CN116814432A - 一种高透气性的细胞封闭培养装置及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高透气性的细胞封闭培养装置及方法，培养装置包括：底座；反应器壳体，设置于底座的上方，并与底座相连接形成密闭腔体；气体交换组件，设置于底座的上方，并与密闭腔体相连通；第一液体交换组件，设置于反应器壳体的上方，且与反应器壳体相连接；第二液体交换组件，设置于反应器壳体的侧壁，并与密闭腔体相连通；第一液体交换组件内设置有过滤器，过滤器内设置有过滤膜，过滤膜以折叠或堆叠的方式内置于过滤器内；过滤器的气体透过速率为5‑30L/min，过滤膜的膜面积大于2700 mm2。本发明解决抽取培养基导致底部硅胶透气膜会因负压隆起的问题，以及正压的方式排出培养基导致设备复杂的问题。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种高透气性的细胞封闭培养装置及方法。
背景技术
细胞培养技术是指细胞在体外条件下利用相应的营养物质及气体进行生长增殖的技术。随着制药技术的发展，细胞培养越来越成为制药研究与药物生产过程中必不可少的技术手段，目前的细胞培养技术已经逐步应用于药物筛选研究、单克隆抗体生产、疫苗生产以及细胞治疗等多个技术领域。
现有技术中，T 细胞疗法、过继免疫疗法和过继细胞疗法应用的细胞，往往采用常规的方法进行制备和储存，但是由于细胞的生长空间以及营养物质有限，当细胞增殖达到一定的数量后需要进行传代，通常需要在细胞大量增殖后对其频繁增加培养基或使细胞从培养基分离，在此过程中需要通过利用大量的细胞耗材进行培养来提高细胞增殖数量。然而，一方面，这种操作方式需要反复开盖操作，这样就极大地增加了细胞制备过程中细胞被污染的风险，且延长了细胞的收获时间，细胞一旦被细菌污染，细胞将停止增殖并大量死亡，造成巨大的损失。另一方面，细胞的生长需要二氧化碳和氧气，现有的培养装置透气效率低，无法一次性加入大量培养基，就无法实现细胞的长时间培养，进而最终导致细胞培养的效率低下，进而使细胞的培养成本大量增加。
细胞基因治疗（CGT，Cell and Gene Therapy）指将确定的遗传物质转移至患者的特定靶细胞内，通过基因添加、基因修正、基因沉默等方式修饰个体基因的表达或修复异常基因，达到治愈疾病目的的过程。据ASCGT(美国细胞和基因治疗协会American Society ofCell and Gene Therapy)统计，全球CGT领域在线管线有超过3600项临床试验处于进行当中，迄今为止，已有23种基因和细胞治疗产品获得美国FDA批准，其中包括对神经肌肉疾病、遗传性失明、某些血液癌症等疾病的颠覆性疗法。在中国推动进行了726项试验，并已上市5款药物。CGT具有很高的靶向性，可以不损伤正常细胞的同时杀死癌细胞，同时细胞是来源于患者体内，不具有免疫排斥性，基本无副作用和不良反应，治疗过程中病人不会产生痛苦。CGT治疗需要将患者体内的缺陷细胞取出进行相应的基因改造，并进行细胞培养增殖，再回输至患者体内。常规的细胞培养过程，采用常规的细胞培养瓶，单个培养耗材中生长的细胞数量有限，需要定期开盖操作，进行细胞传代或者检测，容易造成细胞的污染。此种培养方式必然不适合CGT的细胞培养。CGT细胞的培养增殖应尽可能在完全封闭的系统中，减少人为干预造成不可预见的污染。
为解决上述问题，急需一种高透气全封闭的细胞培养系统。细胞培养到收集整个过程处于全封闭系统中，通过管路进行转运细胞和培养基，极大减少污染风险。
