CN116789754A - 一种基于细菌感染的多肽铜抗菌材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于细菌感染的多肽铜抗菌材料的制备方法，该方法利用EE19与Cu²⁺合成了具有杀菌效果的材料，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等具有很好的抗菌效果，可以解决抗菌活性与细胞毒性间的矛盾关系。本发明提供的杀菌材料在伤口敷料，植入体涂层，神经外科导管等领域的潜在应用前景。

Description

一种基于细菌感染的多肽铜抗菌材料的制备方法

技术领域

本发明涉及抗菌材料的制备方法，具体说是多肽铜抗菌材料、其制备方法以及其杀菌方面的应用。

背景技术

细菌感染包括植入和介入式医疗器械相关感染，正在威胁着人们的生命健康，细菌对抗生素的耐药性是严重的公共卫生问题，所以迫切需要替代抗生素药物的开发。细菌给人们的生活带来诸多不便，而且游离菌容易聚集在活性组织或材料表面进一步发展为成熟的生物膜造成更严重的后果。随着抗菌材料的不断发展，刺激响应型抗菌材料引起了学者的广泛关注。自19世纪后期以来，细菌被认为是几种人类疾病的原因；从那个时期开始，在许多方面作出了重大努力，以解决这一严重问题，包括接种疫苗、改善卫生条件和开发抗生素。自发现以来，抗菌药物尤其挽救了数百万人的生命，并缓解了一些患有慢性感染的患者。材料技术的进步带来了生物材料和医疗设备(如导尿管、心脏起搏器、髋关节植入物和隐形眼镜)使用的增加，然而，这种装置的应用涉及一些挑战-特别是由于生物膜的存在而引起的植入物相关感染。传染病造成数千万人死亡，约占全球死亡人数的20％，据估计，80％的人类感染与生物膜形成有关。此外，许多致病生物表现出越来越强的抗菌素耐药性。

铜是人体内的微量元素，具有较强的抗菌性能，铜及含铜材料已广泛应用于许多抗菌应用中。多肽具有设计简单、易修饰、易表征和结构可调等优点，在基础研究和临床应用中备受青睐，被认为是新的、有效的药物。天然抗菌肽有广谱抗菌，抗耐药性，生产成本高，毒性大，稳定性差等特点。基于以上优缺点，我们可以将多肽与铜形成多肽铜配合物，制成杀菌材料，可以解决抗菌活性与细胞毒性间的矛盾关系。

发明内容

本发明中的EE19肽是从亚洲玉米螟表皮提取，并通过截取其中的重复序列得到。该多肽由19个氨基酸组成，故将其命名为EE19，其序列为EVKHEYKHEAPKHEEHKHE。该多肽中含有较多组氨酸、酪氨酸以及谷氨酸。将多肽(EE19)与Cu²⁺形成EE19-Cu配合物，制成杀菌材料，可以解决抗菌活性与细胞毒性间的矛盾关系。EE19-Cu配合物提高了Cu²⁺的生物安全性，具有释放杀菌的特点。

本发明首先提供一种多肽，其是由氨基酸序列为EVKHEYKHEAPKHEEHKHE所示的多肽，或在其基础上增加氨基酸1个或数个，如VEVKHEYKHEAPKHEEHKHE、KVEVKHEYKHEAPKHEEHKHE、EVKHEYKHEAPKHEEHKHEHKE、EVKHEYKHEAPKHEEHKHEYKHEPK等，或者N端或/和C端删减氨基酸1个或数个(如2个、3个、4个等)，如VKHEYKHEAPKHEEHKHE、KHEYKHEAPKHEEHKHE、EVKHEYKHEAPKHEEH、EVKHEYKHEAPKHE等，但仍然具有相同功能的多肽。

