CN116891856A - 赣彤1号CcMYB10_LIKE基因及其表达蛋白和应用 - Google Patents

赣彤1号CcMYB10_LIKE基因及其表达蛋白和应用 Download PDF

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CN116891856A CN202310874590.XA CN202310874590A CN116891856A CN 116891856 A CN116891856 A CN 116891856A CN 202310874590 A CN202310874590 A CN 202310874590A CN 116891856 A CN116891856 A CN 116891856A
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Abstract

本发明公开了‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因及其表达蛋白和应用，属于植物基因工程技术领域。本发明的‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。以‘赣彤1号’7个组织为材料，克隆得到‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因，在此基础上构建其植物表达载体35S::CcMYB10_LIKE，转入‘南林895杨’与拟南芥中，得到转基因植株。转基因杨树植株的新叶的叶柄与叶片交接处呈红色，除PAL外的结构基因均显著上调。转基因拟南芥叶片边缘呈现紫红色，其茎与子叶的连接处呈明显的紫色，所有结构基因均显著上调。

Description

赣彤1号CcMYB10_LIKE基因及其表达蛋白和应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因及其表达蛋白和应用。
背景技术
樟树(Cinnamomum camphora)为樟科樟属植物，四季常青、高大挺拔、树姿优美、叶色丰富，是深受人们喜爱的园林绿化和景观树种。红杆樟新品种‘赣彤1号’枝干春季、冬季和夏初均保持鲜红色，初生新叶为橙色，具有较高的观赏价值和园林绿化应用前景。
MYB转录因子广泛存在于植物中，是调控花青素生物合成和积累的关键因子，它们通过与花青素合成途径中结构基因启动子序列上的顺式作用元件相结合，进一步激活或抑制基因的表达，从而实现对花青素生物合成的调控。Zhong等利用代谢组和转录组数据分析了‘赣彤1号’树皮的成色机制，发现天竺葵素、矢车菊色素和芍药素是使‘赣彤1号’呈现红色的主要色素；另外鉴定出24个上调的差异基因参与了花青素生物合成，其中6个转录因子(3个MYBs和3个bHLHs)可能是‘赣彤1号’花青素合成途径的候选调节因子。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因；本发明所要解决的另一技术问题在于提供‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因的表达蛋白；本发明还要解决的技术问题在于提供‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因的应用，用于樟树种质改良。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因的表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
含有‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因的载体。
所述的载体是植物表达载体。
所述的植物表达载体是35S::CcMYB10_LIKE。
‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因在使转基因‘南林895杨’新叶的叶柄与叶片交界处颜色变红中的应用，包括以下步骤：
1)构建‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因的植物表达载体；
2)将构建的植物表达载体转化到‘南林895杨’叶片中；
3)培育筛选得到新叶的叶柄与叶片交界处颜色变红的‘南林895杨’植株。
‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因在使转基因拟南芥叶片边缘变紫红色以及茎与子叶的连接处变紫色中的应用。
‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因在提高转基因‘南林895杨’中花青素合成相关结构基因4CL、C4H、CHS、F3H、LDOX和DFR表达量或降低花青素合成相关结构基因PAL表达量中的应用。
‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因在提高转基因拟南芥中花青素合成相关结构基因4CL、C4H、CHS、F3H、LDOX和DFR、PAL表达量中的应用。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明以‘赣彤1号’7个组织为材料，通过克隆得到‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因，在此基础上构建其植物表达载体35S::CcMYB10_LIKE，转入‘南林895杨’叶片与拟南芥花序中，得到转基因植株。与CK相比，CcMYB10_LIKE转基因植株在30天左右整个叶柄呈现粉色，而叶片呈现黄色；40天左右叶柄呈粉色的范围逐渐减小，黄叶凋落，而后叶片不再呈现黄色。但在新叶的叶柄与叶片交接处仍呈红色。转CcMYB10_LIKE基因的拟南芥叶片边缘呈现紫红色，其茎与子叶的连接处呈明显的紫色。转CcMYB10_LIKE基因‘南林895杨’植株中，PAL的表达量显著下调，而其它结构基因均显著上调。转CcMYB10_LIKE基因拟南芥植株中，所有结构基因均显著上调。
附图说明
图1为‘赣彤1号’樟树不同组织总RNA琼脂糖凝胶电泳检测图；
图2为CcMYB10_LIKE在‘赣彤1号’樟树7个组织中的qRT-PCR结果图；
图3为‘赣彤1号’樟树叶肉原生质体细胞活力检测图；
图4为‘赣彤1号’樟树叶肉原生质体转化图；
图5为‘赣彤1号’樟树叶肉原生质体转化效率检测图；
图6为35S::CcMYB10_LIKE重组质粒T-DNA区图；
图7为转CcMYB10_LIKE基因杨树DNA水平检测图；
图8为CcMYB10_LIKE基因在转基因杨树中的表达水平图(CK为未转基因杨树，T为转基因杨树)；
图9为CcMYB10_LIKE转基因杨树表型图；
图10为转基因拟南芥植株的半定量检测图；
图11为CcMYB10_LIKE基因在转基因拟南芥中的表达水平图；
图12为转基因拟南芥双子叶时期表型观测图；
图13为CcMYB10_LIKE转基因拟南芥表型图；
图14为转基因杨树下游结构基因相对表达量图；
图15为转基因拟南芥下游结构基因相对表达量图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中如无特殊说明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本申请的实验材料‘赣彤1号’与来自于同一半同胞家系的对照植株，来源于江西省科学院生物资源研究所，经过嫩枝扦插用于本研究。
2020年4月收集‘赣彤1号’的根、花、韧皮部、叶、木质部和茎尖，2020年11月收集果实，共7个组织。
实施例1
1、总RNA的提取
采用RNAprepPure多糖多酚总RNA提取试剂盒(天根，中国)提取‘赣彤1号’7个组织(根、花、韧皮部、叶、木质部和茎尖、果实)的总RNA。具体方法如下：
在1.5mLRNase-Free离心管中加入475μL裂解液SL和25μLβ-巯基乙醇，制得预混液；取新鲜样品或保存于-80℃超低温冰箱的植物组织样品，迅速加入液氮并立刻研磨至样品呈粉末状，将研磨好的样品取100mg左右，迅速加入预混液中，立刻涡旋震荡30s，12,000rpm离心2min；将上清液转移至过滤柱中，再次以12,000rpm离心2min，随后将小心吸取上清液至新的1.5mLRNase-Free离心管中；加入0.4倍上述上清液体积的无水乙醇，混匀后转移至吸附柱中，12,000rpm离心30s，倒出收集管中的废液，并将吸附柱重新放置在收集管中；向吸附柱中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心30s，倒出废液；从-20℃冰箱取出配制好的10μLDNaseI，加入70μLRDD并轻柔混匀；将配制好的80μLDNaseI工作液悬空加入吸附柱的吸附膜中央(枪头要避免触碰到吸附膜)，室温静置15min；再次向吸附柱中加入350μL去蛋白液RW1，12,000rpm离心30s，倒出废液；向吸附柱中加入500μL的漂洗液RW(已加入乙醇)，12,000rpm离心30s，倒出废液，并将吸附柱重新置于收集管中，执行2次；)再次以12,000rpm离心2min，将吸附柱放入一个新的1.5mLRNase-Free离心管中；向吸附柱底部的吸附膜正中央垂直悬空滴加20μLRNase-FreeddH2O，室温静置2min，移入低温离心机，12,000rpm离心2min；将离心管底部的溶液重新吸出，垂直悬空滴加于吸附柱，室温静置2min，移入低温离心机，12,000rpm离心2min，将得到的RNA溶液立即进行反转录，剩余的RNA溶液保存至-80℃超低温冰箱中，备用。