现有的发明专利CN113462570A，该发明专利公开了一种大容量悬浮细胞培养瓶，具体地，该大容量悬浮细胞培养瓶是一种全封闭操作设备，通过一体式培养瓶设计，能够在细胞培养过程中减少交叉污染的风险。其采用抽取的方式换取培养液，由于上部透气膜体过滤气体采用传统的单层膜片式过滤器，单位面积的孔数量少，透气速率低，适用于细胞培养过程中的气体交换，但在抽取培养基时，不能实时以及瞬时维持瓶体内外压力平衡，因抽吸培养基会造成瓶内负压，在抽吸培养基时底部硅胶透气膜会因负压隆起，影响正在培养的细胞，进而使接近下部连接管的细胞被扰动，且随废液一同吸出，进而导致细胞的培养效率降低，且降低培养细胞的收率；当补充培养基时，由于上部透气膜体透气速率低，导致补充速度慢，影响细胞的生长。
为了避免抽吸培养基造成瓶内负压，发明专利CN105392876A，公开了一种用于透气性细胞培养过程的封闭系统装置和方法，其封闭系统装置是利用压力将气体推送到细胞培养和细胞回收装置，进而排出培养基和培养的细胞。具体地，其采用的是连接空气泵向瓶内通入无菌空气形成正压的方式将液体排出，但加压时间不好控制，需要设置相应的气体流量控制与监控，判断是否排净了液体，增加了系统的复杂性。
为此，针对上述的技术问题，需要提供一种高透气性的细胞封闭培养装置及方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种高透气性的细胞封闭培养装置及方法，以解决现有技术中的抽取培养基导致底部硅胶透气膜会因负压隆起的问题，以及正压的方式排出培养基导致设备复杂的问题。
本发明第一方面提供了一种高透气性的细胞封闭培养装置，包括：底座；反应器壳体，设置于所述底座的上方，并与所述底座相连接形成密闭腔体；气体交换组件，设置于所述底座的上方，并与所述密闭腔体相连通；第一液体交换组件，设置于所述反应器壳体的上方，且与所述反应器壳体相连接；第二液体交换组件，设置于所述反应器壳体的侧壁，并与所述密闭腔体相连通；其中，所述第一液体交换组件内设置有过滤器，所述过滤器内设置有过滤膜，过滤膜以折叠或堆叠的方式内置于过滤器内；过滤器的气体透过速率为5-30L/min，过滤膜的膜面积大于2700 mm2。
进一步的，所述第一液体交换组件还包括：连通件，设置于所述反应器壳体的顶端，并与所述反应器壳体相连接；端帽，设置于所述连通件的上方，并与连通件相连接，进而通过所述连通件限制所述密闭腔体与外界相连通；液体连通管穿设于所述端帽的内部，并与所述端帽相连接；气体连通管穿设于所述端帽的内部，并与所述端帽相连接；气体连通管内设置过滤器。
进一步的，所述过滤膜的孔径不大于0.22μm，且所述过滤膜的材质为PP、PES、PTFE或NF中的任一种。
进一步的，所述气体交换组件包括：支撑网，设置于所述底座的上方，并与所述底座相连接；密封圈，设置于所述支撑网的上方，并与所述支撑网相连接；第二透气膜，设置于所述支撑网与所述密封圈之间，并与所述支撑网、所述密封圈均相连接。
进一步的，所述第二透气膜为疏水透气膜，进而使细胞生长所需的气体透过，且能够阻挡培养基流过，所述第二透气膜为硅胶材质。
进一步的，所述第二液体交换组件包括：排出口，设置于所述反应器壳体的侧壁，并与所述密闭腔体相连通；排出管，并与所述排出口相连接。
可选择的，所述培养装置还包括第一透气膜，所述第一透气膜设置于反应器壳体上方，并与所述密闭腔体相连通。
可选择的，分隔组件，设置于所述反应器壳体内部，并与所述反应器壳体的内侧壁相连接，进而使所述密闭腔体分为第一腔室和第二腔室，且所述第一腔室设置于所述第二腔室的上方；所述第一腔室的容积与所述第二腔室的容积比为9：1。
