、容易に結晶化する能力を反映して表記される残りの「Ｆｃ」フラグメントとが得られた。Ｆａｂ断片は、Ｌ鎖全体に加えて、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）、及び１本の重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関しては一価であり、すなわち、それは単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理によって、異なる抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合されたＦａｂ断片におおむね相当し、依然として抗原を架橋することができる単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片が得られる。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体のヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む幾つかの追加の残基を有する点でＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離のチオール基を有するＦａｂ’の呼称である。Ｆ（ａｂ’）２ 抗体断片は、元々、Ｆａｂ’断片の間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片のその他の化学的結合も公知である。
Ｆｃ断片は、ジスルフィド結合により互いに保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列によって決まり、この領域は、特定の種類の細胞上に見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によっても認識される。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この断片は、１つの重鎖可変領域ドメイン及び１つの軽鎖可変領域ドメインが緊密に非共有結合的に会合した二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みにより、抗原結合のためのアミノ酸残基を提供し、抗体に抗原結合特異性を付与する、６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、結合部位全体よりも低い親和性であるが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される「一本鎖Ｆｖ」は、接続されて単一のポリペプチド鎖になるＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。いくつかの実施形態では、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能とする。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照のこと。
本開示の抗体の「機能性フラグメント」は、インタクトな抗体の一部分を含み、これには、概して、インタクトな抗体の抗原結合領域若しくは可変領域、またはＦｃＲ結合能力を保持するか若しくは修飾されたＦｃＲ結合能力を有する抗体のＦｖ領域が含まれる。抗体フラグメントの例としては、線形抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。
本明細書におけるモノクローナル抗体は、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か、またはそれと相同である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か、またはそれと相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）に加えて、そのような抗体のフラグメントが所望の生物活性を示す限り、そのフラグメントを特に含む（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５（１９８４）を参照のこと）。本明細書における関心対象のキメラ抗体としては、抗体の抗原結合領域が、例えば、関心対象の抗原でマカクサルを免疫することにより生成される抗体に由来するＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体が挙げられる。本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」は、「キメラ抗体」のサブセットとして使用される。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲ由来の残基が、非ヒト種、例えば、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類のＨＶＲ由来の所望の特異性、親和性、及び／または能力を有する残基（ドナー抗体）で置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基が、相当する非ヒト残基で置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見出されない残基を含み得る。これらの改変は、結合親和性等の抗体性能をさらに改良するために行うことができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、ここで、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリン配列のものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものに対応するが、ＦＲ領域には、結合親和性、異性体化、免疫原性等の抗体の性能を向上させる１つ以上の個々のＦＲ残基置換が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、Ｈ鎖で６以下、Ｌ鎖で３以下である。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常はヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照のこと。例えば、Ｖａｓｗａｎｉ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５－１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３：１０３５－１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８－４３３（１９９４）、ならびに米国特許第６，９８２，３２１号及び同第７，０８７，４０９号も参照のこと。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、単一の抗原部位を標的とする。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、複数の抗原部位を標的とする。代替のヒト化方法が、米国特許第７，９８１，８４３号及び米国特許出願公開第２００６／０１３４０９８号に記載されている。
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」及び「ＶＬ」と呼ばれる場合がある。これらのドメインは、一般に（同じクラスの他の抗体と比較して）抗体の最可変部分であり、抗原結合部位を含む。
「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列において超可変である、及び／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、このうち３つがＶＨにあり（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、３つがＶＬにある（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。天然抗体では、Ｈ３及びＬ３は、６つのＨＶＲの中で最大の多様性を示し、特にＨ３は、抗体に好適な特異性を与えることにおいて固有の役割を果たすと考えられる（例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７－４５ （２０００）；Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗｕ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１－２５ （Ｌｏ， ｅｄ．， Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， ２００３））を参照）。実際に、重鎖のみからなる天然のラクダ抗体は、軽鎖の不在下において機能性であり、かつ安定である。例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８（１９９３）及びＳｈｅｒｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３－７３６（１９９６）を参照のこと。
多くのＨＶＲ描写が用いられており、これらは本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＨＶＲは、配列の多様性に基づいており、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。ＣｈｏｔｈｉａのＨＶＲは、その代わりに構造的ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。「接触」ＨＶＲは、使用可能な複合結晶構造の解析に基づく。これらのＨＶＲのそれぞれに由来する残基を以下に示す。
別途指示のない限り、可変ドメインの残基（ＨＶＲ残基及びフレームワーク領域の残基）は、前出のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従って番号付けされる。
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で定義するＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
「Ｋａｂａｔにあるような可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置番号付け」という表現、及びそれらの変形形態は、Ｋａｂａｔら（上記）における抗体の編成において重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用されている番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮、またはそれへの挿入に対応するより少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインには、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸インサート（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）、及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）が含まれ得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、特定の抗体に対して、抗体の配列と「標準の」Ｋａｂａｔによって番号付けされた配列との相同領域での整列によって決定され得る。
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンフレームワーク由来またはヒトコンセンサスフレームワーク由来のＶＬフレームワークまたはＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、または既存のアミノ酸配列変化を含み得る。いくつかの実施形態において、既存のアミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一率（％）」は、保存的置換を配列同一性の一部として考慮せず、最大の配列同一率（％）が得られるように配列同士を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同じである候補配列内のアミノ酸残基の割合（％）として定義される。アミノ酸配列同一率（％）を決定する目的でのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野の技能の範囲内である種々の方法で実現することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長にわたって最大のアライメントを得るために必要とされるあらゆるアルゴリズムを含む、配列同士を整列するために適切なパラメータを決定することができる。例えば、特定のアミノ酸配列Ｂに対する、アミノ酸配列Ｂとの、またはアミノ酸配列Ｂと対比した、特定のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一率（％）（あるいは、特定のアミノ酸配列Ｂに対して、アミノ酸配列Ｂと、またはアミノ酸配列Ｂと対比して特定のアミノ酸配列同一率（％）を有する、または含む、特定のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列によってそのプログラムのＡとＢとの整列において完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは等しくないことが理解される。
特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに「結合する」、「特異的に結合する」、または「特異的である」抗体は、他のいずれのポリペプチドまたはポリペプチドエピトープにも実質的に結合することなく、その特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体（例えば、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体）の、無関係な非Ｓｉｇｌｅｃ－８ポリペプチドへの結合は、当該技術分野では周知の方法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって測定されるＳｉｇｌｅｃ－８への抗体結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体（例えば、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体）は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．７ｎＭ、≦０．６ｎＭ、≦０．５ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
「抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体」または「ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体」という用語は、他のいずれのポリペプチドまたは無関係の非Ｓｉｇｌｅｃ－８ポリペプチドのエピトープに実質的に結合することなくヒトＳｉｇｌｅｃ－８のポリペプチドまたはエピトープに結合する抗体を指す。
本明細書で使用する「Ｓｉｇｌｅｃ－８」という用語は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８タンパク質を指す。この用語はまた、スプライス変異体または対立遺伝子変異体を含む、Ｓｉｇｌｅｃ－８の天然に存在する変異体も含む。例示的なヒトＳｉｇｌｅｃ－８のアミノ酸配列を、配列番号７２に示す。別の例示的なヒトＳｉｇｌｅｃ－８のアミノ酸配列を、配列番号７３に示す。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域に融合されたヒトＳｉｇｌｅｃ－８の細胞外ドメインを含む。免疫グロブリンのＦｃ領域に融合された例示的なヒトＳｉｇｌｅｃ－８の細胞外ドメインのアミノ酸配列を、配列番号７４に示す。配列番号７４で下線で示されるアミノ酸配列は、Ｓｉｇｌｅｃ－８ Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列のＦｃ領域を示す。
ヒトＳｉｇｌｅｃ－８のアミノ酸配列
ＧＹＬＬＱＶＱＥＬＶＴＶＱＥＧＬＣＶＨＶＰＣＳＦＳＹＰＱＤＧＷＴＤＳＤＰＶＨＧＹＷＦＲＡＧＤＲＰＹＱＤＡＰＶＡＴＮＮＰＤＲＥＶＱＡＥＴＱＧＲＦＱＬＬＧＤＩＷＳＮＤＣＳＬＳＩＲＤＡＲＫＲＤＫＧＳＹＦＦＲＬＥＲＧＳＭＫＷＳＹＫＳＱＬＮＹＫＴＫＱＬＳＶＦＶＴＡＬＴＨＲＰＤＩＬＩＬＧＴＬＥＳＧＨＳＲＮＬＴＣＳＶＰＷＡＣＫＱＧＴＰＰＭＩＳＷＩＧＡＳＶＳＳＰＧＰＴＴＡＲＳＳＶＬＴＬＴＰＫＰＱＤＨＧＴＳＬＴＣＱＶＴＬＰＧＴＧＶＴＴＴＳＴＶＲＬＤＶＳＹＰＰＷＮＬＴＭＴＶＦＱＧＤＡＴＡＳＴＡＬＧＮＧＳＳＬＳＶＬＥＧＱＳＬＲＬＶＣＡＶＮＳＮＰＰＡＲＬＳＷＴＲＧＳＬＴＬＣＰＳＲＳＳＮＰＧＬＬＥＬＰＲＶＨＶＲＤＥＧＥＦＴＣＲＡＱＮＡＱＧＳＱＨＩＳＬＳＬＳＬＱＮＥＧＴＧＴＳＲＰＶＳＱＶＴＬＡＡＶＧＧＡＧＡＴＡＬＡＦＬＳＦＣＩＩＦＩＩＶＲＳＣＲＫＫＳＡＲＰＡＡＧＶＧＤＴＧＭＥＤＡＫＡＩＲＧＳＡＳＱＧＰＬＴＥＳＷＫＤＧＮＰＬＫＫＰＰＰＡＶＡＰＳＳＧＥＥＧＥＬＨＹＡＴＬＳＦＨＫＶＫＰＱＤＰＱＧＱＥＡＴＤＳＥＹＳＥＩＫＩＨＫＲＥＴＡＥＴＱＡＣＬＲＮＨＮＰＳＳＫＥＶＲＧ（配列番号７２）
ヒトＳｉｇｌｅｃ－８のアミノ酸配列
ＧＹＬＬＱＶＱＥＬＶＴＶＱＥＧＬＣＶＨＶＰＣＳＦＳＹＰＱＤＧＷＴＤＳＤＰＶＨＧＹＷＦＲＡＧＤＲＰＹＱＤＡＰＶＡＴＮＮＰＤＲＥＶＱＡＥＴＱＧＲＦＱＬＬＧＤＩＷＳＮＤＣＳＬＳＩＲＤＡＲＫＲＤＫＧＳＹＦＦＲＬＥＲＧＳＭＫＷＳＹＫＳＱＬＮＹＫＴＫＱＬＳＶＦＶＴＡＬＴＨＲＰＤＩＬＩＬＧＴＬＥＳＧＨＰＲＮＬＴＣＳＶＰＷＡＣＫＱＧＴＰＰＭＩＳＷＩＧＡＳＶＳＳＰＧＰＴＴＡＲＳＳＶＬＴＬＴＰＫＰＱＤＨＧＴＳＬＴＣＱＶＴＬＰＧＴＧＶＴＴＴＳＴＶＲＬＤＶＳＹＰＰＷＮＬＴＭＴＶＦＱＧＤＡＴＡＳＴＡＬＧＮＧＳＳＬＳＶＬＥＧＱＳＬＲＬＶＣＡＶＮＳＮＰＰＡＲＬＳＷＴＲＧＳＬＴＬＣＰＳＲＳＳＮＰＧＬＬＥＬＰＲＶＨＶＲＤＥＧＥＦＴＣＲＡＱＮＡＱＧＳＱＨＩＳＬＳＬＳＬＱＮＥＧＴＧＴＳＲＰＶＳＱＶＴＬＡＡＶＧＧＡＧＡＴＡＬＡＦＬＳＦＣＩＩＦＩＩＶＲＳＣＲＫＫＳＡＲＰＡＡＧＶＧＤＴＧＭＥＤＡＫＡＩＲＧＳＡＳＱＧＰＬＴＥＳＷＫＤＧＮＰＬＫＫＰＰＰＡＶＡＰＳＳＧＥＥＧＥＬＨＹＡＴＬＳＦＨＫＶＫＰＱＤＰＱＧＱＥＡＴＤＳＥＹＳＥＩＫＩＨＫＲＥＴＡＥＴＱＡＣＬＲＮＨＮＰＳＳＫＥＶＲＧ（配列番号７３）
Ｓｉｇｌｅｃ－８Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列
「アポトーシスを誘導する」または「アポトーシス性」である抗体とは、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞の断片化、及び／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成などの標準的なアポトーシスアッセイによって測定されるプログラムされた細胞死を誘導するような抗体である。例えば、本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体（例えば、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体）のアポトーシス活性は、細胞をアネキシンＶで染色することによって示すことができる。
抗体「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異型Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞毒性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；及びＢ細胞活性化が挙げられる。
「抗体依存性細胞傷害作用」（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）または「ＡＤＣＣ」とは、分泌されたＩｇが特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合することで、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原を保持する標的細胞に特異的に結合し、その後、標的細胞を細胞毒素で殺傷する、細胞傷害性の１つの形態である。抗体は、細胞傷害性細胞で「武装」し、この機序により標的細胞を死滅させるために必要である。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞が、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体（例えば、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体）は、ＡＤＣＣを増強する。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するには、例えば米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されるようなインビトロＡＤＣＣアッセイを行うことができる。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。上記に代えて、または上記に加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるものなどの動物モデルで評価することもできる。ＡＤＣＣ活性及び他の抗体特性を変化させる他のＦｃ変異体としては、Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：６３７－４０，１９９７；Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：５６３－５６４，１９８８；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７：２６５７－２６６２，１９９１；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：５３－５９，１９９２；Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５７：１５３７－１５４３，１９９４；Ｈｕｔｃｈｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：１１９８０－１１９８４，１９９５；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．４４：１１１－１１７，１９９５；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ９：１１５－１１９，１９９５；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ５４：１０１－１０４，１９９６；Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７：４９６３－４９６９，１９９６；Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：２６１３－２６２４，１９９９；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：４１７８－４１８４，２００；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：１９２５－１９３３，２０００；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００：１６－２６，２０００；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：２５７１－２５７５，２００１；Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：６５９１－６６０４，２００１；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７－６５．２００２；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３０：４８７－４９０，２００２；Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：４００５－４０１０，２００６；米国特許第５，６２４，８２１号、同第５，８８５，５７３号、同第５，６７７，４２５号、同第６，１６５，７４５号、同第６，２７７，３７５号、同第５，８６９，０４６号、同第６，１２１，０２２号、同第５，６２４，８２１号、同第５，６４８，２６０号、同第６，１９４，５５１号、同第６，７３７，０５６号、同第６，８２１，５０５号、同第６，２７７，３７５号、同第７，３３５，７４２号、及び同第７，３１７，０９１号により開示されるものが挙げられる。
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで広がると定義される。本開示の抗体における使用に好適な天然配列Ｆｃ領域としては、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が挙げられる。組換えＩｇＧ４抗体で観察される異種性をなくすために、単一のアミノ酸置換（Ｋａｂａｔ番号付けによるＳ２２８Ｐ；ＩｇＧ４Ｐｒｏと称される）を導入することができる（例えば、Ａｎｇａｌ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０， １０５－１０８を参照）。
「非フコシル化」または「フコース欠損」抗体とは、Ｆｃ領域に結合した炭水化物構造にフコースが少ないかまたはフコースがないＦｃ領域を含むグリコシル化抗体変異体を指す。いくつかの実施形態では、フコースが減少した、またはフコースがない抗体は、ＡＤＣＣ機能が改善されている。非フコシル化抗体またはフコース欠損抗体は、１つの細胞株で産生された同じ抗体のフコース量と比較して、フコースが減少している。いくつかの実施形態では、本明細書で想到される非フコシル化またはフコース欠損抗体組成物は、組成物中の抗体のＦｃ領域に結合したＮ結合型グリカンの約５０％未満がフコースを含む組成物である。
「フコシル化」または「フコシル化された」という用語は、抗体のペプチド骨格に結合したオリゴ糖内のフコース残基の存在を指す。具体的には、フコシル化抗体は、抗体のＦｃ領域、例えばヒトＩｇＧ１のＦｃドメインのＡｓｎ２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に結合したＮ－結合型オリゴ糖の一方または両方の最も内側のＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基にα（１，６）－結合型フコースを含む。Ａｓｎ２９７はまた、免疫グロブリンのわずかな配列変動のために、２９７位のアミノ酸約＋３個上流または下流、すなわち２９４位と３００位の間に位置し得る。
「フコシル化度」は、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）によって評価されるＮ－グリコシダーゼＦ処理抗体組成物中の、当該技術分野では周知の方法によって同定される全オリゴ糖に対するフコシル化オリゴ糖のパーセンテージである。「完全フコシル化抗体」の組成物では、本質的にすべてのオリゴ糖がフコース残基を含む、すなわち、フコシル化されている。いくつかの実施形態では、完全フコシル化抗体の組成物は、少なくとも約９０％のフコシル化度を有する。したがって、そのような組成物中の個々の抗体は、一般的には、Ｆｃ領域中の２個のＮ結合型オリゴ糖のそれぞれにフコース残基を含む。逆に、「完全非フコシル化」抗体の組成物では、本質的にどのオリゴ糖もフコシル化されておらず、そのような組成物中の個々の抗体は、Ｆｃ領域中の２個のＮ結合オリゴ糖のいずれにもフコース残基を含まない。いくつかの実施形態では、完全非フコシル化抗体の組成物は、約１０％未満のフコシル化度を有する。「部分フコシル化抗体」の組成物では、一部のオリゴ糖のみがフコースを含む。そのような組成物中の個々の抗体は、組成物を構成する本質的にすべての個々の抗体がＦｃ領域のＮ－結合型オリゴ糖中のフコース残基を欠くわけではなく、本質的にすべての個々の抗体がＦｃ領域の両方のＮ結合型オリゴ糖にフコース残基を含むわけでもない条件で、Ｆｃ領域のＮ－結合型オリゴ糖のどちらにもフコース残基を含まないか、または一方もしくは両方にフコース残基を含むことができる。一実施形態では、部分フコシル化抗体の組成物は、約１０％～約８０％（例えば、約５０％～約８０％、約６０％～約８０％、または約７０％～約８０％）のフコシル化度を有する。
「結合親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性の相互作用の強度のことを指す。いくつかの実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃ－８（本明細書に記載のＳｉｇｌｅｃ－８－Ｆｃ融合タンパク質などの二量体であってもよい）に対する抗体の結合親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載のものを含む当該技術分野では周知の一般的な方法によって測定することができる。
「結合アビディティー」とは、分子（例えば、抗体）の複数の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性の相互作用の強度のことを指す。
本明細書に抗体をコードする「単離された」核酸分子とは、核酸分子が産生される環境中で通常、核酸分子に付随する少なくとも１つの混入核酸分子から同定及び分離された核酸分子である。いくつかの実施形態では、単離核酸は、産生環境に付随するいずれの成分とも結合していない。本明細書のポリペプチド及び抗体をコードする単離核酸分子は、それが自然界で見出される形態または状況以外での形態である。したがって、単離核酸分子は、細胞内に天然に存在する本明細書のポリペプチド及び抗体をコードする核酸とは区別される。