利用NanoDrop2,000c紫外-可见分光光度计(ThermoFisher，USA)测定提取的总RNA的浓度和纯度(OD260/280＝1.8-2.1)，并利用1％琼脂糖凝胶电泳对提取的RNA进行分离，电泳后于紫外成像系统下进行观察，以确定其完整性及是否存在污染。
结果如图1所示，所有RNA样品条带清晰，说明樟树总RNA的完整性好，樟树总RNA的质量符合进一步实验的要求。
利用cDNA反转录Prime0ScriptTMRTMasterMix试剂盒(TaKaRa，日本)将植物总RNA反转录为cDNA，PCR反应体系为：5×PrimeScriptRTMasterMix4μL、TotalRNA(500ng/μL)2μL、RNaseFreeddH2O14μL、Totalvolume20μL。PCR扩增程序为：37℃，15min；85℃，5s。
2、分别从TAIR和JGI数据库查询并下载拟南芥和毛果杨的MYB蛋白序列，根据本课题组先前公布的樟树基因组数据库(T.F.Shen,H.R.Qi,X.Y.Luan,etal.Thechromosome-levelgenomesequenceofthecamphortreeprovidesinsightsintoLauraceaeevolutionandterpenebiosynthesis[J].PlantBiotechnol.J.,2022,20,2,244-246.)中提供的CcMYB10_LIKE序列，利用Oligo7设计CcMYB10_LIKE在CDS序列两侧的引物，引物序列如下所示：
CcMYB10_LIKE-F：5’-ATGGGTAGAAGTCCTTGTTGT-3’，
CcMYB10_LIKE-R：5’-TCATTCTCCCAGCCAATCGGC-3’。
3、使用MaxDNAPolymerase(TaKaRa，日本)对目的基因进行克隆基因，反应体系如下所示：
ForwardPrimer(10μM) 1μL
ReversePrimer(10μM)) 1μL
Template(cDNA) 2μL
PrimeSTARMaxPremix(2×) 25μL
ddH2O 21μL
TotalVolume 50μL
PCR扩增程序如下所示：
使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，回收单一且清晰的凝胶条带，用于回收纯化。
4、使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(Axygen，美国)对目的片段进行回收与纯化，实验步骤如下：
将含有目的DNA的凝胶切下，并称取其重量；加入相应体积的BufferDE-A(V)，混合后于75℃水浴锅中加热至凝胶完全熔化；加入0.5V体积的BufferDE-B，并混合均匀，制得混合液；将混合液转移至制备管中，11,000rpm离心1min，倒出废液并将制备管重新放回离心管中；在制备管中加入500μLBufferW1，以11,000rpm离心30s，倒出废液并将制备管重新放回离心管中；再在制备管中加入700μLBufferW2(已加入规定体积的乙醇)，以12,000rpm离心30s，倒出废液并将制备管重新放回离心管中；重复上一步；以12,000rpm转速将空的制备管离心30s；将制备管转移至试剂盒提供的1.5mL离心管中，在制备膜中央悬空滴加20μL加热好的去离子水，室温静置2min；11,000rpm离心1min以洗脱DNA；将离心管底部的溶液重新吸出，垂直悬空滴加于吸附柱的吸附膜正中央，室温静置2min，11,000rpm离心1min以提高回收率。
回收后的DNA经NanoDrop2000c测定浓度和质量后，重组连接到全式金公司提供的-BluntZeroCloningVector载体中，反应体系如下所示：
反应程序如下所示：
25℃ 15min
16℃ ∞
将连接产物转化到大肠杆菌感受态菌株Trans1-T1中以实现目的基因的扩增，具体方法如下：
