CN116870173A - 自报告荧光团标记的基因递送载体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种自报告荧光团标记的基因递送载体及其制备方法与应用。所述基因递送载体具有如下式所示的结构：其中，R1、R3、R4独立地选自碳链长度2‑10的烷基链或乙二醇单元数为2‑6个聚乙二醇类链。本发明中的基因递送载体带有马来酰亚胺二硫醚荧光基团，其自身可以发出荧光，具有更好的观察效果和更长的观察窗口期，同时避免了荧光基团之间的相互作用引起的荧光淬灭和降低了生产成本。

Description

自报告荧光团标记的基因递送载体及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于递送载体技术领域，具体涉及一种自报告荧光团标记的基因递送载体及其制备方法与应用。
背景技术
合成的干扰小核酸(small interfering RNAs，siRNAs)通过内源性RNA干扰(RNAi)途径介导基因沉默，抑制不良基因的表达。siRNAs显示出强大的治疗潜力，然而，由于大分子量和负电荷，高效和靶向递送仍然是瓶颈。最近，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)偶联物由于与ASGPR受体(asialglycoprotein receptor，也称为Ashwell-Morell受体)具有良好的相互作用，成功并广泛应用于肝脏靶向siRNA递送。通过将GalNAc附着在核酸分子上，核酸药物载荷可以有效地递送到肝细胞中并触发相应的生物学功能，这是核酸药物开发的一种强大而有前景的递送方法。
去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)是靶向基因最有效的受体，其作为肝脏的一种重要且高效的异源低聚物的内吞受体，由Ashwell和Morell及其合作者于20世纪60年代在研究哺乳动物血浆糖蛋白代谢时被发现。ASGPR的相对分子质量约41KDa，定位于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜表面，密度很高，每个细胞表面可多达50万个受体。ASGPR具有对糖的特异性，并有特定的生物学功能，故又称为肝糖凝集蛋白或肝凝集素。由于各种糖蛋白在用酶水解或用酸解除去末端唾液酸后，暴露出的次末端是半乳糖残基，所以ASGPR的糖结合特异性实际上在于半乳糖基，又称半乳糖特异性受体。ASGPR给核酸药物的递送提供了特异性的靶向。
目前国内外众多企业都在利用GalNAc核酸递送平台，实现了多种核酸药物的开发。目前，已经有相关核酸药物被批准上市，同时，还有多种核酸药物进入临床测试阶段，例如Alnylam公司GalNAc载体核心结构，如图1所示，因此，开发具有自主知识产权的基于GalNAc递送技术的新型核酸递送载体具有极大的必要性。目前，GalNAc核酸递送技术在跟踪核酸药物进入细胞的时存在一个较为普遍的问题，即需要在核酸序列中额外引入荧光分子，在荧光显微镜下进行成像。由此带来了诸多的问题：1)对于结合分子的位置及其在胶束宿主、结合剂和有效载荷中的迁移性，通常存在不明确性；2)荧光基团的共轭聚集效应会一定程度上引起的载体分子的相互作用或荧光基团之间相互作用，造成荧光淬灭；3)通常的荧光分子是一个大的疏水染料分子，可以导致核酸和GalNAc偶联物稳定性的变差；4)额外的荧光团会增加核酸-GalNAc偶联物的合成成本。综上，需要开发一种简便、经济、无干扰的自报告荧光团标记的基于GalNAc技术的新结构是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种自报告荧光团标记的基因递送载体及其制备方法与应用，以克服现有技术的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种自报告荧光团标记的基因递送载体，所述基因递送载体具有如式(I)所示的结构：
其中，R1、R3、R4独立地选自碳链长度2-10的烷基链或乙二醇单元数为2-6个聚乙二醇类链。
本发明实施例还提供了一种基因递送体系，其包括前述的基因递送载体以及与所述基因递送载体共价连接的核酸分子；所述基因递送体系具有下式(II)所示结构：
其中，R1、R3、R4独立地选自碳链长度2-10的烷基链或乙二醇单元数为2-6个聚乙二醇类链，●为所述核酸分子。
本发明实施例还提供了前述的基因递送体系的制备方法，其包括：
使巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺与炔基修饰的二溴代马来酰亚胺发生巯基-马来酰亚胺反应，制得双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺；
以及，将氨基修饰的核酸单链进行两次酰胺化反应，并与所述双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺发生叠氮-炔基环加成反应，然后与所述核酸单链的互补链杂交，制得所述基因递送体系。
