CN116789980A

CN116789980A - 一种多功能阳离子共价有机框架材料及其应用

Info

Publication number: CN116789980A
Application number: CN202311021459.5A
Authority: CN
Inventors: 边玮玮; 周宝龙; 宋倩; 岳琪; 徐丹丹
Original assignee: Weifang Medical University
Current assignee: Weifang Medical University
Priority date: 2023-08-15
Filing date: 2023-08-15
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2043-08-15
Also published as: CN116789980B

Abstract

本发明公开了一种多功能阳离子共价有机框架材料及其应用，属于生物医药技术领域。所述多功能阳离子共价有机框架材料是由1H‑吡唑‑4‑甲醛、紫晶胺阳离子化合物和Cu₂O通过溶剂热反应，聚合得到的。本发明制备得到的多功能阳离子共价有机框架材料HLV‑Cu，具有的光热活性、类芬顿活性，加之阳离子本身优异的抗菌效果使得多功能阳离子共价有机框架材料在250μg/mL浓度下就可以对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌产生了100%的杀灭率。

Description

一种多功能阳离子共价有机框架材料及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种多功能阳离子共价有机框架材料及其应用。

背景技术

目前，微生物污染，尤其是那些与滥用抗生素有关的多药耐药致病菌，严重威胁着全球公众的健康。无抗生素治疗策略，采用先进的治疗方式，同时具有非侵入性和高时空精度，如酶疗法、光疗以及阳离子抗菌疗法，作为替代的抗菌方法，已经得到越来越多的认可。然而，单一模式的治疗通常难以完全杀死细菌，这可能导致感染的复发，甚至在长期使用后诱发细菌的耐药性。针对这种复杂的状态，通过双重或多种方式的协同作用来打击细菌的联合疗法最近得到了广泛的关注，它不仅可以有效地克服单一疗法的限制，而且还可以大大提高治疗效果。

基于材料的多功能抗菌剂是目前最有潜力的无抗生素抗菌方法。共价有机框架（COFs）具有精确调节的结构和功能，被认为是最典型的抗菌材料之一。与其他治疗剂不同，COFs不仅可以单独发挥抗菌作用，还可以作为平台与其他抗菌方法结合使用，实现多重杀菌功能。Sun等人（Synergistic Photodynamic and Photothermal AntibacterialNanocomposite Membrane Triggered bySingle NIR Light Source，ACS Appl. Mater.Interfaces 2019, 11, 30, 26581–26589）开发了一种具有协同光动力治疗和光热治疗抗菌作用的nm复合膜，有效地抑制了炎症反应，提高了抗菌效率。Ding等人（SynergisticAntibacterial and Anti-Inflammatory Effectsof a Drug-Loaded Self-StandingPorphyrin-COF Membrane for Efficient Skin Wound Healing，Adv Healthc Mater10(2021) 2001821）通过原位界面聚合和浸渍方法，报道了用布洛芬（IBU）包裹的自支撑性卟啉共价有机骨架（COF）基底膜，显示了良好的抗感染和组织重塑活性。Zhang的研究小组（Acridine-Based Covalent Organic Framework Photosensitizer with Broad-Spectrum Light Absorption forAntibacterial Photocatalytic Therapy，Adv HealthcMater 10 (2021) 2100775）通过2,4,6-三羰基间苯二酚（TFP）和3,6-二氨基吖啶（DAA）之间的希夫碱缩合，开发了一种基于吖啶的共价有机框架（COF）光敏剂，记为TPDA，用于抗菌光催化治疗。尽管已经取得了巨大的成就，但COFs的真正抗菌应用仍处于起步阶段，申请号CN202310175497.X的专利公开了一种光热-类芬顿反应人工nm酶及其制备方法和应用，利用含有Cu的COF材料的光热-类芬顿作用进行抗菌。申请号为CN114940734A的专利公开了一种双阳离子共价有机骨架负载硝普钠复合物及其制备方法和应用，将三咪唑醛与吡啶胺合成具咪唑鎓阳离子和吡啶鎓阳离子的双阳离子多孔框架载体，对硝普钠进行负载制备了双阳离子COF@SNP复合物，实现光热、阳离子和NO三种方式共同抗菌。为了进一步提高抗菌效果，如能将光热-类芬顿与阳离子的抗菌模式进结合形成新的协同抗菌模式，可拓宽COFs的应用潜力。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种多功能阳离子共价有机框架材料及其应用。本发明的多功能阳离子共价有机框架材料即HLV-Cu作为抗菌治疗平台除了具有光热-类芬顿联合抗菌作用，还具有阳离子抗菌、光动力抗菌作用，四种抗菌模式相结合可以100%杀灭大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种多功能阳离子共价有机框架材料，所述多功能阳离子共价有机框架材料是由1H-吡唑-4-甲醛、紫晶胺阳离子化合物和Cu₂O通过溶剂热反应，聚合得到的。

