CN116831993A - 抗菌蛋白的冷冻干燥制剂 - Google Patents

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Abstract

一种冷冻干燥的制剂包括具有对以下属中的至少一种或全部具有特异性的杀灭活性的抗菌蛋白：阿尔莱葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊葡萄球菌、产色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、路邓葡萄球菌、蝇葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌；泊洛沙姆；糖；和氨基酸。

Description

抗菌蛋白的冷冻干燥制剂
相关申请案
本申请要求于2016年1月12日提交的美国临时申请号62/277,588的权益，所述申请出于所有目的通过引用并入本文，如同在本文完全阐述一样。
技术领域
本发明涉及抗菌蛋白、具体来说对以下属中的至少一种或全部具有特异性的抗菌蛋白的冷冻干燥制剂：阿尔莱葡萄球菌(Staphylococcus arlettae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耳葡萄球菌(Staphylococcus auricularis)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、山羊葡萄球菌(Staphylococcus carprae)、产色葡萄球菌(Staphylococcus chromogenes)、科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)、海豚葡萄球菌(Staphylococcus delphini)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)、鸡葡萄球菌(Staphylococcus gallinarum)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus hemolyticus)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、中间葡萄球菌(Staphylococcus intermedius)、克氏葡萄球菌(Staphylococcus kloosii)、缓慢葡萄球菌(Staphylococcus lentus)、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、蝇葡萄球菌(Staphylococcus muscae)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)、腐生性葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、瓦氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)和木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)。
背景技术
噬菌体(bacteriophage)是感染细菌的多种病毒样微生物中的任一种，并且这个术语通常以其缩写形式“噬菌体(phage)”使用。分离出具有对金黄色葡萄球菌具有特异性的杀灭活性的噬菌体，并于2006年6月14日将其保藏于韩国农业培养物保藏所(KACC)、国立农业生物技术研究所(NIAB)(登记号：KACC 97001P)。尽管这种噬菌体可有效预防和治疗金黄色葡萄球菌感染，但这种噬菌体的使用有一些缺陷。
从这种噬菌体衍生出具有针对金黄色葡萄球菌的杀灭活性的抗菌蛋白，并且所述抗菌蛋白可用于预防和治疗由金黄色葡萄球菌引起的疾病。参见美国专利号8,232,370。
此外，这种抗菌蛋白展现对所有以下属具有特异性的抗菌活性：阿尔莱葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊葡萄球菌、产色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、路邓葡萄球菌、蝇葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌。
当制备包含抗菌蛋白的药物组合物时，必须以抗菌蛋白的活性维持适当时间段的方式配制组合物。抗菌蛋白的活性或稳定性损失可由蛋白质的化学或物理不稳定性导致，例如，由于变性、聚集或氧化。因此，组合物可为药学上不可接受的。已知使用赋形剂可增加生物活性蛋白质的稳定性，但这些赋形剂的稳定效应是不可预测的并且高度依赖于生物活性蛋白质和赋形剂的性质。
仍然需要含有抗菌蛋白作为活性成分的制剂，并且所述制剂在适当的时间段内稳定并适于注射。制剂可用于施用以治疗由细菌感染引起的疾病。
发明内容
