KR20150034170A

KR20150034170A - 온도 안정성 백신 제형

Info

Publication number: KR20150034170A
Application number: KR20157000755A
Authority: KR
Inventors: 지 룩; 크리스챤 페르난도 루이즈; 아론 폴 마일즈; 리차드 윌리엄 웰치
Original assignee: 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 게이더스버그 인코포레이티드
Priority date: 2012-06-25
Filing date: 2013-06-25
Publication date: 2015-04-02
Also published as: IL236380A0; AU2013280480A1; CA2877130A1; AU2013280480B2; SG11201408262XA; EP2863898A4; EP2863898A1; HK1207312A1; WO2014004578A1; IN2015MN00038A; CN104470506A; US20150335752A1; JP2015525748A; RU2014151424A

Abstract

냉동 및 해동조건을 겪은 후에 안정한 탄저병 보호 항원과 같은 백신 항원의 제형이 제공된다. 백신의 제조하기 위해 제형을 사용하는 방법이 또한 제공된다. 제형을 포함하는 백신은 탄저병 감염에 관련되는 것과 같은 질병 또는 감염에 대해 보호하거나, 질병 또는 감염을 저해하거나 또는 완화시키는데 유용하다.

Description

온도 안정성 백신 제형{TEMPERATURE STABLE VACCINE FORMULATIONS}

정부 권리

본 발명은 승인번호 HHSO100201000059C 하에 부분적으로 정부 지원에 의해 만들어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가질 수 있다.

전자적으로 제출된 서열목록에 대한 언급

본 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일(명칭 "2479115PC02_sequencelisting.txt"; 용량: 12,954 바이트; 및 제작일: 2013년 6월 25일)의 전자적으로 제출된 서열 목록의 내용은 그의 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다.

본 발명의 기술분야

본 발명은 알루미늄 애주번트에 흡착된 항원을 함유하는 온도 안정성 백신 제형 및 이러한 제형의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 동결건조 및 냉동 백신 제형을 포함한다. 본 발명은 온도 안정성 백신, 온도 안정성 백신의 제조방법 및 사용방법을 포함한다.

탄저병은 그램 양성 박테리아인 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis(비. 안트라시스(B. anthracis))에 의해 야기되는 잘 알려진 감염성 질환이다. 3가지 유형의 탄저병 감염(피부, 위장관 및 흡입) 중에서, 피부 탄저병이 가장 흔하며, 다양한 항생제에 의해 상대적으로 용이하게 치료가능하다. 다른 2가지 유형의 탄저병 감염은 드물지만, 보통 공격적 항-미생물 요법에 의할 때조차도 치명적이다.

주요 유독인자인 탄저병 독소는 3가지 단백질로 구성된다: 보호 항원(PA, 83 킬로 달톤, kDa), 부종 인자(EF, 89 kDa), 및 치사 인자(LF, 90 kDa). 독소 성분은 PA+EF(부종 독소) 및 PA+LF(치사 독소)의 이원 조합(binary combination)으로 작용한다. PA는 세포 수용체-결합 단백질이며, 다른 2가지 단백질(EF 및 LF)을 감염 세포의 사이토졸 내로 전달한다.

탄저병을 예방하는데 가장 효과적인 공지 방법은 백신접종이다. 미국에서 현재 유일하게 FDA-승인된 탄저병 백신(상표명 바이오트랙스(BioThrax)(등록상표)(탄저백신흡착(Anthrax Vaccine Adsorbed)) 하에 에머전트 바이오솔루션즈 인코포레이티드(Emergent BioSolutions Inc.)에 의해 생산됨)은 무독력 비. 안트라시스 V770-NP1-R 균주로부터의 멸균 무세포 여과액으로부터 생산된다. 인가된 탄저병 백신은 또한 탄저백신흡착(또는 AVA)으로 불린다. 백신은 주로 PA로 이루어지며, 수산화알루미늄은 애주번트(adjuvant)로서 사용된다. 백신은 1950년대 및 1960년대 동안 개발되었고, 에머전트 바이오솔루션즈 인코포레이티드에 대해 FDA에 의해 인가되었다. 백신은 0.06% 미만의 전신 반응을 나타낸다. 인간에서 면역 반응을 유발하기 위한 백신의 능력은 잘 기록되어 있다. AVA 백신은 현재 18개월에 걸쳐 5회 용량 다음에 매년 추가시키는 것에 대해 승인되어 있다.

AVA 백신은 효과적이고 안전하지만, 재조합 기법을 사용하는 치명적 비. 안트라시스 감염에 대해 대상체를 보호하는 백신의 제조를 위한 새로운 면역원성 조성물이 개발 하에 있다. 보호 항원(PA)은 LF와 EF의 둘 다의 작용에 필요한 흔한 인자이기 때문에, 이는 종종 탄저병용 백신을 제조하는데 사용된다. 개발 중인 PA 백신의 예는 미국 특허 제6,316,006호 및 제6,387,665호 및 미국 특허 제2010/0183675호, 미국 특허 제2011/0229507호 및 국제특허 WO2010/053610호에 개시된 것을 포함한다.

AVA 및 PA와 같은 백신은 전형적으로 적어도 1종의 애주번트를 함유하여 대상체의 면역 반응을 향상시킨다. 명반으로도 빈번하게 지칭되는 알루미늄 염 애주번트는 현재 인간에서 사용을 위해 가장 널리 사용되는 애주번트이다. 명반은 보통 수산화알루미늄(또한 알하이드로겔(ALHYDROGEL)(등록상표)(수산화 알루미늄) 또는 인산 알루미늄으로서 시판됨)이다. AVA 및 "차세대" 탄저병 백신(예컨대 재조합체 PA)은 항원에 결합하는 알하이드로겔과 함께 제형화된다.

현재, 명반을 함유하는 백신은 저온유통을 필요로 한다. 저온유통은 저장 및 유통 동안 2 내지 8℃에서 백신을 유지하도록 세계적으로 확립되어있다. 저온유통을 유지하는 것은 비용이 들고 어렵다. 저온유통 실패의 경우에, 백신은 의도된 것보다 더 고온 또는 더 저온에 노출될 수 있다. 명반을 함유하는 백신은 그들이 선적 및 저장 동안 냉동/해동 과정을 겪는다면 폐기되도록 일반적으로 권고된다. 저온유통의 실패는 선진국과 개발도상국 둘 다에서 일어날 수 있으며, 저온유통 실패에 대한 다수의 이유, 예를 들어 장비 고장, 재료의 부족 또는 규정을 따르지 않음이 있다. 인도네시아와 같은 다수의 개발도상국에서, 냉동 온도는 기준 선적의 75%로 보고되었고, 냉동-민감성의 냉동은 일반적이다. 문헌[Hepatitis B vaccine freezing in the Indonesian cold chain : evidence and solutions . Bulletin of the World Health Organization 2004; 82:99-105] 참조.

저온유통에 의존하는 백신은 또한 시기적절하게 필요한 대상에게 보급되는데 더 오랜 시간이 걸리게 할 수 있다. 바이오테러리스트 사건 또는 다른 공중보건 비상사태의 경우에, 백신 및 다른 의학적 대책을 빠르게 전달하는 능력이 중요하다. 보급을 위한 저온유통에 대한 의존도를 제거하는 것은 다양한 기후에서의 의학적 대책의 더 신속하고 효율적인 전달을 야기할 것이다.

저온유통 필요를 회피하거나 또는 최소화하기 위해, 다수의 인가된 백신은 투여 바로 전에 재구성될 수 있는 건조 분말 조성물로서 제형화된다. 지금까지, 미국에서 사용을 위해 인가된 모든 건조 분말 백신은 동결건조 공정을 통해 생산된다. 또한 냉동 건조로서 지칭되는 동결건조는 백신의 장기간 안정성을 개선시키는 공정이다. 공정은 액체 백신 제형을 냉동시키는 단계 및 진공 하에 냉동 제형을 정제시키는 단계를 수반한다. 분무 건조 및 거품 건조와 같은 다른 기술은 안정한 건조 분말 백신을 생성하는 목적으로 개발되었다. 이들 더 새로운 기술은 냉동을 필요로 하지 않고 건조 분말 백신 물질을 생산하고, 명반 함유 백신과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chen et al , 2010, Vaccine 28:5093-5099] 참조. 그러나, 이들 더 새로운 기술은 여전히 초창기에 있으며, 아직 미국에서 인가 백신의 생산에서 사용되고 있다.

명반을 함유하는 백신 조성물의 냉동(동결건조 공정의 부분으로서 또는 냉동 백신을 생성하기 위함)은 일반적으로 알루미늄 입자의 응집을 유발하며, 효능 손실을 야기하는 명반 애주번트 상에 흡착된 항원의 분해를 야기한다. 추가로, 냉동은 침강 알루미늄 겔 높이의 감소를 야기한다(보통 겔 붕괴로서 지칭됨). 예를 들어, 문헌["The effect of freezing on the appearance, potency and toxicity of adsorbed and unadsorbed DPT vaccines, " 1980, WHO Weekly Epidemiological Record 55:385-92; "Temperature Sensitivity of Vaccines, " Aug 2006, WHO publication WHO / IVB /06.10; Diminsky et al., 1999, Vaccine 18(1-2): 3-17; Maa et al., 2003, J Pharm Sci 92(2) :319-332] 참조.

따라서, 냉동을 견딜 수 있는 명반을 함유하는 백신을 생산할 필요가 있다. 이러한 백신은 제조 공정(예를 들어, 동결건조 또는 냉동 백신)의 부분으로서, 선적 공정 또는 저장 동안 냉동될 수 있다. 본 발명은 명반을 함유하는 온도 안정성 백신의 제조를 위한 신규한 제형을 개시한다.

본 발명은 명반을 함유하면서 효능의 감소가 거의 없는 냉동될 수 있는 백신 제형을 제공한다. 일 실시형태에서, 냉동 백신 조성물은 냉동 결과로서 명반 겔 붕괴를 거의 나타내지 않는다.

일 실시형태에서, 백신 또는 조성물은 안정제로서 작용하는 적어도 20% 당을 포함한다. 일 실시형태에서, 백신 또는 조성물은 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과 또는 30% 초과의 당을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 및/또는 계면활성제와 같은 추가적인 안정제가 첨가된다면 효능을 손상시키는 일 없이 당의 양은 감소될 수 있다. 냉동 및 동결건조 백신 제형에 대해, 효능은 또한 냉동 속도를 증가시키고 현탁 입자(침강 입자와 반대)를 냉동시킴으로써 개선될 수 있다.

본 발명은 냉동 백신 조성물, 동결건조 백신 조성물(동결건조 공정의 부분으로서 냉동됨) 및 선적 및 저장 동안 냉동/해동 조건을 받지 않는 다른 백신 제형을 포함한다.

본 발명의 일부 실시형태는 알루미늄 애주번트에 흡착된 적어도 하나의 항원 및 적어도 20%(w/v) 비환원당을 포함하는 동결건조 백신의 제조를 위한 조성물을 포함한다. 다른 실시형태는 알루미늄 애주번트에 흡착된 적어도 하나의 항원 및 적어도 20%(w/v) 당을 포함하는 온도 안정성 백신 조성물을 포함한다. 추가 실시형태는 동결건조 전에 알루미늄 애주번트에 흡착된 적어도 하나의 항원 및 적어도 20%(w/v) 비환원당을 포함하는 조성물을 포함하되, 재구성 후에, 비환원당은 적어도 6%(w/v)이다. 본 발명의 조성물은 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 알루미늄 애주번트에 흡착된 적어도 하나의 항원, 계면활성제 및 적어도 15%(w/v) 당을 포함하며, 동결건조 백신의 제조를 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 알루미늄 애주번트에 흡착된 적어도 하나의 항원, 계면활성제 및 적어도 15%(w/v) 당을 포함하는 온도 안정성 액체 백신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 아미노산을 추가로 포함한다. 알루미늄 애주번트에 흡착된 적어도 하나의 항원, 계면활성제, 아미노산 및 적어도 10%(w/v) 당을 포함하는 안정한 액체 백신 조성물이 또한 포함된다.

본 발명은 알루미늄 애주번트에 흡착된 적어도 하나의 항원, 계면활성제, 아미노산 및 적어도 10%(w/v) 당을 포함하는 동결건조 백신의 제조를 위한 조성물을 추가로 제공한다.

본 발명은 알루미늄 애주번트에 흡착된 항원을 함유하는 수많은 백신에 적용될 수 있다. 일 실시형태에서, 백신은 rPA 또는 탄저백신흡착과 같은 탄저병 백신이다.

보호 항원의 공급원은 다를 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 비. 안트라시스 보호 항원 단백질은 무포자 비. 안트라시스 박테리움으로부터 생성된다. 일부 실시형태에서, 무포자 비. 안트라시스 박테리움은 박테리아의 Δ스턴(Sterne)-1(pPA102) CR4 균주이다. 일부 실시형태에서, PA 단백질은 이콜라이(E. coli)와 같은 다른 유기체에서 발현된다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 애주번트(예를 들어, 알루미늄에 추가로)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 백신 중 하나의 약제학적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 탄저병 감염을 예방하고 치료하는 방법을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 백신을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유발하는 방법을 포함한다.

본 발명은 (i) 본 발명의 조성물을 냉동시키는 단계, 및 (ii) 냉동 조성물을 승화(sublimation)시키는 단계를 포함하는, 백신을 동결건조시키는 방법을 제공한다.

