CN116903633A - 基于手性有机酸分离的高纯钩吻素子及其药学可接受盐的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于手性有机酸分离的高纯钩吻素子及其药学可接受盐的制备方法，包括如下步骤：钩吻药材粉经提取得钩吻生物总碱，经快速柱层析得到钩吻素子粗品，粗品与手性有机酸反应获得钩吻素子手性有机酸盐；加碱解离获得高纯钩吻素子；与酸成盐得到高纯钩吻素子药学可接受的盐。本发明方法制备量大，产量可达百克级甚至千克级；制备操作简洁高效，工艺稳定环保，反应条件温和，生产成本低；产品得率高，质量高(纯度达99.0％以上，总杂质不高于1.0％，最大单一杂质不高于0.1％)，适用于工业化大规模生产，可用于钩吻素子及其药学可接受盐的原料药制备。

Description

基于手性有机酸分离的高纯钩吻素子及其药学可接受盐的制 备方法

技术领域

本发明涉及基于手性有机酸分离的高纯钩吻素子及其药学可接受盐的制备方法，属于制药技术领域。

背景技术

钩吻(Gelsemium elegans Benth.)为马钱科钩吻属多年生常绿缠绕藤本植物，剧毒，是历史悠久的药用植物，也是促进猪、羊等家畜生长的中药材。1887年Gerrad等将其制成格林制剂，为一些国家副药典所收载；美国药物索引及日本《世界的民间药》中均有钩吻的记载。钩吻主要有效成分为吲哚类生物碱，钩吻素子为其生物总碱中含量最高且毒性较小的一种有效成分，分子式为C₂₀H₂₂N₂O，分子量为306.4。文献报道，钩吻素子具有显著的治疗类风湿关节炎、抗神经病理性疼痛、抗焦虑等药理作用；治疗剂量未见明显毒性，安全性强；作用机制新颖，具有良好的药用前景。

近一半活性药物分子是以盐的形式存在和给药，用与药物带相反电荷的分子或者离子与药物结合成盐，可改变药物某些物理化学或生物药学性质。因此，制备钩吻素子及其药学可接受的盐，可满足不同给药途径的需求；具有工业化大规模生产潜力，钩吻素子及其药学可接受盐的制备方法对其进一步临床研究及质量控制具有重要意义。

经文献检索，钩吻素子的制备方法可从钩吻植物中提取[张兰兰，王志睿，黄昌全，张忠义，林敬明。钩吻总生物碱中钩吻素子的提取与分离，第一军医大学学报，2004，24(9):1006-1008]，也有人工合成的文献报道[Yang Z,Tan Q,Jiang Y,Yang J,Su X,Qiao Z,Zhou W,He L,Qiu H,Zhang M.Asymmetric Total Synthesis of Sarpagine and KoumineAlkaloids.Angew Chem Int Ed.2021,60(23):13105-13111]。同时多个专利也公开了涉及钩吻总生物碱提取和钩吻素子制备的方法，专利CN201711041508.6公开了离子交换法从钩吻中分离制备钩吻生物碱的方法，可用于本申请专利制备方法钩吻素子粗品的制备。专利CN201710444073.3公开了先制备钩吻酸水提取物，然后经多次硅胶柱色谱纯化制备钩吻素子的方法，该方法耗时长，操作繁琐，且因固定相吸附导致得率低。专利CN201110081565.3公开了一种以乙酸乙酯萃取和硅胶柱色谱纯化从钩吻提取物中制备钩吻碱子(即钩吻素子)的方法，但获得钩吻素子仅为2.8克，其纯度仅在96％以上。专利CN201410580093.X公开了利用CO₂超临界萃取技术从钩吻药材中制备钩吻碱子的方法，操作步骤繁琐，有相关仪器设备要求并引入添加剂，后续还需采用反相硅胶柱色谱进行分离纯化，所得钩吻碱子仅为6.2克。专利CN200810071469.9和CN202010399671.5公开了使用高速逆流色谱或高速逆流色谱结合制备液相色谱从钩吻生物碱中分离得到钩吻素子的方法，有仪器设备的高要求，不适用于工业化生产。除此之外，发明人所在课题组前期还开发了多种钩吻素子的制备方法，如pH区带精制逆流色谱法和柱色谱结合动态轴向压缩色谱法等，也都有相关仪器设备要求。