本发明提供冷冻干燥制剂，其包括具有对以下属中的至少一种或全部具有特异性的杀灭活性的抗菌蛋白：阿尔莱葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊葡萄球菌、产色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、路邓葡萄球菌、蝇葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌；泊洛沙姆；糖；和氨基酸。
在一方面，冷冻干燥之前的溶液中抗菌蛋白的浓度为约0.1mg/mL至约30mg/mL。
在另一方面，抗菌蛋白由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。
在另一方面，抗菌蛋白由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
在另一方面，抗菌蛋白是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的第一抗菌蛋白和由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的第二抗菌蛋白的混合物。
在另一方面，抗菌蛋白包括15-35摩尔％的第一抗菌蛋白以及65-85摩尔％的第二抗菌蛋白。
在另一方面，抗菌蛋白包括25摩尔％的第一抗菌蛋白以及75摩尔％的第二抗菌蛋白。
在另一方面，冷冻干燥之前的溶液中的泊洛沙姆的浓度为约0.1g/L至约10g/L。
在另一方面，泊洛沙姆为泊洛沙姆188。
在另一方面，糖为D-山梨醇。
在另一方面，冷冻干燥之前的溶液中的糖的浓度为约1g/L至约600g/L。
在另一方面，氨基酸为L-组氨酸。
在另一方面，冷冻干燥之前的溶液中的氨基酸的浓度为约0.1g/L至约10g/L。
本发明提供抗菌制剂，其包括具有对以下属中的至少一种或全部具有特异性的杀灭活性的抗菌蛋白：阿尔莱葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊葡萄球菌、产色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、路邓葡萄球菌、蝇葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌；泊洛沙姆；糖；氨基酸和水。抗菌蛋白由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，并且抗菌蛋白的浓度为约0.1mg/mL至约30mg/mL。
本发明提供抗菌制剂，其包括具有对以下属中的至少一种或全部具有特异性的杀灭活性的抗菌蛋白：阿尔莱葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊葡萄球菌、产色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、路邓葡萄球菌、蝇葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌；泊洛沙姆；糖；氨基酸；和水。抗菌蛋白由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成，并且抗菌蛋白的浓度为约0.1mg/mL至约30mg/mL。
本发明提供抗菌制剂，其包括具有对以下属中的至少一种或全部具有特异性的杀灭活性的抗菌蛋白：阿尔莱葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊葡萄球菌、产色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、路邓葡萄球菌、蝇葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌；泊洛沙姆；糖；氨基酸；和水。抗菌蛋白包括由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的第一抗菌蛋白和由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的第二抗菌蛋白，并且抗菌蛋白的浓度为约0.1mg/mL至约30mg/mL。
在一方面，抗菌蛋白包括15-35摩尔％的第一抗菌蛋白以及65-85摩尔％的第二抗菌蛋白。
在另一方面，抗菌蛋白包括25摩尔％的第一抗菌蛋白以及75摩尔％的第二抗菌蛋白。
在另一方面，泊洛沙姆为泊洛沙姆188。
在另一方面，泊洛沙姆的浓度为约0.1g/L至约10g/L。
在另一方面，糖为D-山梨醇。
在另一方面，糖的浓度为约1g/L至约600g/L。
在另一方面，氨基酸为L-组氨酸。
在另一方面，氨基酸的浓度为约0.1g/L至约10g/L。