取出保存于-80℃冰箱中的大肠杆菌感受态菌株Trans1-T1，立即置于冰盒之上，待其融化，将5μL连接产物直接加入感受态中，轻柔混匀后静置于冰上30min；将上述样品置于42℃水浴锅中，热激30s，并立刻插入冰盒中，冰浴2min；向样品中加入700μL的LB液体培养基，将其置于摇床上以37℃恒温200rpm培养1h；4,000rpm离心5min，在超净工作台内吸出约550μL的液体，用移液枪轻柔打散混匀剩余菌液，将剩余混匀的菌液转移到含氨苄青霉素(Amp，100mg/mL)抗性的LB固体培养基中，并用已消毒灭菌的涂布棒在LB培养基中均匀涂抹；涂板完成后，将平板倒扣在37℃恒温培养箱中，培养约12h。
以上述菌液为模板，使用南京诺唯赞生物公司的2×RapidTaqMasterMix进行PCR检测，反应体系如下所示：
2×RapidTaqMasterMix 10μL
ForwardPrimer(10μM) 1μL
ReversePrimer(10μM)) 1μL
菌液 1μL
ddH2O 7μL
TotalVolume 20μL
反应程序如下：
用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。挑取部分条带清晰且片段大小一致的样品，送至生工生物工程(上海)公司进行测序。根据测序结果，确定CcMYB10_LIKE位于11号染色体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因长度为1693bp；其CDS的序列如SEQ IDNO.2所示，长度为831bp。
实施例2
2020年4月收集‘赣彤1号’的根、花、韧皮部、叶、木质部和茎尖，2020年11月收集果实，共7个组织。提取‘赣彤1号’7个组织的RNA，并反转录成cDNA，具体方法如实施例1所示。采用qRT-PCR检测CcMYB10_LIKE基因在韧皮部(Phloem)、花(Flower)、叶(Leaf)、木质部(Xylem)、根(Root)、果实(Fruit)和茎尖(Stem tip)组织中的特异性表达情况。引物序列如下所示：
QCcMYB10_LIKE_F：5’-AGAGTCAAGTTCGGGTGGA-3’，
QCcMYB10_LIKE_R：5’-AGATAAGCACAGCCCTCCC-3’
qRT-PCR反应体系为：
PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix 5μL
Forward Primer(10μM) 0.5μL
Reverse Primer(10μM) 0.5μL
cDNA 2μL
ddH2O 2μL
Total volume 10μL
反应程序如下：
结果如图2所示，CcMYB10_LIKE在韧皮部表达量最高，在果实中表达量最低，同时在茎尖和根中也有较高的表达。
实施例3
1、利用无缝克隆方法将目的基因片段插入至pJIT166-GFP瞬时表达载体中，引物序列如下所示：
CcMYB10_LIKE-GFP-F：
5’-CACCATGGCGTGCAGGTCGACATGGGTAGAAGTCCTTGTTGT-3’，
CcMYB10_LIKE-GFP-R：
5’-GCCCTTGCTCACCATGGATCCTTCTCCCAGCCAATCGGCTTC-3’。
将纯化后的CcMYB10_LIKE-GFP载体质粒进行分析和测序，以确认融合载体构建成功。
2、将上述测序正确的重组质粒转化农杆菌EHA105，具体方法如下所示：
从上述测序正确的菌液中提取质粒；从-80℃超低温冰箱取出EHA105感受态，用指温将其部分融化后立即置入冰盒中；在超净工作台中，向溶液中加入200ng质粒，轻柔弹拨离心管底部以将二者混匀；混匀后立即于冰盒中静置25min，随即用液氮速冻5min，后将其放入37℃水浴锅中水浴5min，将水浴完成的菌液拿出迅速插入冰盒，冰浴5min；在超净工作台中，向离心管中加入700μL的LB液体培养基，并混匀。在温控摇床中，以28℃，200rpm，将其复苏2-3h；将复苏后的菌液取出，3,000rpm离心3min；在超净工作台内吸出约550μL的液体，并用移液枪轻柔打散混匀剩余菌液，将剩余混匀的菌液转移到含利福平(rif，20μg/mL)和硫酸卡那霉素(kana，50μg/mL)抗性的LB固体培养基中，并用已消毒灭菌的涂布棒在LB培养基中均匀涂抹；涂板完成后，将平板倒扣在28℃恒温培养箱中，培养48h；将菌液送公司进行检测，经检测正确的农杆菌放入-40℃超低温冰箱进行保存。