「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性を有効とするような形態であり、製剤が投与される個体に許容しえない毒性を示すさらなる成分を含有しない製剤を指す。そのような製剤は、無菌である。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、液体製剤である。
本明細書で使用する場合、「治療」または「治療する」という用語は、臨床病理学の過程で処置される個体または細胞の自然経過を変化させるように設計された臨床的介入を指す。治療の望ましい効果としては、疾患進行速度の低減、疾患状態の回復または緩和、及び寛解または予後の改善が挙げられる。例えば、疾患に関連する１つ以上の症状が軽減または消失する場合に個体は効果的に「治療される」。例えば、治療によって疾患に罹患した者の生活の質が向上し、疾患の治療に必要な他の薬の用量が減り、疾患の再発の頻度が減り、疾患の重症度が軽減され、疾患の発症もしくは進行が遅延され、及び／または個人の生存期間が延長される場合、個人は「治療」に成功したとみなされる。
本明細書で使用する場合、「～と併せて」または「～と組み合わせて」とは、１つの治療モダリティに加えた別の治療モダリティを指す。したがって、「～と併せて」または「～と組み合わせて」とは、個体への１つの治療モダリティの、他の治療モダリティの投与前、投与中、または投与後の投与のことを指す。
本明細書で使用する場合、「予防」または「予防する」という用語は、個体における特定の疾患の発症または再発に対する予防を与えることを含む。個体は、疾患の素因を有するか、疾患に罹患しやすいか、または疾患を発症するリスクがあってもよいが、まだ疾患を診断されていない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体（例えば、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体）は、疾患の発症を遅らせるために用いられる。
本明細書で使用する場合、疾患を発症する「リスクのある」個体は、検出可能な疾患または疾患の症状を有していてもいなくてもよく、本明細書に記載される治療方法の前に、検出可能な疾患または疾患の症状を呈していてもいなくてもよい。「リスクがある」とは、個体が、当該技術分野では周知の疾患の発症と相関する測定可能なパラメータである１つ以上のリスク因子を有することを意味する。これらのリスク因子のうちの１つ以上を有する個体は、これらのリスク因子のうちの１つ以上を有さない個体より、疾患を発症する確率が高い。
「添付文書」という用語は、治療製品の適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌症についての情報、及び／またはかかる治療製品の使用に関する警告を含む、治療製品の市販のパッケージに通例含まれる指示書を指して用いられる。
本明細書で使用する場合、「個体」または「対象」は哺乳動物である。治療目的での「個体」は、ヒト、飼育動物及び家畜、ならびに動物園の動物、競技用動物、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、スナネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどを含む。いくつかの実施形態では、個体または対象は、ヒトである。
ＩＩ．組成物
いくつかの態様において、本明細書では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体）のいずれかを含む組成物（例えば、液体製剤などの医薬組成物）も提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、皮下投与用である。いくつかの実施形態では、本明細書において、（ａ）ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合するモノクローナル抗体であって、約７０ｍｇ／ｍＬ～約２１０ｍｇ／ｍＬの濃度のモノクローナル抗体と、（ｂ）約１５ｍＭの濃度のヒスチジンまたは酢酸ナトリウムと、を含む液体製剤が提供される。いくつかの実施形態では、液体製剤のｐＨは５．０～６．３である。
いくつかの実施形態では、抗体は、（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域と、（１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／または配列番号１６または２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び／または配列番号７６または７７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７７のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域に連結されたＮ－グリコシド結合型炭水化物鎖とを含み、Ｎ－グリコシド結合型炭水化物鎖の約５０％未満がフコース残基を含む。いくつかの実施形態では、抗体の重鎖の少なくとも１つまたは２つがフコシル化されていない。いくつかの実施形態では、Ｎ－グリコシド結合型炭水化物鎖のいずれもフコース残基を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域（例えば、本明細書に記載のヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４）である。
治療用製剤は、所望の純度を有する有効成分を、必要に応じて用いられる薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって保存用に調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ Ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｋｌｉｎｓ， Ｐｕｂ．， Ｇｅｎｎａｒｏ Ｅｄ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｐａ． ２０００）。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、緩衝液；アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、メタ重亜硫酸ナトリウムを含む抗酸化剤；防腐剤、等張化剤、安定化剤、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；ＥＤＴＡなどのキレート剤及び／または非イオン性界面活性剤を含む。例示的な製剤を本明細書に記載する。
本出願は、濁りまたはゲル形成を伴わずに皮下投与するのに十分な高い濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体に適した製剤を実証する。いくつかの実施形態では、抗体は、約７０ｍｇ／ｍＬ～約２１０ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ～約１７５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ～約２１０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ～約２１０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ～約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１２５ｍｇ／ｍＬ～約２１０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ～約２１０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ～約１７５ｍｇ／ｍＬ、約１２５ｍｇ／ｍＬ～約１７５ｍｇ／ｍＬ、ｏｒ 約１３５ｍｇ／ｍＬ～約１６５ｍｇ／ｍＬの濃度である。いくつかの実施形態では、抗体濃度は、約２１０、２００、１９０、１８０、１７０、及び１６０のいずれかの上限（ｍｇ／ｍＬ）と、約９０、１００、１１０、１２０、１３０、及び１４０のいずれかの独立して選択された下限（ｍｇ／ｍＬ）とを有する範囲内の任意の濃度であり、ただし、上限は下限より大きい。いくつかの実施形態では、抗体は、約９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１１０ｍｇ／ｍＬ、１２０ｍｇ／ｍＬ、１３０ｍｇ／ｍＬ、１４０ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１６０ｍｇ／ｍＬ、１７０ｍｇ／ｍＬ、１８０ｍｇ／ｍＬ、１９０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、または２１０ｍｇ／ｍＬのうちのいずれか１つの濃度である。いくつかの実施形態では、抗体は、約９０、１００、１１０、１２０、１３０、及び１４０の少なくともいずれかの濃度（ｍｇ／ｍＬ）であり、場合により、約２１０ｍｇ／ｍＬ未満の濃度である。いくつかの実施形態では、抗体は、約１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である。
緩衝液は、特に安定性がｐＨに依存する場合、治療効果を最適化する範囲内にｐＨを調節するために使用することができる。本出願は、特定の緩衝液が特定の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の安定で可溶性の高濃度製剤を提供する一方で、他の緩衝液は許容されないゲル形成または濁りをもたらすことを示している。いくつかの実施形態では、製剤は、ヒスチジンまたは酢酸ナトリウムを含む。
いくつかの実施形態では、製剤は、ヒスチジンを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、Ｌ－ヒスチジンまたはその塩（例えば、Ｌ－ヒスチジン塩酸塩）を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、Ｌ－ヒスチジンまたはその塩（例えば、Ｌ－ヒスチジン塩酸塩）を約１０ｍＭ～約２５ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、製剤は、Ｌ－ヒスチジンまたはその塩（例えば、Ｌ－ヒスチジン塩酸塩）を、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２０ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭの濃度、または約１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、１７．５ｍＭ、２０ｍＭ、２２．５ｍＭ、または２５ｍＭのうちのいずれか１つの濃度で含む。いくつかの実施形態では、製剤は、Ｌ－ヒスチジンまたはその塩（例えば、Ｌ－ヒスチジン塩酸塩）を約１５ｍＭの濃度で含む。
いくつかの実施形態では、製剤は、酢酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、酢酸ナトリウムを約１０ｍＭ～約２５ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、製剤は、酢酸ナトリウムを、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２０ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭの濃度、または約１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、１５ｍＭ、１７．５ｍＭ、２０ｍＭ、２２．５ｍＭ、または２５ｍＭのうちのいずれか１つの濃度で含む。いくつかの実施形態では、製剤は、酢酸ナトリウムを約１５ｍＭの濃度で含む。
いくつかの実施形態では、製剤のｐＨは５．０～６．３である。いくつかの実施形態では、製剤のｐＨは、５．２～６．３、５．４～６．３、５．５～６．３、５．２～６．０、５．４～６．０、５．５～６．０の間、または５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、もしくは６．３のうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、製剤はヒスチジン（例えば、Ｌ－ヒスチジンまたはＬ－ヒスチジン塩酸塩などのその塩）を含み、液体製剤のｐＨは６．０である。いくつかの実施形態では、製剤は酢酸ナトリウムを含み、液体製剤のｐＨは約５．２～約５．８、例えば５．５である。
さらなる賦形剤としては、以下のうちの１つ以上、すなわち、（１）増量剤、（２）溶解度向上剤、（３）安定化剤、及び（４）変性または容器の壁への付着を防止する薬剤としての機能を有し得る薬剤が挙げられる。驚くべきことに、本出願によれば、特定の賦形剤が特定の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の高濃度製剤には適さないことが示された。例えば、高濃度のアルギニンの存在下で塩析効果が観察され、塩化ナトリウムの存在下でも観察された。
いくつかの実施形態では、製剤は、糖をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤は、トレハロース（例えば、トレハロース二水和物）をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤はさらに、約４％～約１０％、約５％～約１０％、約４％～約７．５％、約５％～約７．５％、約４％～約６％、約５％～約７．５％、約６％～約１０％、約６％～約７．５％の間、または以下、すなわち、約４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．６％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、もしくは１０％のうちのいずれか１つの濃度のトレハロース（例えば、トレハロース二水和物）を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ、約１１５ｍＭ～約２９０ｍＭ、約１４５ｍＭ～約２９０ｍＭ、約１１５ｍＭ～約２２０ｍＭ、約１４５ｍＭ～約２２０ｍＭ、約１１５ｍＭ～約１７５ｍＭ、約１４５ｍＭ～約２２０ｍＭ、約１７５ｍＭ～約３００ｍＭ、約１５０ｍＭ～約２２０ｍＭ、約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、または約１００ｍＭ、１１５ｍＭ、１２０ｍＭ、１２５ｍＭ、１３０ｍＭ、１４５ｍＭ、１５０ｍＭ、１６５ｍＭ、１７０ｍＭ、１７５ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、２１０ｍＭ、２１５ｍＭ、２２０ｍＭ、２２５ｍＭ、２３０ｍＭ、２３５ｍＭ、２４０ｍＭ、２５０ｍＭ、２５５ｍＭ、２６０ｍＭ、２７０ｍＭ、２７５ｍＭ、２９０ｍＭ、ｏｒ ３００ｍＭのうちのいずれか１つの濃度のトレハロース（例えば、トレハロース二水和物）を含む。
いくつかの実施形態では、製剤は、スクロースをさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤はさらに、約４％～約１０％、約５％～約１０％、約４％～約７．５％、約５％～約７．５％、約４％～約６％、約５％～約７．５％、約６％～約１０％、約６％～約７．５％の間、または以下、すなわち、約４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．６％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、もしくは１０％のうちのいずれか１つの濃度のスクロースを含む。
非イオン性界面活性剤または洗浄剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療薬の可溶化を助けるために、また、撹拌により誘発される凝集から治療タンパク質を保護するために存在させることができ、これにより、活性な治療タンパク質または抗体の変性を引き起こすことなく製剤が剪断表面応力に曝露されることも可能にする。好適な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０等）、ポリオキサマー（ｐｏｌｙｏｘａｍｅｒ）（１８４、１８８等）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０等）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０、及び６０、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。使用することが可能な陰イオン洗浄剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、及びジオクチルスルホン酸ナトリウムが挙げられる。カチオン性洗浄剤としては、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが挙げられる。
いくつかの実施形態では、製剤は、ポリソルベート８０をさらに含む。いくつかの実施形態では、製剤はさらに、約０．０２２５％～約０．０２７５％、約０．０２２５％～約０．０２７０％、約０．０２２５％～約０．０２６５％、約０．０２２５％～約０．０２６０％、約０．０２２５％～約０．０２５０％、または約０．０２２５％、０．０２３０％、０．０２３５％、０．０２４０％，０．０２４５％、０．０２５０％、０．０２５５％、０．０２６０％、０．０２６５％、０．０２７０％、もしくは０．０２７５％のうちのいずれか１つの濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１３５ｍｇ／ｍＬ～約１６５ｍｇ／ｍＬ（例えば、約１５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ）のＬ－ヒスチジンまたはＬ－ヒスチジン塩酸塩、約４％～約１０％の濃度のトレハロース（例えば、トレハロース二水和物）、及び約０．０２２５％～約０．０２７５％（例えば、約０．０２５％）の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは、５．０～６．３である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１３５ｍｇ／ｍＬ～約１６５ｍｇ／ｍＬ （例えば、約１５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ）のＬ－ヒスチジンまたはＬ－ヒスチジン塩酸塩、約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ（例えば、約１７５ｍＭ）の濃度のトレハロース（例えば、トレハロース二水和物）、及び約０．０２２５％～約０．０２７５％（例えば、約０．０２５％）の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは、５．０～６．３である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１３５ｍｇ／ｍＬ～約１６５ｍｇ／ｍＬ（例えば、約１５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ）の酢酸ナトリウム、約４％～約１０％の濃度のトレハロース（例えば、トレハロース二水和物）、及び約０．０２２５％～約０．０２７５％（例えば、約０．０２５％）の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは、５．０～６．３である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１３５ｍｇ／ｍＬ～約１６５ｍｇ／ｍＬ（例えば、約１５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ）の酢酸ナトリウム、約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ（例えば、約１７５ｍＭ）の濃度のトレハロース（例えば、トレハロース二水和物）、及び約０．０２２５％～約０．０２７５％（例えば、約０．０２５％）の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは、５．０～６．３である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１３５ｍｇ／ｍＬ～約１６５ｍｇ／ｍＬ（例えば、約１５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ）のＬ－ヒスチジンまたはＬ－ヒスチジン塩酸塩、約４％～約１０％の濃度のスクロース、及び約０．０２２５％～約０．０２７５％（例えば、約０．０２５％）の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは、５．０～６．３である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１３５ｍｇ／ｍＬ～約１６５ｍｇ／ｍＬ（例えば、約１５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ）の酢酸ナトリウム、約４％～約１０％の濃度のスクロース、及び約０．０２２５％～約０．０２７５％（例えば、約０．０２５％）の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは、５．０～６．３である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１３５ｍｇ／ｍＬ～約１６５ｍｇ／ｍＬ（例えば、約１５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ）のＬ－ヒスチジンまたはＬ－ヒスチジン塩酸塩、約４％～約１０％の濃度のスクロース、及び約０．０２２５％～約０．０２７５％（例えば、約０．０２５％）の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは６．０である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１３５ｍｇ／ｍＬ～約１６５ｍｇ／ｍＬ（例えば、約１５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ）のＬ－ヒスチジンまたはＬ－ヒスチジン塩酸塩、約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ（例えば、約１７５ｍＭ）の濃度のトレハロース（例えば、トレハロース二水和物）、及び約０．０２２５％～約０．０２７５％（例えば、約０．０２５％）の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは６．０である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１３５ｍｇ／ｍＬ～約１６５ｍｇ／ｍＬ（例えば、約１５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ）の酢酸ナトリウム、約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ（例えば、約１７５ｍＭ）の濃度のトレハロース（例えば、トレハロース二水和物）、及び約０．０２２５％～約０．０２７５％（例えば、約０．０２５％）の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは６．０である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１３５ｍｇ／ｍＬ～約１６５ｍｇ／ｍＬ（例えば、約１５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ）の酢酸ナトリウム、約４％～約１０％の濃度のスクロース、及び約０．０２２５％～約０．０２７５％（例えば、約０．０２５％）の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは５．５である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１３５ｍｇ／ｍＬ～約１６５ｍｇ／ｍＬ（例えば、約１５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ（例えば、約１５ｍＭ）の酢酸ナトリウム、約４％～約１０％の濃度のスクロース、及び約０．０２２５％～約０．０２７５％（例えば、約０．０２５％）の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは、５．０～６．３である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１５ｍＭのＬ－ヒスチジンまたはＬ－ヒスチジン塩酸塩、約１７５ｍＭの濃度のトレハロース（例えば、トレハロース二水和物）、及び約０．０２５％の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは６．０である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１７５ｍＭの濃度のトレハロース（例えば、トレハロース二水和物）、及び約０．０２５％の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは５．５である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１５ｍＭのＬ－ヒスチジンまたはＬ－ヒスチジン塩酸塩、約５％の濃度のスクロース、及び約０．０２５％の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは６．０である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１５ｍＭの酢酸ナトリウム、約５％の濃度のスクロース、及び約０．０２５％の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは５．２である。いくつかの実施形態では、製剤は、約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１５ｍＭの酢酸ナトリウム、約７．５％の濃度のスクロース、及び約０．０２５％の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは５．２である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１５ｍＭの酢酸ナトリウム、約５％の濃度のトレハロース（例えば、トレハロース二水和物）、及び約０．０２５％の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは５．２である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１５ｍＭの酢酸ナトリウム、約７．５％の濃度のトレハロース（例えば、トレハロース二水和物）、及び約０．０２５％の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは５．２である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１５ｍＭの酢酸ナトリウム、約５％の濃度のスクロース、及び約０．０２５％の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは５．８である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１５ｍＭの酢酸ナトリウム、約７．５％の濃度のスクロース、及び約０．０２５％の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは５．８である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１５ｍＭの酢酸ナトリウム、約５％の濃度のトレハロース（例えば、トレハロース二水和物）、及び約０．０２５％の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは５．８である。
いくつかの実施形態では、製剤は、約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体、約１５ｍＭの酢酸ナトリウム、約７．５％の濃度のトレハロース（例えば、トレハロース二水和物）、及び約０．０２５％の濃度（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含み、ただし、液体製剤のｐＨは５．８である。
製剤がインビボ投与に使用されるためには滅菌状態でなければならない。製剤は、滅菌濾過膜を通す濾過によって滅菌することができる。本明細書における治療組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈注射用溶液袋またはバイアル内に置かれる。
投与経路は、例えば皮下注射などの適当な方法での単回もしくは複数回のボーラス、または長期間にわたる注入によるなど、既知の容認された方法に従う。
本明細書における製剤は、治療される特定の適応症に必要な２つ以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する化合物も含有し得る。かかる活性化合物は、好適には、意図される目的のために化合物な量で組み合わせで存在する。
