CN116789854A - 兼具细菌捕获与抑菌功能的纳米抗菌肽及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种兼具细菌捕获与抑菌功能的纳米抗菌肽及制备方法和应用，弥补了大部分捕获肽抗菌活性差的缺点，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；制备方法如下：交替排布带有正电荷的R和极性不带电的Q，并连续排布极性氨基酸：W，得到RWQW的序列结构单元，将该结构单元重复3遍作为自组装成阳离子肽纤维骨架。采用柔性接头与乳铁蛋白28‑34活性识别区域相连接，构建纳米捕获肽序列结构。本发明的纳米肽在生理环境中能形成致密的纳米纤维网，对大肠杆菌捕获能力较强，并促进巨噬细胞对细菌团的吞噬能力。综上所述，本发明的纳米抗菌肽对革兰氏阴/阳性菌均具有良好的杀灭活性，是一种应用价值较高的纳米抗菌肽。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种兼具细菌捕获与抑菌功能的纳米抗菌肽及制备方法和应用。
背景技术
抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMPs)是一类天然存在于生物体中的小分子多肽，在生物体内发挥重要的免疫防御作用，并对各种微生物，包括细菌、真菌、病毒和寄生虫等具有杀菌或抑制作用。先天免疫系统进化出一种独特的抗菌肽：人α-防御素6，其主要通过形成纳米纤维网，网捕病原菌，从而防止病原菌入侵宿主上皮并随后传播到其他器官，这种“围而不攻”的策略可以最大限度减少病原菌产生耐药的可能性。然而，该类抗菌肽的抑菌活性差，仍会引起细菌感染的发生的可能性。
发明内容
基于以上问题，本发明的目的在于提供一种兼具细菌捕获与抑菌功能的纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34，该肽通过形成纳米网状结构，捕获细菌的同时杀灭细菌，协同先天免疫细胞：巨噬细胞共同抗菌，有效降低细菌产生耐药的可能性，弥补了大部分捕获肽抗菌活性差的缺点。
本发明所采用的技术方案如下：一种兼具细菌捕获与抑菌功能的纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步的，如上所述的纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34，其纳米自组装结构的条件如下：浓度为1-256μM，37℃孵育24小时。
进一步的，如上所述的纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34，当浓度达到16μM时，其组装成纳米结构后能够捕获大肠杆菌。
本发明的另一目的是提供一种兼具细菌捕获与抑菌功能的纳米抗菌肽及制备方法RWQW3-hLF28-34制备方法，如下：
(1)交替排布带有正电荷的精氨酸和极性不带电的谷氨酰胺，并连续排布极性氨基酸：色氨酸，得到RWQW的序列结构单元，将该结构单元重复3遍作为自组装成阳离子肽纤维骨架，该重复单元模拟离子互补模式，引入极性不带电的谷氨酰胺，促进形成更稳定的纳米纤维结构；
(2)采用GSGS作为柔性接头与乳铁蛋白28-34的活性识别区域RKVRGPP相连接，构建多肽序列结构，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
(3)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到多肽；
(4)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成该多肽的制备，再对所述的多肽的纳米形态表征、体外溶血活性、细胞毒性、杀菌活性、捕获细菌能力及促进巨噬细胞吞噬能力的测定，最后将所述的多肽命名为纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34。
本发明的另一目的是提供以上所述的兼具细菌捕获与抑菌功能的纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34在制备治疗由革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌引起的感染性疾病药物中的应用。
进一步的，所述的革兰氏阴性菌包括：大肠杆菌。
进一步的，所述的革兰氏阳性菌包括：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和/或单核增生李斯特菌。
本发明的有益效果及优点：本发明的纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34在生理环境中能形成致密的纳米纤维网，具有良好的生物相容性，对所测试大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌等革兰氏阴/阳性菌均具有良好的杀灭活性，并具有较强的捕获能力，在浓度16μM的情况下即可有效捕获大肠杆菌。本发明的纳米抗菌肽在维持捕获能力的同时，弥补了大部分捕获肽抗菌活性差的缺点。本发明的纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34进一步促进巨噬细胞表达趋化因子，增强巨噬细胞对细菌团的吞噬能力，这种协同先天免疫系统抗菌的替抗模式可以有效降低细菌选择性压力，降低耐药性的产生。综上所述，RWQW3-hLF28-34是一种应用价值较高的纳米抗菌肽。
附图说明
图1为纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34的质谱图；
图2为纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34的色谱图；