도 1. 2℃ 내지 8℃에서 당 안정제가 없는 rPA 백신을 -80℃에서 냉동하고 해동시킨 동일 조성물과 비교한 사진을 도시한 도면.
도 2. 2℃ 내지 8℃에서 20% 트레할로스 및 2% 아르기닌을 지니는 rPA 백신을 -80℃에서 냉동하고 해동시킨 동일 조성물과 비교한 사진을 도시한 도면.
도 3. 2℃ 내지 8℃에서 및 -80℃ 다음에 해동시킨, 수크로스를 지니는 rPA 백신과 수크로스가 없는 백신의 사진을 도시한 도면.
도 4. 냉동 전에 및 냉동 후에 당이 없는 rPA 제형의 기하평균 NF50을 나타내는 그래프 및 명반 겔의 붕괴를 나타내는 사진을 도시한 도면.
도 5. 냉동시키지 않은 당을 지니는 동결건조 샘플 및 냉동시키지 않은 당이 없는 동결건조 샘플의 기하평균 NF50 반응을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 6. 20% 트레할로스를 함유하는 rPA 조성물에 대한 냉동/해동 전에 및 후에 기하평균 NF50을 도시한 도면.
도 7. 액체 대조군과 비교하여 모든 동결건조 샘플에 대한 기하평균 NF50을 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 8A 내지 도 8B. (A) 선형 NF50 스케일로 나타낸 AVA와 비교한 5℃ 및 50℃에서의 및 (B) 로그 NF50 스케일로 나타낸 AVA와 비교한 5℃ 및 50℃에서의 동결건조 rPA에 대한 시간에 따른 NF50을 나타내며, 각 백신은 1:4에서의 희석인 그래프를 도시한 도면.
도 9A 내지 도 9B. (A) 선형 NF50 스케일로 나타낸 AVA와 비교한 5℃ 및 50℃에서의 및 (B) 로그 NF50 스케일로 나타낸 AVA와 비교한 5℃ 및 50℃에서의 동결건조 rPA에 대한 시간에 따른 NF50을 나타내며, 각 백신은 1:16에서의 희석인 그래프를 도시한 도면.
도 10A 내지 도 10B. (A) 선형 NF50 스케일로 나타낸 AVA와 비교한 5℃ 및 50℃에서의 및 (B) 로그 NF50 스케일로 나타낸 AVA와 비교한 5℃ 및 50℃에서의 동결건조 rPA에 대한 시간에 따른 NF50을 나타내며, 각 백신은 1:64에서의 희석인 그래프를 도시한 도면.
도 11A 내지 도 11B. 5℃ 및 50℃에서의 동결건조 rPA 및 AVA에 대해 (A) 제35일에서의 및 (B) 제42일에서의 NF50의 비교를 나타내며, 각 백신은 1:4에서의 희석인 그래프를 도시한 도면.
도 12A 내지 도 12B. 5℃ 및 50℃에서의 동결건조 rPA에 대해 (A) 제35일에서의 및 (B) 제42일에서의 NF50의 비교를 나타내며, 각 백신은 1:16에서의 희석인 그래프를 도시한 도면.
도 13A 내지 도 13B. 5℃ 및 50℃에서의 동결건조 rPA에 대해 제35일에 (A) 제35일에서의 및 (B) 제42일에서의 NF50의 비교를 나타내며, 각 백신은 1:64에서의 희석인 그래프를 도시한 도면.
도 14. 1개월에 저장한 rPA 액체 백신(액체 rPA F1) 대 4개월에 저장한 동결건조 백신(동결건조 A, 동결건조 B 및 동결건조 C)에 대한 %MLA(마이크로파지 용해 분석)의 비교를 온도의 함수로서 나타낸 그래프를 도시한 도면.
도 15A 내지 도 15B. (A) 1개월 동안 저장한 액체 rPA와 비교하여 4개월 동안 저장한 3가지 rPA 동결건조 제형(동결건조A, 동결건조B 및 동결건조C)의 저장 온도의 함수로서 기준 대조군 이상의 SEC 순도%에서의 상대적 하락을 나타내는 그래프. (B) rPA BDS 기준 표준의 전형적인 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography: SEC-HPLC) 크로마토그래프를 도시한 도면.
도 16A 내지 도 16B. (A) 1개월 동안 저장한 액체 rPA와 비교하여 4개월 동안 저장한 3가지 rPA 동결건조 제형(동결건조A, 동결건조B 및 동결건조C)의 저장 온도의 함수로서 기준 대조군 이상의 AEX 순도%에서의 상대적 하락을 나타내는 그래프. (B) rPA BDS 기준 표준의 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography: AEX-HPLC) 크로마토그래프를 도시한 도면.
도 17A 도 17D. 1개월 동안 5, 25 및 40℃에서 저장한 동결건조 A에 대한 용량 수준 0.25(패널 A), 0.125(패널 B), 0.0625(패널 C) 및 0.03125(패널 D)에서의 NF50의 비교를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 18A 내지 도 18D. 1개월 동안 5, 25 및 40℃에서 저장한 동결건조 B 에 대한 용량 수준 0.25(패널 A), 0.125(패널 B), 0.0625(패널 C) 및 0.03125(패널 D)에서의 NF50의 비교를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 19A 내지 도 19D. 1개월 동안 5, 25 및 40℃에서 저장한 동결건조 C에 대한 용량 수준 0.25(패널 A), 0.125(패널 B), 0.0625(패널 C) 및 0.03125(패널 D)에서 NF50의 비교를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 20A 내지 도 20D. 1개월 동안 5, 25 및 40℃에서 저장한 액체 rPA에 대한 용량 수준 0.25(패널 A), 0.125(패널 B), 0.0625(패널 C) 및 0.03125(패널 D)에서의 NF50의 비교를 나타내는 그래프를 도시한 도면.
도 21. 실시예 8에 기재된 바와 같은 12가지 제형에 대한 NF50 값 및 평균 표준 편차를 나타내는 그래프를 도시한 도면.

여러 해 동안, 명반 함유 백신은 냉동될 수 없는 것으로 믿어졌다. 따라서, 명반 함유 백신은 냉동 또는 동결건조(냉동을 필요로 함)되지 않으며, 저온유통에서의 파손이 냉동의 원인이 된다면, 명반-함유 액체 백신은 전형적으로 폐기된다. 본 발명의 발명자는 트레할로스 또는 수크로스와 같은 당이 탄저병 백신 조성물의 약 20%(w/v) 이상을 구성할 때, 조성물 중의 명반이 냉동 또는 해동의 결과로서 붕괴되지 않는다는 흥미로운 발견을 만들었다. 명반 붕괴는 확인하기가 쉽고, 백신 효능 및 입자 응집의 손실과 관련된다.

본 발명자들은 또한 추가적인 안정화 성분을 확인하였고, 명반 겔 붕괴를 예방하고 감소시키는 파라미터를 처리한다. 제형에 아미노산을 첨가함으로써, 예를 들어, 명반 겔 붕괴를 방지하는데 필요한 당의 양은, 예를 들어 약 10%(w/v)로 감소될 수 있다. 명반 겔 높이에 대해 긍정적 효과를 갖는 공정 변화는 냉동 현탁 입자(침강 입자보다는)를 포함하며, 냉동속도를 증가시킨다.

본 명세서에 사용된 제목은 단지 조직적인 목적을 위한 것이며, 기재된 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 특허, 특허출원, 논문, 책 및 전문 서적을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 본 명세서에 인용된 모든 문헌 또는 문헌의 부분은 임의의 목적을 위해 그의 전문이 참조로서 본 명세서에 명백하게 포함된다. 포함된 문헌 또는 문헌 부분 중 하나 이상이 본 출원에서 해당 용어의 정의와 모순되지 않는 용어를 정의하는 경우에, 본 출원에 나타내는 정의로 조절한다.

단수 용어는 달리 구체적으로 언급되지 않는다면 복수를 포함한다. 단수의 단어는 달리 구체적으로 언급되지 않는다면 "적어도 하나"를 의미한다. "또는 "의 사용은 달리 언급되지 않는다면, "및/또는"을 의미한다. 어구 "적어도 하나"의 의미는 어구 "하나 이상"의 의미와 동일하다. 더 나아가, 용어 "포함하는"뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대 "포함하다" 및 "포함되는"의 사용은 제한되지 않는다. 또한 "구성요소" 또는 "성분"과 같은 용어는 하나의 단위를 포함하는 구성요소들 또는 성분들과 달리 구체적으로 언급되지 않는다면 하나 이상의 단위를 포함하는 구성요소들 또는 성분들을 포함한다. 단어 "약"은 약 1 단위 내를 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은, 보호 항원(Protective Antigen: PA) 또는 재조합체 보호 항원(recombinant Protective Antigen: rPA)은 수용체-결합 및 전좌 도메인을 함유하는 탄저병 독소(대략 83kDa)의 성분이다. 전장 PA 아미노산의 한 가지 예는 하기와 같다:

(서열번호 1).

서열번호 1은 플라스미드 pPA102로부터 발현된 rPA102의 아미노산 서열이다. 비. 안트라시스 Δ스턴-1(pPA102)CR4로부터의 rPA102의 세포밖 공간으로 분비 동안, 처음 29개 아미노산(신호 펩타이드)이 제거되어 735개 아미노산(82,674 Da)의 성숙 rPA 단백질을 수득한다. 성숙 rPA 서열은 밑줄 표시되어 있다(서열번호 2).

rPA102 아미노산 서열은 본 발명 범주 내의 하나의 특정 탄저병 단백질의 일 예이다. 다양한 탄저병 균주로부터의 천연 단백질을 포함하는 PA 단백질의 추가적인 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 참조로서 포함된, 젠뱅크 등록번호 NP_652920.1, ZP_02937261.1, ZP_02900013.1, ZP_02880951.1을 포함한다. 본 명세서 어디에서나 기재된 것과 같은 PA에서의 그의 독성을 감소시키거나 또는 그의 발현 특징을 개선시키기 위한 다양한 단편, 돌연변이 및 변형은 또한 다양한 융합 단백질과 같이 공지되어 있다. 해당 단편, 돌연변이체 및 융합 단백질은 문맥 또는 내용이 해당 형태가 제외된다는 것을 명확하게 표시하지 않는다면 용어 "PA"에 포함된다. 표시되는 경우, PA 단편, 돌연변이체, 및 융합 단백질(전장 PA이든 또는 PA 단편이든)은 독소 중화 분석(toxin neutralization assay: TNA)에서 활성인 항혈청을 유발하는 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은, "온도 안정성", "안정한" 또는 "안정성"은 냉동/해동 주기 후의 백신의 효능 및 명반 겔의 안정성을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 안정한 백신은 2℃ 내지 8℃에서 유지된 비슷한 액체 백신에 비해 냉동/해동 주기 후의 활성 및/또는 효능 및/또는 명반 겔 붕괴 및/또는 입자 응집에서의 감소를 전혀 또는 거의 나타내지 않는 백신이다. 안정성은 작업예를 포함하는 본 명세서에 기재된 분석 중 어느 하나 이상뿐만 아니라 활성, 효능 및/또는 펩타이드 분해를 측정하기 위해 사용한 당업계에 공지된 분석을 사용하여 측정될 수 있다.

특정 실시형태에서, 항원 또는 백신, 예를 들어 보호 항원의 면역원성은 50% 중화 인자(NF50)를 계산함으로써 측정될 수 있다. 백신 제형에 대한 NF50의 기하학적 평균(기하평균 또는 <NF50>gm)은 주어진 수의 데이터 지점으로부터의 NF50 값에 기반하여 계산될 수 있다. 특정 실시형태에서, NF50 및/또는 기하평균은 표준 독소 중화 분석(Toxin Neutralization Assay: TNA)으로부터의 혈청 샘플(문헌[Hering et al., Biologicals 32 (2004) 17-27; Omland et al., Clinical and Vaccine Immunology (2008) 946-953; 및 Li et al., Journal of Immunological Methods (2008) 333 :89-106]), 예를 들어, 면역화 마우스 또는 토끼로부터의 혈청을 사용함으로써 결정된다. 독소의 50% 중화를 야기하는 혈청의 희석은 "ED50"이다. 기준 혈청의 능력에 대한 각 시험 혈청의 중화 능력(50% 중화 인자, 또는 NF50, 또한 중화비로서 알려진 바와 같음)은 기준 혈청의 ED50 및 시험 혈청의 ED50의 몫으로부터 계산되며, 즉, 중화 인자인 NF50는 다음과 같이 계산된다:

특정 실시형태에서, T-검정 또는 일원 ANOVA는 95% 신뢰 수준에서 상이한 제형으로부터의 NF50의 기하평균을 비교하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 기하평균 NF50의 p값이 0.05보다 크다면, 제형 중의 NF50에서 유의한 차이가 없다. 다른 실시형태에서, p 값이 0.05 미만이라면, 제형 중의 기하 평균 NF50은 서로 유의하게 차이가 있다.

마우스 효능 분석 실험으로부터의 중화 인자(NF50) 계산은 NF50 값을 및 이에 따른 효능이 명반 겔 붕괴와 상관관계가 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 안정성은 -80℃에서 밤새 냉동된 백신의 명반 겔을 관찰하고 측정한 다음, 이어서 실온에서 해동시킴으로써 평가될 수 있다. 안정한 백신은 대조군 백신(동일 조성물이지만 2℃ 내지 8℃에서 저장됨)에 비해 명반 겔 붕괴를 거의 내지 전혀 나타내지 않을 것이다. 명반 겔 높이는 측정될 수 있고, 냉동/해동 샘플과 2℃ 내지 8℃ 대조군 간의 a% 차이가 결정될 수 있다. 일 실시형태에서, 약 1%, 2%, 3%, 5%, 8%, 10% 또는 12% 미만의 차이는 안정한 백신을 나타낸다.

안정성은 또한 무결함 단백질(예를 들어, 명반과 함께 rPA 무결함) 또는, 대조적으로 흡착 단백질(예를 들어, 명반으로부터 흡착된 rPA)에 대한 냉동 후에 조성물을 분석함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 안정성은 ELISA에 의한 유리 rPA102(방출); 예를 들어, 시차주사 열량법 및 고유 형광에 의한 단백질 구조; A₂₈₀에 의한 흡착 유리 단백질; SDS-PAGE, SEC 및 또는 RP-HPLC에 의한 순도 및 백본 분해; IEX 또는 등전점 전기영동에 의한 전하 변화; 및 소식세포 용해 분석(microphage lysis assay: MLA)에 의한 생화학적 활성을 분석하고 특성규명함으로써 결정될 수 있다.

일 실시형태에서, 온도 안정성 백신은 냉동/해동 조건(예를 들어, 냉동 백신 또는 동결건조 백신)에 노출된 후에 약 2℃ 내지 8℃에서 저장된 비슷한 액체 백신과 동일하거나 또는 적어도 약 98%, 적어도 약 95%, 적어도 약 93%, 적어도 약 90%), 적어도 약 88% 또는 적어도 약 85%인 효능을 나타내는 백신이다. 일 실시형태에서, 탄저병 마우스 효능 분석은 냉동 또는 동결건조 백신이 강력한지 여부를 결정하기 위해 사용된다.

일부 실시형태에서, 조성물은 40℃에서 적어도 1 개월 동안 동결건조 형태에서 저장 후에 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 면역원성을 보유한다.

본 발명의 백신은 온도 안정성 백신이다. 본 발명의 제형이 안정한 온도는 일반적으로 약 30℃ 미만이지만, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃ 또는 50℃ 초과일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제형의 안정성은 약 25℃, 약 20℃, 약 15℃, 약 10℃, 약 8℃, 약 5℃, 약 4℃, 또는 약 2℃ 미만의 온도에 관한 것이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 온도는 약 25℃ 내지 약 -10℃, 약 20℃ 내지 약 - 10℃, 약 15℃ 내지 약 -10℃, 약 10℃ 내지 약 -10℃, 약 8℃ 내지 약 -10℃, 약 5℃ 내지 약 -10℃, 약 15℃ 내지 약 -5℃, 약 10℃ 내지 약 -5℃, 약 8℃ 내지 약 -5℃, 및 약 5℃ 내지 약 -5℃의 범위에 있다.

실시예 부문은 안정성을 결정하기 위한 다양한 방법을 기재한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 백신은 동일한 샘플이지만 새롭고/새롭거나 5℃에서의 저장된 샘플에 비해 냉동 해동 후에 안정성의 통계적으로 유의한 감소를 나타내지 않았다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 백신은 동일 기간 동안 5℃에서의 저장에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54 또는 60개월 동안 -80℃, -20℃, 25℃, 40℃ 및/또는 50℃에서 저장 후에 안정성, 면역원성, 효능 또는 이들의 임의의 조합에서의 통계적으로 유의한 감소를 나타내지 않았다.

일부 실시형태에서, 조성물의 안정성은 소식세포 용해 분석(MLA), 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC) 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피(AEX-HPLC)에 의해 측정된다.

일부 실시형태에서, 조성물은 50℃에서 적어도 4개월 동안 동결건조 형태에서 저장 후에 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 순도를 보유한다.

본 발명의 백신 조성물은 알루미늄 애주번트(명반)에 흡착된 항원 및 제형을 안정화하는데 필요한 양의 당을 함유한다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 백신 제형은 2℃ 내지 8℃에서 유지한 유사한 액체 백신에 비교할 때 냉동/해동에 노출 후에 효능의 감소를 거의 내지 전혀 나타내지 않고/않거나 명반 겔의 붕괴를 거의 내지 전해 나타내지 않는다.

알루미늄 애주번트(명반)는, 예를 들어, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄 또는 황산 알루미늄일 수 있다. 일 실시형태에서, 애주번트는 수산화 알루미늄(예를 들어, 알하이드로겔)이다. 알루미늄의 양은 명반 겔의 안정성에 대한 분명한 효과 없이 상당히 다를 수 있다(다시 말해서, 조성물 중의 명반 양의 증가가 명반 겔이 붕괴할 가능성을 증가시키는 것으로 나타나지 않음). 본 발명의 일 실시형태에서, 백신 조성물은 약 1 내지 10㎎/㎖의 수산화 알루미늄을 포함한다. 다른 실시형태에서, 조성물은 약 1.5 내지 5㎎/㎖의 수산화 알루미늄을 포함한다. 다른 실시형태에서, 백신 조성물은 약 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 또는 5㎎/㎖의 수산화 알루미늄을 포함한다.

본 발명의 안정한 백신 조성물은 명반과 함께 제형화된 임의의 항원을 안정화하기 위해 사용될 수 있는 것으로 믿어진다. 예를 들어, 항원은 비. 안트라시스 재조합체 보호 항원(rPA) 또는 무독력 비. 안트라시스 균주, 예컨대 V770-NP1 -R(예를 들어, 탄저 백신 흡착)로부터의 무세포 여과액일 수 있다.