本申请提供制造冷冻干燥制剂的方法，其包括形成由以下组成的混合物：具有对以下属中的至少一种或全部具有特异性的杀灭活性的抗菌蛋白：阿尔莱葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊葡萄球菌、产色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、路邓葡萄球菌、蝇葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌；泊洛沙姆；糖；和氨基酸，以及使所述混合物经受冻干。
在一方面，冻干之前的混合物中的抗菌蛋白的浓度为约0.1mg/mL至约30mg/mL。
在另一方面，抗菌蛋白由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。
在另一方面，抗菌蛋白由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
在另一方面，抗菌蛋白是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的第一抗菌蛋白和由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的第二抗菌蛋白的混合物。
在另一方面，抗菌蛋白包括15-35摩尔％的第一抗菌蛋白以及65-85摩尔％的第二抗菌蛋白。
在另一方面，抗菌蛋白包括25摩尔％的第一抗菌蛋白以及75摩尔％的第二抗菌蛋白。
在另一方面，冻干之前的混合物中的泊洛沙姆的浓度为约0.1g/L至约10g/L。
在另一方面，泊洛沙姆为泊洛沙姆188。
在另一方面，糖为D-山梨醇。
在另一方面，冻干之前的混合物中的糖的浓度为约1g/L至约600g/L。
在另一方面，氨基酸为L-组氨酸。
在另一方面，冻干之前的混合物中的氨基酸的浓度为约0.1g/L至约10g/L。
应理解，前述一般描述和以下详细描述两者都是例示性和解释性的且打算提供对所要求保护的本发明技术的进一步解释。
附图说明
包括用于提供对本发明的进一步理解并纳入本说明书中并构成本说明书的一部分的附图图解说明了本发明的实施方案，并且与描述一起用于解释本发明的原理。
在图式中：
图1是在零时分析的冷冻干燥制剂的尺寸排除高效液相色谱的结果。
图2是在存储1个月后分析的冷冻干燥制剂的尺寸排除高效液相色谱的结果。
图3是在存储6个月后分析的冷冻干燥制剂的尺寸排除高效液相色谱的结果。
具体实施方式
现在将详细参考本发明的实施方案，在附图中图解说明这些实施方案的实例。
如本文所用的“以下葡萄球菌属中的至少一种或全部”意指任一种、两种、三种、四种、五种、六种至高达二十二种选自由以下各项组成的组的葡萄球菌属：阿尔莱葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊葡萄球菌、产色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、路邓葡萄球菌、蝇葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌。
已知蛋白质在水性状态下相对不稳定，并经历化学和物理降解，从而导致在加工和存储期间损失生物活性。冷冻干燥(也称为冻干)一种保藏蛋白质用于存储的方法。
冷冻干燥制剂包括具有对以下属中的至少一种或全部具有特异性的杀灭活性的抗菌蛋白：阿尔莱葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊葡萄球菌、产色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、路邓葡萄球菌、蝇葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌；泊洛沙姆；糖；和氨基酸。
制造冷冻干燥制剂的方法包括形成由以下组成的混合物：具有对以下属中的至少一种或全部具有特异性的杀灭活性的抗菌蛋白：阿尔莱葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊葡萄球菌、产色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、路邓葡萄球菌、蝇葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌；泊洛沙姆；糖；和氨基酸，以及使所述混合物经受冻干。
冷冻干燥之前的溶液中的抗菌蛋白的浓度可以为约0.1mg/mL至约30mg/mL、0.1mg/mL至30mg/mL、0.5mg/mL至30mg/mL、1.0mg/mL至30mg/mL、1.5mg/mL至30mg/mL、5mg/mL至30mg/mL、0.1mg/mL至25mg/mL、0.1mg/mL至20mg/mL、0.5mg/mL至25mg/mL、0.5mg/mL至20mg/mL或1.0mg/mL至20mg/mL。
抗菌蛋白由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成，或是由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的第一抗菌蛋白和由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的第二抗菌蛋白的混合物。
