CN116889581A - 三七活性组合物、代餐粉及其在减肥降糖降脂中的应用 - Google Patents

三七活性组合物、代餐粉及其在减肥降糖降脂中的应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种三七活性组合物、代餐粉以及其应用。该三七活性组合物包括15种活性成分以及不低于1亿/g的菊糖芽孢乳杆菌活菌粉，对α‑葡萄糖苷酶抑制率不低于51.49％，OARC值不低于32.60μmolTE/mL。利用该三七活性组合物制作的代餐粉不仅对糖尿病模型鼠具有降糖降脂和减肥作用，对小鼠脏器损伤小，还对小鼠肠道菌群分析发现了本申请实施例提供的代餐粉具有提高小鼠肠道厚壁菌门丰度的作用，利于小鼠肠道微生态向益生方向转变。

Description

三七活性组合物、代餐粉及其在减肥降糖降脂中的应用
技术领域
本申请涉及三七技术领域，尤其涉及三七活性组合物、代餐粉及其在减肥降糖降脂中的应用。
背景技术
三七为寥科寥属植物中华抱茎寥(Polygouum amplexic-aide D.Donvar.siueu.se)的干燥根茎，是苗族和土家族的常用药材。中医理论认为其味涩、微苦，有活血舒筋、散癖止痛、抗菌消炎和止血生肌等功效，临床上用于跌打损伤、肠胃炎等疾病的治疗。现代药理学研究结果证明，三七具有抗真菌、抗氧化和辅助治疗动脉粥样硬化等作用。近年来文献报道，三七的活性成分在肿瘤防治方面也起到了重要的作用。但目前，针对三七生物活性成分及药理作用的研究仍较少，充分三七的活性成分，为进一步探究其更为广泛的应用价值具有十分现实重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于开发一种能够具有更为广阔应用前景的三七活性组合物以及其相关产品和应用。
第一方面，本申请实施例公开了一种三七活性组合物，包括白黎芦醇、根皮苷、槲皮素、6-甲氧基-7羟基香豆素、儿茶素、南烛木树脂酚、原儿茶酸甲酯、没食子酸甲酯、没食子酸正丁基酯、6-O-(E)-咖啡酰基葡萄糖苷、胡萝卜苷、苯甲酰基β-D-吡喃葡萄糖苷、2,8-三醇-1-O-β-D-吡喃葡糖苷、槲皮素-3-O-α-D-呋喃阿拉伯糖苷和阿魏酸以及不低于1亿/g的菊糖芽孢乳杆菌活菌粉。
在本申请实施例中，所述三七活性组合物，按重量千分比计包含14.20～16.24wt‰白黎芦醇、16.48～18.16wt‰根皮苷、12.50～13.12wt‰槲皮素、4.69～4.95wt‰6-甲氧基-7羟基香豆素、6.498～6.622wt‰儿茶素、2.088～2.172wt‰南烛木树脂酚、1.053～1.127wt‰原儿茶酸甲酯、0.794～0.846wt‰没食子酸甲酯、0.612～0.648wt‰没食子酸正丁基酯、0.415～0.445wt‰6-O-(E)-咖啡酰基葡萄糖苷、1.732～1.848wt‰胡萝卜苷、12.19～14.31wt‰苯甲酰基β-D-吡喃葡萄糖苷、3.68～4.56wt％2,8-三醇-1-O-β-D-吡喃葡糖苷、5.153～5.327wt‰槲皮素-3-O-α-D-呋喃阿拉伯糖苷和9.23～10.87wt‰阿魏酸，以及不低于1亿/g的菊糖芽孢乳杆菌活菌粉。
在本申请实施例中，所述三七活性组合物，按重量千分比计包含11.93～14.61wt‰白黎芦醇、17.41～20.69wt‰根皮苷、9.18～11.08wt‰槲皮素、1.87～2.75wt‰6-甲氧基-7羟基香豆素、4.108～5.212wt‰儿茶素、1.732～1.788wt‰南烛木树脂酚、0.745～0.775wt‰原儿茶酸甲酯、0.317～0.363wt‰没食子酸甲酯、0.449～0.491wt‰没食子酸正丁基酯、0.546～0.574wt‰6-O-(E)-咖啡酰基葡萄糖苷、1.426～1.534wt‰胡萝卜苷、16.93～19.39wt‰苯甲酰基β-D-吡喃葡萄糖苷、2.89～3.61wt％2,8-三醇-1-O-β-D-吡喃葡糖苷、2.732～2.848wt‰槲皮素-3-O-α-D-呋喃阿拉伯糖苷和13.56～17.14wt‰阿魏酸，以及不低于1亿/g的菊糖芽孢乳杆菌活菌粉。
在本申请实施例中，所述三七活性组合物，按重量千分比计包含14.02～16.26wt‰白黎芦醇、12.21～14.69wt‰根皮苷、10.19～11.97wt‰槲皮素、4.42～4.94wt‰6-甲氧基-7羟基香豆素、7.744～7.896wt‰儿茶素、2.799～2.861wt‰南烛木树脂酚、1.189～1.311wt‰原儿茶酸甲酯、0.817～1.003wt‰没食子酸甲酯、0.738～0.782wt‰没食子酸正丁基酯、0.519～0.5761wt‰6-O-(E)-咖啡酰基葡萄糖苷、1.448～1.612wt‰胡萝卜苷、9.52～11.94wt‰苯甲酰基β-D-吡喃葡萄糖苷、4.07～4.77wt％2,8-三醇-1-O-β-D-吡喃葡糖苷、5.053～5.187wt‰槲皮素-3-O-α-D-呋喃阿拉伯糖苷和9.11～10.37wt‰阿魏酸，以及不低于1亿/g的菊糖芽孢乳杆菌活菌粉。