进一步的，所述分隔组件包括；卡槽，设置于所述反应器壳体的内壁周向，并与所述反应器壳体内壁相连接；卡板，所述卡板的边缘设置于所述卡槽内部，并与所述卡槽相连接，进而使所述反应器壳体内部的腔体分为所述第一腔室和所述第二腔室；交换口，穿设于所述卡板，通过所述交换口，使得所述第一腔室和所述第二腔室相连通；半透膜，设置于卡板上，并与所述卡板相连接，所述半透膜允许透过分子量小于10 kDa 的物质。
本发明还提供了一种细胞培养方法，其使用所述的一种高透气性的细胞封闭培养装置，该方法的具体步骤包括：
S1：添加培养基；
通过液体连通管向反应器壳体的密闭腔体内添加培养基；
S2：接种细胞；
再将待培养的细胞通过液体连通管添加至反应器壳体的密闭腔体内；
S3：培养细胞；
培养细胞全过程保持气体交换组件畅通，保证在细胞生长过程中的所需气体，并放入培养箱中培养；培养过程中，可通过液体连通管取样，监测培养基中营养成分的变化，添加缺少的营养成分；
S4：排出培养基；
将液体连通管与废液瓶连通，通过蠕动泵将密闭腔体中的废弃培养基排出，在排出过程中，外部空气通过过滤器过滤掉污染物后进入密闭腔体中，进而保证装置内部的压力平衡；
S5：收集细胞；
通过第二液体交换组件收集细胞。
本发明还提供了另一种细胞培养方法，其使用所述的一种高透气性的细胞封闭培养装置，该方法的具体步骤包括：
S1：接种细胞；
用密闭腔体容积的10%的培养基稀释所需的细胞后，通过第二液体交换组件添加至反应器壳体的第二腔室；
S2：添加培养基；
通过液体连通管向第一腔室内添加培养基，添加的培养基占密闭腔体容积的90%；
S3：培养细胞；
培养细胞全过程保持第一透气膜和气体交换组件畅通，保证在细胞生长过程中的所需气体，并放入培养箱中培养；
S4：更换培养基；
需要更换培养基时，通过液体连通管抽吸废弃培养基，抽吸过程中通过过滤器过滤掉污染物后进入密闭腔体中，进而保证装置内部的压力平衡；抽吸结束后，再通过液体连通管输入新鲜的培养基，供细胞生长；
S5：收集浓缩的细胞；
多次重复步骤S4，进而在第二腔室内得到多批次的混匀的培养后细胞、细胞分泌产物和培养基，即得到浓缩的细胞；将第一液体交换组件与废液瓶连通，将第一腔室中的废弃培养基排出；第二腔室内培养后细胞、细胞分泌产物和培养基混匀并悬浮在培养基中，再将第二液体交换组件打开，通过第二液体交换组件将培养后细胞、细胞分泌产物和培养基转移并收集。
有益效果
相较于现有技术，本发明提供了一种高透气性的细胞封闭培养装置及方法，本发明通过外接高透气性的过滤器，过滤器内部采用高面积折叠式或堆叠式的多层过滤膜结构，由于折叠式或堆叠式的多层过滤膜不仅仅增加了膜面积，还有单位面积的孔数量的成倍增加，所以气体透过速率较传统膜片式具有巨大优势，极大提高了瞬时的气体透过率，降低了因抽吸培养基造成的瓶内负压，在抽吸培养基时底部硅胶透气膜不会因负压隆起。同时，本发明相对于正压式排出培养基的设备，无需连接空气泵，直接使用蠕动泵将液体泵出即可，而且由于过滤器平衡密闭空间内的压力，使液体排出的速度较大，缩短了操作时间，空气通过过滤器直接进入密闭的培养空间，使用较为简易方便。
本发明还设置有分隔组件，分隔组件能进一步防止排出废弃培养基过程中造成的细胞扰动，避免细胞随废弃培养基排出，造成损失；从而实现培养基与培养细胞的有效分离，可以在封闭的空间内，排出废弃的培养基，添加新鲜的培养基，而不影响细胞的生长，确保细胞的长时间无间断的培养；并形成高密度细胞培养区域，同时可得到浓缩的抗体和蛋白等。
附图说明
通过参考附图阅读下文的详细描述，本发明示例性实施方式的上述以及其他目的、特征和优点将变得易于理解。在附图中，以示例性而非限制性的方式示出了本发明的若干实施方式，相同或对应的标号表示相同或对应的部分，其中：
图1是本发明装置分解图；