当抗菌蛋白是第一抗菌蛋白和第二抗菌蛋白的混合物时，抗菌蛋白可包括15-35摩尔％的第一抗菌蛋白以及65-85摩尔％的第二抗菌蛋白。举例来说，抗菌蛋白包括15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35摩尔％的第一抗菌蛋白，以及65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85摩尔％的第二抗菌蛋白。
泊洛沙姆是由聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链和聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两条亲水链构成的单体三嵌段共聚物。冷冻干燥之前的溶液中的泊洛沙姆的浓度可以为约0.1g/L至约10g/L、0.1g/L至10g/L、0.2g/L至10g/L、0.1g/L至8g/L、0.2g/L至8g/L、0.1g/L至6g/L或0.2g/L至6g/L。优选地，泊洛沙姆为泊洛沙姆188。
冷冻干燥制剂中所用的优选的糖是(例如)D-山梨醇、蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、甘油、乙二醇、甘露醇、木糖醇和肌醇。更优选地，糖为D-山梨醇。冷冻干燥之前的溶液中的糖的浓度可以为约1g/L至约600g/L、1g/L至600g/L、5g/L至600g/L、1g/L至500g/L、5g/L至500g/L、1g/L至400g/L或5g/L至400g/L。
冷冻干燥制剂中所用的优选的氨基酸是(例如)L-组氨酸、L-甘氨酸和L-精氨酸。更优选地，氨基酸为L-组氨酸。冷冻干燥之前的溶液中的氨基酸的浓度可以为约0.1g/L至约10g/L、0.1g/L至10g/L、0.5g/L至10g/L、0.1g/L至8g/L、0.5g/L至8g/L、0.1g/L至6g/L或0.5g/L至6g/L。
抗菌制剂包括具有对以下属中的至少一种或全部具有特异性的杀灭活性的抗菌蛋白：阿尔莱葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊葡萄球菌、产色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、路邓葡萄球菌、蝇葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌；泊洛沙姆；糖；氨基酸；和水。抗菌蛋白由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成，由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成，或包括由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的第一抗菌蛋白和由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的第二抗菌蛋白。
抗菌制剂中的抗菌蛋白的浓度可以为约0.1mg/mL至约30mg/mL、0.1mg/mL至30mg/mL、0.5mg/mL至30mg/mL、1.0mg/mL至30mg/mL、1.5mg/mL至30mg/mL、5mg/mL至30mg/mL、0.1mg/mL至25mg/mL、0.1mg/mL至20mg/mL、0.5mg/mL至25mg/mL、0.5mg/mL至20mg/mL或1.0mg/mL至20mg/mL。
当抗菌蛋白是第一抗菌蛋白和第二抗菌蛋白的混合物时，抗菌蛋白可包括15-35摩尔％的第一抗菌蛋白以及65-85摩尔％的第二抗菌蛋白。举例来说，抗菌蛋白包括15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35摩尔％的第一抗菌蛋白，以及65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85摩尔％的第二抗菌蛋白。
抗菌制剂中的泊洛沙姆的浓度可以为约0.1g/L至约10g/L、0.1g/L至10g/L、0.2g/L至10g/L、0.1g/L至8g/L、0.2g/L至8g/L、0.1g/L至6g/L或0.2g/L至6g/L。优选地，泊洛沙姆为泊洛沙姆188。
抗菌制剂中所用的优选的糖是(例如)D-山梨醇、蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、甘油、乙二醇、甘露醇、木糖醇和肌醇。抗菌制剂中的糖的浓度可以为约1g/L至约600g/L、1g/L至600g/L、5g/L至600g/L、1g/L至500g/L、5g/L至500g/L、1g/L至400g/L或5g/L至400g/L。
