CN116789631B - 一种酶协同光控一氧化氮供体、其制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种酶协同光控一氧化氮供体、其制备及应用。具体而言，本发明提供具有下式Ⅰ所示结构的化合物，式中R1为H、C1‑10链烷基、C1‑10环烷基、C1‑4烷氧基、苯基、苄基；R2为4‑硝基苄基、5‑硝基呋喃基、5‑硝基噻吩基、半乳糖基、磷酸二乙酯基。本发明还提供所述式Ⅰ化合物的制备方法，以及式Ⅰ化合物作为酶协同光控一氧化氮供体的用途。
Description
技术领域
本发明属于一氧化氮供体领域，具体涉及一氧化氮供体、其制备及应用
背景技术
一氧化氮是一种可在体内由L-精氨酸和氧分子在一氧化氮合酶（NOS）催化下生成的小分子，同时也是多种生理病理的内源性调节剂，包括维持微血管和大血管的动态平衡、神经信号传导、免疫炎症的调节以及肿瘤的发生与转移等。但一氧化氮寿命较短，半衰期只有数秒钟，且体内一氧化氮生成不足常会引起多种疾病，因此外源性一氧化氮对于这些疾病的预防和治疗有着重要的意义。一氧化氮供体化合物可以克服一氧化氮本身难携带、难定量、半衰期短等缺点，因此一氧化氮供体化合物的合成成为了近年来的研究热点。
近年来，文献报道的一氧化氮供体有金属亚硝基化合物（金属一氧化氮复合物）；偶氮烯二醇类化合物；亚硝胺化合物。然而，这些供体都具有一定的局限性，如供体一旦加入到各种各样的生物基质中后就开始自发释放；剩余的配合物的毒性强；生物背景吸收强；在生物介质中稳定性差；细胞损害大等。
光化学反应的程度可通过曝光的时间来控制，因此，以光为刺激信号的光敏感一氧化氮供体具有克服释放剂量不可控的优势，近期文献报道了一些光控一氧化氮供体。但光控一氧化氮供体仍然存在不足，例如对一氧化氮的释放位置和释放速率控制效果不佳。肿瘤发生是一个复杂而动态的过程，与肿瘤微环境密切相关。在实体瘤内，肿瘤细胞快速增殖，血管结构和功能异常，导致氧气和营养物质供应不足，产生缺氧区域，即乏氧。肿瘤组织乏氧是恶性肿瘤的一个重要生物学特征。肿瘤乏氧会导致还原酶的高表达，主要包括硝基还原酶、醌还原酶和偶氮还原酶等。在供体分子结构中引入酶识别基团可以将释放位置和释放速率有机的关联起来，且使供体在病变组织中的释放速率高于正常组织，有利于研究一氧化氮在病理过程中的参与机制以及对相关疾病的治疗。通过一氧化氮光计量能够对一氧化氮的释放动力学、释放总量以及释放速率有清晰的了解，这对揭示一氧化氮和生物反应之间的相关性有重大意义。
发明内容
针对现有技术中光控一氧化氮供体较少，且释放位置和释放速率控制效果不佳的问题，本发明目的在于提供一种抗干扰能力强的酶协同光控一氧化氮供体。
本发明的另一目的在于提供上述一氧化氮供体的制备方法，原料易得，合成步骤简单，产率高。
本发明的再一目的在于提供式Ⅰ化合物在制备治疗或预防癌症、高血压相关疾病和心血管疾病的药物或相关的用途。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种酶协同光控一氧化氮供体，其结构式如式Ⅰ所示：
式中，R1为H、C1-10链烷基、C1-10环烷基、C1-4烷氧基、苯基、苄基；R2为4-硝基苄基、5-硝基呋喃基、5-硝基噻吩基、半乳糖基、磷酸二乙酯基。
一种上述酶协同光控一氧化氮供体的合成方法，包括以下步骤：
（1）将化合物1a加入氢氧化钠的醇类溶液中，加热搅拌反应液，反应结束后冷却至室温，减压蒸发溶剂，再用盐酸调节pH，过滤沉淀，反复水洗后得到粗品，粗产品经柱层析分离纯化得到化合物2a。
（2）先将化合物2a溶于有机溶剂中，搅拌反应液，再加入4-硝基溴化卞、（或5-硝基呋喃、5-硝基噻吩、半乳糖、氯磷酸二乙酯中的一种），室温搅拌。反应结束后用饱和盐水洗涤溶液，萃取，干燥，旋干得到粗品，粗品经硅胶柱层析得到纯的化合物Ⅰ-A。
（3）将化合物Ⅰ-A溶解在有机酸中，在水浴上搅拌，然后加入亚硝酸钠的水溶液。用薄层色谱监测反应，待反应结束后将反应液萃取、旋干，得到粗品。粗品经硅胶柱层析纯化，得到所需一氧化氮供体Ⅰ。
步骤（1）中，所述反应的醇类溶剂为乙醇。