相应提供所述的多肽在制备抗菌材料中的应用。

本发明进一步提供一种基于细菌感染的多肽铜抗菌材料的制备方法,包括以下步骤：

1)取冻干多肽EE19溶解于去离子水形成透明澄清的多肽EE19溶液；

2)取CuCl₂·2H₂O溶解于去离子水形成透明澄清的铜溶液；

3)将上述两种物料按比例混合反应得到EE19-Cu抗菌材料；

任选地，还包括下述步骤,

4)进一步经过AKTA Pure蛋白质分离纯化系统进行纯化；

任选地，进一步还包括下述步骤,

5)对纯化后的产物进行脱盐处理，具体使用超滤管对其进行脱盐浓缩。

在具体实施方式中，所述的EE19溶液的浓度为1-8mM，优选为2-4mM，更优选为4mM；优选地在4℃条件进行溶解；

所述CuCl₂·2H₂O溶液的浓度为0.5-2M，优选为0.6-1.5M，更优选为0.8-1.2M，例如1M。

优选地，步骤3)所述的AKTA Pure蛋白质分离纯化系统使用的是阴离子交换柱，将样品通过无菌针管以流速1mL/min打进仪器；上样结束，以流速2mL/min开始洗脱，在洗脱过程中，观察到UV线开始升高时收集样品，当UV线升高再降低变平后，即停止收集样品，所得样品即为纯化的EE19-Cu抗菌材料。

另外优选地，步骤4)所述的超滤条件为在截留分子量为1000的超滤管中，调整超滤管的方向使其滤膜垂直于转子的中央，在转速为3000×g的条件下离心10min。

进一步优选地，步骤4)所述的样品回收条件为，将超滤管内管倒过来置于一个干净的离心管中，在1000×g条件下离心2min，使浓缩后的样本从超滤内管转移到收集管中，超滤液保存在收集管中，在4℃冰箱中保存。

本发明也提供利用所述的制备方法制备的多肽铜抗菌材料。

本发明进一步提供所述的多肽铜抗菌材料在制备杀菌制品中的应用。具体地，所述杀菌是指用于预防或消杀革兰氏阳性菌，例如金黄色葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌等；或革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌、沙门氏菌、布氏杆菌等。

进一步的，所述步骤2)中铜溶液的进一步经过过滤处理，具体的过滤方法为：使用孔径为0.22μm的水系针头过滤器对所配制的CuCl₂·2H₂O溶液进行一次过滤操作，以除去不溶于水的杂质。

进一步的，所述步骤3)中上样缓冲液的配制方法为：取NaH₂PO₄加入ddH₂O，进行超声使其充分溶解，用NaOH和HCl调节pH至7.4，将其转移到容量瓶定容，然后抽滤，再进行超声除去气泡，得到NaH₂PO₄上样缓冲液，优选地其为20mM NaH₂PO₄上样缓冲液。

进一步的，所述步骤3)中洗脱缓冲液的配制方法为：取NaH₂PO₄和gNaCl加入ddH₂O，进行超声使其充分溶解，用NaOH和HCl调节pH至7.4，将其转移到容量瓶定容，然后抽滤，再进行超声除去气泡，得到NaH₂PO₄，NaCl洗脱缓冲液，具体为20mM NaH₂PO₄，500mM NaCl洗脱缓冲液。

进一步的，所述步骤3)中EE19-Cu纯化上样前处理：用ddH₂O清洗AKTA Pure蛋白质分离纯化系统仪器管路通道，流速为0.5mL/min，然后使用上样缓冲液润洗仪器管路通道，流速从1mL/min逐步加到3mL/min，观察到UV线变平即可，然后将阴离子交换柱连接到该仪器上，即可上样。

进一步的，所述步骤4)中所得最终纯化脱盐的EE19-Cu抑菌溶液，通过对该样品取样稀释，通过电感耦合等离子体发射光谱(ICP)对样品中的铜元素的浓度进行分析。

本发明提供了前述制备方法制备得到的一种基于细菌感染的多肽铜抗菌材料。

本发明的优点和积极效果为：本研究基于EE19与Cu²⁺合成了具有杀菌效果的材料，探究了该抗菌材料的具体结合方式及其抗菌效果，可以解决抗菌活性与细胞毒性间的矛盾关系。EE19-Cu配合物提高了Cu²⁺的生物安全性，具有释放杀菌的特点。为所合成的杀菌材料在伤口敷料，植入体涂层，神经外科导管等领域的潜在应用提供了理论和实践支持。

附图说明

图1是EE19与Cu²⁺以不同的摩尔比混合后紫外光谱图。

图2是EE19与Cu²⁺以不同的摩尔比混合后紫外光谱峰面积。

图3是红外光谱。(A)EE19和EE19-Cu的FTIR光谱。(B)EF19和EF19-Cu的FTIR光谱。

图4是EE19-Cu在不同浓度的NaCl体系中透析24h后Cu²⁺的比例。

图5是细菌在含有不同材料中的生长曲线：(A)大肠杆菌；(B)金黄色葡萄球菌。

图6是涂布平板法检测EE19-Cu的抗菌性能。(A)细菌经过(a)Ctrl，(b)EE19，(c)EE19-Cu，(d)Cu²⁺和(e)PEN(抗生素)处理后的平板菌落图像，(B)大肠杆菌组对应的菌落数，(C)金黄色葡萄球菌组对应的菌落数。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