现有文献或专利中，未见手性有机酸分离方法用于钩吻素子及其药学可接受盐产业化制备方面的报道，因此，本发明公开了基于手性有机酸分离的钩吻素子及其药学可接受盐的制备方法。

发明内容

为了克服现有钩吻素子及其药学可接受盐的产业化制备技术的不足，本发明目的在于提供一种不过度依赖仪器设备、简单、可控、环保、成本低、可适用于原料药生产的制备方法，即基于手性有机酸分离的钩吻素子及其药学可接受盐的制备方法。

本发明所述基于手性有机酸分离的高纯钩吻素子的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用钩吻素子粗品与手性有机酸反应，得到钩吻素子-手性有机酸非对映异构体盐，加碱游离后得到高纯钩吻素子。

进一步地，在上述技术方案中，所述产品的纯度达99.0％以上，总杂质不高于1.0％，最大单一杂质不高于0.1％。

进一步地，在上述技术方案中，钩吻素子粗品中钩吻素子纯度≥40％。

进一步地，在上述技术方案中，钩吻素子粗品来源可为钩吻药材提取物也可为人工合成产品。

进一步地，在上述技术方案中，采用钩吻生物总碱，以乙酸乙酯/甲醇、二氯甲烷/甲醇或二氯甲烷/丙酮体系为洗脱剂，经过快速硅胶柱层析，收集得到钩吻素子粗品。快速柱层析采用样品与硅胶重量比为1:1-10，两者优选比为1:8；洗脱剂中，二氯甲烷/甲醇比例为30-100:1(W/W)，两者优选比为50-80:1(W/W)。

进一步地，在上述技术方案中，所述钩吻生物总碱中，钩吻素子纯度不低于10％；以钩吻药材粉为原料，采用不限于乙醇溶剂提取得到。

进一步地，在上述技术方案中，所述手性有机酸为D-DTTA(D-二对甲基苯甲酰酒石酸)或D-DBTA(D-二苯甲酰酒石酸)。

进一步地，在上述技术方案中，所述钩吻素子粗品与手性有机酸反应的投料当量比为1:0.3-1.0，优选1:0.6；成盐产物中钩吻素子与D-DTTA以2:1形式成盐。

进一步地，在上述技术方案中，所述钩吻素子手性有机酸盐解离所用碱为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液；碱洗次数1-3次，优选3次。

进一步地，在上述技术方案中，所述钩吻素子与酸成盐，酸可为无机酸或有机酸。无机酸包括但不限于盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸、氯化氢/甲醇溶液、溴化氢/甲醇溶液，有机酸包括但不限于甲磺酸和乙酸。

进一步地，在上述技术方案中，所述钩吻素子药学可接受的盐选自盐酸盐、硫酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐中的一种，优选盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐和氢溴酸盐中的一种，更优选盐酸盐。

进一步地，在上述技术方案中，所述与钩吻素子成盐的酸为氯化氢/乙醇溶液，其中氯化氢与钩吻素子当量比为0.5-2.0:1，优选两者比例为1.0-1.1:1。

进一步地，在上述技术方案中，所述钩吻素子盐酸盐典型制备方法为：以钩吻药材粉为原料，乙醇热提取，浓缩乙醇得到钩吻浸膏；加稀盐酸调pH值＝2-3，过滤，加氢氧化钠水溶液调pH＝9-10，乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩，真空干燥得钩吻生物总碱；经快速柱层析，得到钩吻素子粗品；加D-DTTA反应得到钩吻素子D-DTTA盐；加氢氧化钠水溶液解离，二氯甲烷萃取获得高纯钩吻素子；加氯化氢/乙醇溶液成盐，得到高纯钩吻素子盐酸盐。

进一步地，在上述技术方案中，所述方法制备量大，产量可达百克级甚至千克级；制备操作简洁高效，工艺稳定环保，反应条件温和，生产成本低；产品得率高，质量高，可用于钩吻素子及其药学可接受盐的原料药制备。