3、使用60d的樟树组培苗植株幼叶进行原生质体分离，要求叶片嫩绿且背面无白粉以减少次生代谢物的影响，具体过程如下：
分别向不同的10mL试管中加入3种不同浓度的甘露醇(DM)，20mM的MES，50mM的KCl，剩余用ddH2O补齐，混合后放入70℃水浴锅，水浴5min；分别向试管中加入3种不同浓度的纤维素酶和果胶酶，混匀后放入55℃水浴锅中，水浴10min；待其温度降至室温后，向其中加入0.1％的BSA，并缓慢混匀；加入10mM的CaCl2，混匀后将酶液用0.45nm的水系滤膜过滤到6孔板中；取生长状态良好且平展的樟树组培苗叶片，将其切成0.5mm左右的条状(须切断，若叶片过大可将条状切短)，立即将切好的叶片浸泡于制备好的酶液中；将6孔板放入带盖的纸盒中，28℃，暗培4h，每隔2h取出纸盒手动轻柔摇动1-2min；4h后取出6孔板，向酶液加入等体积的W5溶液以终止反应；将50mL圆底离心管提前置于冰盒中预冷5min，用200目细胞筛将所得溶液全部筛入50mL离心管中；将离心机预冷至4℃，900rpm，加速度和减速度设为4，离心7min；取出离心管并在冰盒中静置2min以彻底沉淀悬浮的原生质体，弃上清；向离心管中加入1-2mL的W5溶液，并在掌心轻柔旋转拨动试管底部，以重悬原生质体；混匀后，用剪枪头从离心管中央吸取8μL溶液于0.1mm血球计数板上，用0.02％FAD测定原生质体活力，并在荧光显微镜下(ZEISS，德国)观察其状态和数量。
原生质体产量(个/g)＝(原生质体浓度×原生质体悬浮液体积)/制备原生质体所用材料鲜重。
原生质体活力＝发荧光的原生质体数/观察到的原生质体总量×100％。
结果如表1所示，当DM浓度为0.56M，纤维素酶浓度为2.2％，果胶酶浓度为0.7％时，原生质体分离效率最高，且形态完整。当DM的浓度低于0.6M时，酶解出的原生质体的数量降低；当DM浓度高于0.6M时酶解的质量变差，大多数原生质体破碎或粘连。当酶浓度不合适时，同样会出现酶解效率降低或质量变差的现象。在5mL的体系中，从100mg叶组织中获得约1.2×106个原生质体。
结果如图3所示，经FDA染色鉴定，产生的原生质体存活率大于95％，黑暗培养72h后，经FDA染色鉴定，存活率为63.3％，该方法得到了高产量和高质量的樟树叶肉原生质体。
表1不同试验组合樟树原生质体提取效率
4、于10mL无菌离心管中加入0.2M的DM，0.1M的CaCl2，30％的PEG·4000，剩余用ddH2O补齐；吸取100μL的摇匀后的原生质体加入无菌2mL离心管中，再加入1μg的GFP融合表达载体质粒，用手轻拨试管混匀，再加入110μL的步骤2)所得溶液，并立即轻拨试管混匀，室温静置2-5min；加入500μL的W5溶液，轻拨混匀以终止反应；在4℃条件下，以1,000rpm离心5min，去除上清；加入100μL的WI(4mM的MES，pH＝5.7，0.6mM的DM，20mM的KCl)溶液，轻拨混匀，室温静置10min；室温环境下暗培16-20h；用0.1mm血球记数板统计樟树原生质体数；吸取8μL溶液，于荧光显微镜(ZEISS，德国)下观察。
结果如图4所示，在樟树叶肉原生质体的细胞质和细胞核中清楚地检测到GFP荧光，在构建的GFP融合载体35S::CcMYB10_LIKE-GFP中也有相同现象
结果如表2与图5所示，对不同浓度的PEG溶液和转化时间的转化效率进行测试，当使用15％PEG转化20min时转化效率较高，转化效率为40％。
表2不同因素对樟树叶肉原生质体转化效率的影响
因素 PEG浓度(％) 转化时间(min) 转化效率(％)
1 15 10 0
2 30 10 10
3 40 10 5
4 15 15 15
5 30 15 20
6 40 15 0
7 15 20 40
8 30 20 10
9 40 20 0
实施例4
1、质粒提取与过表达载体的构建
将含pH35GS载体的菌株在含有Spc抗性的LB固体培养基上进行活化，37℃培养12h；挑取单克隆菌落，在同样抗性的LB液体培养基中250rpm培养4-6h，并进行菌液检测；利用XhoI和KpnI-HF(NewEnglandBiolabs，USA)将过表达载体pH35GS线性化，反应体系如下所示：
XhoI 20μL
KpnI-HF 20μL
PurifiedpH35GSvector 1μg
CutSmart 5μL
ddH2O upto50μL
反应程序如下所示：
使用MaxDNAPolymerase(TaKaRa，日本)对目的基因进行扩增，引物序列如下所示：
35S::CcMYB10_LIKE-F：5’-GGGGACTCTAGAATAGGTACCATGGGTAGAAGTCCTTGTTGT-3’，