在本申请实施例中，所述三七活性组合物对α-葡萄糖苷酶抑制率不低于51.49％，OARC值不低于32.60μmol TE/mL。
第二方面，本申请实施例公开了一种减肥降糖降脂代餐粉，包括第一方面所述的三七活性组合物0.0001～10粉、可溶性膳食纤维50～80份以及其他食品学上可接受的辅料。
第三方面，本申请实施例公开了第一方面所述的三七活性组合物的制备方法，包括以下步骤：
制备含有菊糖芽孢乳杆菌活菌的工作种子液；
制备种子液，所述种子液由所述工作种子液接种至种子培养基中进行，于37℃培养18h得到所述种子液；
制备发酵液，所述发酵液由所述种子液接种至发酵培养基中培养，即可得到所述发酵液；以及
将所述发酵液经由浓缩和干燥，即可得到所述三七活性组合物；
其中，所述种子培养基包含2～5g/L菊芋全粉、6～20g/L三七粉、0.1～7g/L玉米粉和0.1～8g/L荞麦粉；所述发酵培养基包含3～6g/L菊芋全粉、8～20g/L三七粉、0.1～8g/L玉米粉和0.1～8g/L荞麦粉。
在本申请实施例中，制备所述工作种子液是由活化的菊糖芽孢乳杆菌接种至驯化培养基上进行驯化培养得到，所述驯化培养基包含8～18.0g/L菊芋全粉和2.0～12g/L三七粉。
在本申请实施例中，所述驯化培养包括依次在第一驯化培养基、第二驯化培养基和第三驯化培养基中进行的驯化培养，第一驯化培养基包含18.0g/L菊芋全粉和2.0g/L三七粉，第二驯化培养基包含10.0g/L菊芋全粉和10.0g/L三七粉，第三驯化培养基包含8.0g/L菊芋全粉和12.0g/L三七粉。
第四方面，本申请实施例公开了第一方面所述的三七活性组合物、或第二方面所述的制备方法制得的三七活性组合物在制备减肥降糖降脂相关保健品中的应用。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请利用菊糖芽孢乳杆菌对三七粉进行发酵，制得了一种包含由菊糖芽孢乳杆菌活菌和三七相关降糖降脂活性成分的冻干粉，经过对该冻干粉中活性成分分析发现，采用本申请发酵方法，不仅能够充分提高和富集三七相关降糖降脂活性成分含量，还能全面富集这些有效成分，为其作为一种降糖降脂，有效减肥发挥作用的保健品提供了一种应用前景。
由此，本申请实施例进一步利用该冻干粉制作了一种代餐粉，并经过体内实验证实了该代餐粉对KK/Upj-Ay/J糖尿病模型鼠的降糖降脂以及减肥作用，对小鼠脏器损伤小，无明显毒副作用，还对小鼠肠道菌群分析发现了本申请实施例提供的代餐粉具有提高小鼠肠道厚壁菌门的丰度的作用，利用小鼠肠道微生态向益生方向转变。
附图说明
图1为本申请实施例1～3和对比例1～6发酵过程中的pH值变化。
图2为本申请体内试验提供的正常组小鼠脂肪细胞切片染色图。
图3为本申请体内试验提供的模型组小鼠脂肪细胞切片染色图。
图4为本申请体内试验提供的干预组(实施例1)小鼠脂肪细胞切片染色图。
图5为本申请体内试验提供的阳性对照组(实施例1)小鼠脂肪细胞切片染色图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
益生菌发酵
一、材料与方法
1、生物材料
三七，干货，研磨成粉，文山福万家。
辅料：荞麦粉购自兴化市裕丰食品有限公司，玉米粉购自西安四叶草生物科技有限公司。
菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus，简称为SI)，货号B81253，购自明舟生物。
2、制备工作种子液
将菊糖芽孢乳杆菌的冻干粉，使用葡萄糖酵母膏蛋白胨(GYP)培养基，进行活化，冻干粉的首次活化要全部用完，用0.5mL的上述培养液进行溶液，接种至GYP的固体平板上，33℃培养15～18h后，挑取单菌落，接种至驯化培养基上进行驯化培养。
具体的实施例1的实施过程中，驯化培养包括将活化的SI菌落接种至第一驯化培养基中进行驯化的步骤；第一驯化培养基的配方的一个具体实施例为：酪蛋白酶消化物10.0g，牛肉膏粉15.0g，柠檬酸三铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾2.0g，菊芋全粉18.0g，三七粉2.0g，1.5gα-淀粉酶(夏盛FDY-2801)、1.2gβ-淀粉酶(夏盛FDG-2258)、吐温1mL，加蒸馏水至1000mL，煮沸溶解，调pH至7.0(20～25℃)，121℃灭菌20min，冷却分装后，将经过活化的SI单菌落按照12wt％的接种量接站至驯化培养基中，于36℃培养15～18h后，即可得到工作种子液。
具体的实施例2的实施过程中，驯化培养的步骤包括将活性的SI菌落依次转接至第一、第二、第三驯化培养基中进行培养的步骤；第二驯化培养基包含10.0g/L菊芋全粉和10.0g/L三七粉，其余成分均与第一驯化培养基相同，接种量为10wt％，于38℃培养15～18h后；再次转接至第三驯化培养基中，第三驯化培养基包含8.0g/L菊芋全粉和12.0g/L三七粉，其余成分均与第一驯化培养基相同，接种量为10wt％，于38℃培养15～18h后，即可得到工作种子液。