进一步地，在上述技术方案中，钩吻素子盐酸盐制备工艺流程为图1。

发明有益效果

1、本发明采用手性有机酸分离方法大大提高了钩吻素子分离效率。手性有机酸D-DTTA可与钩吻素子粗品中的钩吻素子高选择性成盐析出，将钩吻素子从混合物中“挑选”出来。分离后钩吻素子纯度可由粗品40％左右一次性地提高到99.0％以上，从而实现了钩吻素子和其他杂质的高效分离。

2、本发明适用于钩吻素子及其药学可接受盐的原料药制备。该方法制备量大，钩吻药材粉投料量可达百公斤级到吨级，产量可达百克级甚至千克级，与其他公开的色谱分离方法的克级、毫克级制备相比具有极其显著的优点；制备操作简洁高效，工艺稳定环保，反应条件温和，生产成本低；产品得率高，质量高(纯度达99.0％以上，总杂质不高于1.0％，最大单一杂质不高于0.1％)，适用于工业化大规模生产，可符合原料药的生产制备要求。

3、本发明方法也为钩吻素子及其可接受的盐在制备保健品和饲料等方面应用时的产业化制备奠定生产原料来源基础。

附图说明

图1为钩吻素子盐酸盐制备工艺流程图；

图2为实施例2中钩吻生物总碱的高效液相色谱图；

图3为实施例2中钩吻素子粗品的高效液相色谱图；

图4为实施例2中钩吻素子手性有机酸盐的高效液相色谱图；

图5为实施例2中钩吻素子的高效液相色谱图；

图6为实施例2中钩吻素子盐酸盐的高效液相色谱图。

具体实施例

实施例1

1)钩吻素子粗品制备工艺参数的优选

将钩吻生物总碱经快速柱层析，收集钩吻生物碱粗品。采用一定量硅胶作为固定相，考察不同洗脱体系(乙酸乙酯/甲醇体系、二氯甲烷/甲醇体系和二氯甲烷/丙酮体系)所得粗品中钩吻素子纯度和纯化用时。结果显示，以二氯甲烷/甲醇体系(80:1，W/W)为洗脱剂时，钩吻素子纯度较高且用时较短。

以二氯甲烷/甲醇体系(80:1，W/W)为洗脱剂时，考察不同硅胶用量对所得粗品中钩吻素子纯度和纯化用时的影响。结果显示，钩吻生物总碱与硅胶重量比为1:8时，钩吻素子富集效果较明显，色素去除效果较理想，纯化用时适中。

2)手性有机酸的优选

取平行反应器，分别加入钩吻素子适量，以丙酮为溶剂，加热使之全溶。然后向溶液中加入各种手性有机酸(L-樟脑磺酸、D-樟脑磺酸、L-扁桃酸、L-苹果酸、D-苹果酸、D-DTTA和L-DTTA)，全部溶解后冷却，观察到加入D-DTTA的溶液很快成盐析出，3h后L-DTTA也有少量固体析出，其余都没有固体析出，因此优选D-DTTA作为手性有机酸分离钩吻素子(D-DBTA与D-DTTA结果类似)。

3)钩吻素子粗品纯度的优选

将含有不同纯度钩吻素子粗品(20.86％、41.00％、57.52％和86.36％)与D-DTTA反应，考察其成盐效果和成盐后母液中钩吻素子残留情况。结果显示，粗品中钩吻素子纯度约为20％时，因为杂质含量过多，其与D-DTTA成盐效果差，钩吻素子大部分在母液中；粗品中钩吻素子纯度≥40％时，均可达到与D-DTTA选择性成盐的目标，母液中几乎没有钩吻素子。因此优选与D-DTTA成盐的粗品中钩吻素子纯度≥40％。

4)手性有机酸用量的优选

将不同用量D-DTTA(0.3、0.6和1.0当量)与钩吻素子粗品反应，考察它们成盐后产物收率和D-DTTA残留情况。结果显示，D-DTTA投料量为粗品中钩吻素子重量的0.3当量时，手性有机酸盐收率偏低，同时母液中有部分钩吻素子没有完全成盐；D-DTTA为1.0当量时，产物收率高，但有过量D-DTTA残留，给后续处理带来困难；D-DTTA为0.6当量时，不仅可以与钩吻素子完全成盐，而且收率也与理论值相符。因此优选0.6当量D-DTTA参与反应。