抗菌制剂中所用的优选的氨基酸是(例如)L-组氨酸、L-甘氨酸和L-精氨酸。更优选地，氨基酸为L-组氨酸。抗菌制剂中的氨基酸的浓度可以为约0.1g/L至约10g/L、0.1g/L至10g/L、0.5g/L至10g/L、0.1g/L至8g/L、0.5g/L至8g/L、0.1g/L至6g/L或0.5g/L至6g/L。
制造冷冻干燥制剂的方法包括形成由以下组成的混合物：具有对以下属中的至少一种或全部具有特异性的杀灭活性的抗菌蛋白：阿尔莱葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊葡萄球菌、产色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、路邓葡萄球菌、蝇葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、瓦氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌；泊洛沙姆；糖；和氨基酸，以及使所述混合物经受冻干。
本发明的实用和目前优选的实施方案如以下实施例中所示是说明性的。
然而，应理解，考虑到本公开，所属领域的技术人员可在本发明的精神和范围内进行修改和改善。
实施例1：抗菌蛋白的制备
通过将编码本发明的抗菌蛋白的由SEQ ID NO:3所示的基因常规次克隆到pBAD-TOPO载体(Invitrogen)中来构建本发明的抗菌蛋白的表达质粒。使用利用所得质粒转变的大肠杆菌BL21细胞作为本发明的抗菌蛋白的产生宿主。
用0.2％阿拉伯糖以2.0的600nm下光学密度(OD600)诱导本发明的抗菌蛋白的表达，并且随后将诱导的细菌细胞在19℃下再孵育10小时。通过离心(6,000×g，20分钟)回收细菌细胞，并将所得细胞团粒重新悬浮于溶解缓冲液[50mM Na2HPO4(pH 7.5)、10mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1mM二硫苏糖醇(DTT)]中，并使用常规超声波处理破碎5分钟(1秒脉冲，脉冲之间3秒静止间隔)。在离心(13,000×g，20分钟)后，回收上清液并经受包含离子交换色谱(SP快流柱；GE Healthcare)和疏水相互作用色谱(Toyopearl PPG-600M柱；TosohBioscience)的两步色谱。
为了更具描述性，将制备的产生宿主接种于TSB(胰蛋白酶大豆肉汤)培养基(酪蛋白消化物，17g/L；大豆消化物，3g/L；右旋糖，2.5g/L；NaCl，5g/L；二磷酸钾，2.5g/L)中，并在37℃下进行孵育。当细胞浓度达到2.0的OD600时，添加最终浓度为0.2％的L-阿拉伯糖以诱导抗菌蛋白的表达。从诱导的角度，将细胞在19℃下再培养10小时。将培养肉汤以6,000×g离心20分钟以获得细胞沉淀。将沉淀悬浮于含有10mM EDTA和1mM DTT的50mM Na2HPO4缓冲液(pH 7.5)中(每1g细胞10mL缓冲液)。通过常规超声波使悬浮液中的细胞破碎。将细胞溶解物以13,000×g离心20分钟以去除细胞碎片。使上清液沉淀经受包含以下的两步色谱：离子交换色谱(缓冲液A：25mM Na2HPO4(pH 7.5)、10mM EDTA；缓冲液B：25mM Na2HPO4(pH7.5)、10mM EDTA、1M NaCl；缓冲液C：25mM Na2HPO4(pH 7.5)、10mM EDTA、50mM NaCl、0.5％Triton X-100；程序：样品加载→1.6CV的缓冲液A→30CV的缓冲液C→20CV的缓冲液A→5CV的22％缓冲液B→通过梯度洗脱(20CV的22-100％缓冲液B))以及疏水相互作用色谱(缓冲液A：10mM L-组氨酸(pH 7.5)、1M NaCl；缓冲液B：10mM L-组氨酸(pH 7.5)、1M尿素；程序：样品加载(通过离子交换色谱进行样品纯化)→10CV的缓冲液A→通过梯度洗脱(10CV的0-100％缓冲液B))。然后用0.2μm过滤器过滤蛋白溶液。
为了确定由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的抗菌蛋白的组成，进行两步分析。首先，使用蛋白酶处理的蛋白质样品进行液相色谱(LC)-质谱(MS)。使根据上述程序获得的蛋白溶液通过离心过滤到50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)中经受缓冲液交换并用6M尿素溶液稀释到2.5mg/mL的浓度。使稀释的蛋白溶液经受蛋白酶处理。使用测序级修饰的猪Glu-C蛋白酶(Promega,Madison,WI,USA)作为蛋白酶，并按照制造商的方案进行蛋白酶处理。蛋白酶处理后，使获得的蛋白酶处理的蛋白溶液经受反相HPLC和Q-TOF-MS。通过峰分析，基于估计的蛋白酶消化型式和质量计算鉴别对应于源自由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的抗菌蛋白的MAKTQAE的肽片段以及源自由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的抗菌蛋白的AKTQAE的肽片段的HPLC和MS峰。另外，通过比较使用化学合成的肽(MAKTQAE和AKTQAE)作为样品获得的峰图确认HPLC和MS峰。随后，通过反相HPLC分析利用蛋白酶处理的蛋白样品和化学合成的肽(MAKTQAE和AKTQAE)基于肽浓度与对应于其的峰面积之间的相关性测定抗菌蛋白制剂中由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的抗菌蛋白的组成比率。作为利用三批抗菌蛋白的分析的结果，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的抗菌蛋白的组成比率测定为25、27和29摩尔％。
