CN116837043A - 一种还原胺化酶在不对称合成手性胺中的应用 - Google Patents

一种还原胺化酶在不对称合成手性胺中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种还原胺化酶在不对称合成手性胺中的应用。本发明还原胺化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，来源于Frankiasp.QA3。本发明提供的还原胺化酶作为催化剂可以通过动态动力学拆分(DKR)实现手性胺N‑取代β‑氨基酯的合成，且得到的产物光学纯度高(ee值达99％以上)，反应条件温和，低能耗，环境友好，副反应少，仅需一步还原胺化即可完成，且操作简单，易于工业放大。因此，本发明所述还原胺化酶在不对称合成手性胺中具有很好的工业应用开发前景。

Description

一种还原胺化酶在不对称合成手性胺中的应用
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，尤其是指一种还原胺化酶在不对称合成手性胺中的应用。
背景技术
手性胺是一类非常重要的手性合成砌块和手性拆分试剂，广泛用于天然产物、医药、农药、香精香料等精细化学品的合成，比如用于合成抗过敏药-左旋西替利嗪(适用范围最广、起效剂量低、可用于孕妇)，用于治疗阿尔兹海默症药-卡巴拉汀，抗消炎药物-加雷沙星，抗毒蕈碱类泌尿解痉药-素立芬新，抗心律失常和抗肿瘤药物等。
目前合成手性胺的方法主要有物理和化学合成方法，但是这些方法存在反应条件苛刻，反应时间长，危害环境、产品光学纯度低等问题。而生物催化技术具有环境友好、催化效率高、选择性好等绿色生物制造的典型特征，已发展成为医药化工领域替代或拓展传统化学合成的首要选择。目前已经建立的生物催化法合成手性胺的工艺主要有利用氧化酶氧化拆分(理论收率50％)，转胺酶催化转胺反应(原子利用率低、限于合成伯胺)，以及氨脱氢酶催化还原胺化(催化效率低)。
近年来报道了一种还原胺化酶(RedAms)，它是一类NADPH依赖性的氧化还原酶，是亚胺还原酶的一个子类，还原胺化酶可以催化潜手性酮或醛与游离胺或者有机胺形成亚胺中间体，进而将其还原成高对映选择性的手性胺，具有100％理论转化率、立体选择性高。手性胺中间体的绿色高效生物合成已成为全球各大医药化工企业战略争夺的热点，而还原胺化酶催化的不对称还原胺化被认为最理想的手性胺合成途径。
2017年，TurnerNJ教授发现了来源于米曲霉的NADPH依赖型还原胺化酶(AspRedAm，登录号Q2TW47)，采用该酶的Q240A突变体，实现了雷沙吉兰手性中间体的克级制备，总转化数为32000，时空产率为3.73g·L–1·d–1。2021年，辉瑞公司利用工程酶SpRedAm成功地实现了JAK1抑制剂阿布西替尼中间体商业化规模制备，时空产率高达60g·L–1·d–1，dr>99:1，ee>99％。2022年，天津工生所孙周通等基于亚胺还原酶的晶体结构对IR-G36进行设计改造，实现烷基化氮杂环手性胺的高效合成，在24.9·g·L–1底物浓度下，转化率达到97％。时空产率达到35.5g·L–1·d–1。同年，王斌贵、高书山、崔成森研究员团队合作，利用IR-G02催化苯丙醛与1-萘乙胺外消旋体进行还原胺化制备级反应，通过动力学拆分合成西那卡塞类似物，转化率达到48％，ee>99％，时空产率高达18.1g·L–1·d–1。2023年，许建和团队报道了一种PcIRED可催化一系列羰基化合物和广泛的具有大位阻胺类亲核物的还原偶联，实现了制备级生物催化合成西那卡塞。
上述报道显示还原胺化酶是制备N-取代-α/δ-氨基酯和γ-内酰胺的有效催化剂。然而，利用还原胺化酶对N-取代β-氨基酯的合成目前仅有少量文献报道且具有较低的非对映体选择性。N-取代的β-氨基酯衍生物是合成抗真菌药物和生物碱的重要手性合成砌块，具有重要的药用价值。由于酮烯醇互变异构，β-酮酯的α位置在含水介质中容易外消旋，还原胺化酶可以通过动态动力学拆分(DKR)催化β-酮酯与不同胺供体实现N-取代β-氨基酯的合成，可实现100％的理论转化率。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种还原胺化酶在不对称合成手性胺中的应用，具体为一种还原胺化酶在不对称合成手性胺N-取代β-氨基酯中的应用。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明第一个目的是提供一种还原胺化酶在不对称合成手性胺中的应用，所述还原胺化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一个实施例中，所述还原胺化酶来源于Frankia sp.QA3。
在本发明的一个实施例中，所述手性胺为N-取代β-氨基酯；所述N-取代β-氨基酯为(1S，2R)-2-(环丙氨基)环己烷-1-羧酸乙酯、(1S，2R)-2-(环丙氨基)环戊烷-1-羧酸乙酯，R-3-(环丙氨基)丁酸乙酯和R-3-(环丙基氨基)-4-苯基丁酸乙酯中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，所述应用的方法是以β-酮酯类化合物为底物，以还原胺化酶为催化剂催化生成手性胺。
在本发明的一个实施例中，所述β-酮酯类化合物为环己酮甲酸乙酯、环戊酮甲酸乙酯、乙酰乙酸乙酯和3氧-4-苯基丁酸乙酯中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，所述β-酮酯类化合物的添加量为10mmo1/L～200mmo1/L。