采用人工饲料饲养玉米螟幼虫，选取其幼虫进行无标记定量蛋白质组学分析。收集头囊，用液氮研磨成粉末，用1mL裂解液(8M尿素，50mM Tris,1％ SDS,pH 8.0)提取蛋白质。超声处理5min，收集上清液，4℃，13000r/min离心20min。随后，加入10mM DTT的丙酮沉淀蛋白质。蛋白质含量采用Bradford法，Xmark分光光度计测定。在200μg的样品中加入裂解缓冲液，使其总体积为200μL。随后，加入DTT至终浓度为25mM，反应混合物于60℃孵育1h，再加入碘乙酰胺至终浓度为50mM，30℃孵育10min。将烷基化蛋白转移至超滤管(MWCO10000)，然后在4℃下以12000r/min离心20min。随后，样品用100μL溶出缓冲液洗涤三次。蛋白样品用4μg胰蛋白酶原液在37℃下消化过夜。在离心管中收集胰蛋白酶肽，以12000r/min离心20min。所有样品冻干。

上述样品经过蛋白组测序，分析发现一个表皮蛋白，该蛋白中有一段重复的具有独特的氨基酸组成特点的序列，且占比很大。选取出的该有独特的多肽，其序列为EVKHEYKHEAPKHEEHKHE，其中含有较多的组氨酸。在pH值为3-4时，组氨酸会被质子化，当pH值为4-6时，组氨酸逐渐去质子化分析预测其在中性条件下可能会结合金属离子，所以我们通过该序列合成纯化了多肽，将其命名为EE19，然后验证其是否与金属离子有相互作用，从而利用金属离子来达到杀菌的效果。

实施例2

取4.262g CuCl₂·2H₂O置于烧杯中，加入适量的ddH₂O，待其充分溶解后，将其转移到25mL容量瓶定容至25mL。使用孔径为0.22μm的水系针头过滤器对所配制的CuCl₂·2H₂O溶液进行一次过滤操作，以除去不溶于水的杂质。冻干肽EE19从-20℃冰箱中取出(5mg/管)，于室温下放置20min后置于微量离心机中，在8000rpm的条件下离心1min，使EE19均匀沉积在离心管底部，向其中加入500μL ddH₂O，使多肽完全溶解，得到的多肽水溶液浓度为4mmol/L。在室温下，向上述EE19水溶液中加入20μL1 mol/L的CuCl₂·2H₂O溶液(摩尔比为1：10)，吹打数下使其充分混匀，保存在冰中。将上述合成的EE19-Cu样品经过AKTA Pure蛋白质分离纯化系统进行纯化。取2mL纯化后的EE19-Cu溶液置于截留分子量(MWCO)为1000的超滤管内管中，在转速为3000×g的条件下离心10min对样品进行超滤脱盐处理。将超滤管内管倒过来置于一个干净的离心管中，在1000×g条件下离心2min收集浓缩后的样本，将其从超滤内管转移到收集管中，超滤液保存在收集管中，在4℃冰箱中保存。

上述材料经过表征显示，与不同浓度的Cu²⁺混合反应后，EE19的紫外吸收峰呈现不对称且有拉平趋势，且吸光度有所增高(结果见图1)，随着加入的Cu²⁺浓度的增加，EE19在280nm处的紫外峰面积呈现逐渐减小的趋势(结果见图2)。配位作用分别为Cu²⁺与EE19中的酪氨酸残基上的酚羟基O形成Cu-O键,与EE19中的组氨酸残基咪唑环上的N形成Cu-N键(结果见图3)。0.5M、1M NaCl组中EE19-Cu中的Cu²⁺含量分别有不同程度的下降，Cu²⁺与EE19的谷氨酸之间存在静电相互作(结果见图4)。