实施例2：具有冷冻干燥制剂的药物组合物的制备
通过冷冻干燥制备用于治疗葡萄球菌感染的药物组合物，其包含本发明的抗菌蛋白。制备具有以下组成的冷冻干燥制剂：
表1
制造过程包括将实施例1中制备的蛋白溶液缓冲液交换成含有所述成分的缓冲液，浓缩所获得的溶液，调节溶液中的抗菌蛋白的浓度，过滤浓度调节的溶液以及冻干滤出物。
以下给出过程的每个步骤的描述：
使用常规渗滤将实施例1中制备的蛋白溶液缓冲液交换成缓冲液(1.56g/L L-组氨酸(pH 6.0)、50g/L D-山梨醇、1.47g/L CaCl2·2H2O和1g/L泊洛沙姆188)。
使用离心过滤器(10K)浓缩所获得的溶液。
基于通过常规双金鸡宁酸(BCA)测定的蛋白质用缓冲液(1.56g/L L-组氨酸(pH6.0)、50g/L D-山梨醇、1.47g/L CaCl2·2H2O和1g/L泊洛沙姆188)将抗菌蛋白的浓度调节为18mg/mL。
使用0.2-μm过滤器过滤浓度调节的溶液。
在3-mL玻璃小瓶中添加1mL过滤的溶液，并将填充的小瓶放入不锈钢托盘中。
将托盘装入冷冻干燥机并使用以下冷冻干燥循环冻干产物：
在4℃下平衡约20分钟。
使存架温度为-40℃并维持12小时。
使冷凝器温度为-50℃。
对室内施加真空。
当真空达到1,500mtorr的值时，将存架温度提高到-20℃并维持16小时。
以每小时升高10℃的方式将存架温度提高到20℃并维持4小时。
打破真空。
用适当的翻转盖塞住并密封带有塞子的小瓶。
将冷冻干燥制剂在4℃下存储，并且如下所指出测试稳定性和生物活性。在分析组合物之前，使用注射用水(0.92mL)将其重构。使用尺寸排除高效液相色谱(SEC-HPLC)测定稳定性。用BioSepTM-SEC-S 2000柱(Phenomenex,Torrance,CA)进行SEC-HPLC。以1.0mL/min的流速施加移动相(10mM Tris、0.5M NaCl、1M尿素，pH 7.5)。注射50μL样品并通过测量280nm下的吸光度监测样品洗脱达30min。结果示于图1-3中。
使用浊度减少测定来分析生物活性。浊度减少测定如下进行：将样品添加到10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.2)中的金黄色葡萄球菌菌株ATCC 33591(OD600＝0.5)的悬浮液中，最终抗菌蛋白浓度为0.1μg/mL。每30秒记录细菌细胞密度(OD600)的变化，共记录15分钟。从这个实验获得TOD50(活细菌的初始浓度的一半对数下降，以分钟表示)。
表2总结了制剂的稳定性和生物活性相关的分析测试的结果。值是在4个检查点测定的：在零时、存储1个月、3个月和6个月后，存储温度为4℃。在稳定性测试中，零时的完整蛋白量被认为是100％。在生物活性测试中，分析与在零时测定的TOD50值的差异。
表2
稳定性和生物活性
从表2可以推断出，本发明的冷冻干燥制剂的稳定性和生物活性在存储6个月后保存得很好。
实施例3：冷冻干燥制剂与液体制剂的比较
使用实施例2中所用的浊度减少测定比较冷冻干燥制剂与液体制剂的生物活性。使用存储1个月的冷冻干燥制剂作为冷冻干燥制剂。在分析生物活性之前，使用注射用水(0.92mL)将其重建。使用根据实施例2中所描述的程序新鲜制备的过滤溶液作为液体制剂。在这个实验中，使用以下菌株。
表3
测试菌株
在浊度减少测定中，对于以下菌株的所施加的最终抗菌蛋白浓度为0.1μg/mL：金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊葡萄球菌、产色葡萄球菌、海豚葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、克氏葡萄球菌、路邓葡萄球菌、蝇葡萄球菌、腐生性葡萄球菌和木糖葡萄球菌。对于针对阿尔莱葡萄球菌、科氏葡萄球菌、中间葡萄球菌、缓慢葡萄球菌和瓦氏葡萄球菌的测试，所施加的最终抗菌蛋白浓度为0.5μg/mL。对于针对巴氏葡萄球菌的测试，所施加的最终抗菌蛋白浓度为1.0μg/mL。比较两种制剂之间的TOD50值差异。结果提供于表4中。
表4
表4中所示的结果明显指示，本发明的冷冻干燥制剂可以提供与液体制剂极为相似的抗菌活性和有效性。另外，表4中所示的结果显示，本发明的冷冻干燥制剂针对各种葡萄球菌菌株具有快速而有效的杀菌活性。本发明的冷冻干燥制剂的TOD50针对所测试的葡萄球菌菌株几乎不超过20分钟。