图2为本发明装置装配后状态图；
图3为本发明装置内部结构图；
图4为本发明装置另一种内部结构图；
附图标记说明：
1、第一透气膜；2、气体交换组件；2-1、密封圈；2-2、第二透气膜；2-3、支撑网；3、第一液体交换组件；3-1、端帽；3-2、连通件；3-3、液体连通管；3-4、气体连通管，3-5、过滤器，4、第二液体交换组件；4-1、排出口；4-2、排出管；5、底座；6、分隔组件；6-1、卡槽；6-2、卡板；6-3、交换口；6-4、半透膜；7、反应器壳体；7-1、第一腔室；7-2、第二腔室。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
如图1-3所示，本实施例提供了一种高透气性的细胞封闭培养装置，该装置包括：底座5、反应器壳体7、气体交换组件2、第一液体交换组件3、第二液体交换组件4。
反应器壳体7，设置于底座5的上方，并与底座5相连接；从而形成封闭的空间，与外部空气隔绝。
如图1所示，气体交换组件2，设置于底座5的上方，并与封闭的空间或者第二腔室7-2相连通；具体的，气体交换组件2包括：支撑网2-3，设置于底座5的上方，并与底座5相连接；密封圈2-1，设置于支撑网2-3的上方，并与支撑网2-3相连接；第二透气膜2-2，设置于支撑网2-3与密封圈2-1之间，并与支撑网2-3、密封圈2-1均相连接。第二透气膜2-2为疏水透气膜，细胞可以直接从底部的第二透气膜2-2获得使细胞生长所需的气体，提高气体传递速率。且第二透气膜2-2能够阻挡培养基流过，第二透气膜2-2为硅胶材质。细胞静置悬浮培养过程中将自然沉降于第二透气膜2-2上。
如图1-3所示，第一液体交换组件3，设置于反应器壳体7的上方，并与第一透气膜1相邻设置，且与反应器壳体7相连接；实现培养基的送入和/或抽取。
第一液体交换组件3包括：
连通件3-2，设置于反应器壳体7的顶端，并与反应器壳体7相连接；连通件3-2顶端开口，开口端外周设置有螺纹，通过螺纹与端帽3-1连接；
端帽3-1，设置于连通件3-2的上方，并与连通件3-2螺纹连接，进而限制密闭腔体通过连通件3-2与外界相连通；端帽3-1与连通件3-2之间设置有胶垫，以确保密封效果。
液体连通管3-3，穿设于端帽3-1的内部，并与端帽3-1相连接，使密闭腔体通过连通管3-3与外部相连通；
气体连通管3-4，穿设于端帽3-1的内部，与液体连通管3-3相邻设置，并与端帽3-1相连接；
液体连通管3-3，穿设于连通件3-2的内部，并与连通件3-2相连接，使第一腔室7-1通过液体连通管3-3与外部废弃培养基回收装置或者新鲜培养盛放装置连通。且连通的管路上设置有蠕动泵，提供抽吸的压力。蠕动泵相对于专利CN105392876A中的空气泵产生的压力要小很多，不会对反应器内部产生破坏作用。液体连通管3-3在不使用时呈密封关闭状态。液体连通管3-3可以设置为一个也可以设置为两个或多个，当设置为一个时，通过一个液体连通管3-3实现培养基的送入与抽取；当设置为两个时，可以一个液体连通管3-3送入培养基，另一个液体连通管3-3抽取培养基。液体连通管3-3的一端穿出端帽3-1，便于与蠕动泵的管路连接，另一端至反应器壳体7容积10%的高度处。
气体连通管3-4，穿设于端帽3-1的内部，与液体连通管3-3相邻设置，并与端帽3-1相连接；过滤器3-5，设置于反应器壳体7的外部，并与气体连通管3-4相连接。
过滤器3-5，设置于所述反应器壳体7的外部，并与所述气体连通管3-4相连接，且所述过滤器3-5内设置有过滤膜，过滤膜以折叠或堆叠的方式内置于过滤器3-5内，过滤器3-5的气体透过速率为5-30L/min，过滤膜的膜面积大于2700 mm2。所述过滤膜的孔径为0.22μm，且所述过滤膜的材质为PP、PES、PTFE或NF中的任一种。当通过抽吸的方式排出培养基或细胞时，外部空气通过过滤器3-5提供无菌的空气至密闭腔体内部，使密闭腔体内的压力平衡。