PA을 포함하는 비. 안트라시스 단백질(뿐만 아니라 단편, 돌연변이체 및 융합 단백질)을 발현시키는 방법은, 예를 들어 박(Park) 및 기리(Giri)에 대한 미국 특허 제7,201,912호, 이빈스(Ivins) 등에 대한 미국 특허 제6,387,665호, 워샴(Worsham) 등에 대한 미국 특허 제6,316,006호, 및 레플라(Leppla) 등에 대한 미국 특허 제7,261,900호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그의 전문이 참조로서 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 제7,201,912호에 기재되는 바와 같이, pBP103은 전장, 야생형 rPA에 대한 발현 벡터이다. pBP103로부터의 PA 서열은 야생형 PA의 서열과 동일하다.

본 발명의 일부 실시형태는 비. 안트라시스의 포자형성 또는 비-포자형성 균주 중 하나 또는 둘 다에서의 발현을 포함하는 비. 안트라시스에서 발현된 PA를 포함하는 제형을 포함한다. 예를 들어, PA는 비-포자형성 비. 안트라시스 균주 Δ스턴-1(pPA102)CR4(즉, rPA102)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,316,006호 및 미국 특허 제6,387,665호(둘 다 이빈스(Ivins) 등)를 참조하며, 이들 각각은 본 명세서에 그의 전문이 참조로서 포함된다. 일부 본 발명의 조성물은 무독력 비. 안트라시스 균주 V770-NP1-R로부터의 PA를 포함한다.

본 발명의 제형은 또한 이종성 유기체에 의해 발현된 비. 안트라시스 PA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 이콜라이에서 발현된 PA를 포함한다.

추가로, 다양한 PA 단편, 돌연변이체 및 융합 단백질이 또한 기재되었고, 현재 제형에서 사용될 수 있다. 예를 들어, PA는 기능성 결합 부위를 결여하도록 변형되고, 이에 의해 천연 PA가 결합하는 탄저 독소 수용체(Antlirax Toxin Receptor: ATR)에 또는 천연 LF에 PA가 결합하는 것을 방지할 수 있다(문헌[Bradley, K.A., Nature (2001) 414:225-229] 참조). 예로서, 도메인 4의 아미노산 잔기 315 내지 735 내에서 또는 근처에서 또는 잔기 596 내지 735 내에서 또는 근처에서 만들어진 변형은 ATR에 결합할 수 없는 PA를 제공할 수 있다. 대안적으로(또는 추가로), 대부분의 전장 PA 서열이 잔기 163 내지 168에서 또는 주위에서 발견되는 PA 퓨린 절단 부위 "RKKR"(서열번호 3)은 퓨린 절단 부위 내에서 또는 근처에서 결실, 삽입 또는 치환에 의해 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 천연 PA의 모든 퓨린 절단 부위는 결실될 수 있다. 다른 돌연변이체 PA는 다이펩타이드 Phe-Phe이 키모트립신에 내성이 있는 PA를 제공하도록 변형된 것을 포함한다. PA 단편 또는 PA 융합 단백질은 또한 PA 돌연변이체일 수 있다.

PA 단편의 구체적 예는 미국 특허 제7,201,912, 예를 들어, pBP111에 의해 발현되는 PA64, pBP113에 의해 발현되는 PA47, pBP115에 의해 발현되는 PA27에서의 그것을 포함한다. 해당 단편 중 일부는 또한, 예를 들어 퓨린 절단 부위 RKKR(서열번호 3) 또는 다이펩타이드 서열 Phe-Phe(FF)에 의해 형성된 키모트립신 민감 부위를 제거하기 위한 돌연변이를 포함할 수 있다. 추가로, 단편은 N-말단에서 1 또는 2개의 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. PA를 수반하는 융합 단백질의 예는 미국 특허 제7,201,912호, 예를 들어 플라스미드 pBP107, pBP108 및 pBP109에 의해 발현된 PA-LF 융합 단백질에서의 융합 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한 HIS-태그 PA를 포함하는 제형을 포함한다. 그러나 단편, 돌연변이체 또는 융합 단백질이 사용될 때, 일반적으로 단편, 돌연변이체 또는 융합 단백질은 마우스, 기니픽 또는 토끼 중 하나 이상에서 아메스(Ames) 균주의 탄저병 포자의, 예를 들어 LD₅₀에 의한 시험감염에 대해 보호 면역을 유발한다는 것이 바람직하다.

재조합체 공급원 및/또는 비-재조합체 공급원으로부터의 PA가 사용될 수 있고, 이러한 제제의 안정성은 본 발명의 제형에 의해 개선될 수 있다.

일 실시형태에서, 백신 조성물은 약 75 내지 750㎍/㎖, 100 내지 500㎍/㎖, 100 내지 250㎍/㎖, 100 내지 750㎍/㎖ 또는 250 내지 750㎍/㎖의 항원, 예를 들어 rPA를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 약 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 및 500㎍/㎖의 항원, 예를 들어, rPA를 포함하는 백신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 백신은 대략 175㎍ 항원(예를 들어, rPA)/1500㎍ 수산화 알루미늄을 포함한다. 일부 실시형태에서, 백신은 대략 200㎍/㎖ 항원(예를 들어, rPA) 내지 약 0.5㎎/㎖ 수산화 알루미늄을 포함한다. 추가 실시형태에서, 백신은 대략 250㎍ 항원(예를 들어, rPA)/100 내지 250㎍ 수산화 알루미늄을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원은 탄저병 항원, 예컨대 보호 항원이다. 일부 실시형태에서, 보호 항원은 서열번호 2의 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 80% 동일성이 있다. 일부 본 발명의 조성물은 약 150 내지 500㎍/㎖ 보호 항원 또는 약 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 400, 375, 400, 425, 450, 475 또는 500㎍/㎖ 보호 항원을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 약 0.5 내지 1.5㎎/㎖ 수산화 알루미늄을 함유한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 0.5㎎/㎖ 또는 약 1.5㎎/㎖ 수산화 알루미늄을 함유한다.

일부 실시형태에서, 알루미늄 애주번트는 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄 및 황산알루미늄으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 탄저병 백신은, 그것이 무독력 비. 안트라시스 균주로부터의 rPA 또는 무세포 여과액을 포함하는 백신이든 아니든, 비. 안트라시스에 노출 전에 또는 노출 후에 대상체에 투여될 수 있다. 노출 후에 투여될 때, 백신은 항생제와 함께 투여될 수 있다.

다른 실시형태에서, 항원은 B형 간염 보호 항원, 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum) 신경독소 단백질, 단순포진바이러스 항원, 인플루엔자 항원, 선천성 거대세포바이러스 항원, 결핵 항원, HIV 항원, 디프테리아 항원, 파상풍 항원, 백일해 항원, 스타필로코커스 장독소 B(Staphylococcus enterotoxin B: SEB), 및 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis) 보호 항원 및 F1-V 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 항원에 기반한 단백질(예를 들어, 재조합체)이다. 항원은, 예를 들어 파필로마바이러스(예를 들어, HPV), 인플루엔자, 포진 바이러스, 간염 바이러스(예를 들어, A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스), 수막염균 A, B 및 C, 헤모필루스 인플루엔자 B형(HIB), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp .), 스타필로코커스 종(Staphylococcus sp .), 클로스트리듐 보툴리눔, 바실러스 안트라시스 및 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)로부터 유래될 수 있다.

본 발명의 백신은 명반 겔의 효능 손실 또는 붕괴가 거의 또는 전혀 없이 -80℃에서 밤새 냉동을 견딜 수 있다. 본 발명은 냉동 액체 백신뿐만 아니라 동결건조 백신(또한 본 명세서에서 냉동 건조 백신으로서 지칭됨)을 포함한다. 본 명세서에 개시된 바와 같은, 동결건조 공정은 액제 조성물의 냉동을 포함한다. 이어서, 냉동 조성물은 냉동 하에 승화된다. 동결건조 백신에 대해, 개시된 백신 성분 및 양은 액체 조성물에서 사용되고, 이어서 냉동되며 반드시 건조 동결건조 케이크 또는 재구성 백신을 필요로 하지는 않는 양을 지칭한다. 최종 동결건조 백신 케이크(건조 조성물)는 건조 공정에 기인하는 상이한 백분율의 성분을 함유할 수 있다.

본 발명은 (i) 본 발명의 조성물을 냉동시키는 단계 및 (ii) 냉동 조성물을 승화시키는 단계를 포함하는, 백신을 동결건조시키기 위한 방법을 제공한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 백신은 당과 같은 유리 형성제 중 약 20% 이상을 포함한다. 일 실시형태에서, 유리-형성제는 환원당이며, 일 실시형태에서, 백신은 비환원당, 예컨대 트레할로스 또는 수크로스를 포함한다. 일 실시형태에서, 유리 형성제는 트레할로스 또는 수크로스이다. 백신이 동결건조된다면, 동결건조 전에 약 40% 이하의 당을 사용하는 것이 바람직할 수 있으며, 따라서 백신은 케이크-유사 조성물을 형성한다. 백신은, 예를 들어 동결 건조 전에 약 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21 %, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 35% 또는 40% 당을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 백신 조성물은, 예를 들어 동결건조 전에 약 10 내지 40%, 10 내지 35%, 10 내지 30%, 10 내지 25%, 10 내지 20%, 35 내지 40%, 30 내지 40%, 25 내지 40%, 20 내지 40%, 15 내지 40%, 20 내지 30%, 20 내지 25%, 25 내지 30%, 25 내지 35%, 21 내지 40%, 21 내지 35%, 21 내지 30% 21 내지 25% 또는 10%, 15%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35% 또는 36%(w/v) 초과의 당을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은, 예를 들어 동결건조 전에 약 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21 %, 22%, 23%, 24% 및 25%(w/v) 초과의 당을 함유한다.

본 명세서에 개시되는 바와 같이, 본 발명의 발명자는 적어도 약 20% 트레할로스 또는 수크로스를 포함하는 명반 백신 조성물이 냉동/해동 조건을 견딜 수 있다는 것을 확인하였다. 특정 추가적인 안정제가 첨가되고(예를 들어, 계면활성제 및/또는 아미노산)/되거나 본 명세서에 개시된 공정 개선이 포함될 때(예를 들어, 냉동 속도 증가, 현탁 입자의 냉동), 당의 양은 백신의 효능에 영향을 미치는 일 없이 약 15%(w/v) 또는 심지어 약 10%(w/v)로 감소될 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에서, 알루미늄 애주번트에 흡착된 항원 및 당(예를 들어, 15%w/v 이상)을 포함하는 백신 조성물은 또한, 예를 들어 동결건조 전에 계면활성제와 같은 가용화제를 함유한다. 일 실시형태에서, 계면활성제는 폴리솔베이트 80(트윈(TWEEN)(등록상표) 80)과 같은 비이온성 세정제이다. 일 실시형태에서, 백신 조성물은 약 0.001% 내지 약 0.05% 계면활성제(예컨대 폴리솔베이트 80)를 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물은 약 0.020%, 약 0.025% 내지 약 0.020% 내지 0.025%(w/v) 계면활성제(예컨대, 폴리솔베이트 80)를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 계면활성제는 폴리솔베이트 20, 플루로닉(pluronic) L68, 폴리옥시에틸렌 9-10 노닐 페놀(트리톤(Triton)(상표명) N-101, 옥토자일놀 9), 트리톤(상표명) X-100, 및 데옥시콜산나트륨을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일 실시형태에서, 계면활성제는 제조 공정 동안 제거되며, 따라서 계면활성제는 최종 약물 제품에서 존재하지 않는다. 일 실시형태에서, 계면활성제는, 예를 들어, 동결건조 공정의 냉동 동안 존재한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 제형은 계면활성제를 포함하지 않는다.

본 발명자는 아미노산(예를 들어, 알라닌, 아르기닌, 글라이신 및 프롤린)이, 예를 들어 냉동 및/또는 동결건조 전에 조성물에 첨가된다면, 당의 백분율은 효능에 대한 효과가 거의 내지 전혀 없고/없거나 명반 겔 붕괴가 거의 내지 전혀 없는 약 10%(w/v) 만큼 감소될 수 있다는 것을 발견하였다. 백신 조성물에 첨가되는 아미노산의 양은 다를 수 있다. 일 실시형태에서 백신 조성물은 아미노산 또는 아미노산의 조합물의 0.5 내지 약 15%(w/v)를 포함한다. 일 실시형태에서, 백신 조성물은 아미노산 또는 아미노산 조합물의 약 2 내지 10%(w/v)를 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 백신은 약 2% 아르기닌 또는 알라닌을 포함한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 백신은 약 10% 글라이신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 백신 조성물은 약 2 내지 10%, 2 내지 8%, 2 내지 6%, 2 내지 4%, 2 내지 3%, 3 내지 10%, 5 내지 10%, 7 내지 10%, 2.5 내지 5%, 3 내지 5%, 3 내지 7% 또는 4 내지 6%(w/v)의 아미노산 또는 아미노산의 조합물을 포함하며, 일부 실시형태에서, 예컨대 알라닌, 글라이신, 프롤린 및/또는 아르기닌으로부터 선택된 2, 3개 이상의 아미노산이 존재한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 0.5 내지 4%, 1 내지 4%, 1.5 내지 4%, 2 내지 4%, 2.5 내지 4%, 3 내지 4%, 3.5 내지 4%, 0.5 내지 1%, 0.5 내지 1.5%, 0.5 내지 2%, 0.5 내지 2.5%, 0.5 내지 3%, 0.5 내지 3.5%, 0.5 내지 4%, 1 내지 3%, 1 내지 2%, 2 내지 3%, 또는 1.5 내지 2.5%(w/v) 알라닌 또는 아르기닌을 함유한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 2%, 1.75%, 2.25%, 2.5%, 2.75%, 3%, 3.25%, 3.5%, 3.75% 또는 4%(w/v) 알라닌 또는 아르기닌을 함유한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 6 내지 12%, 7 내지 12%, 8 내지 12%, 9 내지 12%, 10 내지 12%, 11 내지 12%, 6 내지 11%, 6 내지 10%, 6 내지 9%, 6 내지 8%, 6 내지 7%, 7 내지 11%, 8 내지 10%, 7 내지 10%, 11 내지 9%, 7 내지 8%, 8 내지 9% 또는 9 내지 10%(w/v) 글라이신을 함유한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11% 또는 12%(w/v) 글라이신을 함유하며, 일부 실시형태에서, 아미노산의 인용 농도는 냉동 및/또는 동결건조 전이다.

일부 실시형태에서, 제형은 아미노산(들) 용액을 포함하지 않거나 또는 폴리펩타이드 항원의 부분인 아미노산 이외의 아미노산(들)을 함유하지 않는다.

일부 실시형태에서, 제형은 추가로 1종 이상의 추가적인 성분을 포함한다. 예를 들어, 제형은 1종 이상의 염, 예컨대 염화나트륨, 인산나트륨 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 일반적으로, 각각의 염은 약 10mM 내지 약 200mM에서 제형 중에 존재한다.

백신 제형은 20mM 트리스(TRIS)-HCL과 같은 완충제를 함유할 수 있다. 제형의 pH는 또한 다를 수 있다. 일반적으로 약 pH 6.2 내지 약 pH 8.0이다. 일 실시형태에서, 백신의 pH는 약 7.4이다.