图3为纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34的临界聚集浓度图；
图4为纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34的临界聚集浓度的线性拟合值图；
图5为纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34的纳米结构表征图；
图6为纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34溶血活性的测定图；
图7为纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34细胞毒性的测定图；
图8为纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34对常见病原菌的杀灭活性图；(a)E.coli 25922,(b)E.coli K88,(c)S.typhimurium 14028,(d)S.typhimurium 7731,(e)S.aureus 29213,(f)Listeria monocytogenes 1.10753；
图9为纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34沉降捕获大肠杆菌E.coli ATCC 25922能力测定图；(a)菌落数观察图,(b)菌落数测定图；
图10为纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34促进巨噬细胞表达趋化因子图；
图11为不同浓度的纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34促进巨噬细胞吞噬大肠杆菌E.coliATCC 25922对比图；
图12为纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34促进巨噬细胞吞噬大肠杆菌E.coli ATCC 25922对比图，其中(a)对照组Bright,(b)对照组DAPI染色,(c)对照组EGFP观察合并,(d)对照组合并；(e)RWQW3-hLF28-34处理组Bright,(f)RWQW3-hLF28-34处理组DAPI染色,(g)RWQW3-hLF28-34处理组EGFP观察合并,(h)RWQW3-hLF28-34处理组合并。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34的设计：选择Arg和Gln作为带电核心和极性不带电残基，两种氨基酸交替排布，中间选择Trp作为疏水氨基酸，得到形成纳米纤维支架的氨基酸序列模板(Arg Trp Gln Trp)n，n＝3。然后通过连接子GSGS连接乳铁蛋白活性识别区域RKVGPP，该肽的氨基酸序列如表1所示。
表1纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34的氨基酸序列
纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34的分子结构式如式(I)所示：
实施例2
利用固相化学合成法合成纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34
1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，脱去Fmoc基团得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；如上依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，加入约10倍体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末，2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤，真空干燥得到多肽，切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
3、Fmoc-S5-OH(1mmol)，HATU(1mmol)，HOAT(1mmol)，DIPEA将(1mmol)DMF(6mL)混合15min，然后在室温下添加到树脂中。2小时后，依次用DMF(3次)，DCM(3X，5mL)和DMF(3X，5mL)洗涤树脂。使用Grubbs的第一代催化剂在35℃下于1,2-二氯乙烷(DCE)中进行闭环易位反应。用DCM(3X，5mL)和DCE(3X，5mL)洗涤树脂，然后用10mM的Grubbs第一代催化剂在DCE中的溶液处理；
4、使用0.2moL/L硫酸钠(磷酸调节至pH＝7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％ TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％ TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％ B～40％ B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；
5、多肽的鉴定：将上述得到的多肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(见附图)与表1中的理论分子量基本一致，多肽的纯度大于95％。
实施例3
纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34的纳米表征测定：