在本发明的一个实施例中，所述还原胺化酶的添加量为1kU/L～10kU/L。
在本发明的一个实施例中，所述应用的方法是在pH为7-8.5的缓冲液中，在胺基供体和NADP+存在的条件下催化底物β-酮酯类化合物合成手性胺。
在本发明的一个实施例中，所述胺基供体为环丙胺、炔丙胺、烯丙胺和丙胺中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中，所述NADP+的用量为0.1mmol/L～1.0mmol/L。
在本发明的一个实施例中，所述催化的条件为：20℃-35℃反应1h-24h。
在本发明的一个实施例中，编码所述的还原胺化酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。所述的还原胺化酶的编码基因来源于弗兰克氏菌(Frankia sp.QA3)，命名为FsRA29，基因全长909bp，其编码碱基序列(CDS)从第一个碱基起至第909个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，序列内无内含子。
在本发明的一个实施例中，将编码所述还原胺化酶的核酸分子克隆到重组载体中，将所得的重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，经镍柱亲和层析分离纯化获得所述蛋白。
在本发明的一个实施例中，表达载体可通过本领域常规方法将上述还原胺化酶基因克隆到各种表达载体上构建而成。所述的表达载体较佳地包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，所述载体优选地为pET28a质粒。
本发明提供一种表达所述的还原胺化酶的重组菌。重组菌是通过将上述表达载体转化至宿主细胞中制备得到，宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，并且其所携带的还原胺化酶基因可被有效表达即可。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选地为：大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)或大肠埃希氏菌E.coliDH5α。
本发明提供一种利用所述的重组菌制备还原胺化酶的方法，包括如下步骤：将所述的重组细胞接种至含有卡那霉素的LB培养基中，37℃，150rpm～200rpm培养，培养液的吸光密度OD6oo达到0.6～0.8，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷进行诱导，诱导温度为16℃，诱导12小时～16小时得到还原胺化酶。
在本发明的一个实施例中，NADPH采用葡萄糖脱氢酶和葡萄糖反应提供,葡萄糖脱氢酶的用量为1kU/L～10kU/L；葡萄糖的用量为50mmol/L～400mmol/L。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明提供的还原胺化酶FsRA29具有表达水平高、酶活力高等优点，可用于高效制备(1S，2R)-2-(环丙氨基)环己烷-1-羧酸乙酯等目前生物催化难以制备的手性胺N-取代β-氨基酯，经济性高，制备方法简单，反应条件温和，低耗能，对环境友好，副反应少，且只需一步还原即可完成。因此，本发明所述还原胺化酶及其基因具有很好的工业应用开发前景。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明实施例3中还原胺化酶FsRA29的蛋白电泳图，其中，M，Marker；泳道1和2分别为大肠杆菌BL21(DE3)/PET28a-FsRA29诱导后细胞破碎上清和沉淀部分。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有注明具体条件，各实施例中的试验方法均按照常规方法和条件或按照试剂说明书进行。除非另有明确标注，各组分的含量均以质量/体积(w/v)含量表示。表达质粒pET28a购于上海Novagen公司；限制性内切酶、PrimeSTAR和T4 DNA连接酶购于大连宝生物有限公司；E.coliBL21(DE3)感受态细胞、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、细菌基因组提取试剂盒均购自上海捷瑞生物工程有限公司。
实施例1：还原胺化酶基因的克隆。
根据Genebank收录的预测为还原胺化酶的蛋白菌(Frankia sp.QA3)基因序列为依据，设计PCR引物如下：
上游引物的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)如下所示：
5'-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGACTTCACACCCACCTGCTGTAACC-3'
下游引物的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)如下所示：
5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGACGGTTGTGTTCATCTCCCTCGGG-3'；
其中，上游引物核苷酸序列的下划线部分为NdeI酶切位点，下游引物核苷酸序列的下划线部分为XhoI酶切位点。