다른 실시형태에서, 제형은 솔비톨과 같은 당 알코올을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 제형은 0.25% 솔비톨을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물 및 백신 제형은 추가적인 애주번트, 예를 들어 면역 자극 서열(ImmunoStimulatory Sequence: ISS, CpG) 및 인산칼슘을 함유할 수 있다. ISS에 대해, 단백질 샘플은 일반적으로 최종 단백질 농도 50㎍/㎖에서 사용된다. 애주번트의 다른 비제한적 예는 CGP7909(예를 들어, 본 명세서에 그의 전문이 참조로서 포함된 미국특허 제7,223,741호 참조), CpG1018(예를 들어, 본 명세서에 그의 전문이 참조로서 포함된 미국특허 제2010/0183675호), 글루코피라노실 액체 애주번트(Glucopyranosyl Lipid Adjuvant: GLA), 폴리일 폴리C(PIPC), N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-아이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-아이소글루타민(CGP 11637, 노르-MDP로서 지칭됨), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-아이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-다이팔미토일-sn-글라이세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 19840A, MTP-PE로서 지칭됨) 및 RIBI(2% 스쿠알렌/트윈 80 중에서 박테리아로부터 추출된 3가지 성분인 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 다이미콜레이트 및 세포벽 골격(cell wall skeleton)(MPL+TDM+CWS)을 함유)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

본 발명은 다음의 제형을 포함하는 조성물을 포함한다: 0.15㎎/㎖ 항원, 1.5㎎/㎖ 알루미늄, 20% 트레할로스, 2% 알라닌 및 0.025% 계면활성제; 0.5㎎/㎖ 항원, 5㎎/㎖ 알루미늄, 20% 트레할로스, 2% 알라닌 및 0.025% 계면활성제; 0.5㎎/㎖ 항원, 5㎎/㎖ 알루미늄, 20% 트레할로스, 1% 수크로스, 2% 알라닌 및 0.025% 계면활성제; 및 0.5㎎/㎖ 항원, 5㎎/㎖ 알루미늄, 20% 트레할로스, 2% 알라닌 및 0.025% 계면활성제. 일부 실시형태에서, 이들 제형에서 항원 및/또는 계면활성제는 각각 PA 및 트윈(등록상표) 80이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 5mM NaPi, pH 7.0 완충제 또는 20mM 트리스, pH 7.4를 포함한다. 본 발명에 포함되는 다른 조성물은 실시예에서 기재된다.

본 발명의 백신은 주사용으로 제조될 수 있다. 조성물은 온도 안정성(예를 들어, 냉동/해동 주기를 견딜 수 있음)인 액체 제형 또는 냉동 조성물일 수 있다. 조성물은 또한, 예를 들어 투여 전에 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 재구성될 수 있는 동결건조 건조 분말 백신을 제조하는데 사용될 수 있다. 백신 투여는 일반적으로 통상적인 경로, 예를 들어 정맥내, 피하, 복막내 또는 점막 경로에 의한다. 투여는 비경구 주사, 예를 들어 피하 또는 근육내 주사에 의할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 냉동된 다음 진공 하에 승화되어 동결건조 조성물을 생성한다.

용어 "재구성된" 또는 "재구성"은 보존 및/또는 저장을 위해 이미 변경된 물질의, 예를 들어 재수화에 의해 동결건조 형태를 액체 형태로 재저장, 예를 들어 저장된 적용의 동결건조 rPA 제형의 액체 상태로 재저장하는 것을 지칭한다. 본 출원의 동결건조 조성물은 투여에 적합한 안정한 수용액을 제조하는 임의의 수용액 중에서 재구성될 수 있다. 이러한 수용액은 멸균수, TE(트리스 EDTA), 인산염 완충 식염수(PBS), 트리스 완충제 또는 정상 식염수를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 동결건조 샘플은 샘플을 동결건조시키기 위해 사용한 용적보다 더 낮거나, 동일하거나 또는 더 높은 용적으로 재구성될 수 있다.

본 출원의 재구성 동결건조 백신 제형의 용량은 치료되어야 하는 병태, 선택된 투여 경로, 개개 환자의 연령, 성별 및 체중 및 환자 증상의 중증도를 포함하는 다양한 적절한 인자에 비추어 결정될 수 있으며, 단일 용량, 분할 용량 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

백신은 투약 제형에 합당한 방식으로 투여되며, 예방적 및/또는 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 일반적으로 5㎍ 내지 500㎍의 항원/용량의 범위에 있는 투여되는 양은 치료되어야 하는 대상체, 항체를 합성하는 대상체 면역계의 능력 및 원하는 보호 정도에 의존한다. 일 실시형태에서, 백신은 적어도 약 10㎍ PA, 25㎍ PA, 50㎍ PA, 75㎍ PA, 100㎍ PA, 125㎍ PA, 150㎍ PA, 200㎍ PA, 225㎍ PA, 250㎍, 275㎍, 300㎍ PA를 포함한다. 항원의 정확한 양은 전달되어야 하는 항원에 의존한다.

백신은 단일 용량 스케줄 또는 선택적으로 다회 용량 스케줄로 주어질 수 있다. 백신 조성물은, 예를 들어 0.5㎖ 용량으로 투여될 수 있다. 노출 전의 예방에 대해, 다회 용량 스케줄은 백신 접종의 주된 과정이 1 내지 6회의 별개 용량에 의한 다음, 면역 반응을 유지하고 하거나 강화하기 위한 후속적 시간 간격으로 주어진 다음의 용량, 예를 들어, 제2 용량에 대해 1 내지 4개월, 및 필요하다면 몇 개월 후에 후속 용량(들)에 의하는 것이다.

노출 후의 예방에 대해, 백신은 또한 단일 용량 또는 다회 용량 요법에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 백신은 노출 후에 시간 0, 2 및 4주에 3회 용량으로 투여된다. 투약 요법은 또한 적어도 부분적으로 실행자의 판단 및/또는 시험 결과, 예를 들어 항체 수준 및/또는 항원(들)에 대한 T-세포 활성과 같은 백신/항원(들)에 대한 면역 반응 수준의 측정에 대해 개체의 필요에 의해 결정될 것이다.

추가로, 면역원성 항원(들)을 함유하는 백신은 다른 면역조절제, 예를 들어 면역글로불린, 항생제, 인터류킨(예를 들어, IL-2, IL-12), 및/또는 사이토카인(예를 들어, IFN-베타, IFN-알파)과 함께 투여될 수 있다.

일 실시형태에서, 백신은 탄저병에 노출 후에 대상체에게 투여된다. 이 실시형태에서, 백신은 항생제와 함께 투여될 수 있다. 백신과 투여될 수 있는 항생제는 페니실린, 독시사이클린 및 시프로플록사신을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

본 발명은 본 발명의 백신의 약제학적 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 탄저병 감염을 치료하거나(노출 후 예방) 또는 예방하는(노출 전 예방) 방법을 포함한다. 일 실시형태에서, 탄저병 감염은 흡입하는 탄저병(흡입 탄저병)의 결과이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 백신의 약제학적 유효량은 면역 반응을 유발하는 양이다. 일 실시형태에서, 백신의 약제학적 유효량은 적어도 25㎍ PA를 포함하는 양이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 대상체는 인간과 같은 포유류이다.

본 발명은 또한 면역 반응을 자극하는데 충분한 본 발명의 백신의 양을 대상체에 투여함으로써 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 면역 자극은 백신 내 항원에 특이적인 항체 역가에서의 증가에 의해 측정된다. 또 다른 실시형태에서, 면역 자극은 백신 내 항원에 특이적인 세포독성 T 림프구에서의 증가된 빈도에 의해 측정된다.

또한 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 병원균에 대해 대상체를 백신접종하는 방법이 제공된다. 추가적으로 본 발명의 동결건조 조성물로부터 재구성된 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 병원균에 대해 대상체를 백신접종하는 방법이 제공된다. 본 발명은 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 25% 또는 적어도 약 30% 당 및 알루미늄 애주번트에 흡착된 항원을 포함하는 조성물을 현탁시키는 단계 및 침강이 일어나기 전에 현탁 조성물을 냉동시키는데 충분한 속도로 상기 조성물을 냉동, 예를 들어 순간 냉동 시키는 단계를 포함하는, 강력한 명반 기반 냉동 백신의 제조방법을 추가로 포함한다.

본 발명의 일부 실시형태는 본 발명의 조성물의 동결건조를 포함하는, 안정한 동결건조 조성물의 제조방법을 제공하되, 재구성된 동결건조 조성물의 안정성은 소식세포 용해 분석(MLA), 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC) 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피(AEX-HPLC)에 의해 측정된다.

탄저병 백신에 대해, 제형의 면역원성은 다양한 예에 기재된 바와 같이 시험될 수 있다. 예를 들어, 마우스는 애주번트 에멀전에서 현탁된 10㎍, 20㎍ 이상의 rPA에 의해 면역화될 수 있다. 대조군 마우스는 음성 대조군으로서 사용을 위한 애주번트에서 유화된 식염수에 의해 면역화된다. 마우스는 일반적으로 면역화된 다음, 다양한 간격으로, 예를 들어 제0일, 면역화 후 제21일 및 제28일에 출혈된다. 이어서, 혈청은 구체적 항체의 존재에 대해, 예를 들어 또한 항혈청의 역가를 결정하기 위해 사용될 수 있는 ELISA에 의해 분석된다.

마우스 독소-중화 항체 분석은 또한 탄저병 백신 제형이 보호 항체를 유발하는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이 분석에서, rPA에 의해 면역화된 마우스는 이어서 치사 독소(PA 및 치사인자(LF))의 2회 치사 용량에 의해 i.p.로 시험감염된다. 시험감염의 4일 후에, 마우스를 생존자에 대해 스코어링한다.

rPA 제형은 또한 탄저병 독소와 면역반응하는 중화 항체를 포함하는 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 얻어진 항혈청은 탄저병에 대한 노출을 치료하기 위한 의약의 제조를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 항체 조성물은 정제된 항-PA 항체를 포함한다. "정제된"은 항체가 자연적으로 결합된 다른 생물학적 물질이 실질적으로 없음을 의미한다. 본 발명의 정제 항체는 적어도 60중량% 순수, 적어도 70중량% 순수, 적어도 80중량% 순수, 적어도 90중량% 순수 또는 적어도 95중량% 순수하다. 항혈청 또는 항혈청으로부터 정제된 항체는 또한 PA 단편 또는 천연 단백질 중 하나를 검출하기 위한 진단제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 냉동 및 동결건조 제형은 냉동 속도를 증가시킴으로써 증가된 효능을 지니도록 제조될 수 있다. 일 실시형태에서, 제형은 순간냉동된다.

효능은 또한 침강 조성물보다는 현탁된 조성물을 냉동시킴으로써 증가될 수 있다. 조성물은 부드러운 진탕 및 즉시 냉동에 의해 현탁될 수 있다.

본 발명은 본 발명을 순수하게 예시하는 것으로 의도되고, 제한하지 않는 다음의 실시예에 의해 추가로 정제될 것이다.

실시예 1: 트레할로스를 지니는 액체 rPA 및 AVA 백신 및 지니지 않는 백신의 냉동/해동

트레할로스를 지니는 rPA102 백신 제형과 트레할로스가 없는 백신 제형을 이하의 표 1에 약술하는 바와 같이 제조하였다.

조제 후에, 각 샘플을 10㎖ 유리관에서 2개의 8㎖ 알리쿼드로 나누었다. 각 샘플에 대해, 하나의 관을 밤새 부드럽게 혼합시킨 후에 -80℃에 두었고, 다른 관을 밤새 부드럽게 혼합시킨 후에 2 내지 8℃에 두었다.

-80℃에서 밤새 저장한 샘플을 실험실 벤치 상에서 다음날의 관찰 및 비교 전에 몇 시간 동안(3 내지 4시간 초과) 2 내지 8℃로 해동시키고, 샘플을 실온으로 만들었다. 샘플을 촬영하고, 전체 액체 높이 및 알하이드로겔(수산화 알루미늄) 높이를 측정하였다. 정규 rPA102 백신을 냉동/해동 전에 및 후에 비교하였다. 도 1은 2 내지 8℃(5℃ 표지)에서 rPA 대조군 1을 해동 후에 -80℃ 샘플과 비교하는 사진이다. 사진은 냉동/해동 조건에 처한 rPA 대조군 1에서 명반 겔의 상당한 붕괴를 나타낸다. 냉동/해동 스트레스로부터의 rPA102를 보호한 정규 제형에서의 당 수준을 시험하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 냉동 손상 rPA102 백신, 및 효능(MRPT) 데이터는 물리-화학적 및 겔 높이(붕괴)와 상관관계가 있었다. 도 2는 2 내지 8℃에서 rPA 시험 1 샘플(5℃ 표지)을 해동 후에 -80℃ 샘플과 비교한 사진이다. 해동 rPA 시험 1 샘플에서 명반의 뚜렷한 붕괴는 없다. 표 2는 상대적 명반 높이%의 개요를 제공한다.

15% 트레할로스, 0.15㎎ rPA/㎖, 2% 알라닌, 0.025% 폴리솔베이트 80, 25mM NaPi, pH 7.4를 함유하는 시험 조성물에 의해 유사한 냉동/해동 실험을 수행하였고, 유사한 결과를 지니는 15% 트레할로스가 없는 대조군 제형과 비교하였다(데이터 미제시).

바이오트랙스(BioThrax)(등록상표)의 바이알(탄저 백신 흡착), AVA 및 바이알 AVA + 25% 트레할로스를 부드러운 혼합 후에 -80℃에 두었다. 바이오트랙스의 제2 바이알 및 AVA + 25% 트레할로스의 제2 바이알을 부드러운 혼합 후에 2℃ 내지 8℃에서 밤새 두었다. 다음날, -80℃ 바이알을 해동시키고, 모든 바이알을 검사하였다. 알루미늄 겔 높이는 2℃ 내지 8℃에서 저장한 바이오트랙스 및 25% 트레할로스를 함유하는 2개의 AVA 샘플에 대해 거의 동일한 것으로 나타났다. 알루미늄 겔 높이는 -80℃에서 저장한 바이오트랙스에 대해 훨씬 더 낮았다(트레할로스 없음). (데이터 미제시).

실시예 2: 수크로스를 지니는 액체 rPA 백신 및 수크로스가 없는 백신의 냉동/해동

수크로스를 지니는 rPA102 백신 제형 및 수크로스가 없는 백신 제형을 이하의 표 3에서 약술하는 바와 같이 제조하였다.

조제 후에, 각 샘플을 10㎖ 유리관에서 2개의 10㎖ 알리쿼드로 나누었다. 각 샘플에 대해, 하나의 관을 밤새 부드럽게 혼합시킨 후에 -80℃에 두었고, 다른 관을 밤새 부드럽게 혼합시킨 후에 2 내지 8℃에 두었다.

-80℃에서 밤새 저장한 샘플을 실험실 벤치 상에서 해동시키고 다음날 관찰 전에 2 내지 3시간 동안 만들었다. 도 3은 둘 다 실온으로 만든 후에 2 내지 8℃(5℃ 표지) 및 -80℃로부터의 각 제형의 사진을 포함한다. 나타내는 바와 같이, 2 내지 8℃에서 냉장된 채로 남아있는 샘플에 비해 해동 후에 -80℃ 샘플(rPA 대조군 2와 rPA 시험 2) 둘 다에서 겔 붕괴가 일어났다. 그러나, 겔 붕괴의 양은 수크로스를 포함하지 않은 rPA 대조군 2에서 눈에 띄게 더 컸다.

실시예 3: 생체내 마우스 효능 분석

동결건조 백신을 표 4에서 약술한 바와 같이 제조하였다. 주사용수를 이용하여 건조 백신을 0.15㎎/㎖(75㎍/0.5㎖ 용량)의 최종 rPA 농도로 재구성하였고, 이어서, 10배만큼 정상 식염수 중에서 희석시켜 0.1의 용량 수준(용량 수준: DL)을 수득하였다.

5 내지 8주령이며 체중이 20 내지 25 그램인 암컷 CD-1 마우스 각각을 이 연구를 위해 사용하였다. 백신의 0.1 DL을 20 암컷 CD-1 마우스의 그룹 내로 IP 주사하였고(0.5㎖), 마우스에서 독소 중화 분석(TNA)에서 탄저병 LT 세포독성을 중화하는 그의 능력의 평가를 위해 제28일에 수집하였다.

rPA102 제형의 면역원성을 중화인자(NF50)를 계산함으로써 조사하였다. 중화 인자인 NF50는 다음과 같이 정의한다:

유효 용량 50%(ED50)의 경우에, 기준 표준을 -20℃ 이하에서 저장한 적격 기준 표준을 사용함으로써 제조하였다.