传统的针式过滤器，属于膜片式，滤片面积较小，透气速率较低，容易导致细胞培养瓶内形成负压，液体转移困难，并且导致底部透气膜隆起。本装置通过外接高透气性的过滤器3-5，过滤器3-5具有阻菌透气功能，内部采用高面积折叠式或堆叠式的多层过滤膜结构，由于折叠式或堆叠式的多层过滤膜所有具有较大的膜面积以及较大的单位面积孔率，透过速率的增加倍数并不仅仅是膜面积的增加，还有单位面积的孔数量的成倍增加，所以气体透过速率较传统膜片式具有巨大优势。本装置中过滤器3-5气体透过速率可达5--30L/min，而传统的膜片式过滤器最大的气体透过量仅为0.05L/min。从面积上比较：25mm直径膜片式膜面积为490mm2,相同直径的过滤器3-5膜面积可达2732 mm2-16200 mm2。收集细胞过程中，本装置采用过滤器3-5极大提高了瞬时的气体透过率，当通过抽吸的方式排出培养基或细胞时，过滤器3-5快速提供无菌的空气降低了因抽吸培养基造成的瓶内负压，维持反应器内的压力平衡，在抽吸培养基时底部第二透气膜2-2（硅胶透气膜）不会因负压隆起，而造成抽吸时导致细胞的损失，并且防止透气膜的破裂导致培养基漏液等问题产生污染等情况，同时，本装置无需连接空气泵，直接使用蠕动泵将液体泵出即可，而且由于过滤器3-5透气面积增大，导致液体排出的速度较大，缩短了操作时间，空气通过过滤器3-5直接进入培养瓶，使用较为简易方便。
如图1所示，第二液体交换组件4，设置于反应器壳体7的侧壁，并与密闭腔体相连通，以实现细胞的送入和/或排出。
具体的，第二液体交换组件4包括：排出口4-1，设置于反应器壳体7的侧壁，并与反应器壳体7的密闭腔体相连通；排出管4-2，设置于排出口4-1，并与排出口4-1相连接；可以通过管路连接收集瓶，为收集细胞的管路。排出口4-1距离底部距离为有效容积瓶身高度的十分之一。排出管4-2在不使用时呈密封关闭状态。
反应器壳体7上方还可以设置有第一透气膜1，透气材质为PTFE材质，用于增加培养过程中气体交换效率。
优选的，如图4所示，本装置还可以设置有分隔组件6，分隔组件6设置于反应器壳体7内部，并与反应器壳体7的内侧壁相连接，使反应器壳体7内部分为第一腔室7-1和第二腔室7-2，且第一腔室7-1设置于第二腔室7-2的上方；本实施例设置的分隔组件6能防止排出废弃培养基过程中造成的细胞扰动，避免细胞随废弃培养基排出，造成损失；从而实现培养基与培养细胞的有效分离，可以在封闭的空间内，排出废弃的培养基，添加新鲜的培养基，而不影响细胞的生长。实现无菌条件下增加新鲜的培养基，确保细胞的长时间无间断的培养。
进一步的，分隔组件6包括：卡槽6-1，设置于反应器壳体7的内壁周向，并与反应器壳体7内壁相连接；卡板6-2，卡板6-2的边缘设置于卡槽6-1内部，并与卡槽6-1相连接，进而使反应器壳体7内部的腔体分为第一腔室7-1和第二腔室7-2；卡板6-2可设置为一层也可以设置为多层；卡板6-2可设置为环形结构或者网状结构。交换口6-3，穿设于卡板6-2，通过交换口6-3，使得第一腔室7-1和第二腔室7-2相连通；当卡板6-2设置为环形结构时，环形结构中间区域即为交换口6-3；当卡板6-2设置为网状结构时，网孔即为交换口6-3，交换口6-3的面积需满足培养基的交换效率，面积尽可能大些。