本发明实施例还提供了一种双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺，所述双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺具有如式(v)所示的结构：
其中，R1选自碳链长度2-10的烷基链或乙二醇单元数为2-6个聚乙二醇类链。
本发明实施例还提供了前述的双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺的制备方法，其包括：
使巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺与炔基修饰的二溴代马来酰亚胺发生巯基-马来酰亚胺反应，制得双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺。
本发明实施例还提供了前述的自报告荧光团标记的基因递送载体、基因递送体系或双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺在制备基因治疗药物中的用途。
本发明实施例还提供了一种药物组合物，其包括：前述的基因递送体系以及药学上可接受的载体。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明中的基因递送体系(即GalNAc-核酸偶联物)通过高效的巯基-溴代马来酰亚胺偶联反应、酰胺化反应和叠氮-炔基环加成反应(CuAAC反应)进行构建，从而提高了收率，简化纯化，所得基因递送载体具有高纯度；
(2)本发明中的基因递送体系带有马来酰亚胺二硫醚荧光基团，其自身可以发出荧光，因此，无需额外偶联其他外源性的荧光基团，并且在体外细胞内吞实验时，可以通过荧光共聚焦显微镜直观的观察到细胞对GalNAc-核酸偶联物内吞过程；
(3)本发明中的基因递送体系带有马来酰亚胺二硫醚荧光基团，其荧光强度和荧光持续时间较常用的荧光素染料更优，因此具有更好的观察效果和更长的观察窗口期；
(4)本发明中的基因递送体系(即GalNAc-核酸偶联物)和Alnylam公司GalNAc载体(L96)具有同样的稳定性；
(5)本发明通过马来酰亚胺二硫醚荧光基团的引入，siRNA无需额外偶联其他荧光基团，因此，避免了荧光基团之间的相互作用引起的荧光淬灭，同时，也降低了偶联物的合成成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是现有技术中Alnylam公司GalNAc载体核心结构图；
图2是现有技术和本申请中的递送载体的结构及其工作原理示意图；
图3是本发明一典型实施方案中氨基修饰的核酸单链制备基因递送载体的合成路线示意图；
图4是本发明一典型实施方案中化合物2的核磁共振氢谱图；
图5是本发明一典型实施方案中化合物3的核磁共振氢谱图；
图6是本发明一典型实施方案中化合物4的核磁共振氢谱图；
图7是本发明一典型实施方案中2Gal-DTM-alkyne的核磁共振氢谱图；
图8是本发明一典型实施方案中Oligo-2NH2的合成路线示意图；
图9中的A-B是本发明一典型实施方案中Oligo-NH2的高效液相色谱(HPLC)和质谱图；
图9中的C-D是本发明一典型实施方案中Oligo-2NH2的高效液相色谱(HPLC)和质谱图；
图10是本发明一典型实施方案中Oligo-2N3的合成路线示意图；
图11A-图11B是本发明一典型实施方案中Oligo-2N3的高效液相色谱(HPLC)和质谱图；
图12是本发明一典型实施方案中DTM-GalNAc Conjugate的合成路线示意图；
图13A-图13B是本发明一典型实施方案中Gal-DTM-oligomer的高效液相色谱(HPLC)和质谱图；
图14A-图14C是本发明一典型实施方案中基因沉默实验效果图及细胞内吞荧光共聚焦图。
具体实施方式
鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
具体的，作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的一种自报告荧光团标记的基因递送载体具有如式(I)所示的结构：
其中，R1、R3、R4独立地选自碳链长度2-10的烷基链或乙二醇单元数为2-6个聚乙二醇类链。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种基因递送体系，其包括前述的基因递送载体以及与所述基因递送载体共价连接的核酸分子；所述基因递送体系具有下式(II)所示结构：
其中，R1、R3、R4独立地选自碳链长度2-10的烷基链或乙二醇单元数为2-6个聚乙二醇类链，●为所述核酸分子。
进一步地，所述核酸分子包括具有基因治疗功能的siRNA，miRNA或ASO。
在一些较为具体的实施方案中，图2中的A)是目前GalNAc递送平台对于跟踪siRNA进入细胞的常用荧光策略示意图(常规方法)；B)是本申请简便、经济、无干扰的自报告荧光团标记的基于GalNAc技术的新结构及其工作原理示意图。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的基因递送体系的制备方法，其包括：
使巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺与炔基修饰的二溴代马来酰亚胺发生巯基-马来酰亚胺反应，制得双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺；
以及，将氨基修饰的核酸单链进行两次酰胺化反应，并与所述双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺发生叠氮-炔基环加成反应，然后与所述核酸单链的互补链杂交，制得所述基因递送体系。
在一些优选实施方案中，所述制备方法具体包括：使包含巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺、炔基修饰的二溴代马来酰亚胺和第一溶剂的第一混合反应体系于室温反应，制得所述双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺；
进一步地，所述巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺具有如式(III)所示的结构：
其中，R1选自碳链长度2-10的烷基链或乙二醇单元数为2-6个聚乙二醇类链。
进一步地，所述炔基修饰的二溴代马来酰亚胺具有如式(IV)所示的结构：
进一步地，所述双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺具有如式(V)所示的结构：
其中，R1选自碳链长度2-10的烷基链或乙二醇单元数为2-6个聚乙二醇类链。
进一步地，所述巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺与炔基修饰的二溴代马来酰亚胺的摩尔比为6∶1-2∶1，优选为2.4∶1。
在一些优选实施方案中，所述制备方法具体包括：
将氨基修饰的核酸单链进行两次酰胺化反应，获得含叠氮基的核酸单链；
使所述含叠氮基的核酸单链与双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺于20～35℃发生叠氮-炔基环加成反应，之后与所述核酸单链的互补链于70～90℃℃退火杂交，制得所述基因递送体系。
进一步地，所述氨基修饰的核酸单链与双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺的摩尔比为6∶1-2∶1，优选为2.4∶1。
在一些优选实施方案中，所述自报告荧光团标记的基因递送载体的制备方法包括：
1)将两分子巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺通过和炔基修饰的二溴代马来酰亚胺，通过高效巯基-马来酰亚胺反应，制备得到支化的带有荧光的双巯基马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)结构单元，具体如下式所示：
2)氨基修饰的核酸单链通过两次高效的酰胺化反应，衍生出两个叠氮基(Oligo-2N3)，随后通过炔基和叠氮的CuAAC反应，将上面合成的GalNAc结构，链接到核酸单链上，通过与互补链的杂交，形成新型GalNAc-核酸偶联物，即基因递送体系。(合成路线示意图如图3所示)。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺，所述双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺具有如式(V)所示的结构：
其中，R1选自碳链长度2-10的烷基链或乙二醇单元数为2-6个聚乙二醇类链。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺的制备方法，其包括：
使巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺与炔基修饰的二溴代马来酰亚胺发生巯基-马来酰亚胺反应，制得双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺。
在一些优选实施方案中，所述制备方法具体包括：使包含巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺、炔基修饰的二溴代马来酰亚胺和第一溶剂的第一混合反应体系于室温反应，制得所述双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺。
进一步地，所述巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺具有如式(III)所示的结构：
其中，R1选自碳链长度2-10的烷基链或乙二醇单元数为2-6个聚乙二醇类链。
进一步地，所述炔基修饰的二溴代马来酰亚胺具有如式(IV)所示的结构：
进一步地，所述巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺与炔基修饰的二溴代马来酰亚胺的摩尔比为6∶1-2∶1，优选为2.4∶1。