具体的对比例1的实施过程中，其并未进行相关驯化培养的步骤，而是直接将活化的SI菌落接种中工作种子培养基中，对比例1使用的一个具体的工作种子培养基的配方包括20g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，10g/L牛肉膏，5g/L酵母膏，2g/L柠檬酸氢二铵，5g/L乙酸钠，2g/L磷酸氢二钾，0.25g/L硫酸锰，0.5g/L硫酸镁，1mL吐温80，pH6.4，121℃灭菌15min，于40℃培养16h，制成工作种子菌液OD600为值达到0.2以上。
3、制备种子液和发酵液
将上述实施例1、实施例2和对比例1分别制得的工作种子液，接种至种子培养基中，于37℃培养18h，一个具体的种子培养基配方包括：牛肉膏粉25.0g，菊芋全粉3.0g，三七粉12.0g，5.0g玉米粉，7.0g荞麦粉，2.0g柠檬酸三铵，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾2.0g，吐温1mL，加蒸馏水至1000mL，煮沸溶解，调pH至7.0(20～25℃)，121℃灭菌20min，冷却分装后，将工作种子液按照12wt％的接种量接站至种子培养基中，于36℃培养15～18h后，即可得到种子液。
将种子液按照8wt％的接种量接站至发酵培养基中培养，即可得到发酵液。一个具体的发酵培养基的配方包括：牛肉膏粉20.0g，菊芋全粉5.0g，三七粉15.0g，8.0g玉米粉，10.0g荞麦粉，2.0g柠檬酸三铵，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾2.0g，吐温1mL，加蒸馏水至1000mL，煮沸溶解，121℃灭菌20min，冷却后装入发酵罐中。发酵前期不通无菌空气，40℃，随着细胞浓度(OD600值变大)增长，氧化还原电位和二氧化碳发生变化。培养4h后转入微氧培养阶段，根据氧化还原电位和二氧化碳变化控制无菌空气流量。发酵4～30h控制氧化还原电位在-150mV～-180mV，尾气二氧化碳含量在15％～20％，发酵30h后不再通无菌空气，56h后发酵结束。
一个实施例3的实施过程为：其使用的工作种子液与实施例1制得的工作种子液相同，但其实验的种子培养基和发酵培养基的配方均为：牛肉膏粉25.0g，菊芋全粉3.0g，三七粉12.0g，5.0g玉米粉，7.0g荞麦粉，2.0g柠檬酸三铵，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾2.0g，吐温1mL，加蒸馏水至1000mL。
一个对比例2的实施过程为：其使用的工作种子液与实施例1制得的工作种子液相同，但其实验的种子培养基和发酵培养基的配方均为：20g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，10g/L牛肉膏，5g/L酵母膏，2g/L柠檬酸氢二铵，5g/L乙酸钠，2g/L磷酸氢二钾，0.25g/L硫酸锰，0.5g/L硫酸镁，1mL吐温80，pH7.0，121℃灭菌15min，于40℃培养56h；由此经发酵制得其发酵液。
一个对比例3的实施过程为：其使用的工作种子液与实施例2制得的工作种子液相同，但其使用的种子培养基和发酵培养基的配方均为：20g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，10g/L牛肉膏，5g/L酵母膏，2g/L柠檬酸氢二铵，5g/L乙酸钠，2g/L磷酸氢二钾，0.25g/L硫酸锰，0.5g/L硫酸镁，1mL吐温80，pH7.0，121℃灭菌15min，于40℃培养56h；由此经发酵制得其发酵液。
一个对比例4的实施过程为：其使用的工作种子液与对比例1制得的工作种子液相同，但其实验的种子培养基和发酵培养基的配方均为：20g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，10g/L牛肉膏，5g/L酵母膏，2g/L柠檬酸氢二铵，5g/L乙酸钠，2g/L磷酸氢二钾，0.25g/L硫酸锰，0.5g/L硫酸镁，1mL吐温80，pH7.0，121℃灭菌15min，于40℃培养56h；由此经发酵制得其发酵液。
一个对比例5的实施过程为：其使用的工作种子液与实施例1制得的工作种子液相同，但其实验的种子培养基和发酵培养基的配方均为：牛肉膏粉25.0g，菊芋全粉3.0g，葡萄糖粉20.0g，2.0g柠檬酸三铵，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾2.0g，吐温1mL，加蒸馏水至1000mL，调节pH7.0，121℃灭菌15min，于40℃培养16h；由此经发酵制得其发酵液。
一个对比例6的实施过程为：其使用的工作种子液与实施例1制得的工作种子液相同，但其实验的种子培养基和发酵培养基的配方均为：牛肉膏粉25.0g，5.0g玉米粉，7.0g荞麦粉，2.0g柠檬酸三铵，乙酸钠5.0g，硫酸锰0.05g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾2.0g，吐温1mL，加蒸馏水至1000mL，调节pH7.0，121℃灭菌15min，于40℃培养16h；由此经发酵制得其发酵液。