优选的，所述1H-吡唑-4-甲醛、紫晶胺阳离子和Cu₂O的摩尔比为 2：1：1。

优选的，所述紫晶胺阳离子化合物为1,1-双（4-氨基苯基）-[4,4'-联吡啶]-1,1'-二氯化铵。

优选的，所述溶剂热反应的温度为120℃，所述溶剂热反应的时间为72h。

优选的，其特征在于，所述溶剂热反应的溶剂为均三甲苯、二氧六环和乙酸溶液的混合溶剂。

优选的，所述均三甲苯、二氧六环和乙酸溶液的体积比为5：5：1；所述乙酸溶液的浓度为6M。

本发明的第二方面，提供多功能阳离子共价有机框架材料在制备具有光动力、光热、阳离子和类芬顿协同抗菌药物的中的用途。

本发明的第三方面，提供一种含有多功能阳离子共价有机框架材料的抗菌药物，所述抗菌药物以多功能阳离子共价有机框架材料为有效成分。

优选的，所述抗菌药物杀灭致病细菌的杀灭率为100%。

优选的，所述杀灭致病细菌为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

本发明的有益效果：

（1）本发明的制备方法简单，通过溶剂热反应可一步得到多功能阳离子共价有机框架材料，制备成本低。

（2）本发明制备的多功能阳离子共价有机框架材料在激光照射下具有光热活性，250μg/ml温度可升至57.6℃，使细菌蛋白质变性，可以杀死部分细菌；在弱酸环境中可催化H₂O₂产生·OH，使细菌裂解而亡，杀死一定量的细菌；当光热活性和类芬顿活性协同作用，具有强杀菌作用，可杀灭绝大部分细菌。加之多功能阳离子共价有机框架材料中含有阳离子，可以与光热活性和类芬顿活性协同作用，保证细菌100%的杀灭率。

附图说明

图1：单体核磁数据图，紫晶胺阳离子（Vio-NH₂），¹HNMR (400 MHz，D₂O) δ=9.17(d, J=6.3 Hz, 4H), 8.58 (d, J=6.3 Hz, 4H), 7.48 (d, J=8.3Hz, 4H), 6.94 (d,J=8.3 Hz, 4H)；

图2：Vio-NH₂，HL和HLV-Cu的红外光谱图；

图3：（a）HLV-Cu在扫描电镜1μm下的形貌图像；（b）-（f）HLV-Cu在透射电镜500nm、100nm、50nm、20nm、5nm下的TEM图像；

图4：HLV-Cu的各种元素映射图，（a） STEM-HAADF图像，（b）碳元素映射图，（c）氮元素映射图，（d）氧元素映射图，（e）氯元素映射图，（f）铜元素映射图；

图5：HLV-Cu的热重分析图谱；

图6：（a） HLV-Cu在77K下的低温N₂吸收等温线；（b） HLV-Cu的孔径分布曲线；

图7：HLV-Cu的光热性能，（a）不同浓度的HLV-Cu水悬浮液在NIR照射下的温度升高曲线；（b）不同功率密度638nm激光照射下HLV-Cu悬浮液（250μg/ml）的温升曲线；（c）用近红外激光（638nm，1W·cm^-2）处理HLV-Cu悬浮液600秒，然后冷却；（d）从冷却阶段获得的线性时间数据与-lnθ；（e）HLV-Cu水悬浮液在四个循环中的光热分布；（f）HLV-Cu水悬浮液的相应红外热图像；