本開示の製剤は、異なる用量の抗体を個体に投与するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体は、１回または複数回の用量中、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇで個体に投与される。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体は、１回または複数回の用量中、１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇで個体に投与される。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体は、１回または複数回の用量中、０．１ｍｇ／ｋｇ～３ｍｇ／ｋｇで個体に投与される。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体は、１回または複数回の用量中、０．１ｍｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇで個体に投与される。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体は、１回または複数回の用量中、約１ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇで個体に投与される。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体は、１回または複数回の用量中、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇで個体に投与される。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体は、１回または複数回の用量中、３００ｍｇ／ｋｇで個体に投与される。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体は、１回または複数回の用量中、約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、９．５ｍｇ／ｋｇ、または１０．０ｍｇ／ｋｇのいずれかで個体に投与される。
ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する本明細書に記載の抗体は、本明細書に記載の方法において、単独で、または他の薬剤と併用することができる。上述のかかる併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じまたは別個の製剤に含まれる）及び個別投与を包含し、個別投与の場合、本開示の抗体の投与が、１つ以上のさらなる治療剤の投与前に、投与と同時に、及び／または投与後に行われてよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の投与と、１つ以上のさらなる治療剤の投与とは、互いの約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、または約６ヶ月以内に行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の投与と、１つ以上のさらなる治療剤の投与とは、互いの約１週間、約２週間、または約３週間以内に行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の投与と、１つ以上のさらなる治療剤の投与とは、互いの約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、または約６日以内に行われる。
本開示の製剤は、例えば、好酸球及び／またはマスト細胞関連の疾患または障害の治療など、さまざまな適応症を治療または予防するために投与することができる。いくつかの実施形態では、本開示の製剤で治療される個体は、活性化された好酸球の増加、Ｓｉｇｌｅｃ－８を発現するマスト細胞の活性の増加、好酸球及び／またはマスト細胞の増加、または好酸球及び／またはマスト細胞の活性化の増加のうちの１つ以上を特徴とする疾患または障害を有するかまたは診断されている。いくつかの実施形態では、本開示の製剤で治療される個体は、喘息併発を伴う慢性副鼻腔炎、アスピリン増悪呼吸器疾患、副鼻腔疾患を伴う成人発症型非アトピー型喘息、慢性閉塞性肺疾患、線維性疾患、前線維性疾患、進行性全身性マスト細胞症、無痛性全身性マスト細胞症（ＩＳＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、好酸球性食道炎（ＥＯＥ）、好酸球性胃炎（ＥＧ）、好酸球性胃腸炎（ＥＧＥ）、好酸球性大腸炎（ＥＯＣ）、好酸球性十二指腸炎、マスト細胞性胃炎またはマスト細胞性胃腸炎、マスト細胞数増加を伴う胃炎または胃腸炎、過敏性腸症候群、マスト細胞数増加を伴う過敏性腸症候群、機能性消化管疾患、機能性ディスペプシア、アレルギー性結膜炎、巨大乳頭結膜炎、慢性蕁麻疹、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、アレルギー性喘息、好酸球またはマスト細胞表現型を伴う喘息、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、セリアック病、胃不全麻痺、好酸球増多症候群、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー、血管浮腫、マスト細胞活性化症候群／障害、及び好酸球性筋膜炎からなる群から選択される１つ以上の疾患または障害を有するかまたは診断されている。いくつかの実施形態では、本開示の製剤で治療される個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、組成物の投与前に、個体は、上記に記載の適応症の１つ以上に対する以前の治療（例えば、標準治療）に失敗している。いくつかの実施形態では、組成物の投与前に、個体は、上記に記載の適応症の１つ以上に対する以前の治療（例えば、標準治療）によって適切に制御されない疾患症状を有していた。
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるいくつかの実施形態では、投与は、例えば個体から得られた生検試料（組織中の好酸球数）または末梢血（血中の好酸球数）中で、組成物の投与前の好酸球数と比較して好酸球数の減少をもたらす。本明細書に記載の実施形態のいずれかによるいくつかの実施形態では、投与は、例えば、組織から得られた生検試料または末梢血中で、組成物の投与前のマスト細胞活性化と比較してマスト細胞活性化の減少をもたらす。本明細書に記載の実施形態のいずれかによるいくつかの実施形態では、投与は、組成物の投与前の個体における１つ以上の症状と比較して、個体における１つ以上の症状の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、投与（例えば、皮下注射）は、例えば個体から得られた生検試料（組織中の好酸球数）または末梢血（血中の好酸球数）中で、静脈内注入と同等の好酸球数の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、投与（例えば、皮下注射）は、投与の１時間、３時間、１５日、３５日、５６日、及び／または８５日後に、１０３／ｍＬ未満、または検出不可能なレベルの血中好酸球数をもたらす。
抗体
本開示の特定の態様は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する単離抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体（例えば、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合するアゴニスト抗体）を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、以下の特徴のうちの１つ以上を有する。すなわち、（１）ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する。（２）ヒトＳｉｇｌｅｃ－８の細胞外ドメインに結合する。（３）マウス抗体２Ｅ２及び／またはマウス抗体２Ｃ４よりも高い親和性でヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する。（４）マウス抗体２Ｅ２及び／またはマウス抗体２Ｃ４よりも高いアビディティーでヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する。（５）サーマルシフトアッセイで約７０℃～７２℃以上のＴｍを有する；（６）フコシル化度が低いか、またはフコシル化されていない。（７）好酸球上に発現するヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合し、好酸球のアポトーシスを誘導する。（８）マスト細胞上に発現するヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合し、マスト細胞の数を枯渇または減少させる。（９）マスト細胞上に発現するヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合し、マスト細胞のＦｃγＲＩ依存性活性（例えば、ヒスタミン放出、ＰＧＤ２放出、Ｃａ２＋フラックス、及び／またはβ－ヘキソサミニダーゼ放出など）を阻害する；（１０）ＡＤＣＣ活性を改善するように設計されている。（１１）マスト細胞上に発現するヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合し、ＡＤＣＣ活性（インビトロ及び／またはインビボ）によりマスト細胞を殺滅する；（１２）ヒト及びヒト以外の霊長類のＳｉｇｌｅｃ－８に結合する。（１３）ヒトＳｉｇｌｅｃ－８のドメイン１、ドメイン２、及び／またはドメイン３に結合するか、またはヒトＳｉｇｌｅｃ－８のドメイン１、ドメイン２、及び／またはドメイン３を含むＳｉｇｌｅｃ－８ポリペプチド（例えば、融合本明細書に記載のタンパク質）に結合する；（１４）マウス抗体２Ｅ２または２Ｃ４のＥＣ５０よりも低いＥＣ５０で活性化好酸球を枯渇させる。米国特許第９，５４６，２１５号及び／またはＷＯ２０１５０８９１１７に記載される抗体のいずれも、本明細書で提供される方法、組成物、及びキットに用途を見出すことができる。
一態様では、本開示は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８は、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、マスト細胞上に発現するヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合し、マスト細胞を枯渇させるかまたはその数を減少させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、マスト細胞上に発現するヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合し、マスト細胞媒介活性を阻害する。
一態様では、本発明は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８は、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８のドメイン１のエピトープに結合し、ドメイン１は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８のドメイン２のエピトープに結合し、ドメイン２は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８のドメイン３のエピトープに結合し、ドメイン３は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、配列番号１１６のアミノ酸を含む融合タンパク質に結合するが、配列番号１１５のアミノ酸を含む融合タンパク質には結合しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、配列番号１１７のアミノ酸を含む融合タンパク質に結合するが、配列番号１１５のアミノ酸を含む融合タンパク質には結合しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、配列番号１１７のアミノ酸を含む融合タンパク質に結合するが、配列番号１１６のアミノ酸を含む融合タンパク質には結合しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８の細胞外ドメインの線状エピトープに結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８の細胞外ドメインのコンフォメーションエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、好酸球上に発現するヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合し、好酸球のアポトーシスを誘導する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、好酸球上に発現するヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合し、好酸球を枯渇させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、マスト細胞上に発現するヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合し、マスト細胞媒介活性を阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、マスト細胞上に発現するヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合し、ＡＤＣＣ活性によりマスト細胞を殺滅する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体はマスト細胞を枯渇させ、マスト細胞活性化を阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書の抗体は、活性化された好酸球を枯渇させ、マスト細胞活性化を阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書の抗体（例えば、非フコシル化抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体）は、血液中の好酸球を枯渇させ、マスト細胞活性化を阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書の抗体（例えば、非フコシル化抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体）は、末梢血由来の好酸球を枯渇させ、マスト細胞活性化を阻害する。
本明細書では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８及び非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃ－８に結合する単離された抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。霊長類の交差反応性を有する抗体の同定は、非ヒト霊長類での抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の前臨床試験に有用であると考えられる。一態様では、本発明は、非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体を提供する。一態様では、本発明は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８及び非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃ－８は、配列番号１１８のアミノ酸配列またはその部分を含む。いくつかの実施形態では、非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃ－８は、配列番号１１９のアミノ酸配列またはその部分を含む。いくつかの実施形態では、非ヒト霊長類はヒヒ（例えば、Ｐａｐｉｏ Ａｎｕｂｉｓ）である。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８及び非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８のドメイン１のエピトープに結合する。さらなる実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８のドメイン１は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８及び非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８のドメイン３のエピトープに結合する。さらなる実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８のドメイン３は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８及び非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８及び非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体は、マウス抗体である。いくつかの実施形態では、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８及び非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体である。
一態様では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、モノクローナル抗体である。一態様では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、抗体フラグメント（抗原結合フラグメントを含む）、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２フラグメントである。一態様では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、抗体フラグメント（抗原結合フラグメントを含む）、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２フラグメントを含む。一態様では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。一態様では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体のいずれも精製される。
一態様では、Ｓｉｇｌｅｃ－８に結合するマウス２Ｅ２抗体及びマウス２Ｃ４抗体と競合する抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。マウス２Ｅ２抗体及びマウス２Ｃ４抗体と同じエピトープに結合する抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体も提供される。Ｓｉｇｌｅｃ－８、２Ｅ２、及び２Ｃ４抗体に対するマウス抗体は、米国特許第８，２０７，３０５号、米国特許第８，１９７，８１１号、米国特許第７，８７１，６１２号、及び米国特許第７，５５７，１９１号に記載されている。
一態様では、Ｓｉｇｌｅｃ－８への結合について本明細書に記載のいずれかの抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体（例えば、ＨＥＫＡ、ＨＥＫＦ、１Ｃ３、１Ｈ１０、４Ｆ１１、２Ｃ４、２Ｅ２）と競合する抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。本明細書に記載のいずれかの抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体（例えば、ＨＥＫＡ、ＨＥＫＦ、１Ｃ３、１Ｈ１０、４Ｆ１１、２Ｃ４、２Ｅ２）と同じエピトープに結合する抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体も提供される。
本開示の一態様では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体をコードするポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。特定の実施形態では、そのようなベクターを含む宿主細胞が提供される。本開示の別の態様では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体または抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。特定の実施形態では、本開示の組成物は、本開示の好酸球またはマスト細胞関連の疾患または障害を治療するための医薬製剤である。
一態様では、本明細書では、マウス抗体２Ｃ４のＨＶＲ配列のうちの１、２、３、４、５、または６個を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。一態様では、本明細書では、マウス抗体２Ｅ２のＨＶＲ配列のうちの１、２、３、４、５、または６個を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＶＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲまたはＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲである。
一態様では、本明細書では、マウス抗体１Ｃ３のＨＶＲ配列のうちの１、２、３、４、５、または６個を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。一態様では、本明細書では、マウス抗体４Ｆ１１のＨＶＲ配列のうちの１、２、３、４、５、または６個を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。一態様では、本明細書では、マウス抗体１Ｈ１０のＨＶＲ配列のうちの１、２、３、４、５、または６個を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。いくつかの実施形態では、ＨＶＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲまたはＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８のドメイン１のエピトープに結合し、ドメイン１は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８のドメイン２のエピトープに結合し、ドメイン２は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８のドメイン３のエピトープに結合し、ドメイン３は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、配列番号１１６のアミノ酸を含む融合タンパク質に結合するが、配列番号１１５のアミノ酸を含む融合タンパク質には結合しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、配列番号１１７のアミノ酸を含む融合タンパク質に結合するが、配列番号１１５のアミノ酸を含む融合タンパク質には結合しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、配列番号１１７のアミノ酸を含む融合タンパク質に結合するが、配列番号１１６のアミノ酸を含む融合タンパク質には結合しない。
別の態様では、本明細書において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含み、及び／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８のドメイン２のエピトープに結合し、ドメイン２は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本明細書において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含み、及び／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８のドメイン３のエピトープに結合し、ドメイン３は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８及び非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃ－８に結合する。
別の態様では、本明細書において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含み、及び／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８のドメイン１のエピトープに結合し、ドメイン１は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８及び非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃ－８に結合する。
一態様では、本明細書において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含み、及び／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。
一態様では、本明細書において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６７～７０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含み、及び／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。
一態様では、本明細書において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含み、及び／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。
別の態様では、本明細書において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号６７～７０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含み、及び／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。
別の態様では、本明細書において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含み、及び／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。
別の態様では、本明細書において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含み、及び／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。
別の態様では、本明細書において、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含み、及び／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。
本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、抗体がヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する能力を保持するという条件で、任意の適当なフレームワーク可変ドメイン配列を含むことができる。本明細書で使用する場合、重鎖フレームワーク領域は「ＨＣ－ＦＲ１－ＦＲ４」と呼ばれ、軽鎖フレームワーク領域は「ＬＣ－ＦＲ１－ＦＲ４」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、配列番号２６、３４、３８、及び４５（それぞれ、ＨＣ－ＦＲ１、ＨＣ－ＦＲ２、ＨＣ－ＦＲ３、及びＨＣ－ＦＲ４）の重鎖可変ドメインのフレームワーク配列を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、配列番号４８、５１、５５、及び６０（それぞれ、ＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、及びＬＣ－ＦＲ４）の軽鎖可変ドメインのフレームワーク配列を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、配列番号４８、５１、５８、及び６０（それぞれ、ＬＣ－ＦＲ１、ＬＣ－ＦＲ２、ＬＣ－ＦＲ３、及びＬＣ－ＦＲ４）の軽鎖可変ドメインのフレームワーク配列を含む。