5)碱洗次数的优选

以2％氢氧化钠水溶液解离钩吻素子手性有机酸盐。结果显示，用2％氢氧化钠对手性有机酸盐进行1-3次洗涤后，有机相均检测不出D-DTTA，钩吻素子纯度为99.92％。优选洗涤次数为3次，以确保彻底除去D-DTTA。

6)钩吻素子盐型的优选

称取适量钩吻素子，以成盐收率为指标，考察钩吻素子与常用无机酸(盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸、氯化氢/甲醇溶液、溴化氢/甲醇溶液)和有机酸(甲磺酸和乙酸)在不同溶剂(丙酮、甲醇和二氯甲烷)中成盐情况。结果显示，以丙酮为溶剂时，钩吻素子盐酸盐、硫酸盐、氢溴酸盐和磷酸盐成盐后析晶较好。理化性质和稳定性结果表明，钩吻素子盐酸盐成盐收率较高、无或几乎无引湿性、在不同pH水溶液中溶解性好、固体稳定，因此优选制备钩吻素子盐酸盐。

7)钩吻素子成盐时氯化氢当量的优选

以不同用量氯化氢乙醇溶液(1.0、1.1、1.2和1.5当量)与钩吻素子反应，考察钩吻素子盐酸盐收率、纯度和氯离子含量。结果显示，钩吻素子和上述用量氯化氢成盐后，产品收率均≥95％，纯度均≥99.0％；当氯化氢用量为1.0-1.1当量时，产品中氯离子含量接近理论值，随着氯化氢用量增加到1.5当量，产品中氯离子含量随之提高。因而优选氯化氢用量为1.0-1.1当量。

实施例2

1)从钩吻药材粉中提取得钩吻生物总碱

将500kg钩吻药材粉加入95％乙醇，搪瓷反应釜中加热搅拌提取，冷却过滤，滤渣再同法提取2次，合并3次提取液，浓缩得钩吻浸膏。钩吻浸膏中加入95％乙醇和纯化水，冷却降温，析出大量固体，过滤得滤液并浓缩至干。以稀盐酸调节体系pH＝2-3，加入乙酸乙酯除去有机相杂质，酸水相中加入稀NaOH水溶液调节体系pH＝9-10，以乙酸乙酯萃取钩吻生物碱，萃取液浓缩至干，真空干燥至恒重得钩吻生物总碱，其为褐色膏状固体，重量为2.899kg，钩吻素子纯度为26.5％，HPLC谱图见图2。

2)钩吻生物总碱经快速柱层析得钩吻素子粗品

将2.834kg钩吻生物总碱投入玻璃旋蒸瓶中，用二氯甲烷和甲醇溶解后加入200-300目硅胶拌样。将16.0kg200-300目硅胶加入到不锈钢低压制备柱中装柱，加入钩吻生物总碱拌样品，二氯甲烷/甲醇＝80/1(W/W)混合溶剂洗脱，并用TLC监控，收集含有钩吻素子的流份，减压浓缩，油泵干燥至恒重，得到钩吻素子粗品1.276kg，钩吻素子纯度为52.14％，HPLC谱图见图3。

3)D-DTTA高选择性地和钩吻素子成盐得手性有机酸盐

将1.007kg钩吻素子粗品投入玻璃反应釜中，加入丙酮，氮气保护，开启搅拌，使固体完全溶解。滴加含有0.6当量D-DTTA溶液，20～30℃保温搅拌0.5-1h，抽滤。滤饼加入丙酮打浆，去除杂质，得钩吻素子手性有机酸盐粗品。粗品投入玻璃反应釜，重结晶，真空干燥至恒重，得到钩吻素子手性有机酸盐精品630.1g，HPLC谱图见图4。