20마리 마우스로부터의 20개 NF50 값에 기반하여 각 백신 제형의 NF50의 기하학적 평균(기하평균)을 계산하였다. T-검정 또는 일원 ANOVA를 사용하여 95% 신뢰수준에서 각 제형의 NF50의 기하평균을 비교하였다. 기하평균 NF50의 p값이 0.05를 초과한다면, 제형 중에서 NF50(효능)에서의 유의한 차이가 없었다. p값이 0.05 미만이라면, 제형의 기하평균 NF50은 서로 유의하게 차이가 있었다.

대조군(동결건조 #2)은 안정제(0.15㎎/㎖ rPA, 1.5㎎/㎖ 알루미늄, 20mM 트리스-HCl, pH 7.4)가 없는 rPA102 제형이었다. 정규 rPA102 제형에 대한 상대적 효능 분석으로부터의 NF50 기하평균 값에 대한 냉동 효과를 도 4에 나타낸다. 대조군 제형은 냉동 공정 후에 상당히 떨어지는 면역원성에 의해 냉동/해동 손상이 되기 쉬웠다(도 4). 면역원성의 하락은 용액 중의 알루미늄 겔의 높이 감소에 대응한다.

동결건조 샘플 #1 및 2는 동결건조 샘플 #3 및 4(각각 30% 및 20% 트레할로스를 함유함)에 비해 상당히 더 낮은 면역원성 효능을 나타내었다. rPA102 백신의 동결건조에 대한 제형 내 당의 효과는 도 7에서의 기하평균 NF50 결과에 의해 나타내었다. 동결건조 샘플 #1(10% 당)은 냉동-건조 스트레스로부터 rPA102를 보호할 수 없었다(도 7 참조). 이들 결과는 20% 및 30% 당이 동결건조 스트레스로부터 rPA102를 보호할 수 있다는 것을 나타내었다. 겔 붕괴의 출현은 효능 손실과 상관관계가 있었다.

트레할로스의 부재 또는 존재에 의해서만 상이한 2 이상의 제형으로부터 NF50 반응을 결정하였고(#1) 0.15㎎/㎖ rPA, 1.5㎎/㎖ 명반, 2% 아르기닌, 0.025% TWEEN 80(폴리솔베이트 80), 20mM 트리스-HCl, pH 7.4 및 #2 및 #3) 0.15㎎/㎖ rPA, 1.5㎎/㎖ 명반, 20% 트레할로스, 2% 아르기닌, 0.025% 트윈 80(폴리솔베이트 80), 20mM 트리스-HCl, pH 7.4), rPA102에 대한 기하평균값에 대한 냉동 전의 당 효과를 도 5에 나타낸다. 도 5 제형에서, 그룹 #2 및 #3은 단지 동일 제형의 상이한 바이알이다. 트레할로스의 첨가는 2가지 제형(3가지 샘플)(당 있음 및 당 없음 및 냉동 없음)에 대해 NF50에서 통계적 변화가 없음에 의해 입증되는 바와 같은 제형의 면역원성에 대해 영향이 없었다(도 5). 제형을 함유하는 이들 트레할로스의 냉동 전에 및 후에 기하평균 값의 비교를 도 6에 나타낸다. 이 제형을 사용할 때, 냉동 전에 및 냉동 후에 면역원성(NF50)에서의 통계적으로 유의한 변화는 없었다(도 6). 추가로, 이 제형과 함께 냉동시킨 후에 명반 겔(유지된 겔 높이)의 붕괴가 없었다(도 6의 사진). 이들 결과는 20% 트레할로스를 지니는 시험 제형이 냉동/해동 스트레스로부터 이 rPA 백신을 보호한다는 것을 나타낸다.

실시예 4: 토끼 면역원성 및 안정성 연구

5 및 50℃에서 4개월 동안 저장한 재조합체 보호 항원(rPA) 동결건조 백신 제형의 면역원성을 뉴질랜드 화이트(New Zealand White: NZW) 토끼에서의 독소 중화 항체 분석(TNA)을 사용하여 탄저백신흡착(AVA)(바이오트랙스(등록상표))과 비교하였다. 이 토끼 면역원성 연구는 2가지 면역화 스케줄을 이용하였고(제0일 및 제28일), -제1일, 제0일, 제14일, 제21일, 제28일, 제35일, 제42일, 제56일 및 제70일에 출혈시켰다.

rPA 동결건조 백신을 표 5에 나타낸 성분을 사용하여 제조하였다. 최종 제형의 성분을 표 5에 나타낸 바와 같이 동결전조 전에 및 재구성 후에 배합하였다. 간략하게, 2㎖의 현탁액을 10㎖ 유리 바이알 내에 채웠다. 비르티스 어드밴티지(VirTis Advantage) 동결건조기를 사용하여 동결건조를 수행하였다. 동결건조 후에, 백신을 5 및 50℃에서 저장하였다.

특히, 저장액을 제조하였고, (트윈 80 및 NaCl을 제외) 0.1N NaOH 및/또는 0.1N HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조절하였다. 저장액을 제조한 후에, 150㎖의 다음의 제형 배합물을 200㎖ 날겐(Nalgene) 보틀에서 제조하였으며: 0.5㎎/㎖ rPA, 5.0㎎/㎖ 알루미늄, 30% 트레할로스(w/v), 0.25% 솔비톨(w/v), 1% 아르기닌(w/v), 0.025% 트윈 80, 75㎜ NaCl, 20mM 트리스-HCl, pH 7.4, 이를 사용하여 2㎖ 제형 배합물과 함께 10㎖ 바이알을 채웠다.

바이알을 채운 후에, 다음의 프로그램을 사용하는 비르티스 어드밴티지 동결건조기를 사용하여 샘플을 건조시켰다:

바이알을 표 6에 기재한 바와 같이 저장하였다. 면역화 당일에, 6.11㎖ 멸균 주사용수를 각 바이알에 첨가하여 동결건조 샘플을 재구성하였다. 모든 제형 성분이 완전히 용해될 때까지 바이알을 빙글빙글 회전시켜 혼합하였다. 각 시험 및 대조군 물품의 희석물(1:4, 1:16 및 1:64)을 멸균 정상 식염수 중에서 제조하였다.

NZW 토끼를 본 연구를 위해 사용하였다. 독성, 면역원성 및 효능 연구를 위한 시험을 위해 바실러스 탄저병에 대한 동물 모델로서 NZW 토끼를 보통 사용하며, NZW 토끼는, 그들이 인간에서 보이는 바와 같은 유사한 발병 및 임상적 제시를 가지기 때문에, 잘 특성규명된 모델이 되는 것으로 고려된다(EK Leffel et al., Clin Vaccine Immunol. 19(18): 1158-1164, 2012; AJ Phipps et al., Microbiol Mol Biol Rev. 68(4):617-29, 2004). NZW 토끼의 각 그룹(백신 그룹 당 10마리)은 제0일 및 제28일에 동결건조 rPA 백신 제형 또는 AVA의 1:4, 1:16 및 1:64 희석물로 0.5㎖ 근육내 주사를 받았다. AVA(바이오트랙스(등록상표))는 83kDa 보호 항원 단백질을 포함하는 액체 탄저병 백신이며, 1.2㎎/㎖ 알루미늄(0.85% 염화 나트륨 중에서 수산화 알루미늄으로서 첨가됨), 25㎎/㎖ 염화 벤제토늄 및 100㎎/㎖ 폼알데하이드(보존제로서 첨가됨)와 함께 제형화한다.

혈청 샘플을 -제1일, 제0일, 제14일, 제21일, 제28일, 제35일, 제42일, 제56일 및 제70일에 종결 전에 수집하였다. -제1일, 제0일, 제14일, 제35일 및 제42일에 수집한 혈청을 사용함으로써 TNA 분석을 수행하였다. 표 6은 연구 설계를 요약한다.

TNA 분석은 LF 및 PA(치사 독소, LT)의 치사 비. 안트라시스 독소 복합체를 불활성화시키는데 필요한 항체의 양을 평가하는 기능적 시험이다. 시험관내 치사 독소를 중화하기 위한 시험 혈청 샘플의 능력을 분석의 종말점으로서 세포독성을 사용함으로써 표준 혈청 샘플의 능력과 비교하였다(PR Pittman et al., Vaccine 24(17):3654-60, 2006).

간략하게는, J774A.1 세포를 4.5g/리터 d-글루코스를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle media: DMEM) 중에서 48 내지 72시간 동안 플라스크에서 배양시켰고, 10% 열-불활성화 소 혈청, 2mM L-글루타민, 1mM 피루브산나트륨, 페니실린(50 U/㎖), 스트렙토마이신(50㎍/㎖) 및 0.11mM 중탄산나트륨으로 보충하였다. 세포를 채취하였고, 30,000 세포/웰에서 96-웰 조직 배양물 플레이트에서 파종한 다음, 16 내지 24시간 인큐베이션시켰다. 샘플 당 전체 7회 희석을 위해 2배 희석으로 별개의 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서 혈청 샘플을 제조하였다. 이어서, LT를 지니는 혈청 샘플을 1시간 동안 일정한 농도의 LT(100ng/㎖ PA 및 80ng/㎖ LF)와 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 혈청 샘플을 세포를 함유하는 조직 배양 플레이트의 대응 웰에 첨가하였고, 4시간 동안 인큐베이션시켰으며, 이후에 25㎕/웰의 5㎎/㎖ 테트라졸륨 염, 즉, 3-(4,5-다이메틸티아졸릴-2)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 첨가하였다. 1시간 인큐베이션 후에, HCl을 사용하여 pH를 4.7로 조절한 100㎕/웰의 산성화한 아이소프로판올(50% N,N-다이메틸폼아마이드(탈이온수와 함께) 및 20% SDS(1 리터의 50% 다이메틸폼아마이드 중에서 200g))를 사용함으로써 세포를 용해시켰다. 분석 플레이트를 추가 16 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰고, 570 및 690㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 캘리브레이션한 몰레큘러 디바이스 버사맥스(Molecular Devices VersaMax) 플레이트 판독기를 사용하여 690 광학 밀도값을 570 값으로부터 차감하였다. 광학 밀도 측정에서 집단의 50%에서 양자 효과를 생성하는 용량인 ED50을 소프트맥스 프로(SoffMax Pro) 소프트웨어(버전 5.4.1, 캘리포니아주 서니베일에 소재)를 사용하여 결정하였다.

마우스 기준 혈청(로트# MS011211)에 대한 ED50을 사용하여 시험 혈청 샘플 및 양성 대조군(NF50 = ED50 시험/ED50 기준)의 NF50 값을 결정하였다. CPG 7909 애주번트를 함유하는 AVA 백신을 이용하여 300마리 마우스를 면역화시킴으로써 마우스 기준 표준을 준비하였다. 300마리 마우스로부터의 혈청을 수집하고, 풀링시키며, 저장하고 기준 표준으로서 -80℃에서 냉동시켰다. 표 7A 내지 표 7C는 각각 제14일, 제35일 및 제42일에 혈청 샘플로부터의 5℃에서 저장한 동결건조 rPA, 50℃에서 저장한 동결건조 rPA 및 5℃에서 저장한 AVA 대조군에 대한 평균 역학 데이터(NF50)의 비교를 나타낸다.

모든 동물을 제0일에 독소 중화 활성에 대해 음성으로 시험하였다. <NF50>은 모두 3가지 용량 수준에서 모두 3가지 시험 백신에 대해 제35일에 최대 농도 수준에 도달하였고(도 8A 내지 도 8B, 9A 내지 9B, 및 10A 내지 10B), 이는 rPA가 모두 3가지 용량에서 AVA와 유사하거나 또는 더 양호한 면역원성 역할을 가진다는 것을 나타낸다. 도 8A 내지 도 8B에 나타낸 바와 같이, 5℃와 50℃에서 저장한 동결건조 rPA(1:4 희석)는 AVA(1:4 희석)보다 <NF50>이 더 높았다. 유사하게, 1:16 및 1:64의 희석에서, 동결건조 rPA는 비슷한 AVA 희석보다 <NF50>이 더 높았다(도 9A 내지 도 9B 및 10A 내지 도 10B).

제35일에 1:4 희석에 대해, 5 및 50℃에서 저장한 동결건조 rPA에 대한 <NF50>기하평균(gm)은 각각 3.14 및 2.98이 되는 것을 발견하였고; 1:4 희석에서 AVA의 <NF50>gm은 1.61이었다. 5℃ 대 50℃에서 저장한 동결건조 rPA 제형(1:4) 간의 <NF50>gm에서 통계적인 차이는 없었다, p=0.82(t 검정). 조합한 데이터(rPA 동결건조 5 및 50℃)의 <NF50>gm은 3.06이 되는 것을 발견하였고; 조합 <NF50>gm은 AVA 기준(1.61)보다 통계적으로 더 높았다, p = 0.034(t 검정). 제42일에(1:4), 5 대 50℃(각각 2.07 및 2.13)에서 저장한 rPA 동결건조 간에 <NF50>gm에서의 통계적인 차이가 없었고, p = 0.92(t 검정); 조합 <NF50>gm은 2.10이 되는 것을 발견하였다. 2.10의 조합 <NF50>gm은 AVA 기준(1.01)보다 통계적으로 더 높았다, p = 0.028(t 검정).

제35일에 1:16 희석에 대해, 5 및 50℃에서 저장한 동결건조 rPA에 대한 <NF50>gm은 각각 1.70 및 0.94가 되는 것을 발견하였다. 5 내지 50℃에서 저장한 rPA 동결건조간의 <NF50>gm에서 통계적인 차이가 없었다, p=0.081(t 검정). 조합 <NF50>gm은 1.27이 되는 것을 발견하였고, rPA 동결건조 (5 및 50℃)에 대한 조합 <NF50>gm 및 AVA 기준(0.67)의 그것에 대해 통계적인 차이는 없었다, p = 0.064(t 검정). 42일에(1:16), 5 대 50℃(각각 1.08 및 0.57)에서 저장한 rPA 간의 <NF50>gm에서 통계적 차이는 없었고, p=0.071(t 검정); 조합 <NF50>gm은 0.78이 되는 것을 발견하였다. 0.78의 조합 <NF50>gm은 AVA 기준(0.40)의 그것보다 통계적으로 더 높았다, p = 0.05(t 검정).

제35일에 1:64 희석에 대해, 5 및 50℃에서 저장한 동결건조 rPA에 대한 <NF50>gm은 통계적으로 차이가 없었다(각각 1.06 및 0.10), p=0.386(t 검정). 조합 <NF50>gm은 0.13이 되는 것을 발견하였고, AVA 기준은 0.06이었다. 제42일에(1:64), 5 및 50℃에서 저장한 rPA 동결건조 간의 <NF50>gm에서 통계적 차이는 없었고(각각 0.11 및 0.10), p=0.91 (t 검정); 조합 <NF50>gm은 0.11이 되는 것을 발견하였다. 0.11의 조합 <NF50>gm과 AVA 기준(0.04) 간의 통계적 차이는 없었다, p = 0.35(t 검정).

제35일 및 제42일에 3가지 희석(1:4, 1:16 및 1:64)에서 AVA에 비교한 5 및 50℃에서 저장한 동결건조 rPA의 NF50(<NF50>gm)의 기하평균을 도 11A 내지 도 11B, 도 12A 내지 도 12B, 및 도 13A 내지 도 13B에 나타낸다.

제35일에, 50℃에서 저장한 동결건조 rPA 백신에 대한 <NF50>gm은 각각 용량 1:4, 1: 16 및 1:64에 대해 2.98, 0.94 및 0.1에 되는 것을 발견하였다. 5℃에서 저장한 동결건조 rPA 백신의 <NF50>gm은 제35일(각각 3.14, 1.7 및 0.16)에 유사하였고, 50℃(알프=0.05)에 비해 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 유사한 결과를 제42일에 발견하였다. 이들 데이터는 50℃에서 4개월 동안 동결건조 rPA 백신의 면역원성이 5℃에서 저장된 동결건조 rPA 백신과 통계적으로 차이가 없다는 것을 입증하였다.