半透膜6-4，当卡板6-2设置为一层时，半透膜6-4固定设置于卡板6-2的上，并与卡板6-2相连接。当卡板6-2设置为两层或多层时，半透膜6-4夹持在两层或多层卡板6-2之间固定。分隔组件6的半透膜6-4允许透过分子量小于10 kDa 的营养物质，从第一腔室7-1渗透到第二腔室7-2，代谢抑制物从第二腔室7-2渗透到第一腔室7-1，并且保证所有目的蛋白质和细胞仍留在第二腔室7-2。即半透膜6-4可以阻挡细胞以及分子量较大的抗体和蛋白等，但是培养基可以自由交换。优选的，第一腔室7-1的容积与第二腔室7-2的容积比为9：1。也即在培养瓶底部以上10%位置设置分隔组件6，由于细胞静置悬浮培养过程中将自然沉降于装置底部，第一腔室7-1内均为培养基，提供丰富的培养基和营养供应；第二腔室7-2内为10%体积培养基以及培养的细胞，可以形成高密度细胞培养区域，同时浓缩所生产的抗体和蛋白等。
本发明另一方面提出一种高透气性的细胞封闭培养装置的方法，当不设置分隔组件6时，可适用于细胞基因治疗方向的操作，该方法的具体步骤包括：
S1：添加培养基；
通过液体连通管3-3向反应器壳体7的密闭腔体内添加培养基，添加的培养基占密闭腔体容积的90%；
S2：接种细胞；
再用密闭腔体容积的10%的培养基稀释所需的细胞后，通过液体连通管3-3添加至反应器壳体7的密闭腔体内；
S3：培养细胞；
培养细胞全过程保持气体交换组件2畅通，保证在细胞生长过程中的所需气体，并放入培养箱中培养；培养过程中，可通过液体连通管3-3取样，监测培养基中营养成分的变化，添加缺少的营养成分；
S4：排出培养基；
将液体连通管3-3与废液瓶连通，通过蠕动泵将密闭腔体中的废弃培养基排出，在排出过程中，外部空气通过过滤器3-5过滤掉污染物后进入密闭腔体中，进而快速保证装置内部的压力平衡；
S5：收集细胞；
通过第二液体交换组件4收集细胞。
当设置有分隔组件6时，本装置不仅适用于细胞基因治疗方向的操作，更适用于浓缩收集抗体蛋白方等相关操作。本装置中第二透气膜2-2和中间的半透膜6-4使本产品突破了传统培养板、方瓶和培养袋等容器的培养高度限制，传统培养板和方瓶的静态培养高度约0.3cm,而培养袋高度约为1.0cm，若高于限制的高度，则培养装置内的氧气和营养供应会极大受到限制，无法保证能充足供应细胞培养所需要的氧气和营养，同时导致细胞生长所产生的废气无法排出，最终导致细胞生长活率，收率急剧降低，而本装置的培养高度能达到约10cm。
传统的培养板和方瓶在培养细胞生产蛋白或抗体时，由于其体积限制和培养基营养供应限制，一般静态培养只能培养3-5天左右，而本装置由于突破了传统培养容器的培养高度限制，底部第二透气膜2-2能平衡氧气和二氧化碳，半透膜6-4的允许透过分子量小于10kDa，用来跟细胞培养的第二腔室7-2交换新鲜的培养基以及交换培养代谢产物，并且保证所有的蛋白质仍留在第二腔室7-2，用户根据实验设计，能使细胞培养能到10-14天左右，能极大延长细胞培养时间而产生足够多的蛋白和抗体；传统培养容器的细胞收集和抗体蛋白等收集，最终只能将全部培养基、细胞、蛋白和抗体一起收集，而本装置设置有约10kDa的半透膜6-4，能使产生的抗体和蛋白浓缩在膜的第二腔室7-2，收集约只需要传统细胞培养方法体积的1/10，极大减轻了下游的工作内容。
该方法的具体步骤包括：
S1：接种细胞；
用密闭腔体容积的10%的培养基稀释所需的细胞后，通过第二液体交换组件4添加至反应器壳体7的第二腔室7-2；
S2：添加培养基；
通过液体连通管3-3向第一腔室7-1内添加培养基，添加的培养基占密闭腔体容积的90%；
S3：培养细胞；
培养细胞全过程保持第一透气膜和气体交换组件2畅通，保证在细胞生长过程中的所需气体，并放入培养箱中培养；
S4：更换培养基；