4)钩吻素子手性有机酸盐经碱洗解离后重结晶得钩吻素子

将600.2g钩吻素子手性有机酸盐投入玻璃反应釜中，加入二氯甲烷和纯化水搅拌均匀，滴加2％氢氧化钠水溶液洗涤，滴加完毕保温搅拌，静置分层，水相再用二氯甲烷萃取，合并有机相；重复2次，合并3次洗涤有机相。有机相采用5％氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，二氯甲烷洗涤滤饼。滤液减压浓缩至干，真空油泵干燥得钩吻素子粗品。钩吻素子粗品以丙酮重结晶，油泵干燥至恒重得白色固体，即钩吻素子产品，重量为346.7g，纯度为99.98％，总杂质≤1.0％，最大单一杂质≤0.1％，HPLC谱图见图5。

5)钩吻素子与酸成盐后重结晶得其药学可接受的盐

将320.0g钩吻素子投入玻璃反应釜中，加入丙酮溶解，氮气保护下滴加1.03当量的氯化氢乙醇溶液，析出固体，保温搅拌后缓慢降温，抽滤，滤饼用冰丙酮洗涤后，真空干燥至恒重，得到钩吻素子盐酸盐粗品。粗品以无水乙醇和纯化水溶解，过滤除杂后，滤液减压浓缩，以乙酸乙酯重结晶，得白色固体，为产品钩吻素子盐酸盐，重量为332.8g，纯度为99.98％，总杂质≤1.0％，最大单一杂质≤0.1％，HPLC谱图见图6。

实施例3

本实施例采用方法与实施例2相同，将钩吻药材粉投料量提高到1.5倍，制备钩吻素子盐酸盐。从750kg钩吻药材粉中提取得钩吻生物总碱；钩吻生物总碱经快速柱层析得钩吻素子粗品；D-DTTA高选择性地和钩吻素子反应得手性有机酸盐；手性有机酸盐经碱洗解离后重结晶得钩吻素子，纯度≥99.0％，总杂质≤1.0％，最大单一杂质≤0.1％；钩吻素子与盐酸成盐后重结晶得钩吻素子盐酸盐，其重量为511.4g，纯度为99.97％，总杂质≤1.0％，最大单一杂质≤0.1％。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (10)

1.基于手性有机酸分离高纯钩吻素子的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用钩吻素子粗品与手性有机酸反应，得到钩吻素子-手性有机酸非对映异构体盐，加碱游离后得到高纯钩吻素子。

2.根据权利要求1所述基于手性有机酸分离高纯钩吻素子的方法，其特征在于：所述钩吻素子粗品中钩吻素子纯度≥40％。

3.根据权利要求1所述基于手性有机酸分离高纯钩吻素子的方法，其特征在于：采用钩吻生物总碱，以乙酸乙酯/甲醇、二氯甲烷/甲醇或二氯甲烷/丙酮体系为洗脱剂，经过快速硅胶柱层析，收集得到钩吻素子粗品。

4.根据权利要求3所述基于手性有机酸分离高纯钩吻素子的方法，其特征在于：所述钩吻生物总碱中，钩吻素子纯度不低于10％；以钩吻药材粉为原料，采用但不限于乙醇溶剂提取得到。

5.根据权利要求1所述基于手性有机酸分离高纯钩吻素子的方法，其特征在于：所述手性有机酸选自D-二苯甲酰酒石酸或D-二对甲基苯甲酰酒石酸。

6.根据权利要求1所述基于手性有机酸分离高纯钩吻素子的方法，其特征在于：手性有机酸投料量与粗品中钩吻素子当量比0.3-1.0:1。

7.根据权利要求1所述基于手性有机酸分离高纯钩吻素子的方法，其特征在于：碱选自氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液。

8.一种钩吻素子药学可接受盐的制备方法，其特征在于：采用权利要求1-7中得到的高纯钩吻素子，然后高纯钩吻素子与无机酸或有机酸反应得到高纯钩吻素子药学可接受盐。

9.根据权利要求8所述钩吻素子药学可接受盐的制备方法，其特征在于：所述药学可接受盐选自盐酸盐、硫酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐或扑酸盐。

10.根据权利要求9所述钩吻素子药学可接受盐的制备方法，其特征在于：所述药学可接受盐为盐酸盐，采用高纯钩吻素子与氯化氢/乙醇溶液反应得到高纯钩吻素子盐酸盐。