本发明首次提出一种带有自报告功能的马来酰亚胺二硫醚荧光基团的新型GalNAc载体结构，其解决问题如下：(1)针对偶联物合成繁琐，收率低，纯化难度大的问题，GalNAc-核酸偶联物通过高效的巯基-溴代马来酰亚胺偶联反应、酰胺化反应和CuAAC反应进行构建，从而提高了收率，简化纯化，所得GalNAc-核酸偶联物具有高纯度；(2)针对传统GalNAc-核酸偶联物需要额外引入荧光基团问题，带有马来酰亚胺二硫醚荧光基团的新型GalNAc-核酸偶联物，其自身可以发出荧光。因此，无需额外偶联其他外源性的荧光基团。并且在体外细胞内吞实验时，可以通过荧光共聚焦显微镜直观的观察到细胞对GalNAc-核酸偶联物内吞过程；(3)针对传统带有荧光素GalNAc-核酸偶联物荧光效果差的问题，新型GalNAc-核酸偶联物马来酰亚胺二硫醚荧光基团，其荧光强度和荧光持续时间较常用的荧光素染料更优，因此具有更好的观察效果和更长的观察窗口期；(4)针对传统带有荧光素GalNAc-核酸偶联物荧光稳定性不佳的问题，侧面通过在对于小鼠甲状腺转运蛋白表达基因(mTTR)的沉默效果，新型GalNAc载体结构与Alnylam公司GalNAc载体核心结构相比，具有相同的效果，证明了新型GalNAc-核酸偶联物具有同样的稳定性：(5)针对额外引入荧光基团会因其相互作用引起的荧光淬灭的问题，由于马来酰亚胺二硫醚荧光基团的引入，siRNA无需额外偶联其他荧光基团，因此，避免了荧光基团之间的相互作用引起的荧光淬灭。同时，也降低了偶联物的合成成本。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的自报告荧光团标记的基因递送载体、基因递送体系或双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺在制备基因治疗药物中的用途。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种药物组合物，其包括：前述的基因递送体系以及药学上可接受的载体。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
实施例
(1)巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺(化合物4)合成步骤，其合成路线如下：
化合物2的制备：化合物1(197mg，0.51mmol)和2-溴代乙醇(0.11mL，1.54mmol)溶于3mL无水二氯甲烷中，加入三氟甲磺酸钪(37mg，0.075mmol)，室温搅拌27小时。溶剂蒸干柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶2)得化合物2纯品白色固体(153mg，收率67％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ5.95(d，J＝8.6Hz，1H)，5.52-5.12(m，2H)，4.77(d，J＝8.4Hz，1H)，4.21-4.06(m，3H)，4.00-3.89(m，2H)，3.86-3.75(m，1H)，3.46(dd，J＝9.1，3.7Hz，2H)，2.12(s，3H)，2.02(s，3H)，1.97(s，3H)，1.96(s，3H)；化合物2的核磁共振氢谱如图4所示。
化合物3的制备：化合物2(14.2g，0.043mol)溶于162mL干燥的DMF。随后加入硫代乙酸钾(8.4g0.074mol)，体系加热至45℃反应24小时。TLC显示反应完全，体系收率除去多余硫代乙酸钾，滤饼用3×25mL丙酮洗涤。蒸干柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1到1∶1)得到化合物3油状纯品(11.8g，yield84％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ5.71(d，J＝8.6Hz，1H)，5.47-5.18(m，2H)，4.73(d，J＝8.4Hz，1H)，4.22-4.08(m，2H)，3.97(dq，J＝9.2，6.4Hz，3H)，3.65(dt，J＝10.5，6.7Hz，1H)，3.10(ddd，J＝20.7，13.8，7.4Hz，2H)，2.35(s，3H)，2.15(s，3H)，2.05(s，3H)，2.01(s，3H)，1.99(s，3H)；化合物3的核磁共振氢谱如图5所示。
化合物4的制备：将化合物3(500.0mg，0.69mmol)溶于15mL无水甲醇中，加入甲醇钠(225.0mg，4.16mmol)，氩气保护，室温搅拌3小时，TLC显示反应完全。随后加入Dowex树脂搅拌0.5小时，抽滤，滤饼用甲醇洗涤。滤液蒸干得到化合物4纯品发泡状固体(250.0mg，80％)。化合物4的核磁共振氢谱如图6所示。
(2)双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺(2Gal-DTM-alkyne)合成步骤，其合成路线如下：