4、相关指标测定
收集实施例1～3和对比例1～6提供的发酵液进行如下相关指标的测定。
乳酸菌、酵母菌活菌数量的测定：采用稀释倒平板法，参考GB 4789-2010中酵母菌和乳酸菌菌落总数的测定方法。
pH测定：发酵液桑堪浆的pH直接用PB-10pH计测定量。
抗氧化能力的测定：以氧自由基吸收能力(Oxygen Radical AbsorbanceCapacityORAC)法测定上述各实施例和对比例制得的发酵液额的ORAC，结果以μmol TE/mL(μmol TE/g)表示。
测定方法为：在96孔板微孔中分别加入20μL稀释后的样品液及Trolox标准溶液(日本和纯药株式会社)，再加入80μL 1.25μmol/L荧光素钠溶液(用pH为7.4的75mmol/L磷酸盐缓冲液配制)混合均匀，于37℃下避光反应10min；然后加入100μL 140mmol/L自由基产生剂AAPH(用pH为7.4的75mmol/L磷酸盐缓冲液配制)，混匀后，将微孔板置于酶标仪中，在37℃下以激发波长485nm，发射波长520nm，进行多点循环测定，每2min测定一次各微孔荧光强度，测定时间一般设定在荧光衰减呈基线后为止。实验分为阴性对照组1、阴性对照组2和实验组。阴性对照组1的孔板小孔中未添加自由基产生剂AAPH。阴性对照组2的孔板小孔中未添加Trolox标准溶液。样品的抗氧化能力与自由基作用下荧光衰退曲线的延缓部分面积(Net AUC)直接相关。实验所得各微孔反应的荧光强度数据通过软件的输出后，经过SPSS进行统计处理。各孔的不同时间点的绝对荧光强度数据与阴性对照组1的荧光强度相比，折算成相对荧光强度f，以相对荧光强度采用近似积分法计算应该熄灭曲线下面积(AUC)，则OARC值＝[(AUC样品－AUC阴性对照组2)/(AUC标准品－AUC阴性对照组2)]×(Trolox标准溶液量/样品量)。
α-葡萄糖苷酶抑制率的测定：取50μL样品(各实施例和对比例提供的发酵液)于96孔无菌细胞板中，并加入含100μL 1u/mLα-葡萄糖苷酶(G5003-100UN)pH6.9的0.1M磷酸缓冲液，25℃反应10min后，继续添加50μL含1.5mM硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷的pH6.9的0.1M磷酸缓冲液，混合均匀后，立即用酶标仪测定405nm下的吸光度值，以50μL pH6.9的0.1M磷酸缓冲液的孔板作为空白对照，根据公式计算α-葡萄糖苷酶抑制率(％)＝(1－A样品/A空白)×100％。
单糖含量测定：将待测样品(各实施例和对比例提供的发酵液)加入2倍体积的无水乙醇超声处理30min后，8000rpm离心10min，0.22μm滤膜过滤后用于HPLC分析其中的单糖含量。色谱条件为：糖类分析用高效液相色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，Cosmosil Sugar-D)，柱温30℃，蒸发光检测器进行检测，ELSD漂移管温度为40℃；流动相为75％乙睛，流速为1mL/min，进样量为10μL；采用外标法定量分析单糖的含量。
有机酸含量测定：用一定量偏磷酸溶液提取样品，超声处理30min，8000rpm离心10min，取上清液，0.22μm滤膜过滤，用于HPLC分析。色谱条件为：Aquasil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为pH2.7的0.1％磷酸二氢铵，等度洗脱15min，流速1mL/min，进样量为20μL，检测波长210nm。采用外标法测定有机酸含量。
5、数据处理
所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用SPSS13.0软件处理数据，并对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。
二、结果
表1
由表1可知，实施例1～3提供的发酵液菊糖芽孢乳杆菌活菌数均显著高于对比例1～6(对比例4除外)，由此说明采用本申请实施例提供的发酵方法能够提供更高活菌数的发酵液，表1中，“-”表示未检出。而由图1可知，从第0～56h的发酵过程看，各实施例1～3在发酵过程中，第0～12h过程中，发酵pH值迅速降低，发酵值36h后，发酵液pH值较为稳定；而除对比例4外，其他各对比例的发酵液pH值在发酵过程中均逐步降低，且发酵完成后的发酵液pH值均低于实施例。另外，由表1可知，实施例1～3最终发酵得到的发酵液中的有机酸含量较低；而对比例1～3最终得到的发酵液中有机酸含量较高，对比例4提供的发酵液中并未检出乙酸和柠檬酸，对比例5、6中的有机酸含量与实施例相当。
表2
表2列出了各发酵液中果糖和葡萄糖含量，以及各发酵液的OARC值和α-葡萄糖苷酶抑制率，表2中，“-”表示未检出。结果可知，实施例1～3提供的发酵液中果糖和葡萄糖含量显著低于对比例1～6，并且实施例3甚至并未检出单糖成分，由此说明本申请实施例提供的发酵液为低糖含量发酵液。