图8：（a）不同浓度HLV-Cu 与TMB 和 H₂O₂培养的紫外可见吸收光谱；（b）不同组别处理的 TMB 溶液在 pH=5.5 的 PBS 中的紫外可见吸收光谱；（c）不同组别处理的 TMB 溶液在 pH=5. 5 的 PBS 中的紫外可见吸收光谱；（d）TMB 和 H₂O₂与 HLV-Cu 在不同 pH 条件下的紫外可见吸收光谱；（e） ABDA 在 638nm(1 W cm^-2) 激光照射下5分钟的紫外光谱；（f）HLV-Cu 与 ABDA 混合后在 638nm (1 W cm^-2) 激光照射 5 分钟后的紫外光谱；

图9：（a）金黄色葡萄球菌和大肠杆菌经不同浓度的 HLV-Cu+H₂O₂+ 激光处理后形成的菌落照片；（b）用平板计数法测量的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的相应细菌活力；

图10：金黄色葡萄球菌的杀灭率统计；

图11：金黄色葡萄球菌和大肠杆菌与 (I) PBS、(II) H₂O₂、(III)HLV-Cu、(IV)HLV-Cu+ H₂O₂、(V)PBS + 激光、(VI) H₂O₂+ 激光、(VII)HLV-Cu + 激光和 (VIII) HLV-Cu +H₂O₂+ 激光培养后的荧光图像 PI 和 SYTO 9 共同染色（标尺=200 μm，照射时间=10min）；

图12：（a）大肠杆菌和（b）金黄色葡萄球菌与 (I) PBS、(II) H₂O₂、(III) HLV-Cu、(IV)HLV-Cu+ H₂O₂、(V) PBS + 激光、(VI) H₂O₂+ 激光、(VII) HLV-Cu + 激光和 (VIII)HLV-Cu+ H₂O₂+ 激光孵育的 TEM 图像；

图13：1,1-双（4-氨基苯基）-[4,4'-联吡啶]-1,1'-二氯化铵的合成路线图；

图14：HLV-Cu的合成路线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，共价有机框架（COFs）具有精确调节的结构和功能，被认为是最典型的抗菌材料之一。与其他治疗剂不同，COFs不仅可以单独发挥抗菌作用，还可以作为平台与其他抗菌方法结合使用，实现多重杀菌功能。为了进一步提高抗菌效果，如能将光热-类芬顿与阳离子的抗菌模式进结合形成新的协同抗菌模式，可拓宽COFs的应用潜力。

基于此，本发明的目的是提供一种多功能阳离子共价有机框架材料及其应用。本发明以1H-吡唑-4-甲醛、紫晶胺阳离子和Cu₂O为原料，通过原位"一锅煮 "的方法使得希夫碱聚合和配位同时发生，得到了多孔聚合物。以1H-吡唑-4-甲醛为团簇单元，与有机连接剂紫晶胺阳离子聚合得到COFs，具体制备路线见图。本申请采用溶剂热反应制备得到多孔聚合物，所用溶剂中，均三甲苯是非极性芳香溶剂，二氧六环是有一定极性的溶剂，二者混合有助于单体的分散，同时可以调控反应体系的极性范围，从而有助于COF形成的平衡反应的稳定调控。以乙酸水溶液为催化剂和调节剂。一方面，乙酸可广泛应用于各种混合溶剂体系；另一方面，以乙酸为催化剂合成的COFs具有刚性结构的C=N键，因此最终形成的结构结晶度更好、孔隙更为规则。COFs的结构与其中所含Cu可以通过光热-类芬顿实现抗菌，同时紫晶胺阳离子为COFs提供阳离子，COFs又能实现光动力抗菌，从而实现光热-类芬顿-阳离子-光动力的协同抗菌，又扩展了抗菌模式，并且实现细菌的100%杀灭，进一步提高了抗菌效果。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例

（1）1,1-双（4-氨基苯基）-[4,4'-联吡啶]-1,1'-二氯化铵的合成：将4,4′-联吡啶（1.56g，10mM）和2,4-二硝基氯苯（5.66 g，28mM）溶于装有9mL混合溶剂（Vethanol：VH₂O=1：1）的50mL玻璃烧瓶中。反应体系在氮气环境下加热至回流，持续15h。之后，将粗品溶于乙醇，并从水中重结晶为黄白色固体。产量：74%。在搅拌下，将黄白色固体（0.5 g，0.89mM）加入250mL乙醇中，随后加入对苯二胺（281mg，2.6mM）。将反应体系加热至回流6h。然后，收集产品，用THF和丙酮清洗。然后，将固体粉末在真空炉中干燥，得到黑色固体，产率: 81%，合成路线见图13。¹HNMR (400 MHz，D₂O) δ=9.17 (d, J=6.3 Hz, 4H), 8.58 (d, J=6.3 Hz,4H), 7.48 (d, J=8.3Hz, 4H), 6.94 (d, J=8.3 Hz, 4H)。