1、临界聚集浓度测定：为了检测纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34形成纳米结构的能力，临界聚集浓度(CAC)使用1-苯胺-8-萘磺酸(ANS)荧光探针测定。将1μL ANS(终浓度为1mM，溶解于100％ DMF中)加入不同浓度的多肽(溶解于去离子水中)，37℃孵育15min。将混合样品转移到96孔板上，使用荧光酶标仪进行荧光谱扫描，激发波长为369nm，发射波长为440nm-550nm。随后使用Origin软件计算多肽的CAC值。检测结果见图3和图4。
从图3和图4看出，随着浓度(1-256μM)的上升，纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34在440nm-550nm内荧光强度逐渐上升，表明溶液中存在纳米大分子，初步判定了纳米结构的形成，随后使用Origin软件拟合分析纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34的CAC值为58.52μM。
2、纳米形貌分析：为了进一步分析纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34的纳米形貌，将肽(1.28mM)在去离子水中稀释至2×CAC浓度，37℃培养箱中孵育24小时。将样品沉积在包碳网上，采取日立H-7800TEM(Hitachi,Japan)在100KV下用2％乙酸双氧铀负染色15秒观察。检测结果见图5。
从图5可以看出，纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34在2×CAC浓度时形成致密的纤维网状结构，直径为13nm。
实施例4
纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34体外溶血活性、细胞毒性和杀菌活性测定：
1、溶血活性测定：采集人的新鲜血液1mL于肝素钠抗凝管中，1000g离心5min收集红细胞，用PBS冲洗3遍后用10mL PBS重悬，将不同浓度肽添加至含有50μL PBS的96孔板中，随后加入等体积的红细胞悬液。用0.1％Triton X-100处理的hRBC悬浮液用作阳性对照，未处理的hRBC悬浮液用作阴性对照。在37℃培养箱内恒温孵育1h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测定光吸收值，以引起5％溶血的浓度为最小溶血浓度。溶血率使用下列公式计算：
溶血率(％)＝[(样品OD570nm-阴性对照OD570nm)/(阳性对照OD570nm-阴性对照OD570nm)]×100％
溶血结果(图6)显示纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34对血细胞无破坏作用，最小溶血浓度为>128μM。
2、细胞毒性测定：将冻存于液氮中的细胞复苏后接种于含有10％胎牛血清和1％双抗的培养基中，在37℃、5％ CO2条件下传代培养。将培养好的细胞用0.25％胰酶消化，用培养基将其调整至2～4×105cells/mL。将50μL细胞悬液与50μL不同浓度的多肽混合于96孔板中，在37℃、5％ CO2条件下孵育24h，随后每孔加入25μL MTT(5mg/mL)，继续孵育4h。孵育结束后，弃去上清，用100μL DMSO溶解孔底结晶，用酶标仪在570nm处测定每孔吸光度值。培养基孔作为空白对照。检测结果见图7。
从图7可以看出，纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34对RAW 264.7和HEK 293T细胞无显著毒性，说明纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34具有良好的生物相容性，具有成为抗生素替代品的潜力。
3、杀菌活性测定：利用微量稀释法测定抗菌肽的最小抑菌浓度。将不同浓度肽添加至0.2％ BSA稀释液(含0.01％乙酸)于96孔板中，随后加入等体积的终浓度为1×105CFUmL-1的细菌悬液，96孔板中的最终肽浓度范围为0.25至128μM。在37℃温育3小时，吸出50μL在PBS梯度稀释后，使用平板计数法，杀灭99.99％菌的肽浓度确定为最小杀菌浓度。检测结果见图8和表2。
表2纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34的杀菌活性、MHC和TI值
1最小溶血浓度>128μM时，用256μM计算选择性指数
2TI＝MHC/GMMBC
由图8和表2和可以看出，纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌及表皮葡萄球菌均表现出较强的杀灭活性，相比于肽RFQF4-hLF28-34杀菌活性显著增强，弥补了肽RFQF4-hLF28-34杀菌活性差的缺点。
实施例5
纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34捕获细菌能力测定：
为了评估纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34捕获病原菌的能力，将OD600nm＝0.4的E.coli25922菌液3mL置于经乙醇消毒比色皿中，加入16-128μM的纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34肽溶液，室温静置放置6h，观察细菌凝集状态并拍照，以未经肽处理组作为对照组。分别在0、0.5、1、2、4、6h时吸取50μL细菌上清液，加入450μL经高温灭菌的PBS中进行梯度稀释，取100μL稀释液均匀接种于MHA平板培养基上。在37℃培养箱中过夜培养，计数每一个样品的菌落数，计算每一个样品的CFU值，试验重复三次，检测结果见图9。