需要更换培养基时，通过液体连通管3-3抽吸废弃培养基，抽吸过程中通过过滤器3-5过滤掉污染物后进入密闭腔体中，进而快速保证装置内部的压力平衡；抽吸结束后，再通过液体连通管3-3输入新鲜的培养基，供细胞生长；
S5：收集浓缩的细胞；
多次重复步骤S4，进而在第二腔室7-2内得到多批次的混匀的培养后细胞、细胞分泌产物和培养基，即得到浓缩的细胞；将第一液体交换组件3与废液瓶连通，将第一腔室7-1中的废弃培养基排出；第二腔室7-2内培养后细胞、细胞分泌产物和培养基混匀并悬浮在培养基中，再将第二液体交换组件打开，通过第二液体交换组件4将培养后细胞、细胞分泌产物和培养基转移并收集。
本装置能使细胞高密度培养，同时营养供应充足，培养时间久，使用本装置培养细胞产物的抗体和蛋白极大高于传统培养方法，例如杂交瘤的抗体生产，浓度都在 1-5mg/mL左右，比传统培养方法，产品浓度要提高50-100 倍。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (11)
1.一种高透气性的细胞封闭培养装置，其特征在于，包括：
底座（5）；
反应器壳体（7），设置于所述底座（5）的上方，并与所述底座（5）相连接形成密闭腔体；
气体交换组件（2），设置于所述底座（5）的上方，并与所述密闭腔体相连通；
第一液体交换组件（3），设置于所述反应器壳体（7）的上方，且与所述反应器壳体（7）相连接；
第二液体交换组件（4），设置于所述反应器壳体（7）的侧壁，并与所述密闭腔体相连通；
其中，所述第一液体交换组件（3）内设置有过滤器（3-5），所述过滤器（3-5）内设置有过滤膜，过滤膜以折叠或堆叠的方式内置于过滤器（3-5）内；过滤器（3-5）的气体透过速率为5-30L/min，过滤膜的膜面积大于2700 mm2。
2.根据权利要求1所述的一种高透气性的细胞封闭培养装置，其特征在于，所述第一液体交换组件（3）还包括：
连通件（3-2），设置于所述反应器壳体（7）的顶端，并与所述反应器壳体（7）相连接；
端帽（3-1），设置于所述连通件（3-2）的上方，并与连通件（3-2）相连接，进而通过所述连通件（3-2）限制所述密闭腔体与外界相连通；
液体连通管（3-3）穿设于所述端帽（3-1）的内部，并与所述端帽（3-1）相连接；
气体连通管（3-4）穿设于所述端帽（3-1）的内部，并与所述端帽（3-1）相连接；气体连通管（3-4）内设置过滤器（3-5）。
3.根据权利要求1所述的一种高透气性的细胞封闭培养装置，其特征在于，所述过滤膜的孔径不大于0.22μm，且所述过滤膜的材质为PP、PES、PTFE或NF中的任一种。
4.根据权利要求1所述的一种高透气性的细胞封闭培养装置，其特征在于，所述气体交换组件（2）包括：
支撑网（2-3），设置于所述底座（5）的上方，并与所述底座（5）相连接；
密封圈（2-1），设置于所述支撑网（2-3）的上方，并与所述支撑网（2-3）相连接；
第二透气膜（2-2），设置于所述支撑网（2-3）与所述密封圈（2-1）之间，并与所述支撑网（2-3）、所述密封圈（2-1）均相连接。
5.根据权利要求4所述的一种高透气性的细胞封闭培养装置，其特征在于，所述第二透气膜（2-2）为疏水透气膜，进而使细胞生长所需的气体透过，且能够阻挡培养基流过，所述第二透气膜（2-2）为硅胶材质。
6.根据权利要求1所述的一种高透气性的细胞封闭培养装置，其特征在于，所述第二液体交换组件（4）包括：
排出口（4-1），设置于所述反应器壳体（7）的侧壁，并与所述密闭腔体相连通；
排出管（4-2），设置于所述排出口（4-1），并与所述排出口（4-1）相连接。