（2）HLV-Cu聚合物的制备：在10mL Schlenk管中加入1H-吡唑-4-甲醛（HL）14.4mg、Cu₂O10.7mg、1,1-双（4-氨基苯基）-[4,4'-联吡啶]-1,1'-二氯化铵25.5mg、0.5mL均三甲苯、0.5mL二噁烷和0.1mL6M乙酸水溶液。Schlenk管在77K（开尔文）的液氮浴中快速冷冻，并在解冻循环中用三个冷冻泵进行脱气。升温至室温后，将试管在120℃下加热72h。通过过滤分离管中的黑褐色固体，清洗，用四氢呋喃（THF）和新鲜二甲基甲酰胺（DMF）交换溶剂。得到的固体在100℃真空下干燥8h，即得到多功能阳离子共价有机框架材料：HLV-Cu聚合物，合成路线见图14。

表征：

（1）核磁氢谱测定：图1显示紫晶胺阳离子（Vio-NH₂）核磁谱图结果为：¹HNMR (400MHz，D₂O) δ=9.17 (d, J=6.3 Hz, 4H), 8.58 (d, J=6.3 Hz, 4H), 7.48 (d, J=8.3Hz,4H), 6.94 (d,J=8.3 Hz, 4H)，其与先前文献一致验证了Vio-NH₂的成功合成。

（1）HLV-Cu聚合物的红外光谱测定：分别取3mg的Vio-NH₂、HL和HLV-Cu与干燥溴化钾粉末在研钵中充分研磨，然后放置压片模具中压制成透明无裂痕的模片，将压片放置于红外光谱扫描仪中在400-4000cm^-2范围内扫描36圈。

傅里叶变换红外光谱（FT-IR）用于验证HLV-Cu聚合物的结构。如图2显示，HL的-CHO（1689 cm^-1）和属于Vio-NH2的-NH₂（3202-3442 cm^-1）在HLV-Cu中基本消失，表明聚合后形成了亚胺连接。同时，聚合后Cu-N键在836 cm^-1处出现的新特征峰表明HLV-Cu中形成了配位基，证明HLV-Cu聚合物成功聚合。

（2）扫描电镜SEM和透射电镜TEM：通过SEM观察聚合物的形态，图3（a）显示了材料在1μm下的形貌，块状结构由不规则的颗粒组成，具有相互连接的层状孔隙。图3（b）-图3（f）是催化剂的TEM形貌图，明暗对比可以清楚地检测到在HLV-Cu聚合物上均匀分布的明显孔隙。另外，元素mapping图4（b）-图4（f）显示了N、O、Cl和Cu在以碳为主的基质上均匀分布。

（3）热重分析：使用热重分析仪测量样品的热重分析曲线，图5可以看出，HLV-Cu具有极佳的热稳定性，在温度升至 800°C 时，其质量百分比不会突然下降，其重量在 800°C 时可保持在初始值的 60%。

（4）N₂吸附解吸曲线：如图6（a）所示，催化剂的N₂吸附解析曲线显示出典型IV型等温线，具有分级孔结构；催化剂的BET表面积为50m²/g，最大孔隙体积为0.2488m³g^-1，图6（b）显示催化剂在0-50nm间具有分级孔，微孔主峰在1.21nm处，占据主导地位，次级峰分布在3-10nm的介孔范围，表明催化剂具有丰富的多孔结构和高孔隙率。

（5）HLV-Cu的光热性能：将不同浓度（0、50、200、400µg mL^-1）的HLV-Cu混悬水溶液分别加入到1.5mL的EP管中，用水作为空白对照组，将样品放置于热成像仪下并用638 nm激光照射10min，记录其升温过程及温度成像。不同功率密度的HLV-Cu升温曲线测试方法和上述类似，固定HLV-Cu浓度为250μg/mL，将混悬液放置在热成像仪下，并用不同功率密度（0.5、0.75、1、1.5W·cm^-2）的638nm激光照射样品10min，记录其温度变化过程。另外，用加热/冷却循环评价催化剂本身的光热稳定性，用1W·cm^-2的638nm近红外激光照射1 mL的HLV-Cu（250µg mL^-1）水悬浮液，照射10min后关闭激光，待水悬浮液的稳定降到室温后再次打开激光，如此开启/关闭激光五次，记录材料五个周期的升温降温过程。