步骤（1）中，所述反应加热温度为30~120 ℃。
步骤（1）中，所述反应时间为12~24小时。
步骤（1）中，所述反应中柱层析分离的洗脱剂为：二氯甲烷/甲醇=5-10/1。
步骤（2）中，所述反应有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺等。
步骤（2）中，所述反应时间为1~12小时。
步骤（2）中，所述反应中柱层析分离的洗脱剂为：二氯甲烷/甲醇=5-10/1。
步骤（3）中，所述反应中所述有机酸为甲酸、乙酸、丙酸、苯甲酸、苯乙酸。
步骤（3）中，所述反应中水浴温度为-20~40 ℃。
步骤（3）中，所述反应中亚硝酸钠和化合物Ⅰ-A的摩尔比为0.5-20。
步骤（3）中，所述反应中反应时间为0.5~24小时。
步骤（3）中，所述反应中所述硅胶柱层析分离的洗脱剂为二氯甲烷：甲醇=10:0.5-5。
一种上述酶协同一氧化氮的供体用于在水溶液、细胞以及斑马鱼中通过光辐射来释放一氧化氮。
本发明酶协同光控一氧化氮供体释放一氧化氮的机理如下：
带有硝基还原酶识别基团（4-硝基溴化卞）的供体Ⅲ-B性质稳定，光照释放一氧化氮速率较慢；当和体系中的硝基还原酶反应后，4-硝基苄基离去，此时光照释放一氧化氮的速率增加了一倍。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
供体在与硝基还原酶完全反应后，被光照射时，可释放出一份子一氧化氮，其荧光强度随光照时间增加逐渐增强。与已有的一氧化氮供体相比，它的主要优势是：一是供体4-硝基苄基未离去时，随着一氧化氮的释放，荧光强度随光照时间逐渐减弱，释放速率缓慢；当供体与硝基还原酶反应后4-硝基苄基离去，释放一氧化氮速率增加为原来的二倍。这表明合成的供体在缺氧病变组织中的释放速率会高于正常组织，这有利于精准光控释放一氧化氮，便于研究一氧化氮在病理过程中的参与机制以及对相关疾病的治疗；二是所述供体化合物合成步骤简单、收率高，稳定性好。预估未来该供体在生物医学领域会具有更加宽阔的应用前景。
附图说明
图1是酶协同光控一氧化氮供体式Ⅰ的结构式图。
图2是酶协同光控一氧化氮供体Ⅱ-B释放一氧化氮的机理图。a）供体Ⅱ-B光照释放一氧化氮的机理图，b）供体Ⅱ-B+还原型辅酶Ⅰ+硝基还原酶反应后光照释放一氧化氮的机理图。
图3是化合物3a的质谱图。
图4是化合物3a的核磁氢谱图。
图5是酶协同光控一氧化氮供体Ⅱ-B光裂解后的质谱图。
图6是供体Ⅱ-B分解时释放一氧化氮的荧光光谱图。将供体Ⅱ-B溶解在中性磷酸盐缓冲溶液中，用365 nm的紫外灯照射，并间歇记录供体Ⅱ-B荧光发射光谱的变化（激发波长为480 nm）。从图中可以看到，供体的荧光信号随光照时间的增加逐渐减弱，80分钟释放结束。
图7是供体Ⅱ-B+还原型辅酶Ⅰ+硝基还原酶反应的荧光光谱图。将供体Ⅱ-B溶解在中性磷酸盐缓冲溶液中，同时加入还原型辅酶Ⅰ和硝基还原酶，并间歇记录荧光发射光谱的变化（激发波长为480 nm）。
图8是供体Ⅱ-B+还原型辅酶Ⅰ+硝基还原酶反应完全后光照释放一氧化氮的荧光光谱图。将供体Ⅲ-B溶解在中性磷酸盐缓冲溶液中，同时加入还原型辅酶Ⅰ和硝基还原酶，待供体Ⅱ-B与硝基还原酶完全反应后，用365 nm的紫外灯光照，并间歇记录荧光发射光谱的变化（激发波长为480 nm），40分钟释放结束。
图9是用2，3-二氨基萘（DAN）检测供体Ⅱ-B释放一氧化氮的荧光光谱图。将同浓度的供体Ⅱ-B和DAN溶解在中性磷酸盐缓冲液中。用365 nm的紫外灯光照，并间歇记录荧光发射光谱的变化。
图10是斑马鱼成像。将供体Ⅱ-B与斑马鱼共同培养30 min后，用中性磷酸盐缓冲溶液清洗3次，进行荧光显微成像，并间歇记录斑马鱼缓慢死亡过程中的荧光显微成像，直至鱼完全死亡且荧光强度不再变化。后用365 nm的紫外灯照射并间歇记录斑马鱼的荧光显微成像至荧光强度不再变化。
实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 一氧化氮供体（Ⅱ-B）的合成