进一步的，由表2可知，实施例1～3提供的发酵液的OARC值和α-葡萄糖苷酶抑制率均显著高于对比例，由此说明，本申请实施例提供的菊糖芽孢乳杆菌发酵液具有优异的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制功能。
发酵液活性成分分析
1、发酵液后处理
(1)浸膏
收集上述实施例1～3和对比例1～6分别制得的发酵液，于65℃条件下减压浓缩后，向浓缩液中加入至9倍体积的95％的乙醇水溶液中，磁力搅拌处理30min，2000rpm离心10min，取上清液减压浓缩，得到第一浸膏。
(2)提取
将浸膏用90％的甲醇溶解后用等体积的石油醚萃取3～5次，取其下层相，减压回收得到第二浸膏；
将第二浸膏依次用异丁醇、丙醇、四氢呋喃和丙酮萃取，每一级萃取后的下层浸膏或者溶液作为下一级的待萃取物。
由此，依次得到异丁醇萃取物、丙醇萃取物、四氢呋喃萃取物和丙酮萃取物，将这些萃取物分别减压浓缩和冷冻干燥，去除其中的溶剂，得到对应的冻干粉。
2、冻干粉的活性成分检测
对于异丁醇萃取物和丙醇萃取物采用反向液相色谱法进行检测，以WatersSunfire ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)为色谱柱，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为可变波长(0min，230nm；10min，283nm；25min，203nm)，柱温为30℃，进样量为10μL。
供试品：将上述的异丁醇萃取物、丙醇萃取物、四氢呋喃萃取物和丙酮萃取物的冻干粉分别用对应的异丙醇、丙醇、四氢呋喃和丙酮作为溶剂，配制成1.0mg/mL的溶液，以作为供试品。
标准品：为本实验所涉及的标准品参照表3所示。
表3标准品
3、结果
表4
表4中列出了将实施例1～3和对比例1～6经过上述发酵方法得到的发酵液进行后处理，分别得到各自的异丁醇萃取物、丙醇萃取物、四氢呋喃萃取物和丙酮萃取物的冻干粉，再将这些冻干粉混合后，采用上述反相色谱法检测H1～H15占发酵液冻干粉重量百分比，“wt‰”表示重量千分比。另外，本申请还将三七的粉末直接作为对比例7，采用上述的浸膏和提取的步骤，得到异丁醇萃取物、丙醇萃取物、四氢呋喃萃取物和丙酮萃取物的冻干粉，再将这些冻干粉混合后，采用上述反相色谱法检测H1～H15化合物占三七的粉末的重量百分比。表4中，H1～H15化合物中未写明的成分代表未检出该化合物。
由表4可知，实施例1～3相对于对比例7，不仅Hi～H15的组分保留齐全，而且其含量比例提升了3个数据级，极大了富集了三七中的相关活性成分。
而对比例1和4，由于其发酵过程中使用了对比例1制得的工作种子液，使得其发酵液经过后期处理后，使得其萃取物冻干粉中的三七相关活性成分大量损失。而对比例2、3和6，由于其发酵过程中的培养基配方不同，同样导致其发酵液经过后期处理后，使得其萃取物冻干粉中的三七相关活性成分大量损失。对比例5制得的萃取物冻干粉中相关三七活性成分得以保留。
体内实验
一、材料与方法
1、实验动物
SPF级KK/Upj-Ay/J糖尿病模型小鼠，体重24.5±2.3g，雌雄各半，喂食60Co鼠料1025，广州市赛柏诺生物科技有限公司。
SPF级C56BL/6J小鼠，体重20.1±1.6g，雌雄各半，正常喂食，北京华阜康生物科技股份有限公司。
实验动物饲养在IVC笼具中，温度21～25℃，湿度40～70％。糖尿病模型小鼠饲喂专用高脂高能量饲料60Co鼠料1025，C57BL/6J小鼠饲喂SPF专用饲料，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
2、供试品
本实验将以上述实施例1～3和对比例1～7为基础制成一种代餐粉，以测试其对模型小鼠的降糖降脂以及减肥作用。具体可参照如下工艺制作：
将所有基础原料球磨到指定粒径，过100目筛后，采用倍散工艺技术，将可溶性膳食纤维组分、实施例1～3或对比例1～7提供的冻干粉以及其他辅料在三维混合机中进行预混合，即可得到所述代餐粉。
为此，本申请实施例还公开了一种具有降糖降脂以及减肥功能的代餐粉，其包括上述实施例1～3制得的冻干粉0.0001～10粉、可溶性膳食纤维50～80份以及其他食品学上可接受的辅料。
其中，实施例1～3制得的冻干粉为经过实施例1～3发酵制得的发酵液经过浓缩、冷冻干燥得到，冷冻干燥过程中可加入重量百分比不大于6wt％的冻干保护剂。具体的，冻干保护剂选自脱脂乳、蔗糖、海藻糖、葡聚糖和维生素C钠盐中的至少一种。
上述代餐粉的组份中，可溶性膳食纤维选自水溶性大豆膳食纤维、水溶性糙米纤维、水溶性胚芽精米纤维、水溶性性玉米纤维、水溶性大麦纤维、水溶性米糠纤维、水溶性根菜纤维、水溶性海带纤维、水溶性胡萝卜纤维、水溶性四季度纤维、水溶性红豆纤维、水溶性豌豆纤维、水溶性红薯纤维和水溶性裙带菜纤维中的至少一种。
上述代餐粉的组分中，食品学上可接受的辅料包括调味剂、风味剂和/或食品防腐剂。
具体的，本实验所涉及的供试品的代餐粉的配方参照表5所示。