由图9可以看出，纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34对大肠杆菌E.coli 25922具有明显的捕获沉降作用，并具有浓度和时间依赖性，128μM纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34处理4小时能够完全将大肠杆菌沉降。
实施例6
纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34免疫调节能力测定：
1、纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34对巨噬细胞表达趋化因子的影响：为了评估纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34是否会影响巨噬细胞产生免疫调节因子-趋化因子。趋化因子可以激活其他免疫细胞的吞噬能力，并吸引更多的免疫细胞聚集到感染部位。取对数生长期的E.coli25922菌液，3000rpm离心5分钟收集菌体，利用PBS缓冲液洗涤3次，重悬于PBS缓冲液中，调节细菌浓度至OD 600nm＝0.4。加入32μM的纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34与细菌悬液在37℃中共培养2小时。将经肽预处理的细菌颗粒加入到RAW 264.7的细胞培养液中，37℃培养2小时，吸走细胞培养液并洗涤3遍，加入200μL细胞裂解液Trizol进行提取RNA，反转录为cDNA后，以β-actin为内参基因，根据2-ΔΔCt方法计算趋化因子CCL1和CCL2基因的相对mRNA的水平。β-actin上游引物5’GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG 3’，下游引物5’ATGCCACAGGATTCCATACC 3’；CCL1上游引物5’ACCGAAGTCATAGCCACACTC 3’，下游引物5’CTCCGTTACTTGGGGACACC 3’；CCL2上游引物5’CCAGACAGAAGTCATAGCCACT 3’，下游引物5’GGTTCTTCCGTTGAGGGACA 3’。
从图10可以看出，与对照组相比，采用纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34预处理细菌后，显著促进RAW 264.7巨噬细胞表达趋化因子CCL1和CCL2，有利于进一步吸引更多的免疫细胞聚集到细菌感染部位，清除病原菌。
2、庆大霉素保护试验：为了评估纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34是否会促进巨噬细胞对细菌团的吞噬作用，通过庆大霉素保护试验检测巨噬细胞内细菌含量。取对数生长期的E.coli25922菌液，3000rpm离心5分钟收集菌体，利用PBS缓冲液洗涤3次，重悬于PBS缓冲液中，调节细菌浓度至OD600nm＝0.4。加入16μM和32μM RWQW3-hLF28-34与细菌悬液在37℃中共培养2小时。将经肽预处理的细菌颗粒加入到RAW 264.7的细胞培养液中，37℃培养2小时，吸走细胞培养液并洗涤3遍，加入含有50μg/mL的庆大霉素溶液清除胞外菌，使用0.1％Triton X-100裂解10分钟，吸取50μL裂解液，加入450μL经高温灭菌的PBS进行梯度稀释，取100μL稀释液均匀接种于MHA平板培养基上。在37℃培养箱中过夜培养，计算每一个样品的菌落数(CFU)，试验重复三次，检测结果见图11。
从图11可以看出，与对照组相比，经过浓度为16μM和32μM的纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34预处理后，显著增加了大肠杆菌颗粒在RAW 264.7中的内化，且具有剂量依赖性。这说明纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34能够捕获细菌，促进吞噬细胞中趋化因子的表达和吞噬能力。
3、巨噬细胞吞噬细菌试验：为了直观观察纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34促进巨噬细胞对细菌团的吞噬作用，我们利用使用荧光倒置显微镜观察了RAW 264.7对大肠杆菌的吞噬作用。准备含有绿色荧光蛋白的大肠杆菌颗粒，3000rpm离心5min收集大肠杆菌菌体，重悬于PBS缓冲液中。加入终浓度为16μM的肽液，与细菌悬液在37℃中共培养2h。将经肽预处理的细菌颗粒加入到RAW 264.7的细胞培养液中，37℃培养2h，吸走细胞培养液并洗涤3遍，加入Triton X-100固定10min，吸走Triton X-100并洗涤3遍，加入含有DAPI的抗淬灭剂。用荧光倒置显微镜观察。检测结果见图12。
结果如图12所示，与对照相比，经纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34处理的大肠杆菌颗粒发生聚集，并且RAW 264.7巨噬细胞对聚集的大肠杆菌颗粒的吞噬作用增强。这说明纳米抗菌肽能够捕获大肠杆菌，进一步促进吞噬细胞的摄取。
Claims (7)
1.一种兼具细菌捕获与抑菌功能的纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种兼具细菌捕获与抑菌功能的纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34，其特征在于，其纳米自组装结构的条件如下：浓度为1-256μM，37℃孵育24小时。
3.根据权利要求1所述的一种兼具细菌捕获与抑菌功能的纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34，其特征在于，当浓度达到16μM时，其组装成纳米结构后能够捕获大肠杆菌。