光热转换效率的计算：利用加热/冷却循环中降温过程来计算光热转换效率：

（公式1）

其中，h是传热系数，S是容器的表面积；T_max是照射10min后的平衡温度；T_surr是周围环境温度，Q_Dis是溶剂和容器热量耗散值；I代表638nm激光功率（1W·cm^-2）；A638是HLV-Cu水悬浮液溶液在638 nm处的吸光度。

hS的值是根据以下公式确定的：

（公式2）

其中m_i是水溶剂的质量（1g），C_H2O是水溶剂的热容量（4.2J/g）；是指冷却时间的斜率与温度的负自然对数，由以下公式确定：

t=-τs(Inθ)（公式3）

其中，定义为/>T和/>T_Max的比值，t是最高温度降温到室温所用的时间。

为了研究光热反应性，在638nm的激光照射下监测了HLV-Cu的温度升高。图7（a）和图7（b）的详细测量结果表明，HLV-Cu的温度变化主要依赖于浓度和激光功率。如图7（a）所示，当激光照射功率为1W·cm^-2时，照射10min后，浓度为100μg/mL的材料悬浮液已经可以达到43.2℃，当浓度达到250μg/mL时，温度可以达到57.6℃，这足以杀死大部分细菌。悬浮液的升温过程在图7（f）中清晰可见。当浓度为250μg/mL的悬浮液用不同功率密度的激光照射时，当激光功率为0.5W·cm^-2时，悬浮液可升温至42.9℃，随着照射激光功率密度的增加，悬浮液的温度升高，当功率密度为1.5W·cm^-2时，最高温度升至67.3℃。此外，图7（e）通过五个加热/冷却循环评估了HLV-Cu的光热稳定性，升温和冷却曲线基本相同，表明其良好的光热稳定性及其作为长效光热剂的潜力。如图7（c）所示，显示了催化剂的单独加热和冷却过程，根据其冷却过程，获得了时间和- In之间的线性关系图7（d），使用公式1~3计算，得催化剂的光热转换效率为49.59%。

（5）HLV-Cu产生ROS：借助9, 10-蒽二基-双(亚甲基)二芳酸作为活性氧探针，研究HLV-Cu在光照后ROS的生成情况。如图8（e）所示，在仅有探针存在的情况下，即使暴露在638nm的激光下5min（1W cm^-2），最大吸收波长的吸光度也不会改变。然而，在探针溶液中加入HLV-Cu分散体图8（f），导致396nm附近的吸光度持续下降，这表明在消除探针的干扰后产生了ROS，具有PDT的潜力。更为重要的是，PDT和PTT是在单波长的激发下实现的，可以避免二次激光，节省了抗菌治疗时间，又优化了抗菌效果。

（6）为了研究过氧化物酶样活性，研究了HLV-Cu将H₂O₂催化成有毒的-OH的能力，使用3，3，5，5-四甲基联苯胺（TMB）作为发色底物，通过紫外分光光度计监测其吸收。如图8（a）所示，在类似于细菌生理环境的培养基中（PBS溶液，pH=5.5），HLV-Cu溶液（50~400 μgmL^-1，由PBS配置）在加入TMB和H₂O₂后呈现出典型的颜色变化（从无色到蓝色）。而且紫外吸收随着HLV-Cu浓度的增加而增加。这些明显的颜色变化表明HLV-Cu具有过氧化物酶样的活性。紫外吸收的增强表明HLV-Cu（250μg mL^-1）的催化性能在激光照射下可以进一步增强图8（b）。HLV-Cu的过氧化物酶样活性的提高是由于HLV-Cu的光热特性引起的温度升高，促进了-OH的产生。通过在pH值为5.5的PBS缓冲液中的对比实验验证了HLV-Cu的酶选择性。如图8（c）所示，只有在含有HLV-Cu + TMB + H₂O₂的PBS中，同时检测到深蓝色，在652nm处有明显的紫外吸收率。相比之下，对照组，包括HLV-Cu + TMB + PBS组，HLV-Cu + H₂O₂+ PBS组，TMB + H₂O₂+ PBS组，几乎没有发现颜色的变化（试验组中HLV-Cu的浓度均为250μg mL^-1，每组中HLV-Cu的用量为75μl，TMB的用量为250μl，H₂O₂用量为75μl，PBS的用量为600μl）。图8（d）传递了pH值对比色效果的影响。可以看出，随着酸度的增加，酶的活性开始加强，然后减弱，在pH值为3.5时达到最大值。