实施例3

在超净台中将培养至对数生长期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌以OD₆₀₀为0.05的接种量分别接种于培养基(空白组)、溶有10μg/mL氨苄青霉素钠的培养基(阳性对照组)、溶有10mg/mL的EE19肽的培养基(实验组)、溶有含有400μg/mL的Cu²⁺的EE19-Cu肽的培养基(实验组)、溶有400μg/mL的Cu²⁺的培养基(实验组)中，放入恒温摇床，在温度为37℃，转速为250rpm的条件震荡培养，分别通过生长曲线法和涂布平板法对革兰氏阴性菌：大肠杆菌和革兰氏阳性菌：金葡菌进行抗菌实验，验证EE19-Cu材料的广谱抗菌性。

结果显示，加EE19-Cu组，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长都受到抑制EE19-Cu对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌作用(结果见图5)。EE19对两种细菌不具备杀菌功能，而EE19-Cu均显著减少了体系中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种细菌的数目，抑菌效果显著，且EE19-Cu组对大肠杆菌的杀菌效果要比AMP(氨苄青霉素钠)的略好(结果见图6)，具体抑菌数据见图6中(B)和(C)分别显示大肠杆菌组对应的菌落数和金黄色葡萄球菌组对应的菌落数。

对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

1.一种多肽，其特征在于，其是由氨基酸序列为EVKHEYKHEAPKHEEHKHE所示的多肽，或在其基础上增加氨基酸1个或数个，如VEVKHEYKHEAPKHEEHKHE、KVEVKHEYKHEAPKHEEHKHE、EVKHEYKHEAPKHEEHKHEHKE、EVKHEYKHEAPKHEEHKHEYKHEPK等，或者N端或/和C端删减1个或数个氨基酸，如VKHEYKHEAPKHEEHKHE、KHEYKHEAPKHEEHKHE、EVKHEYKHEAPKHEEH、EVKHEYKHEAPKHE等，但仍然具有相同功能的多肽。

2.如权利要求1所述的多肽在制备抗菌材料中的应用。

3.一种基于细菌感染的多肽铜抗菌材料的制备方法,包括以下步骤：

1）取冻干多肽EE19溶解于去离子水形成透明澄清的多肽EE19溶液；

2）取CuCl₂·2H₂O溶解于去离子水形成透明澄清的铜溶液；

3）将上述两种物料按比例混合反应得到EE19-Cu抗菌材料；

任选地，还包括下述步骤,

4）进一步经过例如AKTA Pure 蛋白质分离纯化系统进行纯化；

任选地，进一步还包括下述步骤,

5）对纯化后的产物进行脱盐处理，具体使用超滤管对其进行脱盐浓缩。

4.根据权利要求3所述的一种基于细菌感染的多肽铜抗菌材料的制备方法，其特征在于：所述的EE19溶液的浓度为1-8mM，优选为2-4mM，更优选为4 mM；优选地在4℃条件进行溶解；

所述CuCl₂·2H₂O溶液的浓度为0.5-2M，优选为0.6-1.5M，更优选为0.8-1.2M，例如1 M。

5.根据权利要求3所述的一种基于细菌感染的多肽铜抗菌材料的制备方法，其特征在于：步骤3）所述的AKTA Pure 蛋白质分离纯化系统使用的是阴离子交换柱，将样品通过无菌针管以流速1 mL/min打进仪器；上样结束，以流速2 mL/min开始洗脱，在洗脱过程中，观察到UV线开始升高时收集样品，当UV线升高再降低变平后，即停止收集样品，所得样品即为纯化的EE19-Cu抗菌材料。

6.根据权利要求3所述的一种基于细菌感染的多肽铜抗菌材料的制备方法，其特征在于：步骤4）所述的超滤条件为在截留分子量为1000的超滤管中，调整超滤管的方向使其滤膜垂直于转子的中央，在转速为3000×g的条件下离心10 min。

7.根据权利要求6所述的一种基于细菌感染的多肽铜抗菌材料的制备方法，其特征在于：步骤4）所述的样品回收条件为，将超滤管内管倒过来置于一个干净的离心管中，在1000×g条件下离心2 min，使脱盐浓缩后的EE19-Cu从超滤内管转移到收集管中，超滤液保存在收集管中，在4 ℃冰箱中保存。

8.利用权利要求3至7任一项所述的制备方法制备的多肽铜抗菌材料。

9.如权利要求8所述的多肽铜抗菌材料在制备杀菌制品中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述杀菌是指用于预防或消杀革兰氏阳性菌，例如金黄色葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌等；或革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌、沙门氏菌、布氏杆菌等。