7.根据权利要求1所述的一种高透气性的细胞封闭培养装置，其特征在于，所述培养装置还包括第一透气膜（1），所述第一透气膜（1）设置于反应器壳体（7）上方，并与所述密闭腔体相连通。
8.根据权利要求1所述的一种高透气性的细胞封闭培养装置，其特征在于，包括：
分隔组件（6），设置于所述反应器壳体（7）内部，并与所述反应器壳体（7）的内侧壁相连接，进而使所述密闭腔体分为第一腔室（7-1）和第二腔室（7-2），且所述第一腔室（7-1）设置于所述第二腔室（7-2）的上方；所述第一腔室（7-1）的容积与所述第二腔室（7-2）的容积比为9：1。
9.根据权利要求8所述的一种高透气性的细胞封闭培养装置，其特征在于，所述分隔组件（6）包括；
卡槽（6-1），设置于所述反应器壳体（7）的内壁周向，并与所述反应器壳体（7）内壁相连接；
卡板（6-2），所述卡板（6-2）的边缘设置于所述卡槽（6-1）内部，并与所述卡槽（6-1）相连接，进而使所述反应器壳体（7）内部的腔体分为所述第一腔室（7-1）和所述第二腔室（7-2）；
交换口（6-3），穿设于所述卡板（6-2），通过所述交换口（6-3），使得所述第一腔室（7-1）和所述第二腔室（7-2）相连通；
半透膜（6-4），设置于卡板（6-2）上，并与所述卡板（6-2）相连接，所述半透膜（6-4）允许透过分子量小于10 kDa 的物质。
10.一种细胞培养方法，其使用如权利要求1所述的一种高透气性的细胞封闭培养装置，其特征在于，该方法的具体步骤包括：
S1：添加培养基；
通过液体连通管（3-3）向反应器壳体（7）的密闭腔体内添加培养基；
S2：接种细胞；
再将待培养的细胞通过液体连通管（3-3）添加至反应器壳体（7）的密闭腔体内；
S3：培养细胞；
培养细胞全过程保持气体交换组件（2）畅通，保证在细胞生长过程中的所需气体，并放入培养箱中培养；培养过程中，可通过液体连通管（3-3）取样，监测培养基中营养成分的变化，添加缺少的营养成分；
S4：排出培养基；
将液体连通管（3-3）与废液瓶连通，通过蠕动泵将密闭腔体中的废弃培养基排出，在排出过程中，外部空气通过过滤器（3-5）过滤掉污染物后进入密闭腔体中，进而保证装置内部的压力平衡；
S5：收集细胞；
通过第二液体交换组件（4）收集细胞。
11.一种细胞培养方法，其使用如权利要求8所述的一种高透气性的细胞封闭培养装置，其特征在于，该方法的具体步骤包括：
S1：接种细胞；
用密闭腔体容积的10%的培养基稀释所需的细胞后，通过第二液体交换组件（4）添加至反应器壳体（7）的第二腔室（7-2）；
S2：添加培养基；
通过液体连通管（3-3）向第一腔室（7-1）内添加培养基，添加的培养基占密闭腔体容积的90%；
S3：培养细胞；
培养细胞全过程保持第一透气膜（1）和气体交换组件（2）畅通，保证在细胞生长过程中的所需气体，并放入培养箱中培养；
S4：更换培养基；
需要更换培养基时，通过液体连通管（3-3）抽吸废弃培养基，抽吸过程中通过过滤器（3-5）过滤掉污染物后进入密闭腔体中，进而保证装置内部的压力平衡；抽吸结束后，再通过液体连通管（3-3）输入新鲜的培养基，供细胞生长；
S5：收集浓缩的细胞；
多次重复步骤S4，进而在第二腔室（7-2）内得到多批次的混匀的培养后细胞、细胞分泌产物和培养基，即得到浓缩的细胞；将第一液体交换组件（3）与废液瓶连通，将第一腔室（7-1）中的废弃培养基排出；第二腔室（7-2）内培养后细胞、细胞分泌产物和培养基混匀并悬浮在培养基中，再将第二液体交换组件（4）打开，通过第二液体交换组件（4）将培养后细胞、细胞分泌产物和培养基转移并收集。
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