제35일에, 조합 <NF50>gm(5℃ 및 50℃)은 각각 용량 1:4, 1:16 및 1:64에서 3.06, 1.27 및 0.1이 되는 것을 발견하였고; 1:4 및 1:16에서 AVA와 비교한 조합 <NF50>gm에 대한 p값은 각각 p=0.034 및 p=0.064였다. 조합 <NF50>gm은 AVA보다 하위에 있지 않다(통계적으로 더 높거나 또는 차이 없음)는 것을 발견하였다. 제42일에 대해 유사한 결과를 나타낸다. 제42일에, 1:4, 1:16 및 1:64에 대한 조합 <NF50> 값은 각각 2.10, 0.78, 0.11이었고; 1:4, 1:16 및 1:64에서 AVA와 비교한 조합 <NF50>gm에 대한 p값은 각각 p=0.92, p=0.071 및 p=0.91이었다. 이들 면역원성 데이터는 5℃ 및 50℃에서 4개월 동안 저장한 rPA 동결건조 백신이 적어도 AVA 백신만큼의 면역원성이 있다는 것을 나타낸다.

요컨대, 이들 결과는 시험 동결건조 제형이 50℃에서 적어도 4개월 동안 rPA 백신을 안정화시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 데이터는 rPA 동결건조 제형은 AVA 백신에 비해 우수한 열 안정성 프로파일을 가진다는 것을 입증하였다. 따라서, 결과는 rPA 동결건조 제형이 rPA 탄저병 백신 저장에 효과적이고, 시험 제형이 실온 온도 안정하며, 저온유통 배급을 피할 수 있다는 것을 나타내었다.

실시예 5: 기니픽 면역원성 연구

기니픽 면역원성 연구를 표 8에서 약술한다.

실시예 6: 마우스에서 면역원성 및 이화학적 안정성

3가지 동결건조 면역원성 및 이화학적 안정성에 대해 시험하였고 rPA 백신 제형을 액체 rPA 백신과 비교하였다. rPA 백신(이화학적 안정성 특성)의 내용물 및 순도를 대식세포 용해 분석(MLA), 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC) 및 음이온 교환 크로마토그래피(AEX-HPLC)에 의해 측정하였다. 4회 용량 수준에 의해 CD-1 마우스를 백신접종함으로써 rPA 백신의 면역원성을 평가하였고, 탄저병 독소(NF50)를 중화하는 마우스 혈청의 능력을 시험하였다.

액체 rPA 백신 제형

0.15㎎/㎖ rPA, 1.5㎎/㎖ 명반, 2% 아르기닌, 0.01% 트윈 80, 25mM NaPi, pH 7.0에서 함유하는 액체 rPA 제형(F1)을 무균상태 하에 제조하였다. 안정성 분석을 위한 샘플은 10㎖ 유리 바이알 중에 채운 5㎖ 액체 현탁액을 함유하였다(바이알 당 10 용량). 의도된 인간 용량은 근육내 주사에 의해 0.5㎖ 당 75㎍ rPA/750㎍ 명반이다.

동결건조 rPA 백신 제형

3가지의 동결건조 rPA 제형을 제조하였다. 동결건조 전에 최종 제형을 표 9에 나타낸다. 0.15㎎/㎖ rPA, 1.5㎎/㎖ 명반, 20% 트레할로스, 2% 알라닌, 0.025% 트윈80 및 5mM NaPi, pH 7.0를 지니는 제1 로트(동결건조A)를 제형화하였다. 제2 및 제3 로트(각각 동결건조B 및 동결건조C)는 표 9에 표시한 바와 같이 당, 아미노산 및 완충제를 약간 변화시켜 3.3x 더 높은 rPA 및 명반 농도(각각 0.5㎎/㎖ 및 5.0㎎/㎖)를 함유하였다.

용액 중에서 유리 rPA 단백질이 거의 또는 전혀 없는 명반에 대부분의 rPA가 결합되도록 모두 3가지의 rPA 동결건조 제형을 설계하였다. 2㎖ 액체 현택액을 10㎖ 유리 바이알에 채웠다. 다음의 처리 파라미터로 FTS LyoStar(등록상표) II를 사용하여 동결건조를 수행하였다.

백신접종 및 시험 전에, 동결건조 샘플을 주사용수(WFI)를 이용하여 재구성하여 모두 3가지 제형에 대해 최종 농도 0.15㎎/㎖ rPA 및 1.5㎎/㎖ 명반을 생성하였다. 1.55, 6.2 및 6.18㎖의 WFI를 제1 로트(동결건조 A), 제2 로트(동결건조 B) 및 제3 로트(동결건조 C)에 각각 첨가함으로써 최종 농도를 달성하였다. 동결건조 A에 대한 바이알 당 최종 현탁액 용적은 2.0㎖였고, 로트 동결건조 B와 동결건조 C 둘 다에 대해 6.7㎖였다. 재구성 후에 rPA 백신의 농도를 표 10에 나타낸다.

로트 동결건조 B 및 동결건조 C에서의 바이알 당 전체 용량 수는 로트 동결건조 A에서의 바이알 당 전체 용량 수보다 더 높았다(13.3 대 4.0). 더 높은 용량(예컨대 바이알 당 13.3 용량)의 바이알의 제조 비용은 더 낮은 용량 바이알(예를 들어, 바이알 당 4 용량)의 제조비용보다 유의하게 더 낮다. 따라서, 이는 더 높은 용량 바이알을 생산하기 위한 제형 및 공정을 개발하는 것에 경제적인 선호도가 있었다.

안정성 및 시험 분석

rPA 액체 제형(F1)을 5, 25 및 40℃의 저장 온도에서 장기간 안정성 프로그램에 두었다. 3가지 rPA 동결건조 로트(동결건조 A, 동결건조 B 및 동결건조 C)를 5, 25, 40 및 50℃의 저장 온도에서 장기간 안정성 프로그램에 두었다. 이화학적 시험을 액체(F1)와 동결건조 rPA 백신 제형 둘 다에 대해 수행하였다. 샘플에 대한 사(4) 개월의 데이터를 수집하였다.

rPA 시험 백신의 이화학적 특성을 일련의 분석, 즉, MLA, SEC-HPLC 및 AEX-HPLC에 의해 평가하였다. 명반으로부터 추출한 rPA 단백질을 사용하여 모든 이들 분석을 수행하였다. 추출 절차는 200mM 인산칼륨/0.01% 트윈80/0.9% NaCl을 이용하였다.

-80℃에서 저장한 rPA 벌크 약물 물질(bulk drug substance: BDS)을 기준 대조군으로서 사용하였다. BDS 대조군을 rPA의 생성을 위한 무포자, 비독성 발현 시스템으로서 육군 전염병의학연구소(U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases: USAMRIID)에 의해 개발된 비. 안트라시스의 Δ스턴-1(pPA102)CR4 균주로부터 정제하였다. rPA BDS를 정제하였고 -80℃ 냉동 조건 하에 20mM 트리스, 0.9% NaCl, pH 7에서 저장하였다.

I. 대식세포 용해 분석(MLA)

시험관내 대식세포 용해 분석(MLA)을 사용하여 뮤린 대식세포 세포주 J7774 A.1에 대한 rPA 세포독성을 결정하였다. MLA는 rPA 및 rLF 독소의 활성을 측정한다. 분석은 치사인자 단백질(rLF)에 rPA 단백질을 첨가하여 대식세포의 세포막에 의한 기공 형성을 야기하는 치사 독소 복합체를 형성하며, 이는 세포 용해를 야기하였다.

rPA 동결건조 백신(명반으로부터 흡착된 rPA를 사용)의 활성을 BDS 기준 표준에 대해 측정하였고, 기준 표준의 백분율로서 기록하였다. 세포 생존 독소 시험감염의 백분율을 결정하였다. 예를 들어, rPA 백신의 100% MLA 활성은 명반에 흡착된 rPA의 세포독성 활성에서 동결건조 후에 손실이 없다는 것을 나타낸다. 간략하게, 소식세포를 5x10⁴ 세포/웰에서 96웰 플레이트에 파종하였고, 플레이트를 CO₂ 인큐베이터에서 밤새 두었다. 다음날, 100㎕의 단계희석시킨 rPA 시험 샘플 또는 rPA 기준 표준(출발 rPA 농도는 800ng/㎖였고, 이어서 0.8ng/㎖까지 1:2로 희석시킴)을 rLF(rLF 농도는 100ng/㎖에서 일정함)와 혼합하였고, 웰에 첨가하였다. 4시간 후에, 25㎕의 MTT(3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드)를 5㎎/㎖에서 각 웰에 첨가하였고, 플레이트를 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 1.5시간 인큐베이션 후에, 100㎕의 가용성 용액(50% 다이메틸폼아마이드 용액 중에서 20% SDS)을 웰에 첨가하였고, 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음날, 플레이트를 570㎚에서 플레이트 판독기에 의해 판독하였고, OD 판독을 소프트웨어(소프트맥스(SoftMax))를 사용하여 4-파라미터 모델로 그래프화 하였다. 이어서, 시험 샘플 rPA의 ED50 값을 rPA 기준 표준과 비교하였고, 그들의 비를 사용하여 rPA 시험 샘플의 상대적 활성을 보고하였다. 분석 정확도는 +/-30%가 되는 것으로 결정하였다.

II. 크기-배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)

SEC-HPLC는 단백질을 그들의 분자량 및 크기에 기반하여 분리시키기 위해 사용한 크로마토그래피 기법이며, 이는 보통 제형 내 단백질의 안정성을 평가하기 위해 사용한다. 더 큰 단백질은 전형적으로 더 작은 단백질보다는 SEC-칼럼에서 체류 시간이 더 짧다(더 빨리 용리됨). 분해되는(또는 단편화된) 단백질은 크기가 더 작게 되고, 크로마토그래피 이후에 용리될 것이다. 반대로, 응집된 단백질은 더 빨리 용리될 것이다. 예를 들어, 크기가 증가된 응집 rPA 단백질은 천연 rPA 단백질보다 체류 시간이 더 짧으며, 분해 rPA 단백질(크기가 붕괴)은 체류 시간이 더 길다.

SEC-HPLC는 제형 내 단백질의 이화학적 안정성을 평가하기 위해 사용되는 흔한 분석이다. MLA와 비교하면, SEC-HPLC는 일반적으로 상대적으로 더 민감하며, 피크 영역%에서 5% 미만의 정확도로 정량화되고, 동일한 실행 내에서 체류 시간은 0.1% 미만이다.

pH 7.4에서 50mM 인산나트륨/250mM 염화칼륨의 이동상을 이용하는 TSK G3000SWXL 칼럼(토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience) P/N M1182-05M)을 사용하여 SEC-HPLC를 수행하였다. 215㎚에서의 자외선(UV) 검출기 또는 280㎚(여기) 및 335㎚(방출)에서의 형광 검출기를 검출을 위해 사용하였다.

III. 음이온 교환 크로마토그래피(AEX-HPLC)

AEX-HPLC는 단백질을 그들의 순정전하(net electrostatic charge)에 기반하여 분리한다. 일반적으로, 분석은 음이온 교환 칼럼을 구비한 HPLC 내로 rPA 단백질 용액을 주입하는 것을 수반한다. 정전기 상호작용에 기인하여 음이온 교환(AEX) 칼럼(정지상)에 의해 rPA 단백질을 보유하였다. 이어서, 점진적으로 증가된 이온 강도(NaCl 농도)로 이동상을 사용함으로써 rPA 단백질을 용리시켰다. rPA 분자가 용리된 이온 강도(또는 용리 시간)는 그의 순전하와 관련된다.

rPA 분자는 순전하의 변화를 야기하는 탈아마이드화 메커니즘에 의해 분해되기 쉬운 것으로 알려져 있다(D'Souza, Journal of Pharmaceutical Sciences, 102(2):454-461, 2013). 탈아마이드화는 아스파라긴 잔기의 아스파테이트(더 음성)로의 전환에 기인하여 rPA 단백질의 음의 전하를 증가시킨다. 탈아마이드화된 rPA(전형적으로 산성 종으로서 지칭됨)는 더 높은 이온 강도 용액에서 용리되며, 천연 rPA 단백질보다 용리 시간이 더 길다. rPA의 순도는 주요 피크%에 의해 특성규명된다.

pH 8.0에서 25mM 트리스의 이동상 A 및 pH 8.0에서 25mM 트리스, 0.5M NaCl의 이동상 B를 사용하여 해밀턴 PRP-X500 음이온 교환 칼럼(P/N 79641)을 사용하여 AEX-HPLC를 수행하였다. SEC-HPLC와 유사하게, UV 또는 형광 검출기를 사용하였다.

IV. 면역원성 시험

독소 중화 분석(TNA)을 사용하여 면역원성을 평가하였다(문헌[Hering et al., Biologicals 32 (2004) 17-27; Omland et al., Clinical and Vaccine Immunology (2008) 946-953; 및 Li et al, Journal of Immunological Methods (2008) 333 :89-106]). 마우스 기준 혈청(상기 기재한 바와 같이 제조)에 대한 ED50 값을 사용하여 시험 혈청 샘플 및 양성 대조군의 NF50 값을 결정하였다. 첫째 달의 안정성 데이터를 본 명세서에서 보고한다.

생체내 면역원성 시험에 대해, 그룹 당 20마리 암컷 CD-1 마우스는 동결건조 A, 동결건조 B, 동결건조 C, 또는 액체 rPA(F1)의 단일 0.5㎖ 복강내(i.p.) 주사를 받았다. 4가지 희석 용량 수준을 평가하였다(1:4, 1:8, 1:16 및 1:32). 식염수 용액에 의한 백신접종일에 희석물을 제조하였다. 백신접종 후 제28일에 심장 출혈에 의해 혈청 샘플을 얻었다.

이화학적 안전성 결과

표 11은 4개월에 5, 25, 40 및 50℃에서 저장한 3가지 동결건조 제형 및 BDS 기준 대조군의 MLA, SEC-HPLC 및 AEX-HPLC 결과를 요약한다.

대식세포 용해 분석 결과

이들 MLA 결과는 BDS 기준 대조군(+/- 30%의 오차 가변성 내임)과 비교할 때, 40 및 50℃까지의 온도에서 4개월에 저장된 3가지 동결건조 제형에 대한 rPA 세포독성에서 유의한 하락이 없음을 나타낸다.

비교하면, 5, 25 및 40℃에서 1개월 동안 저장한 액체 rPA 백신(F1)에 대한 MLA 값에서 유의한 하락이 있다. MLA 값은 5, 25 및 40℃에서 각각 98%, 65% 및 0%가 되는 것을 발견하였다. 도 14는 4개월 동안 저장한 3가지 동결건조 로트 대 1개월 동안 저장한 rPA 액체 로트(F1)에 대한 저장 온도의 함수로서 MLA%의 비교를 나타낸다. 이들 결과는 3가지 동결건조 제형이 40 및 50℃에서 적어도 4개월까지 동안 rPA 백신의 MLA 활성을 유지한 반면, 액체 rPA 백신은 1개월 동안 40℃에서 저장 후에 MLA 활성을 모두 상실한다는 것을 나타낸다.

크기-배제 크로마토그래피(SEC-HPLC) 결과

rPA 기준 대조군(BDS)의 전형적인 SEC 크로마토그래피를 도 15B에 나타낸다. 각 샘플 피크에 대해 피크 면적%를 계산하였다. 천연 rPA 단백질(단량체)은 85%의 주요 피크 면적%로 17.1분에 용리되었다. 제2 피크는 18.2분에 용리되었고, ~15%의 응집 rPA 분자 주요 피크 면적에 대응한다. rPA 단백질의 순도%를 17.1분 용리 피크의 면적%에 의해 결정하였고, 즉, rPA 단백질 순도(순도% rPA) = rPA 피크의 피크 면적%(~17.1분의 체류시간을 지니는 단량체 rPA에 대응)/(전체 피크 면적).