表5
实施方式 配方
实施例1 发酵冻干粉8份、可溶性膳食纤维65份、L-谷氨酸钠0.5份
实施例2 发酵冻干粉8份、可溶性膳食纤维65份、L-谷氨酸钠0.5份
实施例3 发酵冻干粉8份、可溶性膳食纤维65份、L-谷氨酸钠0.5份
对比例1 发酵冻干粉8份、可溶性膳食纤维65份、L-谷氨酸钠0.5份
对比例2 发酵冻干粉8份、可溶性膳食纤维65份、L-谷氨酸钠0.5份
对比例3 发酵冻干粉8份、可溶性膳食纤维65份、L-谷氨酸钠0.5份
对比例4 发酵冻干粉8份、可溶性膳食纤维65份、L-谷氨酸钠0.5份
对比例5 发酵冻干粉8份、可溶性膳食纤维65份、L-谷氨酸钠0.5份
对比例6 发酵冻干粉8份、可溶性膳食纤维65份、L-谷氨酸钠0.5份
对比例7 三七的粉末8份、可溶性膳食纤维65份、L-谷氨酸钠0.5份
3、实验分组
适应性饲养1周后，开始实验，C57BL/6J小鼠设为正常对照组。将血糖值达到糖尿病诊断标准(即≧11.1mmol/L)的KK/Upj-Ay/J糖尿病模型小鼠按随机血糖水平随机分为模型组、干预组和阳性组，每组20只动物，雌雄各半。
干预组每日灌胃给药上述供试品两次，给药容积20mg/kg.bw，灌胃体积0.1mL/10g，间隔4h以上，连续给药4周。
阳性组小鼠每日灌胃盐酸二甲双肌胍的剂量为：第一周128mg/kg.bw，第二周204mg/kg.bw，第三周280mg/kg.bw，第四周到实验结束303mg/kg.bw，灌胃体积0.1mL/10g。
正常对照组和模型组给子等容积0.5％梭甲基纤维素钠。鼠房温度维持在20～24℃，白天和黑夜各12h，相对湿度60-65％左右。实验共进行4周。
4、体重和血糖监测
每周称重1次。血糖给药期间每周测随机血糖和空腹血糖1次，测空腹血糖前禁食不禁水4h。将小鼠尾尖用酒精棉球擦净，取血约2μL滴于血糖试纸上检测血糖值。
5、血脂四项、胰岛素、糖化血红蛋白检测以及组织病理检测
给药4周后，小鼠禁食不禁水16h后摘眼球采血，待其自然凝固后3000rpm离心10min分离血清。用生化分析仪(AU5800系列，BECKMAN)检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋自胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋自胆固醇(LDL-C)四项指标，采用INS ELISA试剂盒(货号:JL18382，江莱生物)检测胰岛素含量，糖化血红蛋白ELISA试剂盒(上海一研生物科技有限公司)检测糖化血红蛋白含量。并计算胰岛素敏感指数(insulinsensitivityindex,ISI)，ISI为空腹血糖值与空腹血胰岛素值乘积的倒数，呈非正态分布，分析时取其自然对数值。
取各组中小鼠的适当大小的睾丸附件的附睾脂肪放入脂肪固定液瓶中固定，肝脏组织取肝脏最大叶中部大小为1cm的正方形块入中性甲醛固定液瓶中固定，固定时间24h，制作石蜡切片，并进行苏木精染色后，光学纤维镜观察。
数据分析：所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用SPSS13.0软件处理数据，并对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。
6、对小鼠肠道菌群的影响
(1)收集各组小鼠的粪便，采用CTAB方法从样本中提取基因组DNA；然后进行DNA扩增，扩增引物为F:cctaygggrbgcascag；R:ggactacnngggtatctaat，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的条带，使用genejettmgel提取试剂盒(Thermo S cientific)对混合PCR产物进行纯化。使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48rxns构建文库，经过Qubit定量和文库检测是否合格，上机测序使用Thermofisher公司的IonSSTMXL。
(2)数据分析
首先应用Cutadapt(V1.9.1,http://cutadapt.readthedocs.io/en/stab/)对reads低质量部分剪切，根据Barcode得到reads中拆分出各样品的数据，截取初步质控得到的原始数据(Raw reads，Reads经过以上处理后还需要进行去除嵌合体序列的步骤，该序列通过(https://github.com/torognes/vsearch/)与物种注释数据库进行比对，去除其中的嵌合体序列，最后得到最终有效的数据(Clean Reads)。