一実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、フレームワーク配列と超可変領域とを含む重鎖可変ドメインを含み、フレームワーク配列は、ＨＣ－ＦＲ１～ＨＣ－ＦＲ４配列として、それぞれ、配列番号２６～２９（ＨＣ－ＦＲ１）、配列番号３１～３６（ＨＣ－ＦＲ２）、配列番号３８～４３（ＨＣ－ＦＲ３）、及び配列番号４５または４６（ＨＣ－ＦＲ４）を含み、ＨＶＲ－Ｈ１は配列番号６１のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ－Ｈ２は配列番号６２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ－Ｈ３は配列番号６３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、フレームワーク配列と超可変領域とを含む重鎖可変ドメインを含み、フレームワーク配列は、ＨＣ－ＦＲ１～ＨＣ－ＦＲ４配列として、それぞれ、配列番号２６～２９（ＨＣ－ＦＲ１）、配列番号３１～３６（ＨＣ－ＦＲ２）、配列番号３８～４３（ＨＣ－ＦＲ３）、及び配列番号４５または４６（ＨＣ－ＦＲ４）を含み、ＨＶＲ－Ｈ１は配列番号６１のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ－Ｈ２は配列番号６２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ－Ｈ３は配列番号６７～７０から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、フレームワーク配列と超可変領域とを含む軽鎖可変ドメインを含み、フレームワーク配列は、ＬＣ－ＦＲ１～ＬＣ－ＦＲ４配列として、それぞれ、配列番号４８または４９（ＬＣ－ＦＲ１）、配列番号５１～５３（ＬＣ－ＦＲ２）、配列番号５５～５８（ＬＣ－ＦＲ３）、及び配列番号６０（ＬＣ－ＦＲ４）を含み、ＨＶＲ－Ｌ１は配列番号６４のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ－Ｌ２は配列番号６５のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ－Ｌ３は配列番号６６のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、フレームワーク配列と超可変領域とを含む軽鎖可変ドメインを含み、フレームワーク配列は、ＬＣ－ＦＲ１～ＬＣ－ＦＲ４配列として、それぞれ、配列番号４８または４９（ＬＣ－ＦＲ１）、配列番号５１～５３（ＬＣ－ＦＲ２）、配列番号５５～５８（ＬＣ－ＦＲ３）、及び配列番号６０（ＬＣ－ＦＲ４）を含み、ＨＶＲ－Ｌ１は配列番号６４のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ－Ｌ２は配列番号６５のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ－Ｌ３は配列番号７１のアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号２～１０から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号１６～２２から選択されるアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号２～１０から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２３または２４から選択されるアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１１～１４から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号１６～２２から選択されるアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１１～１４から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２３または２４から選択されるアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖ＨＶＲ配列は、以下を含む：
ａ）ＨＶＲ－Ｈ１（ＩＹＧＡＨ（配列番号６１））、
ｂ）ＨＶＲ－Ｈ２（ＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号６２））、及び
ｃ）ＨＶＲ－Ｈ３（ＤＧＳＳＰＹＹＹＳＭＥＹ（配列番号６３）；ＤＧＳＳＰＹＹＹＧＭＥＹ（配列番号６７）、ＤＧＳＳＰＹＹＹＳＭＤＹ（配列番号６８）、ＤＧＳＳＰＹＹＹＳＭＥＶ（配列番号６９）、またはＤＧＳＳＰＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号７０））。
いくつかの実施形態では、重鎖ＨＶＲ配列は、以下を含む：
ａ）ＨＶＲ－Ｈ１（ＳＹＡＭＳ（配列番号８８）、ＤＹＹＭＹ（配列番号８９）、またはＳＳＷＭＮ（配列番号９０））、
ｂ）ＨＶＲ－Ｈ２（ＩＩＳＳＧＧＳＹＴＹＹＳＤＳＶＫＧ（配列番号９１）、ＲＩＡＰＥＤＧＤＴＥＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号９２）、またはＱＩＹＰＧＤＤＹＴＮＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号９３））、及びｃ）ＨＶＲ－Ｈ３（ＨＥＴＡＱＡＡＷＦＡＹ（配列番号９４）、ＥＧＮＹＹＧＳＳＩＬＤＹ（配列番号９５）、またはＬＧＰＹＧＰＦＡＤ（配列番号９６））。
いくつかの実施形態では、重鎖ＦＲ配列は、以下を含む：
ａ）ＨＣ－ＦＲ１（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＴ（配列番号２６）、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＦＳＬＴ（配列番号２７）、ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＳ（配列番号２８）、または ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴ（配列番号２９））、
ｂ）ＨＣ－ＦＲ２（ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ（配列番号３１）、ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＧ（配列番号３２）、ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＳ（配列番号３３）、ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧ（配列番号３４）、ＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（配列番号３５）、またはＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧ（配列番号３６））、
ｃ）ＨＣ－ＦＲ３（ＲＦＴＩＳＫＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３８）、ＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号３９）、ＲＬＴＩＳＫＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号４０）、ＲＦＳＩＳＫＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号４１）、ＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号４２）、または ＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＮＱＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号４３））、及び
ｄ）ＨＣ－ＦＲ４（ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号４５）、またはＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４６））。
いくつかの実施形態では、軽鎖ＨＶＲ配列は、以下を含む：
ａ）ＨＶＲ－Ｌ１（ＳＡＴＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号６４））、
ｂ）ＨＶＲ－Ｌ２（ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号６５））、及び
ｃ）ＨＶＲ－Ｌ３（ＱＱＲＳＳＹＰＦＴ（配列番号６６）、またはＱＱＲＳＳＹＰＹＴ（配列番号７１））。
いくつかの実施形態では、軽鎖ＨＶＲ配列は、以下を含む：
ａ）ＨＶＲ－Ｌ１（ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号９７）、ＲＡＳＱＤＩＴＮＹＬＮ（配列番号９８）、またはＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号９９））、
ｂ）ＨＶＲ－Ｌ２（ＤＴＳＫＬＡＹ（配列番号１００）、ＦＴＳＲＬＨＳ（配列番号１０１）、またはＤＴＳＳＬＡＳ（配列番号１０２））、及び
ｃ）ＨＶＲ－Ｌ３（ＱＱＷＳＳＮＰＰＴ（配列番号１０３）、ＱＱＧＮＴＬＰＷＴ（配列番号１０４）、またはＱＱＷＮＳＤＰＹＴ（配列番号１０５））。
いくつかの実施形態において、抗体は、
（ｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／または（ｉ）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｉｉ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域、
（ｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／または（ｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域、または
（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／または（ｉ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態では、軽鎖ＦＲ配列は、以下を含む：
ａ）ＬＣ－ＦＲ１（ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣ（配列番号４８）、または ＥＩＩＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣ（配列番号４９））、
ｂ）ＬＣ－ＦＲ２（ＷＦＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ（配列番号５１）、ＷＦＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＷＩＹ（配列番号５２）、またはＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹ（配列番号５３））、
ｃ）ＬＣ－ＦＲ３（ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番号５５）、ＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番号５６）、ＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番号５７）、または ＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣ（配列番号５８））、及び
ｄ）ＬＣ－ＦＲ４（ＦＧＰＧＴＫＬＤＩＫ（配列番号６０））。
いくつかの実施形態では、本明細書において、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体（例えば、ヒト化抗Ｓｉｇｌｅｃ－８）であって、
（ａ）重鎖可変ドメインであって、
（１）配列番号２６～２９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ－ＦＲ１、
（２）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、
（３）配列番号３１～３６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ－ＦＲ２、
（４）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、
（５）配列番号３８～４３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ－ＦＲ３、
（６）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、及び
（７）配列番号４５～４６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ－ＦＲ４を含む、重鎖可変ドメイン、
及び／または、
（ｂ）軽鎖可変ドメインであって、
（１）配列番号４８～４９から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ－ＦＲ１、
（２）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、
（３）配列番号５１～５３から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ－ＦＲ２、
（４）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、
（５）配列番号５５～５８から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ－ＦＲ３、
（６）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３、及び
（７）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＬＣ－ＦＲ４を含む、軽鎖可変ドメインを含む、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。
一態様では、本明細書では、配列番号２～１０から選択される重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号１６～２２から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。一態様では、本明細書では、配列番号２～１４から選択される重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号１６～２４から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。一態様では、本明細書では、配列番号２～１０から選択される重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号２３または２４から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。一態様では、本明細書では、配列番号１１～１４から選択される重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号１６～２２から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。一態様では、本明細書では、配列番号１１～１４から選択される重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号２３または２４から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。一態様では、本明細書では、配列番号６の重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号１６または２１から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。
一態様では、本明細書では、配列番号１０６～１０８から選択される重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号１０９～１１１から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。一態様では、本明細書では、配列番号１０６の重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号１０９の軽鎖可変ドメインを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。一態様では、本明細書では、配列番号１０７の重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号１１０の軽鎖可変ドメインを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。一態様では、本明細書では、配列番号１０８の重鎖可変ドメインを含み、かつ／または配列番号１１１の軽鎖可変ドメインを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書では、配列番号２～１４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書では、配列番号１０６～１０８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列に対して置換、挿入、または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失（例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸）は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で生じる。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、配列番号１０６～１０８から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書では、配列番号１６～２４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書では、配列番号１０９～１１１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列に対して置換、挿入、または欠失を含むが、そのアミノ酸配列を含む抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する能力を保持している。いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失（例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸）は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で生じる。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、配列番号１６または２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、配列番号１０９～１１１から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
一態様では、本開示は、（ａ）表１に示されるものから選択される１個、２個、または３個のＶＨ ＨＶＲ、及び／または（ｂ）表１に示されるものから選択される１個、２個、または３個のＶＬ ＨＶＲを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体を提供する。
一態様では、本開示は、（ａ）表２に示されるものから選択される１個、２個、または３個のＶＨ ＨＶＲ、及び／または（ｂ）表２に示されるものから選択される１個、２個、または３個のＶＬ ＨＶＲを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体を提供する。
一態様では、本開示は、（ａ）表３に示されるものから選択される１個、２個、３個、または４個のＶＨ ＦＲ、及び／または（ｂ）表３に示されるものから選択される１個、２個、３個、または４個のＶＬ ＦＲを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書において、表４に示される抗体、例えば、ＨＡＫＡ抗体、ＨＡＫＢ抗体、ＨＡＫＣ抗体などの重鎖可変ドメイン及び／または軽鎖可変ドメインを含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。
免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つのクラスが存在し、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと表記される重鎖を有する。γ及びαクラスは、さらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられ、例えば、ヒトは以下のサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２を発現している。ＩｇＧ１抗体は、複数の多型変異体として存在し（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ ２００９．ｍＡｂｓ Ｖｏｌ １ Ｉｓｓｕｅ ４ １－７に概説されている）、これらのいずれもが本明細書の実施例の一部での使用に適している。ヒト集団における一般的なアロタイプ変異体は、文字ａ、ｆ、ｎ、ｚ、またはこれらの組み合わせで表記されるものである。本明細書の実施例のいずれにおいても、抗体はヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む重鎖Ｆｃ領域を含んでよい。さらなる実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４は、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含み、ただし、アミノ酸残基はＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４は、配列番号７９のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書において、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び／または配列番号７６または７７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体が提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖及び／または配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことができる。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体はリレンテリマブである。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、活性化された好酸球のアポトーシスを誘導する。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、休止状態の好酸球のアポトーシスを誘導する。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、活性化された好酸球を枯渇させ、マスト細胞活性化を阻害する。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、マスト細胞を枯渇または減少させ、マスト細胞活性化を阻害する。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、マスト細胞を枯渇またはその数を減少させる。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、ＡＤＣＣ活性によってマスト細胞を殺滅する。いくつかの実施形態では、抗体は、組織でＳｉｇｌｅｃ－８を発現するマスト細胞を枯渇または減少させる。いくつかの実施形態では、抗体は、生体液中でＳｉｇｌｅｃ－８を発現するマスト細胞を枯渇または減少させる。
１．抗体親和性
いくつかの態様では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、マウス抗体２Ｅ２及び／またはマウス抗体２Ｃ４と比較して、ほぼ同じまたはより高い親和性及び／またはより高いアビディティーでヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する。特定の実施形態では、本明細書に提供される抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、１μＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０－８Ｍ以下、例えば、１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば、１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、マウス抗体２Ｅ２及び／またはマウス抗体２Ｃ４よりも約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍または約１０倍高い親和性でヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／または配列番号１６または２１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の結合親和性は、表面プラズモン共鳴アッセイによって測定することができる。例えば、ＫｄまたはＫｄ値は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を、約１０個の反応単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で使用することにより測定することができる。簡潔に述べると、供給業者の指示に従って、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）で活性化する。捕捉抗体（例えば、抗ヒトＦｃ）を、３０μｌ／分の流速で注入する前に、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で希釈し、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体でさらに固定化する。動態測定を行うには、二量体Ｓｉｇｌｅｃ－８の２倍段階希釈液を、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中、２５℃で約２５μＬ／分の流速にて注射する。結合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、結合センサグラム及び解離センサグラムを同時に適合することによって計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算する。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ．，（１９９９） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１を参照されたい。
別の実施形態では、バイオレイヤー干渉計を使用して、Ｓｉｇｌｅｃ－８に対する抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の親和性を決定することができる。例示的なアッセイでは、例えば、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４システム （ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、Ｓｉｇｌｅｃ－８－Ｆｃでタグ付けしたタンパク質を抗ヒト捕捉センサー上に固定化し、増加する濃度のマウス、キメラ、またはヒト化抗Ｓｉｇｌｅｃ－８のＦａｂフラグメントとインキュベートすることで親和性測定値を得る。
抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の結合親和性は、関連技術分野では周知の標準的方法を用いて、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０ （１９８０）に記載されるＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって測定することもできる（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ｇ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０ （１９４７）も参照）。
２．抗体のアビディティー
いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の結合アビディティーは、表面プラズモン共鳴アッセイによって測定することができる。例えば、ＫｄまたはＫｄ値は、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００を使用して測定することができる。捕捉抗体（例えば、ヤギ抗ヒトＦｃ及びヤギ抗マウスＦｃ）をＣＭ５チップ上に固定する。フローセルに抗ヒト抗体または抗マウス抗体を固定化することができる。アッセイは、特定の温度及び流速で、例えば２５℃で３０μｌ／分の流速にて行われる。二量体Ｓｉｇｌｅｃ－８を様々な濃度、例えば、１５ｎＭ～１．８８ｐＭの範囲の濃度でアッセイ緩衝液で希釈する。抗体を捕捉し、高性能インジェクションを行った後、解離させる。フローセルは、緩衝液、例えば５０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５で再生される。結果は、空の参照セルと複数回のアッセイ緩衝液注入によりブランクを取り、１：１のグローバルフィットパラメーターで分析する。
３．競合アッセイ