以蛋白菌Frankia sp.QA3的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×TaqPCR MasterMix 10μL，上游引物和下游引物各1μL(0.3μmol/L)，DNA模板1μL(0.1μg)和ddH2O 7μL。PCR扩增程序为：(1)95℃，预变性3min；(2)94℃，变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30个循环；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。获得一条完整的还原胺化酶全长基因序列，经DNA测序，全长909bp，命名为FsRA29。所述基因核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2：还原胺化酶重组质粒和重组表达转化体的制备。
将实施例1所得的还原胺化酶基因DNA片段及pET28a空质粒在37℃用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切2h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，在4℃下连接过夜得到重组表达质粒pET28a-FsRA29。
将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌E coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-FsRA29，菌落PCR和基因测序验证阳性克隆。
实施例3：还原胺化酶的表达。
将实施例2所得的重组大肠杆菌，接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，16℃诱导18h后，4℃、8000r/min离心10min收集菌体。将收集好的菌体悬浮于磷酸钠缓冲液(100mM，pH 7.0)中，超声破碎，得到FsRA29粗酶液，并通过SDS-PAGE分析蛋白的表达情况(图1)。由图1可知，上清液中目标位置有蛋白可溶高表达，说明重组还原胺化酶在大肠杆菌中得到成功表达。
实施例4：还原胺化酶和葡萄糖脱氢酶酶活力的测定。
通过检测340nm处吸光值变化的方式，利用酶标仪测定还原胺化酶和葡萄糖脱氢酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)的活力。还原胺化酶活力测定方法如下：于200μL反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0)中，加入终浓度5mmol/L环己酮乙酸乙酯，20mM环丙胺，1mmol/LNADPH，加入适量实施例3制备的粗酶液，迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化。葡萄糖脱氢酶活力测定方法如下：于200μL反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0)中，加入50mmol/L葡萄糖，1mmol/LNADP+，加入适量葡萄糖脱氢酶，迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化。还原胺化酶活力测定根据NADPH的减少来计算。酶活力单位(U)定义为在测活条件下每分钟催化氧化1μmol的NADPH所需的酶量。
通过以上方法可以得出，本发明使用的还原胺化酶和葡萄糖脱氢酶酶的活力为0.5U/mg、5U/mg。
实施例5-8：还原胺化酶催化环己酮甲酸乙酯的还原胺化反应。
在20mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中加入实施例3制备的FsRA29粗酶液和葡萄糖脱氢酶粗酶液，重组还原胺化酶的用量为100U/L(酶活力定义见实施例4)，葡萄糖脱氢酶用量为100U/L，环己酮乙酸乙酯终浓度为10mM，胺供体终浓度为20mM，NADP+终浓度为0.5mM，葡萄糖终浓度为50mM。反应都在30℃下进行，反应24h。
转化率及选择性分析如下：取500μL反应液，加入100μL1MNa2CO3碱化，加入500μL乙酸乙酯，震荡1min，12000rpm离心5min，取上层有机相到新的离心管，加入无水Na2SO4干燥，随后使用气相色谱仪进行分析。色谱柱为CP7502-Chirasil-DEX CB手性气相柱，以氮气为载气，分流比为1:10，进样口温度为280℃，检测器温度为280℃，柱流速：1.43mL·min–1。升温程序为：柱温80℃保留0min，以5℃·min– 1升温至150℃，保留2min，以10℃·min–1升温至180℃，保留5min。结果如表1所示：
表1FsRA29不对称还原胺化环己酮甲酸乙酯与胺基供体的转化率与选择性分析
由表1可以看出FsRA29可以以不同的胺作为胺基供体实现环己酮甲酸乙酯的还原胺化，并具有较高的转化率与选择性。
实施例9-12：还原胺化酶催化β-酮酯与环丙胺的还原胺化反应。