4.根据权利要求1所述的一种兼具细菌捕获与抑菌功能的纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)交替排布带有正电荷的精氨酸和极性不带电的谷氨酰胺，并连续排布极性氨基酸：色氨酸，得到RWQW的序列结构单元，将该结构单元重复3遍作为自组装成阳离子肽纤维骨架，该重复单元模拟离子互补模式，引入极性不带电的谷氨酰胺，促进形成更稳定的纳米纤维结构；
(2)采用GSGS作为柔性接头与乳铁蛋白28-34的活性识别区域RKVRGPP相连接，构建多肽序列结构，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
(3)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到多肽；
(4)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成该多肽的制备，再对所述的多肽的纳米形态表征、体外溶血活性、细胞毒性、杀菌活性、捕获细菌能力以及促进巨噬细胞吞噬能力的测定，最后将所述的多肽命名为纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34。
5.根据权利要求1所述的一种兼具细菌捕获与抑菌功能的纳米抗菌肽RWQW3-hLF28-34在制备治疗由革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌引起的感染性疾病药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的革兰氏阴性菌包括：大肠杆菌。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的革兰氏阳性菌包括：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和/或单核增生李斯特菌。
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| CN202310673197.4A Active CN116789854B (zh) | 2023-06-08 | 2023-06-08 | 兼具细菌捕获与抑菌功能的纳米抗菌肽及制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116789854B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080032934A1 (en) * | 2005-04-25 | 2008-02-07 | Clear Nano Solutions | Compositions for prevention of adhesions and other barrier applications |
| US20080274979A1 (en) * | 2007-03-14 | 2008-11-06 | Rutledge Ellis-Behnke | Treatment of leaky or damaged tight junctions and enhancing extracellular matrix |
| CN106749532A (zh) * | 2016-11-25 | 2017-05-31 | 东北农业大学 | 具有耐受蛋白酶的多股β‑发卡短肽及制备方法和应用 |
| CN115028704A (zh) * | 2022-03-16 | 2022-09-09 | 东北农业大学 | 一种抗酶解抗菌肽n1及其制备方法和应用 |
-
2023
- 2023-06-08 CN CN202310673197.4A patent/CN116789854B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080032934A1 (en) * | 2005-04-25 | 2008-02-07 | Clear Nano Solutions | Compositions for prevention of adhesions and other barrier applications |
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| CN115028704A (zh) * | 2022-03-16 | 2022-09-09 | 东北农业大学 | 一种抗酶解抗菌肽n1及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
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| YANG YANG 等: ""A Novel Dual-Targeted α-Helical Peptide With Potent Antifungal Activity Against Fluconazole-Resistant Candida albicans Clinical Isolates"", 《GENBANK》, vol. 11, 30 September 2020 (2020-09-30), pages 10 * |
| 于伟康 等: ""超分子多肽自组装在生物医学中的应用"", 《生物工程学报》, vol. 37, no. 7, 22 October 2020 (2020-10-22), pages 2240 - 2255 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116789854B (zh) | 2024-04-02 |
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