競合アッセイを用いて、２つの抗体が同一または立体的に重なるエピトープを認識することにより同じエピトープに結合するか、または一方の抗体が抗原に対する別の抗体の結合を競合的に阻害するかを判定することができる。これらのアッセイは当該技術分野では周知のものである。通常、抗原または抗原発現細胞をマルチウェルプレートに固定し、非標識抗体が標識抗体の結合をブロックする能力を測定する。このような競合アッセイにおける一般的な標識は、放射性標識または酵素標識である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、細胞（例えばマスト細胞）の細胞表面に存在するエピトープへの結合について、本明細書に記載の２Ｅ２抗体と競合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、細胞（例えばマスト細胞）の細胞表面に存在するエピトープへの結合について、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体と競合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、細胞（例えばマスト細胞）の細胞表面に存在するエピトープへの結合について、本明細書に記載の２Ｃ４抗体と競合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、細胞（例えばマスト細胞）の細胞表面に存在するエピトープへの結合について、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（米国特許第８，２０７，３０５号にみられる）と、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（米国特許第８，２０７，３０５号にみられる）とを含む抗体と競合する。
４．熱安定性
いくつかの態様では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８は、サーマルシフトアッセイにおいて、少なくとも約７０℃、少なくとも約７１℃、または少なくとも約７２℃の融解温度（Ｔｍ）を有する。例示的なサーマルシフトアッセイでは、ヒト化抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体を含む試料を蛍光色素（Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ）と共に、ｑＰＣＲサーマルサイクラーで１サイクル当たり１℃上昇させて７１サイクルインキュベートしてＴｍを決定する。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、マウス２Ｅ２抗体及び／またはマウス２Ｃ４抗体と比較して、同様のまたはより高いＴｍを有する。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／または配列番号１６または２１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、キメラ２Ｃ４抗体と比較して、同様のまたはより高いＴｍを有する。いくつかの実施形態では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号８５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを有する抗体と比較して同様のまたはより高いＴｍを有する。
５．生物学的活性のアッセイ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、好酸球を枯渇させ、マスト細胞を阻害する。細胞のアポトーシスを評価するためのアッセイは、当該技術分野では周知のものであり、例えば、アネキシンＶによる染色及びＴＵＮＮＥＬアッセイがある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、ＡＤＣＣ活性を誘導する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、ＡＤＣＣ活性によりＳｉｇｌｅｃ－８を発現する好酸球を殺滅する。いくつかの実施形態では、組成物は、非フコシル化（すなわち、アフコシル化）抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非フコシル化抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体を含む組成物は、部分フコシル化抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体を含む組成物と比較して、Ｓｉｇｌｅｃ－８を発現する好酸球に対するＡＤＣＣ活性を増強する。ＡＤＣＣ活性を評価するためのアッセイは、当該技術分野では周知のものであり、本明細書に記載されている。例示的なアッセイでは、ＡＤＣＣ活性を測定するために、エフェクター細胞と標的細胞を用いる。エフェクター細胞の例としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、ならびにＮＫ及びＬＧＬを含むＰＢＭＣ、または細胞表面にＦｃ受容体を有する、好中球、好酸球及びマクロファージなどの白血球が挙げられる。エフェクター細胞は、対象となる疾患を有する個人を含む任意の由来源から分離できる。標的細胞は、評価される抗体が認識できる抗原を細胞表面に発現する任意の細胞である。そのような標的細胞の例としては、細胞表面にＳｉｇｌｅｃ－８を発現する好酸球がある。そのような標的細胞の別の例としては、細胞表面上にＳｉｇｌｅｃ－８を発現する細胞株（例えば、Ｒａｍｏｓ細胞株）（例えば、Ｒａｍｏｓ２Ｃ１０）である。標的細胞は、細胞溶解の検出を可能にする試薬で標識できる。標識試薬としては、例えばクロム酸ナトリウム（Ｎａ２ ５１ＣｒＯ４）などの放射性物質が挙げられる。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １４， １８１ （１９６８）；Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ．， １７２， ２２７ （１９９４）；ａｎｄ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ．， １８４， ２９ （１９９５）を参照されたい。
マスト細胞に対する抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体のＡＤＣＣ及びアポトーシス活性を評価するための例示的なアッセイでは、ヒトマスト細胞を、公開されたプロトコールに従って、ヒト組織または生体液から単離する（Ｇｕｈｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２０１１， ７５：３８２－３８４；Ｋｕｌｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００１， （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．））か、または、例えば、Ｙｏｋｏｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２００８， １２１：４９９－５０５に記載されるように、ヒト造血幹細胞から分化させる。精製マスト細胞を無菌９６ウェルＵ底プレートで完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、０．０００１ｎｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌの範囲の濃度の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の存在下または非存在下で３０分間インキュベートする。ＡＤＣＣを誘導するため、各試料を精製されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または新鮮なＰＢＬの存在下及び非存在下でさらに４～４８時間インキュベートする。アポトーシスまたはＡＤＣＣによる細胞殺滅を、マスト細胞（ＣＤ１１７及びＦｃεＲ１）を検出するための蛍光標識抗体及び生細胞と死細胞または死にかけている細胞とを識別するためのアネキシンＶ及び７ＡＡＤを使用したフローサイトメトリーによって分析する。アネキシンＶ及び７ＡＡＤ染色は、製造者の指示に従って行う。
いくつかの態様では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体はマスト細胞媒介活性を阻害する。マスト細胞の総数及び活性化のバイオマーカーとしてマスト細胞トリプターゼが使用されている。例えば、総トリプターゼ及び活性トリプターゼ、ならびにヒスタミン、Ｎ－メチルヒスタミン、及び１１－β－プロスタグランジンＦ２を血液または尿で測定して、マスト細胞の減少を評価することができる。例えば、マスト細胞活性アッセイの例については、米国特許出願公開第２０１１０２９３６３１号を参照されたい。
Ｅ．抗体の調製
本明細書に記載の抗体（例えば、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体）は、抗体を作製するための当該技術分野で利用可能な技法を使用して調製され、その例示的な方法を、以下のセクションでより詳細に記載する。
１．抗体フラグメント
本開示は、抗体フラグメントを包含する。抗体フラグメントは、酵素消化などの従来の手段によって、または組み換え法によって作製することができる。ある特定の状況では、全抗体ではなく抗体フラグメントを使用する利点がある。ある特定の抗体フラグメントの概説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （２００３）Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２９－１３４に記載されている。
抗体フラグメントを作製するための様々な技術が開発されている。従来、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化により得られていた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１１７（１９９２）、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかしながら、現在、これらのフラグメントは、組み換え宿主細胞によって直接生成することができる。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びＳｃＦｖ抗体フラグメントはいずれもＥ．ｃｏｌｉで発現させ、分泌されることができるため、これらのフラグメントの大量生産を容易に行うことができる。抗体フラグメントは、上述の抗体ファージライブラリから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメントをＥ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することもできる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２））。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え宿主細胞の培養物から直接単離することもできる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が延長されたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２ フラグメントが、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体フラグメントを産生するための他の技術は当業者には明らかであろう。特定の実施形態では、抗体は、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。例えば、ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、定常領域を欠くインタクトな結合部位を有する唯一の種であり、このため、これらはインビボ使用時の非特異的結合の低減に好適であり得る。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合が生じるように構築されてもよい。前出のＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｅｄ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋを参照されたい。抗体フラグメントは、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるような「線状抗体」でもあってもよい。かかる線状抗体は、単一特異性または二重特異性であってもよい。
２．ヒト化抗体
本開示は、ヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化するためのさまざまな方法が当該技術分野で知られている。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトの由来源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を含む。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「インポート」残基と呼ばれ、通常は「インポート」可変ドメインに由来する。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒの方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６）に従って、超可変領域の配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによって行うことができる。したがって、こうしたヒト化抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりも大幅に小さい部分が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されたキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基、かつ可能性としてはいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメインの選択は、軽鎖及び重鎖の双方ともに、抗原性を低減するために非常に重要であり得る。いわゆる「ベストフィット」法によれば、げっ歯類（例えば、マウス）抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワークとして認められる（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１）。別の方法は、すべてのヒト抗体の軽鎖または重鎖の特定のサブグループのコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３．）。
抗体が、抗原に対する高親和性及び他の好ましい生物学的特性を保持してヒト化されることがさらに一般的に望ましい。この目標を達成するために、１つの方法に従って、ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に使用されており、当業者には周知のものである。選択された候補免疫グロブリン配列の予想される立体配座構造を例示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の予想される役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原に結合する能力に影響を与える残基の解析が可能となる。このように、標的抗原（複数可）に対する増加した親和性などの所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント配列及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接的に、かつ最も実質的に関与している。
特定の実施形態では、本明細書の抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または低下させるように改変される。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付加を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－スレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素結合の認識配列である。従って、ポリペプチド内でのこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位をもたらす。Ｏ結合型グリコシル化とは、糖類、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの結合を指すが、５－ヒドロキシプロリンまたは５－ヒドロキシリジンも使用され得る。
抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、上述の（Ｎ結合型グリコシル化部位のための）トリペプチド配列のうちの１つ以上が生成されるかまたは除去されるように、アミノ酸配列を改変することにより簡便に達成される。この改変は、元の抗体の配列への１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加、欠失または置換によって行うこともできる（Ｏ結合型グリコシル化部位の場合）。
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物を改変することができる。例えば、本抗体のＦｃ領域に結合しているフコースを欠く成熟炭水化物構造を有する抗体が、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）に記載されている。同第ＵＳ２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）も参照されたい。抗体のＦｃ領域に結合した炭水化物中にバイセクトＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する抗体が、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ）及び米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ）に参照されている。抗体のＦｃ領域に結合するオリゴ糖中で少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体が、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．）に報告されている。それらのＦｃ領域に結合した改変炭水化物を有する抗体に関してはＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）も参照されたい。修飾されたグリコシル化を有する抗原結合分子に関して、ＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．）も参照されたい。
特定の実施形態では、グリコシル化変異体は、Ｆｃ領域を含み、ここで、炭水化物構造は、フコースを欠くＦｃ領域に結合する。かかる変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有する。場合により、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣをさらに改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／または３３４位（残基のＥｕ番号付け）における置換をその中にさらに含む。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体に関連する刊行物の例としては、米国公開特許第２００３／０１５７１０８号、国際公開第２０００／６１７３９号、国際公開第２００１／２９２４６号、米国公開特許第２００３／０１１５６１４号、米国公開特許第２００２／０１６４３２８号、米国公開特許第２００４／００９３６２１号、米国公開特許第２００４／０１３２１４０号、米国公開特許第２００４／０１１０７０４号、米国公開特許第２００４／０１１０２８２号、米国公開特許第２００４／０１０９８６５号、国際公開第２００３／０８５１１９号、国際公開第２００３／０８４５７０号、国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００５／０３５７７８号、国際公開第２００５／０５３７４２号、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３６：１２３９－１２４９ （２００４）；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８７： ６１４ （２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ． Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２４９：５３３－５４５（１９８６）、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８ Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、及びＷＯ２００４／０５６３１２ Ａ１，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，特に実施例１１）、及びアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８７： ６１４ （２００４））、及びβ１，４－Ｎ－アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）及びゴルジ体μ－マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）を過剰発現する細胞が挙げられる。
野生型ＣＨＯ細胞で産生される同じ抗体のフコースの量と比較してフコースが減少した抗体が本明細書で企図される。例えば、抗体は、天然ＣＨＯ細胞（例えば、天然ＦＵＴ８遺伝子を含有するＣＨＯ細胞などの天然グリコシル化パターンを産生するＣＨＯ細胞）によって産生された場合にさもなければ有するであろう量よりも少ない量のフコースを有する。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、そのＮ結合型グリカンの約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％未満がフコースを含む抗体である。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、そのＮ結合型グリカンのいずれもフコースを含まない抗体であり、すなわち、抗体は、フコースをまったく有さないか、またはフコースを有さないか、または非フコシル化またはアフコシル化されている。フコースの量は、例えばＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分光分析により測定されるＡｓｎ２９７に付着する全てのグリコ構造体（例えば、複合、混成、及び高マンノース構造体）の合計に対する、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより決定することができる。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域における約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ付番）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体における小規模な配列変異に起因して、２９７位から約±３アミノ酸上流または下流、すなわち、２９４位～３００位の間に位置してもよい。いくつかの実施形態では、抗体の重鎖の少なくとも１つまたは２つが非フコシル化されている。
一実施形態では、抗体は、その血清半減期が改善されるように改変される。抗体の血清半減期を増加させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されるように、サルベージ受容体に結合するエピトープが抗体（特に、抗体断片）に組み込まれ得る。本明細書で使用する場合、用語「サルベージ受容体に結合するエピトープ」とは、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期の増加を担う、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す（ＵＳ２００３／０１９０３１１、米国特許第６，８２１，５０５号、米国特許第６，１６５，７４５号、米国特許第５，６２４，８２１号、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第６，１６５，７４５号、米国特許第５，８３４，５９７）。
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基に置き換えられた抗体分子内に少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発において対象となる部位としては超可変領域が挙げられるが、ＦＲ改変も意図される。保存的置換を表５の見出し「好ましい置換」の下に示す。かかる置換が生物学的活性の望ましい変化をもたらす場合、表５に「例示的な置換」と表示されるか、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載されるより実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされ得る。
抗体の生物学的性質の実質的な改変は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シートもしくはらせん形構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ高さ、の維持への置換の影響が顕著に異なる置換を選択することにより達成される。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従って群分けされ得る（Ａ． Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．， ｐｐ． ７３－７５， Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５））：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群分けされてもよい。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーと別のクラスとの交換を伴う。そのような置換残基は、保存的置換部位に、または残りの（保存されていない）部位にも導入され得る。
置換変異体の種類の１つは、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる開発のために選択される、得られた変異体（複数可）は、それらが生成される親抗体と比較して改変された（例えば、改善された）生物学的特性を有する。かかる置換変異体を生成するための簡便な方法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を伴う。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６～７つの部位）は、各部位に全ての可能なアミノ酸置換を生成するために突然変異される。このようにして生成された抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物）の少なくとも一部との融合物として提示される。その後、ファージディスプレイされた変異体は、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変の超可変領域部位候補を同定するために、抗原結合に顕著に寄与する超可変領域残基を同定するためのスキャニング変異誘発（例えば、アラニンスキャニング）を行うことができる。あるいは、または加えて、抗原－抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と抗原との間の接触点を特定することが有益であり得る。かかる接触残基及び隣接残基は、本明細書において詳述するものを含む、当該技術分野では周知の方法に従う置換の候補である。かかる変異体が生成されたなら、変異体のパネルを、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野では周知の方法を用いたスクリーニングに供し、１つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択することができる。
抗ＩｇＥ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野で周知の種々の方法により調製される。これらの方法としては、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、または事前に調製された変異体または本抗体の非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、及びカセット変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。
１つ以上のアミノ酸改変を本開示の抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することが望ましい場合がある。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステインの位置を含む１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域変異体は、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域を含む。さらなる実施形態では、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域は、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含み、ただし、アミノ酸残基はＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスに従って番号付けされる。