동결건조 A, 동결건조 B 및 동결건조 C에 대한 순도 결과는 -80℃에서 저장한 84.0%의 rPA 기준 BDS에 대한 순도 결과와 비슷하였다, 표 11 참조. SEC-HPLC 데이터는 모든 저장 온도에서 4개월 저장한 모두 3가지의 동결건조 제형에 대해 기준 대조군에 비해 순도의 유의한 하락이 없다는 것을 나타내었다.

비교로서, 1개월 동안 가속 온도(25, 40 또는 50℃)에서 저장될 때 액체 rPA 백신에 대한 순도의 유의한 하락이 있었다. 액체 제형의 rPA의 상대적 순도%는 5, 25 및 40℃에서 각각 -3.3%, -7.2% 및 -98.6%로 하락하였다.

BDS 기준 대조군의 순도%는 각각 동결건조 및 액체 분석에 대해 84.0% 및98.6%이 되는 것을 발견하였다. 상이한 시간에 2가지 시험을 수행하였다. 기준 대조군의 순도%의 차이는 특이하지 않았다. 차이는 SEC-칼럼 조건 및 샘플 제조 절차를 달리하는 것에 기인할 수 있었다. 상대적 순도%(기준 대조군에 대해)는 상이한 시간에 상이한 실험실에 걸쳐 안정성 샘플을 비교하기 위해 전형적으로 사용된다.

도 15A는 액체 제형에 비해 3가지 동결건조 제형에 대해 저장 온도의 함수로서 rPA SEC 순도%(BDS 기준 대조군에 대해)의 상대적 감소를 나타낸다. 데이터는 40 또는 50℃에서 적어도 4개월 동안 저장한 동결건조 rPA 백신에 대한 SEC-순도에서 변화가 없는 반면, 액체 rPA 백신은 40℃에서 1개월 저장 후에 완전히 분해되었다는 것을 입증하였다.

음이온 교환 크로마토그래피(AEX-HPLC) 결과

rPA 기준 대조군(BDS)에 대한 전형적인 AEX 크로마토그래프를 도 16B에 나타낸다. rPA의 순도는 주요 피크 면적%에 의해 특성규명된다. 천연 rPA 단백질은 21.0분에 용리되고, ~81.4%의 주요 피크를 지녔다. 탈아마이드화된 rPA(전형적으로 산성종으로 지칭)는 16.6%의 면적으로 21.7 내지 22.4 분에 용리되었다. 우선 모든 피크의 곡선하 면적을 합함으로써(완충제 피크는 제외) 주요 피크 면적%를 계산하였고, 이어서, 주요 피크 면적%은 rPA 피크에 대응하며 체류 시간은 21.0분이었다(즉, 주요 피크 면적% = 피크 면적(RT=21.0분)/모든 피크 면적의 합). SEC-HPLC와 유사하게, rPA의 순도는 주요 피크 면적%와 동일하였다. AEX 분석의 정확도는 약 10% 내지 15%였다.

4개월 동안 저장한 처음 동결건조시킨 로트(동결건조A)의 AEX 순도%는 5, 25 및 40℃에서 각각 87.1, 86.6, 84.7이 되는 것을 발견하였다. 두번째 동결건조 로트(동결건조B)에 대한 AEX 순도는 5, 25 및 50℃에서 각각 87.8%, 86.2% 및 85.3%였다. 세번째 동결건조 로트(동결건조C)에 대한 AEX 순도%는 5, 25 및 50℃에서 각각 87.5%, 84.5% 및 70.5%였다. 동결건조 A, 동결건조 B 및 동결건조 C에 대한 이들 순도 결과는 80.8%의 rPA 기준 대조군(BDS) 순도와 비슷하였다. 모든 저장 온도에서 4개월 저장한 후에 모두 3가지 동결건조 제형에 대한 기준 대조군에 대해 순도의 유의한 하락은 없다.

1개월에 저장한 액체 rPA 백신의 AEX 순도는 5, 25 및 40℃에서 각각 65.5%, 25.6% 및 0%가 되는 것을 발견하였고; rPA 기준 대조군(BDS)에 대한 AEX 순도는 액체 rPA를 시험하는 분석에서 사용할 때 78.2%였다. AEX 순도 결과를 표 11에 요약한다.

도 16A에 나타낸 바와 같이, 동결건조 제형에 비해 5, 25 및 40℃에서 rPA 액체 제형(F1)에서의 AEX-순도에서 유의한 하락이 있었다. AEX-데이터는 40 또는 50℃에서 적어도 4개월 동안 저장한 동결건조 rPA 백신의 순도의 손실이 없는 반면; 액체 백신은 40℃에서 저장 후 1개월에 완전히 분해되었다는 것을 입증하였다.

생체내 면역원성 결과

1개월 동안 저장한 3가지 동결건조 제형에 대해 용량 수준 0.25, 0.125, 0.0625 및 0.03125에서 마우스에서의 NF50 결과를 각각 결정하였다. 도 17A 내지 도 17D, 도 18A 내지 도 18D, 및 도 19A 내지 도 19D는 그들의 대응하는 제형 및 용량 수준에서 다양한 온도(5, 25 및 40℃)에 걸쳐 NF50 데이터(n=20)를 비교한다.

3가지 동결건조 제형의 4가지 용량 수준에 대해 5, 25 및 40℃에서 NF50(<NF50>gm)의 기하평균을 표 12A 내지 표 12C에서 요약한다.

1개월 동안 저장한 후에 로트 동결건조 A에 대해, <NF50>gm은 용량 수준 0.25에서 5, 25 및 40℃에서 각각 1.12, 1.20 및 1.13이 되는 것을 발견하였다. p=0.97에서 3가지 저장 온도(5, 25 및 40℃) 중에서의 <NF50>gm에서 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 유사하게, 또한 모두 3가지 동결건조 제형(동결건조 A, 동결건조 B 및 동결건조 C)에 대해 다른 시험 용량 수준(0.125, 0.0625 및 0.01315)에서 다양한 저장 온도 중에서의 <NF50>gm에서 통계적인 차이가 없다는 것을 나타내었다. NF50 데이터는 40℃까지 1개월에 3가지 동결건조 제형에 대한 면역원성의 유의한 하락이 없다는 것을 입증하였다.

대조적으로, 액체 rPA 제형(F1)은 1개월에 25 및 40℃ 저장 온도에서 면역원성의 유의한 하락을 나타내었다. 표 13은 5, 25 및 40℃에서 1개월에 저장한 rPA 액체 제형에 대한 <NF50>gm 결과를 나타낸다.

0.3 용량 수준에서, <NF50>gm은 5, 25 및 40℃에서 각각 1.26, 0.69 및 0.30이 되는 것을 발견하였고, p=0.0023에서 모든 <NF50>gm에서 통계적으로 유의한 차이가 있었다. 유사하게, 0.2, 0.1 및 0.05의 더 낮은 용량 수준에서, <NF50>gm은 저장 온도가 증가함에 따라 유의하게 하락하였다(도 20A 내지 도 20D 참조). NF50은 5℃에서 모두 4가지 용량 수준에 비교하여 25℃에서, 더 계속해서 40℃에서 저장하였을 때, 유의하게 감소되는 것을 발견하였다.

요컨대, 면역원성 데이터는 액체 rPA 제형 이상으로 동결건조 rPA 제형의 우월성을 입증하였다. 동결건조 제형은 25 및 40℃에서 적어도 1개월 동안 그들의 면역원성을 유지한 반면, 액체 제형의 면역원성은 유사한 저장 조건에 걸쳐 유의하게 감소된다.

대부분의 액체 백신과 마찬가지로, 액체 rPA 백신은 가속화된 저장 온도(예를 들어, 25 및 40℃)에서 불안정하게 되는 것을 발견하였다. 액체 rPA 백신은 40℃에서 1개월 동안 저장될 때 그의 면역원성 및 중요한 이화학적 특성을 상실하였다. 유사하게, 백신의 중요한 이화학적 특성은 또한 상당히 감소되었다. 대식세포 용해 분석(MLA), 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC) 및 음이온 교환 크로마토그래피(AEX-HPLC)에 의해 측정한 바와 같은 백신의 내용물 및 순도는 25℃에서 상당히 감소되는 것을 발견하였고, 40℃에서 1개월 동안 검출될 수 없다. 액체 rPA 백신은 특히 그것이 알루미늄 상에 흡착되고 가속화된 온도에서 저장될 때, 탈아미드화 반응이 되기 쉬운 것으로 알려졌다.

3가지 동결건조 제형은 로트 번호: 동결건조A, 동결건조B 및 동결건조C로서 제조하였다. 이들 3가지 새로운 rPA 동결건조 제형은 rPA 액체 백신 이상으로 우수한 안정성 프로파일을 가졌다. 50℃까지의 온도에서 4개월 동안 저장하였을 때, 동결건조 제형의 모두 3가지 로트에 대한 모든 중요한 이화학적 분석(MLA, SEC-HPLC 및 AEX-HPLC)에서 순도의 통계적으로 유의한 변화는 없었다. 추가로, 동결건조 백신이 40℃까지에 대해 1개월에 4 용량 수준에서 저장될 때, 면역원성(NF50)의 상당한 하락은 없다.

본 명세서의 결과는 동결건조 rPA 제형이 액체 rPA 제형 이상으로 우수한 이화학적 및 면역학적 안정성 프로파일을 가진다는 것을 나타낸다. 동결건조 제형은 50℃까지의 저장 온도에서 4개월의 저장 기간에 걸쳐 MLA, SEC 및 AEX에 의해 시험한 모든 중요한 이화학적 특성을 유지하였다. 동결건조 제형은 또한 40℃까지의 저장 온도에서 적어도 1개월 동안 면역원성을 유지하였다. 대조적으로, 액체 rPA 제형은 이화학적 특성의 완전한 손실(MLA, SEC 및 AEX) 및 40℃에서 1개월 동안 저장한 후에 면역원성의 상당한 하락을 나타내었다.

실시예 7: 다른 애주번트를 이용한 제형 및 동결건조

CPG 7909 벌크 약물 물질(BDS)은 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) 보틀에 동결건조 분말로서 패키징하고, 다층(마일러, 호일) 파우치에 가열 밀봉하며, -20℃±5℃에서 저장하였다.

글루코피라노실 액체 애주번트(GLA)를 아반티 폴라 리피드 인코포레이티드(Avanti Polar Lipids, Inc.)로부터 얻었다. 이는 25㎎의 동결건조 GLA 분말을 함유하는 2㎖ 호박색 유리 바이알에 패키징하였고, -20℃±5℃에서 저장하였다. GLA는 문헌[Arias et al. (2012) PLoS ONE 7(7):e41144]에 기재되어 있다.

벌크 약물 물질(BDS): 2.81㎎/㎖ rPA, 0.9% NaCl 및 pH 7.4에서 20mM 트리스-HCl 중의 완충제를 사용하였다. 이를 -80℃에서 저장하고 사용 전에 5℃에서 밤새 해동시켰다.

폴리I 폴리C(PolyI PolyC: PIPC)를 50㎎의 PIPC를 함유하는 동결건조 케이크로서 20㎖ 유리 바이알 내 인비비겐(InviviGen)으로부터 얻었다. 이를 5℃에서 저장하였다.

화학물질 및 공급원
화학명	공급원
트리스 하이드로클로라이드, 울트라퓨어(Ultrapure)	암레스코(Amresco)
2% 알하이드로겔(10㎎/㎖ 알루미늄)	브렌타그(Brenntag)
α,α-트레할로스 다이하이드레이트	하야시바라 바이오케미컬스(Hayashibara Biochemicals)
인산나트륨, 1염기성, 무수	시그마 알드리치(Sigma Aldrich)
인산나트륨, 2염기성, 헵타-수화물	BDH
폴리솔베이트 80, N.F.	제이.티. 베이커(J.T. Baker)
L-알라닌	EMD

장비/재료
명칭	공급원
비르티스 애드번티지 플러스 동결건조기(VirTis AdVantage Plus Lyophilizer)	에스피 사이언티픽(SP Scientific)
휘스턴 혈청 바이알(Wheaton Serum Vials), 붕규산 유리	VWR
동결건조 바이알용 일자형 고무 마개	VWR
플립-오프 크림프 실(flip off crimp seal)	VWR

저장 용액 제조

트레할로스의 2개 60%(w/v) 용액을 20mM 트리스 및 5mM NaPi 완충제 중에서 별개로 제조하였고, 멸균 여과시켰다. 폴리솔베이트80의 10%(v/v) 용액을 탈이온수 중에서 제조한 다음, 멸균 여과시켰다. 알라닌의 2개의 12%(w/v) 용액을 20mM 트리스 및 5mM NaPi 완충제 중에서 별개로 제조하였고, 멸균 여과시켰다.

하나의 수산화 알루미늄 저장액을 343㎖의 2% AlOH(또는 10㎎/㎖ 알루미늄)까지 7㎖의 1M 트리스 완충제, pH 7.4를 첨가함으로써 완충시켰고, pH 7.4로 적정하였다. 두번째 수산화 알루미늄 저장액을 348.25㎖의 2% AlOH까지 1.75㎖의 1M NaPi 완충제, pH 7.0를 첨가함으로써 완충시켰고, pH 7.0으로 적정하였다. 완충제 첨가 및 후속적 적정으로부터의 용리 효과는 제조에서 보고되지 않았다.

애주번트 제조

50㎖ 코니칼튜브 내로 31.2㎎의 분말을 첨가하고, 15.6㎖의 완충제를 첨가함으로써 20mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.4 중에서 GLA 애주번트를 제조하였다. 최대 전력 15W로 혼합물을 10초 간격과 10초 휴지에서 전체 60초 동안 초음파 처리하였다. 혼탁한 혼합물을 2㎎/㎖ GLA로 얻었다.

CPG 7909 저장액을 20mM 트리스, pH 7.4 또는 5mM NaPi, pH 7.0 완충제 중에서 제조하였다. 각 제조에서, 약 200㎎의 CPG 7909 분말을 최종 용적 10㎖ 중에 완전히 용해시켰다. 제조 둘 다에 대해 맑은 용액을 얻었다.

PIPC의 2㎎/㎖ 저장액을 25㎖의 5mM NaPi 완충제, pH 7.0 중에서 PIPC의 50㎎ 동결건조 케이크를 용해시킴으로써 제조하였다. 최대 전력 15W로 혼합물을 10초 간격과 10초 휴지에서 전체 60초 동안 초음파 처리하였다. 눈에 보이는 입자가 없는 맑은 용액을 얻었다.

배합을 위한 제형 절차

표 16은 준비한 제형의 화학적 조성물을 나타낸다:

표 16에서의 제형 배합물을 표 17에 나타낸 바와 같은 완충 저장액을 사용하여 제조하였다.

모든 부형제를 배합하기 위해 사용한 추가 순서는 다음과 같았다: 수산화 알루미늄 → 트레할로스 → 트윈 80 → 알라닌 → 완충제 → rPA → CPG 또는 GTA 애주번트

최종 용적 20㎖를 동결건조를 위한 샘플 14 내지 20, 40 내지 45 및 76 내지 81에 대해 제조하였다. 배합물을 10㎖ 유리 바이알내로 2㎖ 알리쿼트로 분할하였고, 동결건조를 위해 따로 두었다.

동결건조 절차

비르티스 플러스 냉동 건조기를 사용하여 샘플을 동결건조시켰다. 73시간 주기를 사용하였고, 표 18에서 기재한 바와 같이 시작하였다.

데이터의 요약

6개 백신 제형의 면역학적 반응을 IP 경로를 사용하는 1회의 면역화를 이용하여 마우스(n=10)에서 시험하였다. 혈청을 면역화 후 28일에 수집하였다. 용량 수준 = 0.4에서 TNA 데이터를 실시예 3에서 기재한 바와 같이 결정하였고, 결과를 표 19에 요약한다.

평균 NF50은 CPG-액체, CPG-동결건조, GLA-액체, GLA-동결건조, PIPC/CPG-액체 및 PIPC/CPG-동결건조 샘플에 대해 각각 53.6, 48.9, 69.9, 64.7, 89.4 및 77.3이 되는 것을 발견하였다. CPG, GLA 및 PIPC/CPG에 대한 동결건조 제형에 대해 액체의 평균 NF50에서 통계적인 차이는 없다. 데이터는 동결건조 제형 및 공정이 다른 애주번트의 존재에서조차 면역원성을 유지할 수 있다는 것을 입증하였다.