35S::CcMYB10_LIKE-R：5’-CCTCAGCTACTTAGGCTCGAGTCATTCTCCCAGCCAATCGGC-3’。
反应体系如下所示：
ForwardPrimer(10μM) 1μL
ReversePrimer(10μM)) 1μL
Template(DNA) 1μL/200ng
PrimeSTARMaxPremix(2×) 25μL
ddH2O 22μL
TotalVolume 50μL
扩增程序如下所示：
所得产物经1％的琼脂糖凝胶电泳验证后，对目的片段进行回收，使用诺唯赞公司生产的无缝克隆试剂盒IIOneStepCloningKit构建重组质粒，反应体系如下所示：
线性化载体 XμL(0.02×长度)
插入片段 YμL(0.04×长度)
5×CEIIBuffer 4μL
ExnaseII 2μL
ddH2O upto20μL
反应程序为：
将产物转化到Trans1-T1PhageResistantChemicallyCompetentCell感受态中，将部分阳性菌检菌液送至生工生物工程(上海)公司进行测序。经测序正确的菌液保存至-40℃超低温冰箱。
结果如图6所示，12个单克隆菌落均能够扩增出特异明显且位置正确的特异性条带，表明+过量表达目标MYB基因的过表达载体35S::CcMYB10_LIKE构建成功。
2、转化‘南林895杨’
取生长30d的‘南林895杨’的第4和第5位舒展的叶片。沿叶片边缘剪出伤口，并将叶片剪成边长约为1cm的正方形叶盘；将叶盘平铺于MS分化培养基，在暗培2d；剩余具体转化方法见本实验室前期发表的关于转化‘山新杨’的文章(陈彩慧.樟树精油生物合成相关基因的挖掘与功能研究[D].南京林业大学,2019.)。在进行筛选培养时培养基需添加Tim(200μg/mL)+kana(30μg/mL)；当叶片边缘长出不定芽时，将其转入含有Tim(200μg/mL)+kana(30μg/mL)的壮苗培养基上培养茎杆；当抗性芽长出约1cm时，将其剪下转入含Tim(300μg/mL)+kana(30μg/mL)的WPM培养基中进行生根培养；将一棵不定芽生根形成的植株编为一个株系。
经过进行三次转基因操作后，最终获得转CcMYB10_LIKE基因株系43个，负对照组最终无成活株系。随机选取15个株系转基因杨树和未转基因对照杨树，在DNA水平上使用上游引物p35sf(5’-AGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATC-3’)和下游引物35S::CcMYB10_LIKE-R(5’-CCTCAGCTACTTAGGCTCGAGTCATTCTCCCAGCCAATCGGC-3’)进行目的片段扩增。
结果如图7所示，利用琼脂糖凝胶电泳检测后，发现CK无扩增条带，在15个随机的株系中，过表达CcMYB10_LIKE基因的有9个株系有单一的且位置正确的条带。
通过qRT-PCR对3个转基因‘南林895杨’株系和未转基因植株中目的基因的表达量进行检测，所用引物为QCcMYB10_LIKE_F(5’-AGAGTCAAGTTCGGGTGGA-3’)和QCcMYB10_LIKE_R(5’-AGATAAGCACAGCCCTCCC-3’)，所用内参基因为EFlа，通过2-△△CT法统计目的基因基因在不同转基因株系中相对于内参基因的表达量。
结果如图8所示，CcMYB10_LIKE在未转基因杨树(CK)中表达量相对较低，不同杨树转基因株系与未转基因相比，CcMYB10_LIKE的表达量相对较高，是CK的几到十几倍，其中表达量最高的为T15株系，证明目的基因已成功整合到受体植物基因组中。
结果如图9所示，与CK相比，CcMYB10_LIKE转基因植株在30天左右整个叶柄呈现粉色，而叶片呈现黄色；40天左右叶柄呈粉色的范围逐渐减小，黄叶凋落，而后叶片不再呈现黄色。但在新叶的叶柄与叶片交接处仍呈红色。此外，二者生长速度较为一致。
3、转化拟南芥
将带有重组质粒的农杆菌(培养基中含50mg/Lkana和20mg/Lrif)于28℃，200rpm培养4-6h，至OD值为0.8-1.0；配制含有50mL5％(wt/vol)g蔗糖和40μL0.02％(vol/vol)的表面活性剂SilwetL-77的侵染液500mL；将步菌液4000rpm离心10min，倒掉上清；用侵染液轻柔地悬浮后用于拟南芥侵染；将未完全展开的花序浸入侵染液30-40s；于23-25℃暗培20h后，转入光照周期为16/8h(光/暗)的环境中培养；每10d左右侵染一次，直至花期结束。将收获的种子，播种于含有60μg/mLkana的1/2MS培养基中进行抗性筛选。