本記述及び当該技術分野の教示に従って、いくつかの実施形態では、本開示の抗体が、例えばＦｃ領域において、野生型対応物抗体と比較して１つ以上の改変を含み得ることが企図される。それにもかかわらず、これらの抗体は、それらの野生型対応物と比較して治療的有用性に必要な実質的に同じ特徴を保持する。例えば、Ｆｃ領域にある特定の改変を行うことにより、例えば、ＷＯ９９／５１６４２に記載されるように、改変された（すなわち、改善または減少のいずれか）Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）がもたらされると考えられる。Ｆｃ領域変異体の他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０ （１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ９４／２９３５１号も参照されたい。ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）及びＷＯ２００４／０５６３１２（Ｌｏｗｍａｎ）は、ＦｃＲｓへの改善または減少した結合を有する抗体変異体について記載している。これらの特許公開の内容を本明細書に参照により具体的に援用するＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）も参照されたい。母体ＩｇＧの胎児への移入の原因である、増加した半減期及び新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を有する抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１７：５８７ （１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：２４９ （１９９４））は、米国公開特許第２００５／００１４９３４Ａ１号（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載される。これらの抗体は、ＦｃＲｎへＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。改変されたＦｃ領域アミノ酸配列及び増加または減少したＣ１ｑ結合能を有するポリペプチド変異体が、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号、ＷＯ９９／５１６４２に記載されている。これらの特許公開の内容を本明細書に参照により具体的に援用するＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）も参照されたい。
７．ベクター、宿主細胞、及び組換え方法
本開示の抗体の組換え産生について、それをコードする核酸が単離され、更なるクローニング（ＤＮＡ増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入される。本抗体をコードするＤＮＡは容易に単離され、従来の手技を使用して（例えば、本抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は使用される宿主細胞に一部拠る。一般に、宿主細胞は、原核生物起源または真核生物（一般に、哺乳類）起源のいずれかのものである。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ定常領域等の任意のアイソタイプの定常領域をこの目的のために使用することができ、かかる定常領域を任意のヒトまたは動物種から得ることができることが理解される。
原核宿主細胞を使用した抗体の作製：
ａ）ベクター構築
本開示の抗体のポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準の組換え法を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞等の抗体産生細胞から単離され、配列決定され得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成機またはＰＣＲ技法を使用して合成され得る。得られた時点で、ポリペプチドをコードする配列が、原核宿主で異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組換えベクターに挿入される。利用可能であり、当該技術分野で既知である多くのベクターが本開示で使用され得る。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸のサイズ及びそのベクターで形質転換される特定の宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅若しくは発現、またはそれらの両方）及びそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて、様々な成分を含む。ベクター成分としては、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入、及び転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。
一般に、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種由来の制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。このベクターは、通常、複製部位、ならびに形質転換細胞における表現型選択を提供することができるマーキング配列を持つ。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉ種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含有し、それ故に形質転換細胞を特定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物プラスミドもしくはバクテリオファージは、内因性タンパク質の発現のための微生物によって使用され得るプロモーターも含有し得るか、またはそれを含有するように修飾され得る。特定の抗体の発現のために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒらによる米国特許５，６４８，２３７号に詳細に記載されている。
加えて、レプリコン及び宿主微生物と適合性のある制御配列を含有するファージベクターが、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用され得る。例えば、λＧＥＭ．ＴＭ．－１１等のバクテリオファージを組換えベクターの作製に利用することができ、この組換えベクターを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２等の感受性宿主細胞を形質転換することができる。
本開示の発現ベクターは、ポリペプチド成分の各々をコードする２つ以上のプロモーター－シストロン対を含み得る。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する非翻訳制御配列である。原核プロモーターは、典型的には、誘導型及び構成型の２つのクラスに分類される。誘導プロモーターは、培養条件の変化、例えば栄養素の存在もしくは不在、または温度の変化に応答してその制御下で増加したレベルのシストロンの転写を開始するプロモーターである。
様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化によりソースＤＮＡからプロモーターを除去し、単離されたプロモーター配列を本開示のベクターに挿入することによって、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に結合し得る。天然プロモーター配列も多くの異種プロモーターもいずれも、標的遺伝子の直接増幅及び／または発現に使用することができる。いくつかの実施形態では、異種プロモーターが利用され、それらが、一般に、天然標的ポリペプチドプロモーターと比較して発現した標的遺伝子のより大きい転写及びより高い収率を可能にするためである。
原核生物宿主との使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、β－ガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃまたはｔｒｃプロモーターが含まれる。しかしながら、細菌において機能的な他のプロモーター（他の既知の細菌プロモーターまたはファージプロモーター等）も好適である。それらのヌクレオチド配列が公開されており、それにより、当業者が、任意の必要とされる制限部位を提供するためにリンカーまたはアダプターを使用して、それらを標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンに作動可能に連結することが可能になっている（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９８０） Ｃｅｌｌ ２０： ２６９）。
本開示の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜にわたる発現ポリペプチドの転位を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列は、このベクターの成分であり得るか、またはこのベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であり得る。本開示の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識及びプロセシングしない原核宿主細胞の場合、シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、及びＭＢＰからなる群から選択される原核シグナル配列によって置換される。本開示の一実施形態では、発現系の両シストロンにおいて使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはその変異体である。
別の態様では、本開示に従う免疫グロブリンの産生は、宿主細胞の細胞質で生じ得、それ故に、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在を必要としない。その点において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖が発現され、フォールドされ、アセンブリされて、その細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ある特定の宿主株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｘＢ－株）は、ジスルフィド結合形成に好ましい細胞質条件を提供し、それにより発現タンパク質サブユニットの適切な折り畳み及びアセンブリを可能にする。Ｐｒｏｂａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
本開示の抗体は、分泌及び適切にアセンブリされた本開示の抗体の収率を最大化するために発現ポリペプチド成分の量比が調節され得る発現系を使用して製造することもできる。かかる調節は、ポリペプチド成分の翻訳強度を同時に調節することによって少なくとも部分的に達成される。
翻訳強度を調節するための１つの技術が、Ｓｉｍｍｏｎｓらによる米国特許５，８４０，５２３号に開示されている。それは、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異体を利用する。所与のＴＩＲについて、一連のアミノ酸または核酸配列変異体がある範囲の翻訳強度で作製され、それによりこの因子を特定の鎖の所望の発現レベルに調整するための便利な手段を提供することができる。ＴＩＲ変異体は、アミノ酸配列を改変することができるコドン変化をもたらす従来の変異誘発技法によって生成され得る。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列の変化はサイレントである。ＴＩＲの改変は、例えば、シグナル配列の改変に加えて、シャイン・ダルガノ配列の数またはスペーシングの改変を含み得る。変異シグナル配列を生成するための１つの方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（すなわち、変化がサイレントである）コード配列の始めに「コドンバンク」を生成することである。これは、各コドンの第３のヌクレオチド位置を変化させることによって達成され得、加えて、ロイシン、セリン、及びアルギニン等のいくつかのアミノ酸は、バンクの作製を複雑にし得る複数の第１及び第２の位置を有する。この変異誘発法は、Ｙａｎｓｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４：１５１－１５８に詳細に記載されている。
一実施形態では、一組のベクターが、その内部の各シストロンのある範囲のＴＩＲ強度で生成される。この限定された組は、各鎖の発現レベルの比較、ならびに種々のＴＩＲ強度組み合わせ下での所望の抗体産物の収率を提供する。ＴＩＲ強度は、Ｓｉｍｍｏｎｓらによる米国特許第５，８４０，５２３号に詳細に記載されるように、レポーター遺伝子の発現レベルを定量することによって決定され得る。翻訳強度比較に基づいて、所望の個々のＴＩＲが、本開示の発現ベクター構築物において組み合わせられるように選択される。
本開示の抗体の発現に好適な原核生物宿主細胞としては、グラム陰性またはグラム陽性生物等のＡｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ及びＥｕｂａｃｔｅｒｉａが挙げられる。有用な細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、またはＰａｒａｃｏｃｃｕｓが挙げられる。一実施形態では、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、本開示の宿主として使用される。Ｅ． ｃｏｌｉ株の例としては、株Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ， Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ２ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９８７）， ｐｐ． １１９０－１２１９、ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）及びその誘導体（遺伝子型Ｗ３１１０ ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ－ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲを有する株３３Ｄ３を含む）が挙げられる（米国特許第５，６３９，６３５号）。他の株及びそれらの誘導体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉλ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）及びＥ．ｃｏｌｉ ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ ３１，６０８）も好適である。これらの例は、限定的なものではなく例示的なものである。定義された遺伝子型を有する上述の細菌のうちのいずれかの誘導体の構築方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ８：３０９－３１４（１９９０）に記載されている。概して、細菌の細胞におけるレプリコンの複製可能性を考慮して、適切な細菌の選択が必要である。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０等の周知のプラスミドを使用してレプリコンを提供する場合、Ｅ．ｃｏｌｉ、セラチア、またはサルモネラ種が宿主として好適に使用され得る。典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきで、望ましくは、更なるプロテアーゼ阻害剤が細胞培養に組み込まれ得る。
抗体産生
宿主細胞は、上述の発現ベクターで形質転換され、必要に応じて、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するように修飾された従来の栄養素培地中で培養される。
形質転換とは、ＤＮＡの原核宿主への導入を意味し、これにより、そのＤＮＡが、染色体外要素として、または染色体組み込み体によってのいずれかで複製可能になる。使用される宿主細胞に応じて、形質転換は、かかる細胞に適切な標準の技法を使用して行われる。塩化カルシウムを用いたカルシウム処理が、かなりの細胞－壁障壁を含む細菌細胞に一般に使用される。形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用される更に別の技法は、電気穿孔である。
本開示のポリペプチドを産生するために使用される原核生物細胞は、当該技術分野で既知であり、かつ選択された宿主細胞の培養に好適な培地で成長する。好適な培地の例としては、必要な栄養補助剤を含むルリアブロス（ＬＢ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、この培地は、発現ベクターの構築に基づいて選択される選択剤も含有し、発現ベクターを含む原核細胞の成長を選択的に可能にする。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞を成長させるためにアンピシリンが培地に添加される。
炭素、窒素、及び無機リン酸塩源以外の任意の必要な補充物は、適切な濃度で含まれ、単独で、または複合体窒素源等の別の補充物もしくは培地との混合物として導入され得る。任意に、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール、及びジチオスレイトールからなる群から選択される１つ以上の還元剤を含有し得る。
原核宿主細胞は、好適な温度で培養される。特定の実施形態では、Ｅ． ｃｏｌｉ増殖において、増殖温度は、約２０℃～約３９℃、約２５℃～約３７℃の範囲、または約３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて約５～約９の範囲の任意のｐＨであってよい。特定の実施形態では、ｐＨは、約６．８～約７．４、または約７．０である。
誘導プロモーターが本開示の発現ベクターに使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。本開示の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターは、ポリペプチドの転写を制御するために使用される。したがって、形質転換宿主細胞は、誘導のためにリン酸限定培地中で培養される。特定の実施形態では、リン酸塩限定培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３－１４７を参照されたい）。当該技術分野で既知の用いられるベクター構築物に従って、様々な他の誘導因子を使用することができる。
一実施形態では、本開示の発現ポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズムに分泌され、それから回収される。タンパク質回収は、典型的には、一般に、浸透圧衝撃、超音波処理、または溶解等の手段による微生物の破壊を伴う。細胞が破壊されると、細胞残屑または全細胞が遠心分離または濾過によって除去され得る。タンパク質は、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーによって更に精製され得る。あるいは、タンパク質は、培養培地に輸送され、そこで単離され得る。細胞が培養物から除去され、培養上清が濾過され、産生されたタンパク質の更なる精製のために濃縮され得る。発現したポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットアッセイ等の一般に既知の方法を使用して更に単離及び特定され得る。
本開示の一態様では、抗体産生は、発酵プロセスによって大量に行われる。様々な大規模流加回分発酵手技は、組換えタンパク質の産生に利用可能である。大規模発酵は、少なくとも１０００リットルの容量を有し、特定の実施形態では、１，０００～１００，０００リットルの容量を有する。これらの発酵槽は、酸素及び栄養素、特にグルコースを分配するために撹拌インペラーを使用する。小規模発酵とは、一般に、およそ１００リットル以下の容積であり、約１リットル～約１００リットルの範囲であり得る発酵槽内での発酵を指す。
発酵プロセスにおいて、タンパク質発現の誘導は、典型的には、細胞が好適な条件下で所望の密度、例えば、約１８０～２２０のＯＤ５５０に成長した後に開始し、その段階で、細胞は、初期静止期にある。当該技術分野で既知であり、かつ上述されている用いられるベクター構築に従って、様々な誘導因子を使用することができる。細胞は、誘導前により短い期間成長させられてもよい。細胞は、通常、約１２～５０時間誘導されるが、より長いまたはより短い誘導時間も使用され得る。
本開示のポリペプチドの製造収率及び品質を改善するために、種々の発酵条件が修正され得る。例えば、分泌抗体ポリペプチドの適切なアセンブリ及びフォールディングを改善するために、シャペロンタンパク質、例えば、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、及び／もしくはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を有するペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ）を過剰発現する更なるベクターを使用して、宿主原核細胞を共形質転換することができる。シャペロンタンパク質が細菌宿主細胞内で産生された異種タンパク質の適切なフォールディング及び溶解を容易にすることが実証されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１９６０１－１９６０５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０８３，７１５；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０２７，８８８；Ｂｏｔｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１００－１７１０５；Ｒａｍｍ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ （２０００） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１７１０６－１７１１３；Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９９－２１０．）。
発現異種タンパク質（特にタンパク質分解感受性のもの）のタンパク質分解を最小限に抑えるために、タンパク質分解酵素が欠損したある特定の宿主株が本開示に使用され得る。例えば、宿主細胞株は、既知の細菌プロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、及びそれらの組み合わせをコードする遺伝子において遺伝子変異（複数可）をもたらすように修飾され得る。いくつかのＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損株が利用可能であり、例えば、Ｊｏｌｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）（上記を参照）、Ｇｅｏｒｇｉｏｕらによる米国特許第５，２６４，３６５号、Ｇｅｏｒｇｉｏｕらによる米国特許第５，５０８，１９２号、Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ， ２：６３－７２（１９９６）に記載されている。
一実施形態では、タンパク質分解酵素が欠損し、かつ１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株が、本開示の発現系における宿主細胞として使用される。
ｃ）抗体精製
一実施形態では、本明細書で製造される抗体タンパク質は、さらなるアッセイ及び使用のために、実質的に同種の調製物を得るようにさらに精製される。当該技術分野で既知の標準のタンパク質精製方法が用いられ得る。以下の手技：免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、ＤＥＡＥ等のシリカまたは陽イオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及び例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５を使用したゲル濾過が、好適な精製手技の例示である。
一態様では、固相に固定化されたタンパク質Ａが、本開示の抗体産物の免疫親和性精製に使用される。プロテインＡは、高親和性で抗体のＦｃ領域に結合するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ由来の４１ｋＤの細胞壁タンパク質である（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．６２：１－１３．）。プロテインＡが固定化される固相は、好ましくは、ガラスまたはシリカ表面を含むカラム、または、制御孔ガラスカラムまたはケイ酸カラムであってよい。いくつかの適用では、カラムは、混入物質の非特異的付着を可能な限り阻止するためにグリセロール等の試薬でコーティングされる。
精製の第１のステップとして、上述のように細胞培養から得られた調製物をプロテインＡ固定化固相に適用することで目的とする抗体のプロテインＡへの特異的結合を可能とする。次いで、固相を洗浄して固相に非特異的に結合した混入物質を除去する。最終的に、目的とする抗体が溶出により固相から回収される。
真核宿主細胞を使用した抗体の生産
真核生物宿主細胞で使用するためのベクターは、一般に以下の非限定的な成分、すなわち、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上を含む。
ａ）シグナル配列成分
真核宿主細胞で使用するためのベクターは、目的とする成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドも含有し得る。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識及びプロセシングされ得る（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）。哺乳類細胞発現において、哺乳類シグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。かかる前駆体領域のＤＮＡがリーディングフレーム内で本抗体をコードするＤＮＡにライゲートされる。
ｂ）複製起点
一般に、複製起点成分は、哺乳類発現ベクターに必要ではない。例えば、ＳＶ４０起点が初期プロモーターを含有するため、ＳＶ４０起点が典型的に使用され得る。
ｃ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を含有しても良い。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリンへの耐性を付与するタンパク質、（ｂ）関連性がある場合、栄養要求性欠損を補足するタンパク質、または（ｃ）複合培地から入手不可能な重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止するための薬物を利用する。異種遺伝子による形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を与え、それにより選択レジメンで生存するタンパク質を生成する。かかる優勢選択の例は、薬物である、ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳類細胞に好適な選択可能なマーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン－Ｉ及び－ＩＩ、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等の抗体核酸の取り込みにコンピテントな細胞の特定を可能にするものである。
例えばいくつかの実施形態では、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、最初に、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で全ての形質転換体を培養することによって特定される。いくつかの実施形態では、野生型ＤＨＦＲが用いられるときに適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９０９６）である。
あるいは、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３’－ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）等の別の選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８等の選択可能なマーカー用の選択剤を含有する培地中での細胞成長によって選択され得る（米国特許第４，９６５，１９９号を参照）。宿主細胞には、グルタミン合成酵素（ＧＳ）が欠損した細胞系を含む、ＮＳ０、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、または誘導体が含まれ得る。哺乳動物細胞の選択マーカーとしてＧＳを使用する方法は、米国特許第５，１２２，４６４号及び米国特許第５，８９１，６９３号に記載されている。