同时，检查本发明的冷冻干燥制剂针对非葡萄球菌菌株的抗菌活性。作为非葡萄球菌菌株，测试2株粪肠球菌菌株、3株屎肠球菌菌株、2株草绿色链球菌菌株、1株乳房链球菌菌株、5株大肠杆菌菌株、2株产气荚膜梭菌菌株和3沙门杆菌菌株。因此，本发明的冷冻干燥制剂针对测试的这些非葡萄球菌菌株没有抗菌活性(表5)。这个结果指示，本发明的冷冻干燥制剂的抗菌活性对葡萄球菌具有特异性。
表5
针对非葡萄球菌菌株的抗菌活性
因此，推断出，本发明的冷冻干燥制剂是葡萄球菌特异性的，并且在葡萄球菌内具有宽的抗菌谱，这表明本发明的冷冻干燥制剂可以用作葡萄球菌感染的治疗剂。
实施例4：冷冻干燥制剂对单一葡萄球菌感染的治疗效应
使用动物模型研究本发明的冷冻干燥制剂对单一葡萄球菌感染的治疗效应。在这个实验中，选择表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌作为模型葡萄球菌菌株。使用存储1个月的冷冻干燥制剂作为冷冻干燥制剂。在用于动物实验之前，使用注射用水(0.92mL)将其重构。使用根据实施例2中所描述的程序新鲜制备的过滤溶液作为液体制剂。
对于表皮葡萄球菌实验，使用重量为23g±20％(5周龄)的雌性ICR小鼠[无特异性病原体(SPF)等级]。向分成三组的总共30只小鼠(每组10只小鼠)静脉内注射表皮葡萄球菌菌株CCARM 3751的接种物(1×108CFU/小鼠)。在细菌攻击后30分钟、12小时和24小时，向一组(即，对照组)动物三次静脉内施用仅缓冲液(1.56g/L L-组氨酸(pH 6.0)、50g/L D-山梨醇、1.47g/L CaCl2·2H2O和1g/L泊洛沙姆188)。在细菌攻击后30分钟、12小时和24小时，向利用冷冻干燥制剂的重构溶液的治疗组动物三次静脉内施用冷冻干燥制剂的重构溶液(剂量：25mg/kg)。在细菌攻击后30分钟、12小时和24小时，向利用液体制剂的治疗组动物三次静脉内施用液体制剂(剂量：25mg/kg)。记录死亡小鼠的数目并每日观察临床体征。通过常规群落计数，使用细菌攻击(实验终点)后5天采集的血液检查冷冻干燥制剂的重构溶液和液体制剂从血流中根除细菌的能力。
对于溶血葡萄球菌实验，使用重量为22g±20％(5周龄)的雌性ICR小鼠[无特异性病原体(SPF)等级]。向分成三组的总共30只小鼠(每组10只小鼠)静脉内注射溶血葡萄球菌菌株CCARM 3733的接种物(1×108CFU/小鼠)。在细菌攻击后30分钟、12小时和24小时，向一组(即，对照组)动物三次静脉内施用仅缓冲液(1.56g/L L-组氨酸(pH 6.0)、50g/L D-山梨醇、1.47g/L CaCl2·2H2O和1g/L泊洛沙姆188)。在细菌攻击后30分钟、12小时和24小时，向利用冷冻干燥制剂的重构溶液的治疗组动物三次静脉内施用冷冻干燥制剂的重构溶液(剂量：25mg/kg)。在细菌攻击后30分钟、12小时和24小时，向利用液体制剂的治疗组动物三次静脉内施用液体制剂(剂量：25mg/kg)。记录死亡小鼠的数目并每日观察临床体征。通过常规群落计数，使用细菌攻击(实验终点)后5天采集的血液检查冷冻干燥制剂的重构溶液和液体制剂从血流中根除细菌的能力。
结果，观察到明显的治疗效应。两个实验显示相似的结果。关于临床体征，尽管治疗组中的小鼠在整个实验时段内正常，但对照组中的小鼠在细菌攻击后2天开始出现各种临床体征，包括睑缘红斑、自发活动减少，毛皮损失、立毛和转圈。冷冻干燥制剂的重构溶液和液体制剂的静脉内注射显著提高了存活率(表6)。
表6
单一葡萄球菌感染模型实验中的死亡率
另外，冷冻干燥制剂的重构溶液和液体制剂的静脉内注射显著降低了血液中的细菌计数。从表皮葡萄球菌实验中的对照组小鼠采集的血清中的平均CFU/mL>1×106并且在来自溶血葡萄球菌实验中的对照组小鼠的血清中为>1×105，而在所有治疗组的小鼠中未观察到细菌群落。
从上述结果确认，本发明的冷冻干燥制剂在治疗单一葡萄球菌感染中可提供与液体制剂极为相似的治疗效应。另外，表6中所示的结果显示，本发明的冷冻干燥制剂可有效地用于治疗葡萄球菌感染。
实施例5：冷冻干燥制剂对多种葡萄球菌感染的治疗效应
使用动物模型研究本发明的冷冻干燥制剂对多种葡萄球菌感染的治疗效应。在这个实验中，选择表皮葡萄球菌、路邓葡萄球菌和瓦氏葡萄球菌作为模型葡萄球菌菌株。使用存储1个月的冷冻干燥制剂作为冷冻干燥制剂。在用于动物实验之前，使用注射用水(0.92mL)将其重构。使用根据实施例2中所描述的程序新鲜制备的过滤溶液作为液体制剂。