2Gal-DTM-alkyne的制备：化合物5(585.8mg，2.0mmol)溶于15.0mL无水甲醇中，加入醋酸钠(656.2mg，8.0mmol)，降温至0℃，加入化合物4(1.35g，4.8mmol)，升至室温搅拌12小时。TLC显示反应完全，蒸干柱层析(水∶乙腈＝1∶8)得到2Gal-DTM-alkyne纯品黄色固体(1.2g，yield87.0％)。1H NMR(300MHz，DMSO)δ7.66(t，J＝14.0Hz，2H)，4.55(s，4H)，4.35-4.16(m，5H)，3.96-3.80(m，3H)，3.83-3.59(m，7H)，3.56-3.47(m，6H)，2.94(s，1H)，1.95-1.71(m，6H)；2Gal-DTM-alkyne的核磁共振氢谱如图7所示。
(3)Oligo-2NH2的合成步骤，其合成路线如图8所示：
将5个当量活化酯(2NH2-NHS ester)溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入到氨基修饰的核酸(Oligo-NH2，如表1和图9中A，图9中B)的PBS溶液中，超声和涡旋振荡器混匀至完全溶解，4℃下反应16小时后进行检测，随后浓缩抽干后加入1ml氨水25℃反应16小时后，进行HPLC纯化得到Oligo-2NH2，两步收率82％，其纯度和结构通过高效液相色谱(HPLC)和质谱进行表征(图9中C和图9中D)。
表1.本发明示例所用到的核酸序列
其中，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2′-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2′-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接。
(4)Oligo-2N3合成步骤，其合成路线如图10所示：
将5个当量N3-NHS Ester溶解在无水DMF中，然后将溶解好的活化酯加入到核酸Oligo-2NH2的PBS溶解中，超声和涡旋振荡器混匀至完全溶解，25℃下反应16小时后进行HPLC纯化得到Oligo-2N3，收率87％，其纯度和结构通过高效液相色谱(HPLC)和质谱进行表征(图11A和11B)。
(5)新型GalNAc-核酸偶联物(DTM-GalNAc Conjugate)合成步骤，其合成路线如图12所示：
将Oligo-2N3用PBS溶解；将5个当量2Gal-DTM-Alkyne用无水DMF溶解并加入上述Oligo-2N3溶液中，涡旋震荡5分钟。随后将混合物(五甲基二乙烯三胺(PMDETA)：CuBr＝10∶1)加入上述溶液中，涡旋震荡5分钟，再加入维生素C钠，25℃反应10小时后进行HPLC纯化得到Gal-DTM-oligomer，收率75％，其纯度和结构通过高效液相色谱(HPLC)和质谱进行表征(图13A和图13B)，随后通过和反应链(1：1)在90℃退火得到偶联物DTM-GalNAc Conjugate，用于后续的基因沉默实验。
(6)基因沉默实验(与L96相比较)，其实验步骤如下：
实验第一天分离小鼠原代肝细胞，用8000细胞每孔在96孔板中进行转染。转染组选择了最高浓度0.1nM开始10倍稀释共3个浓度作为质控。转染结束后放入细胞培养箱培养。转染24小时后用加入RNA酶抑制剂的细胞裂解液收样并抽提RNA。后续使用试剂盒去除基因组DNA和逆转录。将得到的cDNA稀释后，进行荧光定量PCR检测，获得每孔的读数后，将数据导出并计算各个样本的剩余抑制效率(使用GraphPad Prism7绘图总结)。同时，通过荧光共聚焦显微镜对细胞内吞荧光现象进行观察，与相同序列L96-核酸荧光素偶联物(GalNAc-L96 FAM)进行了比较(图14C)。
实验现象和结果显示，通过在对于小鼠甲状腺转运蛋白表达基因(mTTR)的沉默效果，新型GalNAc载体结构与Alnylam公司GalNAc载体核心结构相比，具有相同的效果，证明了新型GalNAc-核酸偶联物具有同样的稳定性(图14A和14B)。带有马来酰亚胺二硫醚荧光基团的新型GalNAc-核酸偶联物，其自身可以发出荧光。因此，无需额外偶联其他外源性的荧光基团，并且在体外细胞内吞实验时，可以通过荧光共聚焦显微镜直观的观察到细胞对GalNAc-核酸偶联物内吞过程。同时，新型GalNAc-核酸偶联物马来酰亚胺二硫醚荧光基团，其荧光强度和荧光持续时间较常用的荧光素染料更优，因此具有更好的观察效果和更长的观察窗口期(图14C)。
图14A中结合物摄取到原代小鼠肝细胞。用10nM siRNA孵育野生型小鼠肝脏新鲜分离的肝细胞；图14B转染后TTR基因沉默24小时，收集样品，用添加RNase抑制剂的细胞裂解液提取RNA。然后使用试剂盒去除基因组DNA并进行逆转录。将得到的cDNA进行稀释，荧光定量PCR检测。图14C用FAM标记的反义GalNAc-L96-siRNA偶联物(黄色)和无标记的DTM-GalNAc-siRNA偶联物(黄色)在寡核苷酸浓度为2μm、37℃下孵育2小时的肝细胞CLSM图像(比例尺：20μm)。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
应当理解，本发明的技术方案不限于上述具体实施案例的限制，凡是在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种自报告荧光团标记的基因递送载体，其特征在于，所述基因递送载体具有如式(I)所示的结构：