在50mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中加入实施例3制备的FsRA29粗酶液和葡萄糖脱氢酶粗酶液，重组还原胺化酶的用量为500U/L，葡萄糖脱氢酶用量为500U/L，加入β-酮酯终浓度为50mM，环丙胺终浓度为1M，NADP+终浓度为0.5mM，葡萄糖终浓度为1M。反应都在30℃下进行，通过补充碱液2M NaOH使反应液pH控制在7.5，直至反应完全，即气相检测转化率>99％。结果见表2。反应结束后，将实施例9-12对应的样品用加入4.26g Na2CO3调节反应液pH碱性，加入3×50mL EtoAC萃取三次，4000r离心5min，合并有机相，加入无水Na2SO4过夜干燥后旋蒸至恒重，利用5mL乙醚溶解产物，在加入2mL盐酸乙醚(2M HCl)，得到油状物，继续用3×5mL乙醚洗涤三次，真空浓缩旋蒸除去乙醚，得到盐酸盐形式目的产物，其中产物摩尔收率以及选择性如表2所示：
表2-FsRA29催化β-酮酯与环丙胺的还原胺化反应
由表2可以看出FsRA29可催化不同的β-酮酯分别与环丙胺实现手性胺N-取代β-氨基酯的合成，并具有较高转化率与选择性，说明该还原胺化酶具有广泛的应用价值。
实施例13：还原胺化酶催化环己酮甲酸乙酯与环丙胺的不对称还原胺化反应。
于10mL磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)加入实施例3制备的FsRA29粗酶液10KU/L，加入终浓度200mM环己酮甲酸乙酯(溶于DMSO)，在30℃下通过补充碱液2M NaOH使反应液pH控制在7.5。每隔一段时间进行取样，100μL反应液加入900μL乙酸乙酯，加200μL，1M Na2CO3碱化，12000rpm，离心5min，取出上层有机相，干燥后进行GC分析。由表3可以看出反应24h后，转化率达到97％，产物ee值都保持在99％。
表3:重组还原胺化酶FsRA29催化环己酮甲酸乙酯与环丙胺还原胺化进程表
实施例14：产物的提取及核磁鉴定
反应结束后，将实施例13对应的样品用加入4.26g Na2CO3调节反应液pH碱性，加入3×50mL EtoAC萃取三次，4000rpm离心5min，合并有机相，加入无水Na2SO4过夜干燥后旋蒸至恒重，利用5mL乙醚溶解产物，再加入2mL盐酸乙醚(2M HCl)，得到油状物，继续用3×5mL乙醚洗涤三次，真空浓缩旋蒸除去乙醚，得到(1S，2R)-2-(环丙氨基)环己烷-1-羧酸乙酯盐酸盐形式产物，通过气相色谱鉴定纯度，随后取部分样品溶于氘代甲醇，通过核磁共振分析进行结构鉴定。核磁结果：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ4.24–4.04(m,2H),3.41–3.28(m,1H),3.22(s,1H),2.70(ddd,J＝11.7,6.9,4.6Hz,1H),2.25–2.13(m,1H),1.93(ddd,J＝15.8,8.0,5.3Hz,1H),1.76(tdq,J＝11.7,7.3,4.0Hz,2H),1.64–1.44(m,2H),1.42–1.26(m,1H),1.18(t,J＝7.1Hz,3H),1.06(t,J＝7.0Hz,1H),0.87–0.74(m,4H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ174.07,62.42,60.29,42.05,29.80,28.44,26.81,25.15,22.90,14.44,4.28,4.08。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种还原胺化酶在不对称合成手性胺中的应用，其特征在于，所述还原胺化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述还原胺化酶来源于Frankia sp.QA3。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用的方法是以β-酮酯类化合物为底物，以还原胺化酶为催化剂催化生成手性胺。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述β-酮酯类化合物为环己酮甲酸乙酯、环戊酮甲酸乙酯、乙酰乙酸乙酯和3氧-4-苯基丁酸乙酯中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述β-酮酯类化合物的添加量为10mmo1/L～200mmo1/L。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述还原胺化酶的添加量为1kU/L～10kU/L。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用的方法是在pH为7-8.5的缓冲液中，在胺基供体和NADP+存在的条件下催化底物β-酮酯类化合物合成手性胺。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述胺基供体为环丙胺、炔丙胺、烯丙胺和丙胺中的一种或多种。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述NADP+的用量为0.1mmol/L～1.0mmol/L。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述催化的条件为：20℃-35℃反应1h-24h。
CN202310860051.0A 2023-07-13 2023-07-13 一种还原胺化酶在不对称合成手性胺中的应用 Pending CN116837043A (zh)

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