使用Uparse软件(Uparse v7.0.1001，http：//www.drive5.com/uparse/)对所有样品的Clean Reads进行聚类，97％的一致性(Identity)为默认值，将序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units，与此同时选取OTUs的代表性序列，依照算法原则，OTUs的代表序列是筛选出现频数最高的序列。用Mothur方法与SILVA132(http：//www.arb-silva.de/)的S SSUrRNA数据库的方法对OTUs序列进行物种注释分析(设定阂值为0.8～1)，最终获得分类学信息后统计各样本的群落组成分别：kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)。进行快速多序列比对，使用的是MUSCLE(Version3.8.31，http：//www.drives.com/muscle/)软件。最后以样品中数据量最少的为标准将各组样品的数据均一化处理。
Qiime软件(Version 1.9.1)计算Observed-species，Chaol，R软件(Version2.15.3分析，多样性分析评价样本间物种差异的复杂度。
二、结果
表6
由表6可知，模型组小鼠的在实验第4周后的体重和随机血糖均显著升高，而阳性对照组小鼠的随机血糖虽然显著低于模型组，但是其对体重并未明显降低，说明其对模型小鼠不具有减肥作用。而干预组中，实施例1～3提供的代餐粉干预KK/Upj-Ay/J糖尿病模型小鼠第4周后，其体重和随机血糖均显著低于模型组和阳性对照组小鼠，并与正常组小鼠相差不大，由此说明本申请实施例以经过益生菌发酵的三七的发酵冻干粉为基础制得的代餐粉，对于KK/Upj-Ay/J糖尿病模型小鼠具有降糖和减肥功效。
表7
由表7可知，模型组小鼠的在实验第4周后的四项血脂均显著升高，而阳性对照组小鼠的随机血糖虽然显著低于模型组，但是仍然显著高于正常组，说明阳性药物对模型小鼠的降脂作用有限。而干预组中，实施例1～3提供的代餐粉干预KK/Upj-Ay/J糖尿病模型小鼠第4周后，其四项血脂均显著低于模型组和阳性对照组小鼠，并与正常组小鼠相差不大，由此说明本申请实施例以经过益生菌发酵的三七的发酵冻干粉为基础制得的代餐粉，对于KK/Upj-Ay/J糖尿病模型小鼠具有降脂功效。
进一步地，通过检测小鼠脏器指数和脂肪指数来整体反应药物干预对小鼠的健康状况和体脂含量的影响，结果如表8所示。
表8
由表8可知，模型组小鼠的BMI指数、Lee′s指数、白色脂肪指数和肝脏指数均显著高于正常组，说明模型组小鼠不仅存在高血糖血脂以及肥胖症状，还存在肝脏损伤的可能。而干预组中，实施例1～3提供的代餐粉对小鼠进行干预后，其BMI指数、Lee′s指数、白色脂肪的指数和肝脏指数均由显著降低，尤其是白色脂肪指数，由此说明本申请实施例提供的代餐粉不仅均有降糖降脂，减肥作用，对小鼠的脏器损伤也较小。
另外，如图2所示，正常小鼠的脂肪排列有序且形状规整，而模型组的脂肪细胞排列杂乱，大小不一，脂肪细胞膨胀，由于脂肪的异常堆积导致，脂肪细胞的大小可以反映机体的肥胖程度。图3中脂肪细胞的平均尺寸，模型组的脂肪平均尺寸极显著高于正常组；图4、5中，干预组(实施例1)和阳性对照均显著的降低小鼠脂肪细胞的尺寸，说明实施例提供的代餐粉具有良好减肥作用。
由于本申请实施例提供的代餐粉以经过益生菌发酵的三七的发酵液冻干粉为基础制备，本实验进一步考察了其对于各组小鼠的组成肠道菌群的各菌属的丰富度影响情况，结果如表9、10所示。
表9 Relative Abundance
表10 Relative Abundance
由表9、10所示，肠道内菌群主要以拟杆菌门(Bac.)和厚壁菌门(Fir.)为主，其次占据比例较少的有放线菌门(Act.)、脱铁杆菌门(Def.)、统微菌门(Tle.)、变形菌门(Pro.)等。其中，厚壁菌门主要包括乳杆菌(Lac.)、双歧杆菌属(Bif.)、布劳特氏菌属(Bla.)，Marvinbryantia(Mar.)以及代餐粉中增加的菊糖芽孢乳杆菌(S.inulinus)等均为益生菌。
并且，相对正常组，模型组小鼠肠道菌群中，厚壁菌门的丰度降低，尤其是其中的双歧杆菌属和布劳特氏菌属，并且其肠道菌群中未定义菌群(undentified Bacteria)以及变形菌门(常为致病菌)显著增多，说明模型组小鼠的肠道微生态发生了病变，不利于其生理健康。而经过本申请实施例1～3提供的代餐粉干预后，小鼠菌群厚壁菌门的丰度显著升高，并且经过补充菊糖芽孢乳杆菌，其肠道菌群出现了一定丰度，而对比例5虽然经过前述实验证实了具有一定的降糖降脂作用，但是其菊糖芽孢乳杆菌的肠道丰度远远不及实施例1～3，由此说明了，对比例5在利用菊糖芽孢乳杆菌发酵过程中使用的发酵培养基对制得的发酵冻干粉中活菌数以及最终作用于小鼠肠道丰度均存在显著影响。而其他对比例干预小鼠后，其厚壁菌门的丰度升高作用不明显，不利于小鼠肠道微生态向益生方向转变。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种三七活性组合物，包含白黎芦醇、根皮苷、槲皮素、6-甲氧基-7羟基香豆素、儿茶素、南烛木树脂酚、原儿茶酸甲酯、没食子酸甲酯、没食子酸正丁基酯、6-O-(E)-咖啡酰基葡萄糖苷、胡萝卜苷、苯甲酰基β-D-吡喃葡萄糖苷、2,8-三醇-1-O-β-D-吡喃葡糖苷、槲皮素-3-O-α-D-呋喃阿拉伯糖苷和阿魏酸以及不低于1亿/g的菊糖芽孢乳杆菌活菌粉。