使用重量为22g±20％(5周龄)的雌性ICR小鼠[无特异性病原体(SPF)等级]。向分成三组的总共30只小鼠(每组10只小鼠)静脉内注射表皮葡萄球菌CCARM 3751、路邓葡萄球菌CCARM 3734和瓦氏葡萄球菌KCTC 3340(ATCC 27836)的混合接种物(各1×108CFU/小鼠)。在细菌攻击后30分钟、12小时和24小时，向一组(即，对照组)动物三次静脉内施用仅缓冲液(1.56g/L L-组氨酸(pH 6.0)、50g/L D-山梨醇、1.47g/L CaCl2·2H2O和1g/L泊洛沙姆188)。在细菌攻击后30分钟、12小时和24小时，向利用冷冻干燥制剂的重构溶液的治疗组动物三次静脉内施用冷冻干燥制剂的重构溶液(剂量：25mg/kg)。在细菌攻击后30分钟、12小时和24小时，向利用液体制剂的治疗组动物三次静脉内施用液体制剂(剂量：25mg/kg)。记录死亡小鼠的数目并每日观察临床体征。通过常规群落计数，使用细菌攻击(实验终点)后5天采集的血液检查冷冻干燥制剂的重构溶液和液体制剂从血流中根除细菌的能力。
结果，观察到明显的治疗效应。关于临床体征，尽管治疗组中的小鼠在整个实验时段内正常，但对照组中的小鼠出现各种临床体征，包括睑缘红斑、自发活动减少，毛皮损失、上睑下垂和立毛。冷冻干燥制剂的重构溶液和液体制剂的静脉内注射显著提高了存活率(表7)。
表7
多种葡萄球菌感染模型实验中的死亡率
另外，冷冻干燥制剂的重构溶液和液体制剂的静脉内注射显著降低了血液中的细菌计数。从对照组小鼠采集的血清中的平均CFU/mL>1×106，而在所有治疗组小鼠中未观察到细菌群落。
从上述结果确认，本发明的冷冻干燥制剂在治疗多种葡萄球菌感染中可提供与液体制剂极为相似的治疗效应。另外，表7中所示的结果显示，本发明的冷冻干燥制剂可有效地用于治疗葡萄球菌感染。
所属领域的技术人员将明了，可在不背离本发明的精神或范围的情况下对本发明作出各种修改和变化。因此，本发明打算涵盖本发明的修改和变化，前提是其属于随附权利要求书和其等效物的范围。

Claims (7)

1.一种制造冷冻干燥制剂的方法，其包括：
制备第一抗菌蛋白和第二抗菌蛋白的混合物，所述第一抗菌蛋白由SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列组成，所述第二抗菌蛋白由SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列组成；
通过混合泊洛沙姆188、D-山梨醇、L-组氨酸以及所述第一抗菌蛋白和所述第二抗菌蛋白的混合物制备溶液，并使所述溶液进行冷冻干燥；
其中，所述混合物对以下所有葡萄球菌属具有杀灭活性：阿尔莱特葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、肉葡萄球菌、山羊葡萄球菌、产色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、路邓葡萄球菌、蝇葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、腐生性葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌，
其中，所述混合物包括15-35摩尔％的所述第一抗菌蛋白和65-85摩尔％的所述第二抗菌蛋白，
其中，所述混合物通过以下过程生物学地制备：
通过将编码由SEQ ID NO:3所示的抗菌蛋白的基因亚克隆到pBAD-TOPO载体中来构建表达质粒，
通过利用所述构建的表达质粒转化大肠杆菌BL21细胞，构建生产宿主细胞，
在37℃下孵育生产宿主细胞，
在细胞浓度在600nm下为2.0时，通过添加阿拉伯糖诱导抗菌蛋白的表达，
从诱导的角度，在19℃下培养生产宿主细胞10小时，
其中，所述冷冻干燥通过将所述溶液装入冷冻干燥机中来实施，并按照冷冻干燥循环进行冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在冷冻干燥之前，所述溶液中的所述第一抗菌蛋白和所述第二抗菌蛋白的所述混合物的浓度为0.1mg/mL至30mg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在冷冻干燥之前，所述溶液中的泊洛沙姆188的浓度为0.1g/L至10g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在冷冻干燥之前，所述溶液中的D-山梨醇的浓度为1g/L至600g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在冷冻干燥之前，所述溶液中的L-组氨酸的浓度为0.1g/L至10g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合物包括25摩尔％的所述第一抗菌蛋白和75摩尔％的所述第二抗菌蛋白。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冷冻干燥循环包括以下步骤：
在4℃下平衡20分钟，
使存架温度为-40℃并维持12小时，
使冷凝器温度为-50℃，
对室内施加真空，
当所述真空达到1500毫托的值时，将存架温度提升至-20℃，
维持16小时，
以每小时升高10℃的方式将所述存架温度提升至20℃，
维持4小时，
打破真空，
用翻转盖塞住并密封塞紧的小瓶。
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