ｄ）プロモーター成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、一般に、宿主生物によって認識され、かつ目的のポリペプチド（例えば、抗体）をコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む。真核生物のプロモーター配列は既知である。例えば、実質的に全ての真核遺伝子が、転写が始まる部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０～８０塩基上流に見られる別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであり得るＣＮＣＡＡＴ領域である。大半の真核遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端へのポリＡ尾部の付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。特定の実施形態では、これらの配列のいずれかまたはすべてを、真核生物発現ベクターに適当に挿入することができる。
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御されるが、但し、かかるプロモーターが宿主細胞系と適合性であることを条件とする。
ＳＶ４０ウイルスの早期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として好都合に得られる。ウシ乳頭腫ウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主におけるＤＮＡを発現させるための系は特許第４，４１９，４４６号に開示されている。このシステムの改変については特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ－インターフェロンｃＤＮＡの発現について記載した、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８－６０１（１９８２）も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復配列をプロモーターとして使用することができる。
ｅ）エンハンサーエレメント成分
より高次の真核生物による本開示の抗体をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加する。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、及びインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００～２７０）、ヒトサイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、マウスサイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントについて記載したＹａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７－１８（１９８２）も参照されたい。このエンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列に対して５’位または３’位でベクターにスプライスされるが、一般にプロモーターから５’部位に位置する。
ｆ）転写終結成分
真核宿主細胞において使用される発現ベクターはまた、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有しても良い。かかる配列は、一般的には、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、時折、３’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びそれに開示される発現ベクターを参照されたい。
ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書でのベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞としては、脊椎動物宿主細胞を含む本明細書に記載のより高次の真核生物細胞が挙げられる。脊椎動物培養細胞（組織培養）の繁殖が日常的な手技になっている。有用な哺乳動物細胞株の例としては、例えば、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎由来細胞ＣＶ１株（ＣＳＯ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胎児腎細胞株（２９３細胞、または増殖のために懸濁培養でサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞／ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））、サル腎由来細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頚部癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎由来細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、ＣＨＯＫ１細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞または誘導体、ならびにヒト肝癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）がある。
宿主細胞は、抗体産生のために上述の発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切なものとして修飾された従来の栄養培地中で培養される。
ｈ）宿主細胞の培養
本開示の抗体を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）等の市販されている培地は、宿主細胞の培養に好適である。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、または同第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国再発行特許第３０，９８５号に記載される培地のいずれも宿主細胞の培地として使用することができる。これらの培地のうちのいずれかには、必要に応じて、ホルモン及び／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因等子）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩等）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジン等）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物等）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終密度で存在する無機化合物と定義される）、ならびにグルコースまたは等価エネルギー源が補充され得る。当業者には周知の他の任意の補助物質も適当な濃度で添加することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともにこれまでに使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
ｉ）抗体の精製
組換え技法を使用する際、本抗体は、細胞内に産生され得るか、または培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、微粒子残屑（宿主細胞または溶解フラグメントのいずれか）を、例えば、遠心分離または限外濾過により除去することができる。抗体が培地に分泌される場合、かかる発現系の上清は、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して最初に濃縮することができる。タンパク質分解を阻害するためのＰＭＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤が前述のステップのうちのいずれかに含まれてもよく、外来性夾雑物の成長を阻止するための抗生物質が含まれてもよい。
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、親和性クロマトグラフィーが便宜のよい方法である。タンパク質Ａの親和性リガンドとしての適合性は、本抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６２：１－１３ （１９８３））。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスは、多くの場合アガロースとすることができるが、他のマトリックスも利用可能である。制御された細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定したマトリックスにより、アガロースを用いて達成され得るものよりも流速を早くして処理時間を短くすることが可能となる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質を精製するための他の技法、例えば、イオン交換カラム上での分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（商標）上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）上でのクロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も回収される抗体に応じて利用可能である。
任意の予備精製ステップ（複数可）後、目的とする抗体及び混入物質を含む混合物をさらなる精製、例えば、低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍの塩）で行われる、約２．５～４．５のｐＨの溶出緩衝液を使用した低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけることができる。
一般に、研究、試験、及び臨床使用で使用するための抗体を調製するための様々な方法論が当該技術分野で十分に確立されており、上述の方法論と一致しており、かつ／または当業者により目的とする特定の抗体に適切であるとみなされる。
非フコシル化抗体の産生
本明細書では、フコシル化度が低い抗体を調製する方法が提供される。例えば、本明細書で想到される方法としては、これらに限定されるものではないが、タンパク質フコシル化が欠損している細胞株（例えば、Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞、α－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ノックアウトＣＨＯ細胞、β１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩを過剰発現する細胞）の使用、ならびに抗体の産生に使用される細胞培養培地へのフコース類似体（複数可）の添加が挙げられる（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ． Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２４９：５３３－５４５ （１９８６）；米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８ Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ， Ｌ；ＷＯ ２００４／０５６３１２ Ａ１；Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ． ８７： ６１４ （２００４）；及び米国特許第８，５７４，９０７号を参照）。抗体のフコース含有量を減少させるためのさらなる方法としては、米国特許出願公開第２０１２／０２１４９７５号に記載されるＧｌｙｍａｘｘ技術が含まれる。抗体のフコース含有量を減少させるためのさらなる技術には、抗体の産生に使用される細胞培養培地への１つ以上のグリコシダーゼ阻害剤の添加も含まれる。グリコシダーゼ阻害剤としては、α－グルコシダーゼＩ、α－グルコシダーゼＩＩ、及びα－マンノシダーゼＩが挙げられる。いくつかの実施形態では、グリコシダーゼ阻害剤は、α－マンノシダーゼＩの阻害剤（例えば、キフネンシン）である。
本明細書で使用する場合、「コアフコシル化」とは、Ｎ結合型グリカンの還元末端におけるＮ－アセチルグルコサミン（「ＧｌｃＮＡｃ」）へのフコースの付加（「フコシル化」）を指す。そのような方法によって産生される抗体及びその組成物もまた提供される。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域（またはドメイン）に結合した複合Ｎ－グリコシド結合型糖鎖のフコシル化が低減される。本明細書で使用する場合、「複合Ｎ－グリコシド結合型糖鎖」は、一般的にアスパラギン２９７（Ｋａｂａｔの番号付けによる）に結合するが、複合Ｎ－グリコシド結合型糖鎖は他のアスパラギン残基に結合することもできる。「複合Ｎ－グリコシド結合型糖鎖」には、コア構造の非還元末端にマンノースのみが組み込まれた高マンノース型の糖鎖は含まれないが、１）コア構造の非還元末端側が、ガラクトース－Ｎ－アセチルグルコサミン（「ｇａｌ－ＧｌｃＮＡｃ」とも呼ばれる）の１つ以上の分岐を有し、Ｇａｌ－ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側が場合によりシアル酸、バイセクトＮ－アセチルグルコサミンなどを有するような複合型、または２）コア構造の非還元末端側が高マンノースＮ－グリコシド結合型糖鎖と複合型Ｎ－グリコシド結合型糖鎖の両方の分岐を有するようなハイブリッド型が含まれる。
いくつかの実施形態では、「複合Ｎ－グリコシド結合型糖鎖」は、コア構造の非還元末端側が、０個、１個、または複数個のガラクトース－Ｎ－アセチルグルコサミン（「ｇａｌ－ＧｌｃＮＡｃ」とも呼ばれる）の分岐を有し、Ｇａｌ－ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側が場合によりシアル酸、バイセクトＮ－アセチルグルコサミンなどの構造をさらに有するような複合型を含む。
本方法によれば、一般的に、少量のフコースのみが複合Ｎ－グリコシド結合型糖鎖に取り込まれる。例えば、異なる実施形態において、約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、または約１％未満の抗体が、組成物中でフコースによるコアフコシル化を有する。いくつかの実施形態では、組成物中でフコースによるコアフコシル化を有する抗体は実質的に存在しない（すなわち、約０．５％未満）。いくつかの実施形態では、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超％、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、または約９９％超の抗体が、組成物中で非フコシル化されている。
いくつかの実施形態では、本明細書において、フコース残基を含むＮ－グリコシド結合型炭水化物鎖が実質的に存在しない（すなわち、約０．５％未満）抗体が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書において、抗体の重鎖の少なくとも１つまたは２つが非フコシル化されている抗体が提供される。
上記のように、様々な哺乳動物宿主発現ベクター系を利用して抗体を発現させることができる。いくつかの実施形態では、培地にフコースは添加されない。いくつかの実施形態では、有効量のフコース類似体が培地に添加される。この関連において、「有効量」とは、抗体の複合Ｎ－グリコシド結合型糖鎖へのフコースの取り込みを少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％減少させるのに十分な類似体の量を指す。いくつかの実施形態では、本方法によって製造される抗体は、フコース類似体の非存在下で培養された宿主細胞から産生された抗体と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％の非コアフコシル化タンパク質（例えば、コアフコシル化を欠く）を含む。
糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖と、糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにフコースが結合している糖鎖との含有量（例えば、比）は、例えば、実施例に記載されるようにして決定することができる。他の方法としては、ヒドラジン分解や酵素消化（例：生化学実験法２３：糖タンパク質糖鎖研究法（学会出版センター）、高橋礼子編（１９８９年）参照）、放出された糖鎖の蛍光標識または放射性同位体標識の後、標識された糖鎖をクロマトグラフィーで分離することが挙げられる。また、放出された糖鎖の組成は、ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ法で分析することにより決定することができる（例えば、Ｊ．Ｌｉｑ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ６：１５５７ （１９８３）参照）。（一般的には米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号を参照）。
ＩＩＩ．製品またはキット
別の態様では、本明細書に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体（例えば、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する抗体）を含む本開示の液体製剤または医薬組成物を含む製品またはキットが提供される。製品またはキットは、例えば皮下投与のための、本開示の方法における抗体の使用のための説明書をさらに含むことができる。特定の実施形態では、個体は、ヒトである。
製品またはキットは、さらに容器を含むことができる。適当な容器としては、例えば、ボトル、バイアル（例えば、二室バイアル）、シリンジ（一室または二室シリンジ）、及び試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどのさまざまな材料から形成することができる。容器は製剤を保持する。いくつかの実施形態では、容器はガラスバイアルである。
製造品またはキットは、容器の表面または容器に付属する、製剤の再構成及び／または使用についての指示を示すことができるラベルまたは添付文書をさらに含んでもよい。ラベルまたは添付文書は、製剤が、個体における本開示の疾患または障害を治療及び／または予防するための皮下投与に有用であるか、またはそれを意図したものであることをさらに示してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ラベルまたは添付文書は、製剤が、以下、すなわち、喘息併発を伴う慢性副鼻腔炎、アスピリン増悪呼吸器疾患、副鼻腔疾患を伴う成人発症型非アトピー型喘息、慢性閉塞性肺疾患、線維性疾患、前線維性疾患、進行性全身性マスト細胞症、無痛性全身性マスト細胞症（ＩＳＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、好酸球性食道炎（ＥＯＥ）、好酸球性胃炎（ＥＧ）、好酸球性胃腸炎（ＥＧＥ）、好酸球性大腸炎（ＥＯＣ）、好酸球性十二指腸炎、マスト細胞性胃炎またはマスト細胞性胃腸炎、マスト細胞数増加を伴う胃炎または胃腸炎、過敏性腸症候群、マスト細胞数増加を伴う過敏性腸症候群、機能性消化管疾患、機能性ディスペプシア、アレルギー性結膜炎、巨大乳頭結膜炎、慢性蕁麻疹、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、アレルギー性喘息、好酸球またはマスト細胞表現型を伴う喘息、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、セリアック病、胃不全麻痺、好酸球増多症候群、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー、血管浮腫、マスト細胞活性化症候群／障害、及び好酸球性筋膜炎からなる群から選択される１つ以上の疾患または障害を治療及び／または予防するための皮下投与に有用であるか、またはそれを意図したものであることをさらに示してもよい。
製剤を保持する容器は、一回使用バイアル、または再構成された製剤の繰り返し投与を可能にする複数回使用バイアルであってよい。製品またはキットは、適当な希釈剤を含んだ第２の容器をさらに含むことができる。製品またはキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を有する添付文書を含む商業的、治療的、及び使用者の視点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
特定の実施形態では、本開示は、単回用量投与単位用のキットを提供する。このようなキットは、一室または多室のプレフィルドシリンジの両方を含む治療用抗体の水性製剤の容器を含む。例示的なプレフィルドシリンジは、Ｖｅｔｔｅｒ ＧｍｂＨ、Ｒａｖｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙより販売されている。
別の実施形態では、本明細書において、オートインジェクターで投与するための、本明細書に記載の製剤を含む製造品またはキットが提供される。オートインジェクターは、起動時に患者または管理者によるさらなる必要な操作なしで内容物を投与する注射装置として述べることができる。オートインジェクターは、投与速度が一定である必要があり、投与時間が数分よりも長い場合の治療用製剤の自己投薬に特に適している。
本明細書に述べられる態様及び実施形態はあくまで例示的な目的のものに過ぎず、これらを考慮することでさまざまな改変または変更が当業者に示唆され、かかる改変及び変更は本出願の趣旨及び範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるものである点は理解されよう。
以下の実施例を参照することにより、本開示のより完全な理解が得られるであろう。しかしながら、これらの実施例は本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に述べられる実施例及び実施形態はあくまで例示的な目的のものに過ぎず、これらを考慮することでさまざまな改変または変更が当業者に示唆され、かかる改変及び変更は本出願の趣旨及び範囲、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるものである点は理解されよう。
実施例１：皮下抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体製剤のｐＨのスクリーニング
以下の実施例では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体ＡＫ００２（配列番号７５の配列を含む重鎖と配列番号７６を含む軽鎖とを含むヒト化アフコシル化抗体）の皮下投与のための適切な製剤化条件を特定することを目的とした実験について記載する。現在の高濃度の市販製品は、一般的には、５．５～６．３のｐＨ条件及び５～９％の糖濃度を有するヒスチジン緩衝液中で製剤化される。抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の予備的な高濃度製剤試験として、異なる緩衝液をそれらのｐＫａに基づいて使用して、目的のｐＨ範囲をスクリーニングした。賦形剤の添加についても、糖、塩、アルギニンの効果を比較して評価した。製剤の成功は、製品の濁度または凝集物の形成をほとんど、またはまったくともなうことなく、所定の時間にわたって高濃度の製品を溶液中で維持することに基づいたものとした。
材料及び方法
皮下製剤の開発試験で使用した出発物質は、凍結したＧＭＰ原薬（ＤＳ）とした。ＤＳを再処理の前に周囲温度で解凍した。試験を開始する前に、解凍したＤＳを再精製してポリソルベート８０を除去した。
実施された試験に基づいて、再処理した材料のアリコートを、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）１０Ｋの透析カセットを使用して試験される適切なバッファー中に透析した。透析された物質を、ＭＷＣＯ＝３０ＫのＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターに移した。生成物のプールを、濁度が視認される点まで、または濁度がない点まで濃縮し、３０００ｒｃｆで動作する卓上エッペンドルフ遠心分離機を使用して所望の濃度を得た。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ分光光度計を使用して、２８０ｎｍのＵＶ吸光度によって最終生成物の濃度を分析した。塩化ナトリウム、アルギニン、スクロース、及びトレハロース賦形剤を加えて、濃縮試料に対する賦形剤の影響を評価した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ分光光度計を使用して、３４０ｎｍのＵＶ吸光度によって濁度を分析した。Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ｐＨメーターを使用して濃縮プールのｐＨを確認し、ポリスチレンキュベットを使用して各試料を視覚的に評価した。製剤の成功に基づいて、いくつかのプールを分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析して、モノマー含有量を評価した。試料に対する温度の影響を評価するため、濃縮プールを２～８℃の冷蔵庫に保存した。２～８℃での保存後に最大の製品安定性を示した試料プールを、その後の試験でさらに評価した。
さまざまなｐＨでの抗体物質の濃度により、濁度の視覚的評価が可能であった。３４０ｎｍのＵＶ吸光度での光散乱分析によって濁度をさらに確認した。各試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析し、モノマーと凝集体の含有量を評価した。
結果
異なる緩衝液を使用して、５．０～７．２のｐＨスクリーニング範囲を試験した。１５ｍＭリン酸カリウム緩衝液を使用して、ｐＨ７．２で抗Ｓｉｇｌｅｃ－８産物を評価した。リン酸カリウムプールを１１．０ｍｇ／ｍｌ～１１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した（濃縮係数１０倍）。濃縮中、約３２ｍｇ／ｍｌで濁りが観察され、プール濃度が増加するにつれて次第に濁りが増加した。図１は、リン酸カリウムプールの濃縮時の濁度の推移を示す。
１５ｍＭのＬ－ヒスチジン緩衝液を使用して、ｐＨ６．４で抗Ｓｉｇｌｅｃ－８産物を評価した。Ｌ－ヒスチジンプールを１１．０ｍｇ／ｍｌ～１８５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した（濃縮係数１７倍）。濃縮中、濁りは観察されなかったが、生成物は１８５ｍｇ／ｍｌで高粘度の徴候を示した。周囲温度で１時間暴露した後、１８５ｍｇ／ｍｌの試料の固化またはゲル化が生じていた。周囲温度で一晩保存した後、１８５ｍｇ／ｍｌの１５ｍＭ Ｌ－ヒスチジンプールは完全にゲル化していた。図２は、ヒスチジンプールの濃縮時の濁度の推移を示す。
１５ｍＭのコハク酸ナトリウム緩衝液を使用して、ｐＨ６．０で抗Ｓｉｇｌｅｃ－８産物を評価した。コハク酸ナトリウムプールを１８．０ｍｇ／ｍｌ～１７０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した（濃縮係数９倍）。濃縮中、約１２０ｍｇ／ｍｌで濁りが観察され、プール濃度が増加するにつれて次第に濁りが増加した。周囲温度で１時間後、ゲルの形成が生じた。図３は、コハク酸ナトリウムｐＨ６．０のプールの濃縮時の濁度の推移を示す。
１５ｍＭのコハク酸ナトリウム緩衝液を使用して、ｐＨ５．６での抗Ｓｉｇｌｅｃ－８産物も評価した。コハク酸ナトリウムプールを１０．０ｍｇ／ｍｌ～１６５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した（濃縮係数１６倍）。濃縮中、約１２５ｍｇ／ｍｌで濁りが観察され、プール濃度が増加するにつれて次第に濁りが増加した。周囲温度で１時間後にかなりの濁りが見られ、周囲温度で３日後にゲルの形成が生じた。図４は、コハク酸ナトリウムｐＨ５．６のプールの濃縮時の濁度の推移を示す。
１５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液を使用して、ｐＨ５．０で抗Ｓｉｇｌｅｃ－８産物を評価した。酢酸ナトリウムプールを１７．０ｍｇ／ｍｌ～１９０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した（濃縮係数１１倍）。濃縮中、濁りは観察されなかったが、生成物は１９０ｍｇ／ｍｌで中程度の粘度の徴候を示した。酢酸ナトリウム濃縮中の生成物推移については、図５を参照されたい。１９０ｍｇ／ｍｌの試料では、５℃で７日間まで、濁りやゲル化はみられなかった。すべての試料の条件と結果については、表Ａを参照されたい。
結論として、酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ヒスチジン、及びリン酸カリウム緩衝液を使用して、ｐＫａに基づいてｐＨ範囲を評価した。ヒスチジン及び酢酸ナトリウム緩衝液では、濁りのない抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の濃縮が可能であった。抗体は、ｐＨ５．６または６．０のコハク酸ナトリウム緩衝液中では高濃度でゲルを形成することが分かった。
実施例２：皮下抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体製剤の賦形剤のスクリーニング
本実施例では、賦形剤を異なる緩衝液に添加して、上記の実施例１に記載したように濁度を評価した。