2.根据权利要求1所述的三七活性组合物，其特征在于，按重量千分比计包含14.20～16.24wt‰白黎芦醇、
16.48～18.16wt‰根皮苷、12.50～13.12wt‰槲皮素、4.69～4.95wt‰6-甲氧基-7羟基香豆素、6.498～6.622wt‰儿茶素、2.088～2.172wt‰南烛木树脂酚、1.053～1.127wt‰原儿茶酸甲酯、0.794～0.846wt‰没食子酸甲酯、0.612～0.648wt‰没食子酸正丁基酯、0.415～0.445wt‰6-O-(E)-咖啡酰基葡萄糖苷、1.732～1.848wt‰胡萝卜苷、12.19～14.31wt‰苯甲酰基β-D-吡喃葡萄糖苷、3.68～4.56wt％2,8-三醇-1-O-β-D-吡喃葡糖苷、5.153～5.327wt‰槲皮素-3-O-α-D-呋喃阿拉伯糖苷和9.23～10.87wt‰阿魏酸，以及不低于1亿/g的菊糖芽孢乳杆菌活菌粉。
3.根据权利要求1所述的三七活性组合物，其特征在于，按重量千分比计包含11.93～14.61wt‰白黎芦醇、
17.41～20.69wt‰根皮苷、9.18～11.08wt‰槲皮素、1.87～2.75wt‰6-甲氧基-7羟基香豆素、4.108～5.212wt‰儿茶素、1.732～1.788wt‰南烛木树脂酚、0.745～0.775wt‰原儿茶酸甲酯、0.317～0.363wt‰没食子酸甲酯、0.449～0.491wt‰没食子酸正丁基酯、0.546～0.574wt‰6-O-(E)-咖啡酰基葡萄糖苷、1.426～1.534wt‰胡萝卜苷、16.93～19.39wt‰苯甲酰基β-D-吡喃葡萄糖苷、2.89～3.61wt％2,8-三醇-1-O-β-D-吡喃葡糖苷、2.732～2.848wt‰槲皮素-3-O-α-D-呋喃阿拉伯糖苷和13.56～17.14wt‰阿魏酸，以及不低于1亿/g的菊糖芽孢乳杆菌活菌粉。
4.根据权利要求1所述的三七活性组合物，其特征在于，按重量千分比计包含14.02～16.26wt‰白黎芦醇、12.21～14.69wt‰根皮苷、10.19～11.97wt‰槲皮素、4.42～4.94wt‰6-甲氧基-7羟基香豆素、7.744～7.896wt‰儿茶素、2.799～2.861wt‰南烛木树脂酚、1.189～1.311wt‰原儿茶酸甲酯、0.817～1.003wt‰没食子酸甲酯、0.738～0.782wt‰没食子酸正丁基酯、0.519～0.5761wt‰6-O-(E)-咖啡酰基葡萄糖苷、1.448～1.612wt‰胡萝卜苷、9.52～11.94wt‰苯甲酰基β-D-吡喃葡萄糖苷、4.07～4.77wt％2,8-三醇-1-O-β-D-吡喃葡糖苷、5.053～5.187wt‰槲皮素-3-O-α-D-呋喃阿拉伯糖苷和9.11～10.37wt‰阿魏酸，以及不低于1亿/g的菊糖芽孢乳杆菌活菌粉。
5.根据权利要求1所述的三七活性组合物，其特征在于，所述三七活性组合物对α-葡萄糖苷酶抑制率不低于51.49％，OARC值不低于32.60μmol TE/mL。
6.一种减肥降糖降脂代餐粉，其特征在于，包括如权利要求1～5任一项所述的三七活性组合物0.0001～10粉、可溶性膳食纤维50～80份以及其他食品学上可接受的辅料。
7.权利要求1～5任一项所述的三七活性组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备含有菊糖芽孢乳杆菌活菌的工作种子液；
制备种子液，所述种子液由所述工作种子液接种至种子培养基中进行，于37℃培养18h得到所述种子液；
制备发酵液，所述发酵液由所述种子液接种至发酵培养基中培养，即可得到所述发酵液；以及
将所述发酵液经由浓缩和干燥，即可得到所述三七活性组合物；
其中，所述种子培养基包含2～5g/L菊芋全粉、6～20g/L三七粉、0.1～7g/L玉米粉和0.1～8g/L荞麦粉；所述发酵培养基包含3～6g/L菊芋全粉、8～20g/L三七粉、0.1～8g/L玉米粉和0.1～8g/L荞麦粉。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，制备所述工作种子液是由活化的菊糖芽孢乳杆菌接种至驯化培养基上进行驯化培养得到，所述驯化培养基包含8～18.0g/L菊芋全粉和2.0～12g/L三七粉。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述驯化培养包括依次在第一驯化培养基、第二驯化培养基和第三驯化培养基中进行的驯化培养，第一驯化培养基包含18.0g/L菊芋全粉和2.0g/L三七粉，第二驯化培养基包含10.0g/L菊芋全粉和10.0g/L三七粉，第三驯化培养基包含8.0g/L菊芋全粉和12.0g/L三七粉。
10.权利要求1～5任一项所述的三七活性组合物、或权利要求7～9任一项所述的制备方法制得的三七活性组合物在制备减肥降糖降脂相关保健品中的应用。
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