使用上游引物p35sf(5’-AGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATC-3’)和下游引物35S::CcMYB10_LIKE-R(5’-CCTCAGCTACTTAGGCTCGAGTCATTCTCCCAGCCAATCGGC-3’)随机对拟南芥的三个株系进行RNA水平检测。
结果如图10所示，利用琼脂糖凝胶电泳检测后，除WT(对照组)外，均显示了明亮、单一且位置大致正确的条带。
通过qRT-PCR对3个转基因拟南芥株系和未转基因植株中目的基因的表达量进行检测，所用引物为QCcMYB10_LIKE_F(5’-AGAGTCAAGTTCGGGTGGA-3’)和QCcMYB10_LIKE_R(5’-AGATAAGCACAGCCCTCCC-3’)，所用内参基因为Actin，通过2-△△CT法统计目的基因基因在不同转基因株系中相对于内参基因的表达量。
结果如图11所示，CcMYB10_LIKE在拟南芥不同转基因株系中相对于内参基因的表达量达到几万到几十万倍，其中相对表达量最高的为T1，证明目的基因已成功整合到受体植物基因组中。
结果如图12所示，当拟南芥出现双子叶时，WT的两片子叶均为绿色，而茎为淡绿色或白色；转CcMYB10_LIKE基因的拟南芥叶片边缘呈现紫红色，其茎与子叶的连接处呈明显的紫色。
结果如图13所示，CcMYB10_LIKE过表达转基因拟南芥幼苗转入营养土基质中约35天后，除了莲座和基部分枝呈现紫红色，其余部分均为绿色。
4、为了验证CcMYB10_LIKE与花青素调控是否存在联系，对转基因‘南林895杨’和CK、转基因拟南芥和WT中花青素生物合成通路上的结构基因(包括苯丙烷代谢通路中前三个阶段的PAL、C4H和4CL，两个EBGs：CHS和F3H以及两个LBGs：LDOX和DFR)的表达水平进行了验证。
结果如图14所示，转CcMYB10_LIKE基因‘南林895杨’植株中，PAL的表达量显著下调，而其它结构基因均显著上调。
结果如图15所示，转CcMYB10_LIKE基因拟南芥植株中，所有结构基因均显著上调。

Claims (10)

1.‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.含有权利要求1所述的‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因的载体。
4.根据权利要求3所述的‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因的载体，其特征在于，所述的载体是植物表达载体。
5.根据权利要求4所述的‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因的载体，其特征在于，所述的植物表达载体是35S::CcMYB10_LIKE。
6.‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因在使转基因‘南林895杨’新叶的叶柄与叶片交界处颜色变红中的应用。
7.根据权利要求6所述的‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因在使转基因‘南林895杨’新叶的叶柄与叶片交界处颜色变红中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因的植物表达载体；
2)将构建的植物表达载体转化到‘南林895杨’叶片中；
3)培育筛选得到新叶的叶柄与叶片交界处颜色变红的‘南林895杨’植株。
8.‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因在使转基因拟南芥叶片边缘变紫红色以及茎与子叶的连接处变紫色中的应用。
9.‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因在提高转基因‘南林895杨’中花青素合成相关结构基因4CL、C4H、CHS、F3H、LDOX和DFR表达量或降低花青素合成相关结构基因PAL表达量中的应用。
10.‘赣彤1号’CcMYB10_LIKE基因在提高转基因拟南芥中花青素合成相关结构基因4CL、C4H、CHS、F3H、LDOX和DFR、PAL表达量中的应用。
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