실시예 8: 동결건조 rPA 백신의 면역원성

이 실시예는 새로 만든 액체 백신을 5 및 50℃에서 1개월 동안 저장한 동결건조 백신에 대해 비교하고, 시트르산(pH 5.5) 완충제에 대해 NaPi(pH 7.0)에서 만든 CPG 제형을 비교한다.

이 연구 하에 평가한 4가지 제형이 있다:

NaPi 중의 rPA 명반(pH 7.0)

NaPi 중의 rPA 명반 + CPG(pH 7.0)

시트르산 중의 rPA 명반 + CPG(pH 5.5)

트리스 중의 rPA 명반 + GLA(pH 7.4)

저장 용액 제조

트레할로스의 3가지 60%(w/v) 용액을 제조하였다(20mM 트리스 중의 하나(pH 7.4), 5mM NaPi 완충제 중의 두번째(pH 7.0) 및 20mM Na-시트르산 중의 세번째(pH 5.5)). 90㎖의 탈이온수 중에서 10㎖의 진한 트윈80을 혼합함으로써 폴리솔베이트80의 10%(v/v) 용액을 제조하였다. 알라닌의 3가지 12%(w/v) 용액을 제조하였고(20mM 트리스 중에서 하나(pH 7.4), 5mM NaPi 완충제 중에서 두번째(pH 7.0) 및 20mM Na-시트레이트 중에서 세번째(pH 5.5)), 모두 멸균 여과시켰다.

3가지 수산화 알루미늄 저장액을 2% AlOH에 1M 완충제를 첨가함으로써 완충시켰다. 얻어진 저장액을 원하는 pH로 적정하여 사용 중인 완충제와 매칭하였다. 완충제 첨가 및 후속 적정으로부터의 희석 효과는 제조 중 어떤 것에서 보고되지 않았다.

(표 19)

각각의 제형을 배합한 다음, 실시예 7에 기재한 바와 같은 동결건조 공정을 사용하여 바이알 당 2㎖에서 동결건조시켰다.

동물 모델

각 동물은 열거한 제형의 1/16 희석물 0.5㎖를 받았다. 그룹 당 5마리 암컷/5마리 수컷 기니픽(n=10). IM 면역화를 제0일 및 제14일에 수행하였다. 혈액 수집을 제14일, 제28일 및 제35일에 수행하였다. 제28일에 TNA 데이터를 분석하고, 제공하였다.

NF50 데이터

도 21은 12가지 제형의 NF50 및 평균의 표준편차를 나타낸다.

표 21은 12가지 제형의 각 마우스의 수치 값을 나타낸다.

NF50 데이터는 4가지 동결건조 제형의 우수한 안정성을 나타낸다. 또한 제형의 견고성(robustness)을 입증하였다.

4가지 제형에 대해 액체 제형, 새로운 제형, 동결건조 제형(1개월 동안 5 및 50℃) 중에서 NF50 평균 및 기하평균의 통계적인 차이는 없음:(표 21 참조)

rPA 명반 + CPG 제형에 대한 NaPi 대 시트르산 완충제 간의 NF50의 평균 및 기하평균의 통계적 차이는 없었다, (표 21 참조)

실시예 9: 인플루엔자 항원(들)을 지니는 제형

인플루엔자 항원(들)을 함유하는 제형은 인플루엔자 항원(들)의 존재 및 rPA 항원의 부재를 제외하고 rPA 제형에 대해 본 명세서에 개시한 것과 유사한 방법을 사용하여 제형화한다.

인플루엔자 항원을 함유하는 제형의 예를 표 20에 열거한다.

2세트의 제형(5mM NaPi, pH 7.0 완충제 또는 20mM 트리스, pH 7.4 완충제에서 하나씩)을 만든다. 인플루엔자 항원은 인플루엔자 혈구응집소이다. 제형은 또한 CPG 0.5㎎/㎖, PIPC 0.5㎎/㎖, GLA 0.1㎎/Ml 또는 이들의 조합 등과 같은 다른 애주번트를 함유할 수 있다.

각각의 제형은 실시예 7에 기재한 바와 같은 동결건조 공정을 사용하여 바이알마다 2㎖로 동결건조된다.

각각의 제형을 면역원성 연구, 안정성 연구 및/또는 효능 연구에서 시험한다.

SEQUENCE LISTING <110> EMERGENT PRODUCT DEVELOPMENT GAITHERSBURG INC. <120> TEMPERATURE STABLE VACCINE FORMULATIONS <130> WO/2014/004578 <140> PCT/US2013/047712 <141> 2013-06-25 <150> US 61/664,062 <151> 2012-06-25 <150> US 61/801,385 <151> 2013-03-15 <160> 3 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 735 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Glu Val Lys Gln Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser Ser Ser 1 5 10 15 Gln Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Asn Phe Gln Ala Pro 20 25 30 Met Val Val Thr Ser Ser Thr Thr Gly Asp Leu Ser Ile Pro Ser Ser 35 40 45 Glu Leu Glu Asn Ile Pro Ser Glu Asn Gln Tyr Phe Gln Ser Ala Ile 50 55 60 Trp Ser Gly Phe Ile Lys Val Lys Lys Ser Asp Glu Tyr Thr Phe Ala 65 70 75 80 Thr Ser Ala Asp Asn His Val Thr Met Trp Val Asp Asp Gln Glu Val 85 90 95 Ile Asn Lys Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile Arg Leu Glu Lys Gly Arg 100 105 110 Leu Tyr Gln Ile Lys Ile Gln Tyr Gln Arg Glu Asn Pro Thr Glu Lys 115 120 125 Gly Leu Asp Phe Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gln Asn Lys Lys Glu 130 135 140 Val Ile Ser Ser Asp Asn Leu Gln Leu Pro Glu Leu Lys Gln Lys Ser 145 150 155 160 Ser Asn Ser Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro 165 170 175 Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr 180 185 190 Thr Val Asp Val Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser 195 200 205 Asn Ile His Glu Lys Lys Gly Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu 210 215 220 Lys Trp Ser Thr Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr 225 230 235 240 Gly Arg Ile Asp Lys Asn Val Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val 245 250 255 Ala Ala Tyr Pro Ile Val His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser 260 265 270 Lys Asn Glu Asp Gln Ser Thr Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr 275 280 285 Ile Ser Lys Asn Thr Ser Thr Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His 290 295 300 Gly Asn Ala Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val 305 310 315 320 Ser Ala Gly Phe Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His 325 330 335 Ser Leu Ser Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu 340 345 350 Asn Thr Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn 355 360 365 Thr Gly Thr Ala Pro Ile Tyr Asn Val Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val 370 375 380 Leu Gly Lys Asn Gln Thr Leu Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln 385 390 395 400 Leu Ser Gln Ile Leu Ala Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu 405 410 415 Ala Pro Ile Ala Leu Asn Ala Gln Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile 420 425 430 Thr Met Asn Tyr Asn Gln Phe Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu 435 440 445 Arg Leu Asp Thr Asp Gln Val Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr Asn Phe 450 455 460 Glu Asn Gly Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser Asn Trp Ser Glu Val 465 470 475 480 Leu Pro Gln Ile Gln Glu Thr Thr Ala Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys 485 490 495 Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp 500 505 510 Pro Leu Glu Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys 515 520 525 Ile Ala Phe Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Gln Gly 530 535 540 Lys Asp Ile Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln 545 550 555 560 Asn Ile Lys Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile Tyr Thr 565 570 575 Val Leu Asp Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg 580 585 590 Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp 595 600 605 Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr 610 615 620 Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser 625 630 635 640 Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile 645 650 655 Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly 660 665 670 Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr 675 680 685 Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu 690 695 700 Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly 705 710 715 720 Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly 725 730 735 <210> 2 <211> 706 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 2 Gln Ala Pro Met Val Val Thr Ser Ser Thr Thr Gly Asp Leu Ser Ile 1 5 10 15 Pro Ser Ser Glu Leu Glu Asn Ile Pro Ser Glu Asn Gln Tyr Phe Gln 20 25 30 Ser Ala Ile Trp Ser Gly Phe Ile Lys Val Lys Lys Ser Asp Glu Tyr 35 40 45 Thr Phe Ala Thr Ser Ala Asp Asn His Val Thr Met Trp Val Asp Asp 50 55 60 Gln Glu Val Ile Asn Lys Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile Arg Leu Glu 65 70 75 80 Lys Gly Arg Leu Tyr Gln Ile Lys Ile Gln Tyr Gln Arg Glu Asn Pro 85 90 95 Thr Glu Lys Gly Leu Asp Phe Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gln Asn 100 105 110 Lys Lys Glu Val Ile Ser Ser Asp Asn Leu Gln Leu Pro Glu Leu Lys 115 120 125 Gln Lys Ser Ser Asn Ser Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly Pro 130 135 140 Thr Val Pro Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val 145 150 155 160 Glu Gly Tyr Thr Val Asp Val Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu Ser Pro 165 170 175 Trp Ile Ser Asn Ile His Glu Lys Lys Gly Leu Thr Lys Tyr Lys Ser 180 185 190 Ser Pro Glu Lys Trp Ser Thr Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Asp Phe Glu 195 200 205 Lys Val Thr Gly Arg Ile Asp Lys 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Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg 625 630 635 640 Gln Asp Gly Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu 645 650 655 Pro Leu Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val 660 665 670 Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser 675 680 685 Thr Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu 690 695 700 Ile Gly 705 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Arg Lys Lys Arg 1

Claims

알루미늄 애주번트에 흡착된 적어도 하나의 항원 및 적어도 20%(w/v) 비환원당을 포함하는, 동결건조 백신의 제조를 위한 조성물.
알루미늄 애주번트에 흡착된 적어도 하나의 항원 및 적어도 20%(w/v) 당을 포함하는, 온도 안정성 액체 백신 조성물.
동결건조 전에, 알루미늄 애주번트에 흡착된 적어도 하나의 항원 및 적어도 20%(w/v) 비환원당을 포함하는 조성물로서, 재구성 후에 상기 비환원당은 적어도 6%(w/v)인 것인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 계면활성제를 포함하는, 조성물.
동결건조 백신의 제조를 위해 알루미늄 애주번트에 흡착된 적어도 하나의 항원, 계면활성제 및 적어도 15%(w/v) 당을 포함하는, 조성물.
알루미늄 애주번트에 흡착된 적어도 하나의 항원, 계면활성제 및 적어도 15%(w/v) 당을 포함하는, 온도 안정성 액체 백신 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 아미노산을 더 포함하는, 조성물.
알루미늄 애주번트에 흡착된 적어도 하나의 항원, 계면활성제, 아미노산 및 적어도 10%(w/v) 당을 포함하는, 동결건조 백신의 제조를 위한 조성물.
알루미늄 애주번트에 흡착된 적어도 하나의 항원, 계면활성제, 아미노산 및 적어도 10%(w/v) 당을 포함하는, 안정한 액체 백신 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알루미늄 애주번트는 인산 알루미늄 및 황산알루미늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알루미늄 애주번트는 수산화 알루미늄인 것인 조성물.
제11항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.5 내지 1.5㎎/㎖ 수산화 알루미늄을 함유하는, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.5㎎/㎖ 수산화 알루미늄을 함유하는, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 조성물은 약 1.5㎎/㎖ 수산화 알루미늄을 함유하는, 조성물.
제4항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리솔베이트 80 및 폴리솔베이트 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
제15항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리솔베이트 80인 것인 조성물.
제4항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.020% 또는 0.025%(w/v) 계면활성제를 함유하는, 조성물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당은 트레할로스, 수크로스 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 비환원당인 것인 조성물.
제18항에 있어서, 상기 당은 트레할로스인 것인 조성물.
제18항에 있어서, 상기 당은 수크로스인 것인 조성물.
제18항에 있어서, 상기 당은 트레할로스 및 수크로스인 것인 조성물.
제5항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 15 내지 40%(w/v) 당을 함유하는, 조성물.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 20 내지 40%(w/v) 당을 함유하는, 조성물.
제23항에 있어서, 상기 조성물은 약 20 내지 35%(w/v) 당을 함유하는, 조성물.
제24항에 있어서, 상기 조성물은 약 25 내지 40%(w/v) 당을 함유하는, 조성물.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 20%, 21%, 22%, 23%, 24% 및 25%(w/v) 초과의 당을 함유하는, 조성물.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 탄저병 항원인 것인 조성물.
제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탄저병 항원은 보호 항원인 것인 조성물.
제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보호 항원은 서열번호 2의 폴리펩타이드에 대해 적어도 약 80% 동일성이 있는 것인 조성물.
제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 조성물은 약 150 내지 500㎍/㎖ 보호 항원을 포함하는, 조성물.
제30항에 있어서, 상기 조성물은 약 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 400, 375, 400, 425, 450, 475 또는 500㎍/㎖ 보호 항원을 포함하는, 조성물.
제31항에 있어서, 상기 탄저병 항원은 무독력 비. 안트라시스(B. anthracis) 균주로부터의 무세포 여과액인 것인 조성물.
제32항에 있어서, 상기 무독력 비. 안트라시스 균주는 V770-NP1-R인 것인 조성물.
제7항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산은 아르기닌, 알라닌, 프롤린, 글라이신, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
제34항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.5 내지 4%(w/v) 알라닌 또는 아르기닌을 함유하는, 조성물.
제40항에 있어서, 상기 조성물은 약 2%(w/v) 알라닌 또는 아르기닌을 함유하는, 조성물.
제34항에 있어서, 상기 조성물은 약 6 내지 12%(w/v) 글라이신을 함유하는, 조성물.
제37항에 있어서, 상기 조성물은 약 10%(w/v) 글라이신을 함유하는, 조성물.
제1항, 제3항 내지 제5항, 제7항, 제8항 및 제10항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 진공 하에 승화되어 동결건조 조성물을 제조하는 것인 조성물.
제1항, 제3항 내지 제5항, 제7항, 제8항 및 제10항 내지 제38항 중 어느 한 항의 조성물로부터 동결건조된, 동결건조 조성물.
수용액 중에서 재구성된 제39항 또는 제40항의 동결건조 조성물을 포함하는 재구성 조성물.
제41항에 있어서, 상기 수용액은 물, 트리스 EDTA(TE), 인산염 완충 식염수(PBS), 트리스 완충제 또는 식염수로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 재구성 조성물.
제1항, 제3항 내지 제5항, 제7항, 제8항 및 제10항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 50℃에서 적어도 4개월 동안 동결건조 형태로 저장 후에 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 순도를 보유하는, 조성물.
제1항, 제3항 내지 제5항, 제7항, 제8항 및 제10항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 40℃에서 적어도 1개월 동안 동결건조 형태로 저장 후에 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 면역원성을 보유하는, 조성물.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 병원균에 대해 대상체를 백신접종하는 방법.
제39항 또는 제40항의 동결건조 조성물로부터 재구성된 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 병원균에 대해 대상체를 백신접종하는 방법.
적어도 약 10% 당 및 알루미늄 애주번트에 흡착된 항원을 포함하는 조성물을 현탁시키는 단계 및 침강이 일어나기 전에 현탁 조성물을 냉동시키는데 충분한 속도에서 상기 조성물을 냉동시키는 단계를 포함하는, 강력한 명반 기반 냉동 백신의 제조방법.
제47항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 약 15% 당을 함유하는 것인 방법.
제47항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 약 20% 당을 함유하는 것인 방법.
안정한 동결건조 조성물의 제조방법으로서, 제1항, 제3항 내지 제5항, 제7항, 제8항 및 제10항 내지 제38항 중 어느 한 항의 조성물을 동결건조시키는 단계를 포함하되, 재구성된 동결건조 조성물의 안정성은 소식세포 용해 분석(microphage lysis assay: MLA), 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography: SEC-HPLC) 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography: AEX-HPLC)에 의해 측정되는 것인, 안정한 동결건조 조성물의 제조방법.