１５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２中の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体を１１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。アルギニンを第１の試料に加えて、３２０ｍＭの濃度とした。８５ｍｇ／ｍｌの最終濃度では、プールは周囲温度及び５℃の両方で時間０及び３日目で透明であった。スクロースを第２の試料に加えて、５４０ｍＭの濃度とした。７０ｍｇ／ｍｌの最終濃度では、プールは時間０で中程度に濁っていた。塩化ナトリウムを第３の試料に加えて、５００ｍＭの濃度とした。８０ｍｇ／ｍｌの最終濃度では、プールは時間０で大きく濁っていた。図６は、ｐＨ７．２での４つの試料間の濁度の比較を示す。
１５ｍＭのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．４中の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体を１８５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。アルギニンを第１の試料に加えて、１００ｍＭの濃度とした。１６５ｍｇ／ｍｌの最終濃度では、プールは時間０で中程度に濁り、１日目に大きく濁り、ゲル化が開始した。スクロースを第２の試料に加えて、２６０ｍＭの濃度とした。１５０ｍｇ／ｍｌの最終濃度では、プールは時間０で中程度に濁り、周囲温度での１日のインキュベーション後に透明であった。スクロースプールは、５℃で１か月以上透明なままであった。塩化ナトリウムを第３の試料に加えて、１４０ｍＭの濃度とした。１６５ｍｇ／ｍｌの最終濃度では、プールは時間０及び周囲温度で１日目で大きく濁り、ゲル化が開始した。図７は、ｐＨ６．４での４つの試料間の濁度の比較を示す。
１５ｍＭのコハク酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．６中の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体を１６５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。アルギニンを第１の試料に加えて、１００ｍＭの濃度とした。１５０ｍｇ／ｍｌの最終濃度では、プールは時間０でわずかに濁り、周囲温度で３日目に中程度に濁った。スクロースを第２の試料に加えて、２６０ｍＭの濃度とした。１３０ｍｇ／ｍｌの最終濃度では、プールは時間０で透明であり、周囲温度で３日目に透明であった。塩化ナトリウムを第３の試料に加えて、１４０ｍＭの濃度とした。１５０ｍｇ／ｍｌの最終濃度では、プールは時間０で大きく濁り、周囲温度で３日目にゲル化が開始した。図８は、ｐＨ５．６での４つの試料間の濁度の比較を示す。
１５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０中の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体を１９０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。アルギニンを第１の試料に加えて、１００ｍＭの濃度とした。１７０ｍｇ／ｍｌの最終濃度では、プールは時間０で透明であり、５℃で７日目まで透明のままであった。スクロースを第２の試料に加えて、２６０ｍＭの濃度とした。１５５ｍｇ／ｍｌの最終濃度では、プールは時間０で透明であり、５℃で７日目まで透明のままであった。塩化ナトリウムを第３の試料に加えて、１４０ｍＭの濃度とした。１７０ｍｇ／ｍｌの最終濃度では、プールは時間０で透明であり、５℃で７日目まで透明のままであった。表Ｂに、賦形剤添加試験の結果を示す。
実施例３：実施例１：皮下抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体製剤のｐＨと賦形剤との組み合わせのスクリーニング
前の試験からの正のバッファー及び賦形剤のデータに基づいて、スクロース及びトレハロースの賦形剤の添加を、酢酸ナトリウム及びヒスチジンを使用したｐＨ範囲と組み合わせて濁度を評価した。５ｍＭの酢酸ナトリウムと２６０ｍＭスクロースまたは２６０ｍＭトレハロースとの組み合わせをｐＨ５．０、５．３、及び５．６で評価した。１５ｍＭヒスチジンと２６０ｍＭスクロースまたは２６０ｍＭトレハロースとの組み合わせをｐＨ５．５、５．８、及び６．１で評価した。
ｐＨ５．０、５．３及び５．６の１５ｍＭ酢酸ナトリウム中の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の３つのアリコートを１１．０ｍｇ／ｍｌから１７５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ｐＨ分析後、各プールのｐＨが約０．２～０．３単位増加したことが注目され、ギブス・ドナン効果が生じたことが示唆された。コントロール試料（約１７５ｍｇ／ｍｌでｐＨ５．３、ｐＨ５．６及びｐＨ５．８）を周囲温度で取り置きした。ｐＨ５．３の２つの試料、ｐＨ５．６の２つの試料、ｐＨ５．８で２つの試料の合計６つの試験試料を調製した。スクロースを試料の第１のセット（ｐＨ５．３、５．６、及び５．８）に加えて濃度を２６０ｍＭとした。すべてのスクロース試験試料の最終濃度を約１４０ｍｇ／ｍｌとした。経時的な濁度を評価するために、試料を ５℃で保存した。すべてのスクロース試料は、５℃で１４日目まで透明なままであった。トレハロースを試料の第２のセット（ｐＨ５．３、５．６、及び５．８）に加えて濃度を２６０ｍＭとした。すべてのトレハロース試験試料の最終濃度を約１３０ｍｇ／ｍｌとした。経時的な濁度を評価するために、試料を ５℃で保存した。すべてのトレハロース試料は、５℃で１４日目まで透明なままであった。調製したすべての酢酸ナトリウム試料の目視観察結果を表Ｃに示す。
酢酸ナトリウム試料の濁度を３４０ｎｍのＵＶ吸光度を用いた光散乱法によって分析した。酢酸ナトリウムの光散乱分析の結果を表Ｄに示す。
ｐＨ５．５、５．８及び６．１の１５ｍＭ酢酸ヒスチジン中の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の３つのアリコートを１１．０ｍｇ／ｍｌから１７５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ｐＨ分析後、濃縮後のｐＨ変化の兆候はほとんど認められなかった。コントロール試料（約１７５ｍｇ／ｍｌでｐＨ５．５、ｐＨ５．８及びｐＨ６．１）を周囲温度で取り置きした。ｐＨ５．５の２つの試料、ｐＨ５．８の２つの試料、ｐＨ６．１で２つの試料の合計６つの試験試料を調製した。スクロースを試料の第１のセット（ｐＨ５．５、５．８、及び６．１）に加えて濃度を２６０ｍＭとした。すべてのスクロース試験試料の最終濃度を約１４２ｍｇ／ｍｌとした。経時的な濁度を評価するために、試料を５℃で保存した。すべてのスクロース試料は、５℃で１４日目まで透明なままであった。トレハロースを試料の第２のセット（ｐＨ５．５、５．８、及び６．１）に加えて濃度を２６０ｍＭとした。すべてのトレハロース試験試料の最終濃度を約１３２ｍｇ／ｍｌとした。経時的な濁度を評価するために、試料を５℃で保存した。すべてのトレハロース試料は、５℃で１４日目まで透明なままであった。調製したすべてのヒスチジン試料の目視観察結果を表Ｅに示す。
ヒスチジン試料の濁度を３４０ｎｍのＵＶ吸光度を用いた光散乱法によって分析した。ヒスチジンの光散乱分析の結果を表Ｆに示す。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、ヒスチジン試料のモノマー含有量を分析した。ヒスチジンのＳＥＣ分析の結果を表Ｇに示す。
前の実験で観察されたギブス・ドナン効果を確認するために試験を行った。第１の試験では、１５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２０中の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体を約２１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。濃縮後、プールのｐＨは５．４４になり、０．２４ｐＨ単位増加した。第２の試験では、１５ｍＭのヒスチジン、ｐＨ５．７０中の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体を約１９５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。濃縮後、プールのｐＨは５．８９になり、０．１９ｐＨ単位増加した。ｐＨの結果を表Ｈに示す
結論
ｐＨスクリーニング試験は、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体分子が５．０～６．４のｐＨ範囲でより安定であることを示唆した。ｐＨ範囲の評価は、緩衝液に関係なく、ｐＨ≧６．４で抗体が溶液から析出することを示した。ｐＨ７．２の緩衝液では、３２ｍｇ／ｍＬの濃度で濁りが観察され、さらに濃度が高くなるにつれて次第に悪化するのに従って、分子が沈殿し始めた。抗体分子はまた、特定の緩衝溶液に選択性を有する。表Ａに示すように、高濃度（＞１６５ｍｇ／ｍＬ）の分子は、１５ｍＭの酢酸塩、ｐＨ５．０及び１５ｍＭのＬ－ヒスチジン、ｐＨ６．４では長期間にわたって溶液の状態に維持されたが、ｐＨ５．６及び６．０の１５ｍＭコハク酸緩衝液では沈殿した。
特定の賦形剤の添加により、高濃度での分子の安定性が向上した。ｐＨ５．０、５．６、及び６．４で、２６０ｍＭスクロースの存在下での高濃度プール（≧１３０ｍｇ／ｍＬ）は、長期間にわたって透明なままであった。さらなる実験により、糖（２６０ｍＭスクロース及び２６０ｍＭトレハロース）の存在下では高濃度（≧１３０ｍｇ／ｍＬ）の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体分子が５℃で１４日間よりも長期間にわたって透明なままであることが確認された。光散乱の結果は、糖を含まないコントロール試料と比較して、糖を含む試料の３４０ナノメートルでの吸光度の減少を示した。ＳＥＣ分析の結果によって、５℃での１４日間の保存後もモノマー含有量が変化しなかったことから、分子の安定性も確認された。ギブス・ドナン効果が高濃度試験で確認され、製品濃度がより高くなるのにつれてより顕著となった。驚くべきことに、高濃度のアルギニンの存在下で塩析効果が観察され、塩化ナトリウムの存在下でも観察された。最も成功した条件は、ｐＨ５．０～６．３、ヒスチジンまたは酢酸ナトリウム緩衝液、５％～９％のスクロース、４％～１０％のトレハロース、及び抗体濃度≧１５０ｍｇ／ｍＬであった。
これらの初期の高濃度の製剤開発試験によって与えられた情報は、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体分子を、糖の存在下で酢酸ナトリウムまたはＬ－ヒスチジン緩衝液を使用して、５．０～６．４のｐＨ範囲内で製剤化することで望ましい長期安定性が実現されることを示唆している。
実施例４：成人の健康な志願者に皮下投与された抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の安全性、忍容性、及びバイオアベイラビリティを評価するための第Ｉ相試験
４週間ごとに静脈内注入として投与した、実施例１及び２に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は、健康な志願者において、また、無痛性全身性肥満細胞症（ＩＳＭ）、慢性蕁麻疹、重度のアレルギー性結膜炎（ＡＣ）、及び好酸球性胃腸炎（ＥＧ）及び／または好酸球性十二指腸炎（ＥｏＤ）（以前は好酸球性胃腸炎（ＥＧＥ）と呼ばれていたもの）を有する被験者において、以前に試験されている。ＩＳＭ、蕁麻疹、重度ＡＣ、及びＥＧ／ＥｏＤの被験者に、３ｍｇ／ｋｇの複数回投与が行われている。これらの試験では、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８の薬力学（ＰＤ）活性と疾患症状の改善が長期間にわたって観察され、抗体の薬物動態（ＰＫ）パラメータは、４週間ごとの投与に適した長い半減期を示した。
現在までに、健康な志願者５１人（抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体で３６人、プラセボで１５人）、ＩＳＭの被験者２５人、蕁麻疹（自然発生及び誘発性を含む）の被験者４７人、重度ＡＣの被験者３０人、ＥＧ／ＥｏＤの被験者６５人、マスト細胞胃炎／腸炎の８人の被験者が臨床試験に登録されている。一般に、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体は十分に忍容されている。観察された最も一般的な、治療下で発生した有害事象（ＴＥＡＥ）は、軽度から中等度の輸注反応（ＩＲＲ）であり、抗体のＡＤＣＣ活性に関連すると考えられる最初の注入に主に伴うものである。
前の実施例に記載されているように、抗体の皮下（ＳＣ）製剤も開発されている。理論に拘束されることを望むものではないが、皮下投与した場合の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の全身吸収速度が遅いこと、及び同等の血清濃度－時間曲線（ＡＵＣ）下面積を示す用量と比較して最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）が低くなる可能性が高いことから、抗体が静脈内投与される場合と比較して、投与関連反応の速度及び重症度の低下が認められる場合があると考えられる。本実施例に記載の試験は、健康な志願者における実施例１及び２に記載の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の皮下投与の安全性、忍容性、及び生物学的利用能を試験するために設計されたものである。
用量選択
ＳＣ投与の推奨用量は次のとおりである。
－ ０．３ｍｇ／ｋｇ（コホート１）、
－ １ｍｇ／ｋｇ（コホート２）、
－ ３ｍｇ／ｋｇ（コホート３）、
－ ５ｍｇ／ｋｇ （コホート４）、及び
－ ３００ｍｇ（コホート８）：体重に関係なく、すべての被験者に、１つの注射部位に合計２ｍＬ（３００ｍｇの抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体またはプラセボ）の試験薬を投与する。
これらの用量は、さまざまな臨床研究において、ＩＶ経路によって安全に投与される用量レベルと同等またはそれ以下の曝露をもたらすと推定されている。
バイオアベイラビリティを決定するための比較試験としての抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体ＩＶの以前の投与経験に基づいて、ＩＶ投与用に提案された抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の用量は次のとおりである。
－ 試験薬を用いて調製したＩＶバッグから１００ｍＬで１ｍｇ／ｋｇを注入（コホート５）、
－ 試験薬を用いて調製したＩＶバッグから１００ｍＬで３ｍｇ／ｋｇを注入（コホート６）、及び
－ 試験薬を用いて調製したＩＶバッグから１００ｍＬで３ｍｇ／ｋｇを注入（コホート７）。
試験計画
約５８人の健康な成人ボランティアを、ＩＶ投与を行う各６人の被験者からなる３つのコホートと、ＳＣ投与を行う各８人の被験者からなる５つのコホート（二重盲検でランダム化して割り当てられた、コホート当たり６人の活性薬剤被験者と２人のプラセボ被験者）を含む８つのコホートに登録する。
コホート１、２、３、４、及び８は、単回用量の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体ＳＣ（それぞれ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、及び３００ｍｇ）、またはプラセボを投与する。コホート５、６、及び７の被験者は、単回用量の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体ＩＶ（それぞれ１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び３ｍｇ／ｋｇ）を投与する。被験者の数は、モノクローナル抗体のＳＣ投与とＩＶ投与を比較するＰＫ研究において一般的なものである。
これは、二重盲検（ＳＣコホートの場合）、第１相の安全性、忍容性、及びＰＫの試験である。約５８人の健康な志願者を、米国内の１～２か所の臨床研究施設で登録する。上述のように、４０人の被験者に抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体ＳＣまたはプラセボを投与し、１８人の被験者に抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体ＩＶを投与する。これは単回用量試験である。
１日目に、適格な被験者に抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体（ＩＶまたはＳＣ）またはプラセボ（ＳＣコホート）の単回用量を投与し、注入または注射の終了後、診療所に拘束して１２０時間の監視及び観察を行った。入院期間中の異なる時点（投与前、１、３、６、８、１２、２４、４８、７２、９６、及び１２０時間）で抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体濃度及び分類（絶対好酸球数を含む）をともなう全血算（ＣＢＣ）の分析用にすべての患者から血液試料を採取した。被験者は、６日目に１２０時間後の血液試料の採取後、診療所から退院させる。その後、被験者に８、１５、２２、３５、５６、及び８５日目に診療所に来診させ、ＰＤ及びＰＫ分析用の血液試料を採取する。
試験目的及びエンドポイント
主要試験目的は、健康な志願者に単回用量として投与した場合の抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体ＳＣ製剤の安全性、忍容性、及び薬物動態を評価することである。
二次試験目的は、（１）好酸球の絶対末梢血球数のベースラインからの変化によって測定される抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体のＳＣ製剤の薬力学を評価すること、及び（２）ＡＵＣを分析することによる、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体ＩＶに対する抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体のＳＣ製剤のバイオアベイラビリティを決定することである。
主要エンドポイントは、皮下投与された抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の安全性と忍容性、及び皮下投与された抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体のバイオアベイラビリティを含む薬物動態である。
二次エンドポイントは、好酸球の絶対末梢血球数のベースラインからの変化によって測定される抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体のＳＣの薬力学を評価すること、及び血清ＡＵＣ下面積を分析することによる、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体ＩＶに対する抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体のＳＣ製剤のバイオアベイラビリティを決定することである。
被験者の選択基準
選択基準：被験者は以下の基準を満たす場合、研究に適格である：
－ －インフォームドコンセントフォームに署名した時点で１８歳以上、６５歳以下の男性または女性、
－ －病歴、バイタルサイン、身体検査、検査室評価、ＥＣＧ、及び一般的な観察によって文書化されるように、治験責任医師によって健康と判断された場合。
試験製品、用量、及び投与
抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体ＩＶの単回用量は、末梢ＩＶ注入として投与する（４時間かけて投与）。皮下投与（抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体またはプラセボ）は、２７ゲージの針を使用して大腿部の前部に投与される１回または２回のＳＣ注射で構成される。ＳＣ注射部位ごとに投与される最大量は２ｍＬである。
安全性、ＰＫ、及びＰＤ評価
安全性及び忍容性を、治験薬のＩＶまたはＳＣ投与に起因する投与関連反応（ＡＲＲ）を含む有害事象を監視及び評価することによって、試験全体を通じて評価する。すべてのＴＥＡＥを、治験薬投与の開始から治験終了（ＥＯＳ）まで収集する。重症度は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ バージョン５．０（または最新バージョン）を使用して評価する。すべての有害事象に重症度を割り当て、それらが臨床的に重要であり、試験薬に関連しているかどうかを判定するために評価する。
ＰＤ評価を行うには、末梢血中の好酸球数を試験計画に記載されるように収集する。
ＰＫ評価を行うには、薬物動態学的血液試料を、投与前及び試験計画に記載された異なる時点で得る。
結果
健康なボランティアにおけるこの第１相試験の結果は、上記のように皮下投与した場合、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の６３％のバイオアベイラビリティを示した。図９に示されるように、抗Ｓｉｇｌｅｃ－８抗体の皮下投与は長期の末梢血好酸球の抑制をもたらした。例えば、３．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、及び３００ｍｇの投与レベルでの皮下投与は、１．０ｍｇ／ｋｇ及び３．０ｍｇ／ｋｇで投与された静脈内注入と同じ血中好酸球の枯渇をもたらし、１．０ｋｇの皮下投与でも、８５日目を除くすべての時点で同じであった。
さらに、抗体治療は忍容性が高く、注射部位反応または注射反応がなく、治療下で発生した有害事象、重篤な有害事象がなく、上記に述べたような皮下投与が月１回の投与に適当であることを示している。
配列
すべてのポリペプチド配列は、特に断らない限り、Ｎ末端からＣ末端の方向に表される。
すべての核酸配列は、特に断らない限り、５’から３’の方向に表される。

Claims (36)

  1. 液体製剤であって、（ａ）ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合するモノクローナル抗体であって、前記抗体が約７０ｍｇ／ｍＬ～約２１０ｍｇ／ｍＬの濃度である前記モノクローナル抗体と、（ｂ）約１０ｍＭ～約２５ｍＭの濃度のヒスチジンまたは酢酸ナトリウムを含み、
    前記液体製剤のｐＨが５．０～６．３であり、
    前記抗体が、（１）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域と、（１）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、前記液体製剤。
  2. 前記抗体が、約１３５ｍｇ／ｍｌ～約１６５ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１に記載の製剤。
  3. 前記抗体が、約１５０ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１または２に記載の製剤。
  4. Ｌ－ヒスチジンまたはＬ－ヒスチジン塩酸塩を約１５ｍＭの濃度で含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の製剤。
  5. 前記液体製剤の前記ｐＨが６．０である、請求項４に記載の製剤。
  6. 酢酸ナトリウムを約１５ｍＭの濃度で含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の製剤。
  7. 前記液体製剤の前記ｐＨが約５．２～約５．８である、請求項６に記載の製剤。
  8. 前記液体製剤の前記ｐＨが５．５である、請求項７に記載の製剤。
  9. スクロースを約５％～約９％の濃度でさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の製剤。
  10. スクロースを約５％～約７．５％の濃度で含む、請求項９に記載の製剤。
  11. スクロースを約５％の濃度で含む、請求項１０に記載の製剤。
  12. トレハロースを約４％～約１０％の濃度でさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の製剤。
  13. トレハロースを約５％～約７．５％の濃度で含む、請求項１２に記載の製剤。
  14. トレハロースを６．６％の濃度で含む、請求項１３に記載の製剤。
  15. 前記トレハロースがトレハロース二水和物である、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の製剤。
  16. ポリソルベート８０を約０．０２２５％～約０．０２７５％（ｗ／ｖ）の濃度でさらに含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の製剤。
  17. 前記ポリソルベート８０が、約０．０２５％（ｗ／ｖ）の濃度である、請求項１６に記載の製剤。
  18. （ａ）１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する前記抗体と、
    （ｂ）１５ｍＭのＬ－ヒスチジンまたはＬ－ヒスチジン塩酸塩と、
    （ｃ）１７５ｍＭのトレハロース二水和物と、
    （ｄ）０．０２５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０と、を含み、
    前記液体製剤の前記ｐＨが６．０である、請求項１に記載の製剤。
  19. （ａ）１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する前記抗体と、
    （ｂ）１５ｍＭの酢酸ナトリウムと、
    （ｃ）１７５ｍＭのトレハロース二水和物と、
    （ｄ）０．０２５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０と、を含み、
    前記液体製剤の前記ｐＨが５．５である、請求項１に記載の製剤。
  20. （ａ）１５０ｍｇ／ｍＬの濃度の、ヒトＳｉｇｌｅｃ－８に結合する前記抗体と、
    （ｂ）１５ｍＭのＬ－ヒスチジンまたはＬ－ヒスチジン塩酸塩と、
    （ｃ）５％のスクロースと、
    （ｄ）０．０２５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０と、を含み、
    前記液体製剤の前記ｐＨが６．０である、請求項１に記載の製剤。
  21. 前記抗体が、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６または２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の製剤。
  22. 前記抗体が、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の製剤。
  23. 前記抗体が、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の製剤。
  24. 前記抗体が、ヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む重鎖Ｆｃ領域を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の製剤。
  25. 前記ヒトＩｇＧのＦｃ領域が、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含む、請求項２４に記載の製剤。
  26. 前記ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域が、非フコシル化されている、請求項２５に記載の製剤。
  27. 前記ヒトＩｇＧのＦｃ領域が、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域を含む、請求項２４に記載の製剤。
  28. 前記ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域がアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含み、アミノ酸残基はＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスに従って番号付けされる、請求項２７に記載の製剤。
  29. 前記抗体が、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７６または７７のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の製剤。
  30. 前記抗体が、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の製剤。
  31. 前記抗体が、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号７７のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の製剤。
  32. 前記抗体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を改善するように操作されている、請求項１～３１のいずれか１項に記載の製剤。
  33. 前記抗体の前記重鎖の少なくとも１つまたは２つが非フコシル化されている、請求項１～３２のいずれか１項に記載の製剤。
  34. 請求項１～３３のいずれか１項に記載の製剤を封入した容器を含む製品。
  35. 前記容器が、ガラスバイアルである、請求項３４に記載の製品。
  36. 前記製剤を皮下投与するための説明書をさらに含む、請求項３４または請求項３５に記載の製品。
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