（1）将化合物1（1.0008 g，2.1 mM）加入NaOH（1.6004 g，40 mM）的乙醇溶液（10 mL+20 mL水）中，加热搅拌反应液，反应结束后冷却至室温，减压蒸发溶剂，再用盐酸调节pH至6~7，过滤沉淀，反复水洗得到粗品，粗产品经柱层析分离纯化得到化合物2。
（2）将化合物2（0.2083 g，0.5 mM）和碳酸钾（0.2007 g，1.5 mM）溶于N,N-二甲基甲酰胺（5 mL）中，搅拌半小时。加入4-硝基溴化苄（0.1638 g，0.75 mM），室温搅拌。反应结束后用饱和盐水洗涤溶液，用二氯甲烷萃取，合并有机相，并用无水硫酸镁干燥，旋干，得到化合物3a。
（3）将化合物3a（0.1655 g，0.3 mM）溶解在冰乙酸（3 mL）中，在冰水浴上搅拌，然后加入亚硝酸钠的水溶液。用薄层色谱法监测反应，反应结束后萃取、旋干，得到粗品。粗品经硅胶柱层析纯化，得到所需供体Ⅱ-B。
实施例2 光诱导一氧化氮释放的检测
在25 ºC下，磷酸盐缓冲液中，考察了光诱导Ⅱ-B溶液释放一氧化氮的过程。如图6所示，365 nm的紫外光照射后的Ⅱ-B溶液在发射光谱上发生了明显的变化，Ⅱ-B溶液在560nm处的荧光强度随着照射时间的增加逐渐减弱，80 min后逐渐趋于稳定。与此同时，Ⅱ-B在还原型辅酶Ⅰ存在下与硝基还原酶完全反应后，再经365 nm的紫外灯照射，560 nm处的荧光强度随光照时间的增加逐渐增强，40分钟后逐渐稳定，释放速率比之前快了一倍。证明供体上存在4-硝基苄基时会更稳定，释放一氧化氮速率会更慢。结果如图7和8所示。
实施例3 检测是否释放出一氧化氮
接下来用一个已知的荧光探针，2，3-二氨基萘（DAN）来检测紫外光照射后释放的一氧化氮。2，3-二氨基萘（DAN）本身没有荧光，和一氧化氮反应生成1（H）-萘并噻唑（NAT），在410nm处出现特征荧光峰。将同浓度的供体Ⅱ-B和DAN溶解在中性磷酸盐缓冲液中。经365nm紫外光照射后，利用荧光光谱检测。结果表明，照射后的溶液在410nm处出现了新的荧光发射峰，并随着照射时间的增加，荧光信号逐渐增强。
在斑马鱼成像实验中，将供体Ⅱ-B与斑马鱼共同培养30 min后。用中性磷酸盐缓冲溶液清洗斑马鱼3次，用固定液将斑马鱼固定于载玻片上。随后，进行共聚焦荧光成像。如图10所示，a）为明场条件下斑马鱼成像；b）为刚开始暗场条件下活的斑马鱼成像，只观测到了很微弱的荧光信号。随着时间延长，斑马鱼逐渐死亡，斑马鱼体内形成缺氧环境，使得斑马鱼体内硝基还原酶逐渐增多，因此荧光信号逐渐增强，如图10c）。死亡后的斑马鱼经365nm的紫外光照射后，释放了一氧化氮，荧光信号逐渐增强，如图10d）。结果表明，供体Ⅱ-B可在细胞中实现一氧化氮的光控释放。
Claims (6)
1.一种酶协同光控一氧化氮供体，其结构式如式II-B所示：
。
2.一种如权利要求1所述的酶协同光控一氧化氮供体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）使下式化合物1在氢氧化钠的醇类溶液中加热搅拌反应，获得化合物2，
，
（2）使化合物2与4-硝基溴化苄反应，获得化合物3a，
，
（3）使化合物3a在酸性条件下与亚硝酸钠反应，获得化合物Ⅱ-B。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具有以下一项或多项特征：
步骤（1）的反应在乙醇存在下进行；
步骤（2）的反应在弱碱性条件下进行，所述弱碱为碳酸钾；
步骤（2）的反应在有机溶剂中进行，所述溶剂为N，N-二甲基甲酰胺；
步骤（3）的反应在酸性条件下进行，所选酸为冰乙酸。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，先将化合物3a溶于冰乙酸中，置于冰水浴上搅拌，然后逐滴加入亚硝酸钠水溶液，反应0.5-24小时。
5.权利要求1所述的酶协同光控一氧化氮供体在制备受益于一氧化氮释放的疾病的药物中的用途。
6.如权利要求5所述的酶协同光控一氧化氮供体的用途，其特征在于，所述受益于一氧化氮释放的疾病选自肿瘤、心血管疾病。
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