试验例1：体外抗菌试验

（1）细菌培养：本试验采用了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种细菌，利用二代细菌（OD600=0.1）来完成以下实验。将作为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌模型的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的单个菌落转移到3~5 mL的LB培养基（含有10 g/L胰蛋白酶、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、pH=7.4）中，并在37℃、230 rpm的培养箱中培养过夜。新鲜菌株用LB培养基中的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH=7.4）稀释，以获得所需浓度（OD600=0.1，相当于10⁸CFU mL⁻¹）。

（2）平板计数法测定HLV-Cu的抗菌活性：

向2mL EP管加入400µL 10⁸CFU mL^-1细菌溶液（大肠杆菌或金黄色葡萄球菌），将体外细菌实验分为五组：对照组（PBS，pH=6.5），浓度分别为100、150、200和250 µg/mL HLV-Cu组（先用PBS将HLV-Cu配置成2mg/mL的母液，再根据每组的浓度，将不同体积的母液添加至菌液中，配成1mL试验所需溶液）；每组同时加入20µLH₂O₂，为避免不必要的副作用，H₂O₂浓度采用10 mM远低于临床上采用的浓度（166 mM），以波长638nm功率密度为1 W cm^-2的激光照射。图9表明，四合一疗法中HLV-Cu的杀菌活性与浓度呈正相关。而在浓度为200 µg/mL时，两种细菌的存活率已经低于1%。在浓度为250 µg/mL时，HLV-Cu在激光作用下对两种细菌的杀灭率均达到了100%.

向2mL EP管加入400µL 10⁸CFU mL^-1细菌溶液（大肠杆菌或金黄色葡萄球菌），将体外细菌实验分为八组：PBS（pH=6.5）记为I组、Vio-NH₂记为II组、1H-吡唑-4-甲醛记为III组、Cu₂O记为IV组、HLV-Cu （250 µg/mL）记为V组、PBS+激光记为VI组、Vio-NH₂+激光记为VII组、1H-吡唑-4-甲醛+激光记为VIII组、Cu₂O+激光记为VIIII组、HLV-Cu+激光记为X组（II组~X组的用量均相同为1mL，浓度均为250 µg/mL，配置方法同上）；每组同时加入20µL H₂O₂，为避免不必要的副作用，H₂O₂浓度采用10 mM远低于临床上采用的浓度（166 mM）；激光以波长638nm功率密度为1 W cm^-2的激光照射。按照分组要求处理完成后，放置恒温摇窗（110rpm，37℃）培养12h，然后将吹匀的菌液转移100μL到固体培养基中，并涂抹均匀，在37℃下孵育24h，以观察细菌的形态。计算菌落并与各组比较细菌活性。图10可以看出不同组别共同培养的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭率，X组的杀灭率达100%，远高于VII~VIIII组，说明HLV-Cu在激光照射后产生可以实现光热-类芬顿-阳离子-光动力的协同抗菌。

试验例2：细菌活/死染色试验

SYTO-9和PI用于区分活/死细菌。SYTO-9由于穿透所有细菌膜（完整和受损）而将细菌标记为绿色，而PI只能穿透受损的细胞膜，将细菌标记为红色，同时减少SYTO-9染色产生的绿色。处理细菌，分为PBS（I组）；H₂O₂（II组）；HLV-Cu（III组）；HLV-Cu+ H₂O₂（IV组）；PBS+H₂O₂（V组）；H₂O₂+激光（VI组）；HLV-Cu +激光（VII组）；HLV-Cu + H₂O₂+激光（VIII组）八个组（每组用量均相为1mL，HLV-Cu的浓度为250µg/mL，H₂O₂的加入量同试验例1），分别按照组别要求与400µL 大肠杆菌或金黄色葡萄球菌（10⁸CFU mL^-1）共培养12h，然后吸取100μL的细菌悬浮与20µL SYTO-9（1.0×10^-3M）和20µL PI（1.5×10^-3M）在37℃黑暗处理15min。染色后，用PBS离心混合液以去除过量的SYTO-9和PI，最后将细菌重新悬浮于50µL PBS中，吸取10μL置于载玻片表面。使用60倍放大的倒置荧光显微镜，观察染色的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的图像。将细菌按照各组要求，共培养12h进行活/死染色。