其中，R1、R3、R4独立地选自碳链长度2-10的烷基链或乙二醇单元数为2-6个聚乙二醇类链。
2.一种基因递送体系，其特征在于，包括权利要求1所述的基因递送载体以及与所述基因递送载体共价连接的核酸分子；所述基因递送体系具有下式(II)所示结构：
其中，R1、R3、R4独立地选自碳链长度2-10的烷基链或乙二醇单元数为2-6个聚乙二醇类链，·为所述核酸分子。
3.如权利要求2所述的基因递送体系的制备方法，其特征在于，包括：
使巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺与炔基修饰的二溴代马来酰亚胺发生巯基-马来酰亚胺反应，制得双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺；
以及，将氨基修饰的核酸单链进行两次酰胺化反应，并与所述双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺发生叠氮-炔基环加成反应，然后与所述核酸单链的互补链杂交，制得所述基因递送体系。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体包括：使包含巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺、炔基修饰的二溴代马来酰亚胺和第一溶剂的第一混合反应体系于室温反应，制得所述双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺；
优选的，所述巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺具有如式(III)所示的结构：
其中，R1选自碳链长度2-10的烷基链或乙二醇单元数为2-6个聚乙二醇类链；
优选的，所述炔基修饰的二溴代马来酰亚胺具有如式(IV)所示的结构：
优选的，所述双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺具有如式(V)所示的结构：
其中，R1选自碳链长度2-10的烷基链或乙二醇单元数为2-6个聚乙二醇类链；
优选的，所述巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺与炔基修饰的二溴代马来酰亚胺的摩尔比为6∶1-2∶1。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体包括：
将氨基修饰的核酸单链进行两次酰胺化反应，获得含叠氮基的核酸单链；
使所述含叠氮基的核酸单链与双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺于20～35℃发生叠氮-炔基环加成反应，之后与所述核酸单链的互补链于70～90℃退火杂交，制得所述基因递送体系；
优选的，所述氨基修饰的核酸单链与双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺的摩尔比为6∶1-2∶1。
6.一种双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺，其特征在于，所述双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺具有如式(v)所示的结构：
其中，R1选自碳链长度2-10的烷基链或乙二醇单元数为2-6个聚乙二醇类链。
7.如权利要求6所述的双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺的制备方法，其特征在于，包括：
使巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺与炔基修饰的二溴代马来酰亚胺发生巯基-马来酰亚胺反应，制得双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，具体包括：使包含巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺、炔基修饰的二溴代马来酰亚胺和第一溶剂的第一混合反应体系于室温反应，制得所述双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺；
优选的，所述巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺具有如式(III)所示的结构：
其中，R1选自碳链长度2-10的烷基链或乙二醇单元数为2-6个聚乙二醇类链；
优选的，所述炔基修饰的二溴代马来酰亚胺具有如式(IV)所示的结构：
优选的，所述巯基修饰的N-乙酰半乳糖胺与炔基修饰的二溴代马来酰亚胺的摩尔比为6∶1-2∶1。
9.权利要求1所述的自报告荧光团标记的基因递送载体、权利要求2所述的基因递送体系或权利要求6所述的双巯基-马来酰亚胺N-乙酰半乳糖胺在制备基因治疗药物中的用途。
10.一种药物组合物，其特征在于，包括：权利要求2所述的基因递送体系以及药学上可接受的载体。
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