用标准的活/死染色法进一步确认了用不同组别处理的细菌的活力，分别用荧光核酸PI和SYTO9来识别死（红色）和活（绿色）的细菌。从图11中可以看出，与平板计数法取得的结果相似，从活/死染色中可以看到清晰的杀菌梯度。在PBS（图11（a）中I、V组和图11（b）中I、V组）和H₂O₂（图11（a）中II、VI组和图11（b）II、VI组）处理下，大多数细菌被染成绿色。在HLV-Cu（图11（a）中III、VII组和图11（b）中III、VII组）和HLV-Cu+ H₂O₂（图11（a）中IV、VIII组和图11（b）中IV、VIII组）的情况下观察到明显的红色荧光，在激光照射后可进一步增强。用HLV-Cu + H₂O₂+ 激光组培养的细菌显示出最低的存活率，它被完全标记为红色。

试验例3：细菌透射电镜

将细菌分别与按照试验例2设置的八个组共培养12h之后，用2.50%戊二醛溶液固定细菌，经PBS洗涤之后包埋并封闭。而后依次用低浓度到高浓度的乙醇脱水，再用丙酮脱醇，最后经梯度渗透包埋，负染后即可放置TEM下观察。

如细菌的TEM图像所示，用PBS（图12（a）中I、V组和图12（b）中I、V组）培养的细菌呈现出健康细菌的形态特征，两个细菌的边缘清晰，菌体光滑。但用其他组别处理后，发现有不同程度的损伤。例如，单模式阳离子抗菌剂下，细菌的细胞膜轻微破损，有少量细胞膜脱落（图12（a）中II、VI组和图12（b）中II、VI组）。在双模式（图12（a）IV、VII组和图12（b）中IV、VII组）或多模式（图12（a）中VIII组、12（b）VIII组）抗菌治疗剂下，检测到明显的细胞变形和表面塌陷。值得注意的是，综合四种模式治疗的HLV-Cu + H₂O₂+ NIR组，同时显示出最高的抗菌效果，其细胞膜被严重破坏，并伴随着细胞内容物的外流。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种多功能阳离子共价有机框架材料，其特征在于，所述多功能阳离子共价有机框架材料是由1H-吡唑-4-甲醛、紫晶胺阳离子化合物和Cu₂O通过溶剂热反应，聚合得到的。

2.根据权利要求1所述的多功能阳离子共价有机框架材料，其特征在于，所述1H-吡唑-4-甲醛、紫晶胺阳离子和Cu₂O的摩尔比为2：1：1。

3.根据权利要求1所述的多功能阳离子共价有机框架材料，其特征在于，所述紫晶胺阳离子化合物为1,1-双（4-氨基苯基）-[4,4'-联吡啶]-1,1'-二氯化铵。

4.根据权利要求1所述的多功能阳离子共价有机框架材料，其特征在于，所述溶剂热反应的温度为120℃，所述溶剂热反应的时间为72h。

5.根据权利要求1所述的多功能阳离子共价有机框架材料，其特征在于，所述溶剂热反应的溶剂为均三甲苯、二氧六环和乙酸溶液的混合溶剂。

6.根据权利要求5所述的多功能阳离子共价有机框架材料，其特征在于，所述均三甲苯、二氧六环和乙酸溶液的体积比为5：5：1；所述乙酸溶液的浓度为6M。

7.权利要求1~6任一项所述的多功能阳离子共价有机框架材料在制备具有光动力、光热、阳离子和类芬顿协同抗菌药物的中的用途。

8.一种含有权利要求1~6任一项所述的多功能阳离子共价有机框架材料的抗菌药物，其特征在于，所述抗菌药物以权利要求1~6任一项所述的多功能阳离子共价有机框架材料为有效成分。

9.根据权利要求8所述的抗菌药物，其特征在于，所述抗菌药物杀灭致病细菌的杀灭率为100%。

10.根据权利要求9所述的抗菌药物，其特征在于，所述杀灭致病细菌为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。