CN116769651A - 一株高效降解烟碱和TSNAs的环状芽孢杆菌Ni13及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株高效降解烟碱和TSNAs的环状芽孢杆菌Ni13及应用，属于微生物领域。本发明通过分离、筛选、纯化的工序，从雪茄烟叶表面分离筛选出环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)Ni13，已保藏于中国典型培养物保存中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221335。该环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)Ni13能够实现对雪茄烟烟草中烟碱和TSNAs的高效降解，且耐高温、抗逆性好，来源于雪茄烟草，对降低雪茄烟危害具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一株高效降解烟碱和TSNAs的环状芽孢杆菌Ni13及应用，属于微生物领域。
背景技术
烟草特有亚硝胺(Tobacco-Specific Nitrosamines，TSNAs)是烟草中特有的N-亚硝基类化合物，是烟叶及卷烟烟气中存在的一类致癌性物质，对吸烟者的健康存在严重影响。4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(4-N-nitrosomethylamin-l-(3-pyridyl)-1-butanone，NNK)、N-亚硝基去甲基烟碱(N-nitrosonornieotine，NNN)、N-亚硝基假木贼碱(N-nitrosoanabasine，NAB)和N-亚硝基新烟草碱(N-nitrosoanabine，NAT)是烟草和烟气中主要的TSNAs，且研究最为深入。
烟草生物碱和亚硝酸盐是TSNAs形成的前体物质，其中烟碱，又叫尼古丁(nicotine)是烟草中最重要的生物碱，活性极强，占总生物碱含量的94％以上。而且烟碱是影响烟叶品质的重要因素之一，在烟叶中含量过高灰增大烟气的辛辣刺激味，影响吸味，且安全性差，损害健康。因此，降低烟草中烟碱的含量有助于减少TSNAs的生成，对保证烟草质量及维护消费者健康有重要意义。
目前降低烟草中烟碱含量主要有三种：化学方法、物理方法和微生物方法，相较于物理方法和化学方法，运用微生物方法降低烟碱含量拥有高效、低耗、无公害等优点，拥有广阔的前景和研究空间。近年来烟草行业利用微生物在降低晾晒烟和烤烟中TSNAs前体物方面做了一些探索性的研究和应用，但关于雪茄烟降TSNAs技术的研究几乎处于空白。雪茄发酵过程是微生物高度参与的过程，前人针对卷烟原料晾晒和陈化阶段降TSNAs的微生物菌株可能不适应雪茄的高温发酵过程。因此，筛选出耐热性高、抗逆性好，能实现烟草中烟碱及特有亚硝胺同时降解的菌株，对于提高雪茄烟品质，降低烟草特有亚硝胺对人体健康及生活环境带来的危害都具有十分重要的意义。
发明内容
为实现上述目的，本发明的第一个目的是提供一株高效降解烟碱和烟草特有亚硝胺的环状芽孢杆菌Ni13，该环状芽孢杆菌是可以高效降解烟碱和烟草特有亚硝胺的菌株。
本发明的第二个目的是提供环状芽孢杆菌在烟碱降解方面的应用。
本发明的第三个目的是提供环状芽孢杆菌在制备烟碱降解产品中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种用于烟碱降解的菌制剂。
本发明的第五个目的是提供环状芽孢杆菌在烟草特有亚硝胺降解方面的应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一株高效降解烟碱和烟草特有亚硝胺的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)Ni13，所述菌株为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)Ni13，2022年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221335。
环状芽孢杆菌能在生长繁殖过程中产生有机酸、氨基酸、多糖、激素等有利于植物吸收和利用的物质；其在土壤中繁殖后，分泌植物生长刺激素及多种酶，以增强作物对一些病害的抵抗力，也抑制其他病原菌的生长；菌体内的钾在菌体死亡后，游离出来，又可被植物吸收利用，作为微生物肥料中的一种重要功能菌，可提高土壤速效钾、磷含量，具有提高作物产量和品质等多种功效。本发明从雪茄烟中分离筛选到一株耐高温的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)Ni13，经检测发现其既可以高效降解烟碱，又可以降解烟草特有亚硝胺，为微生物降解烟碱和烟草特有亚硝胺提供新的、更高效的优良菌种，也为环状芽孢杆菌的应用提供新的方向，扩大了环状芽孢杆菌的应用范围。
上述环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)在烟碱降解方面的应用。
该环状芽孢杆菌Ni13是在以烟碱为唯一氮源的培养基上筛选出来的，可以高效地降解烟碱，可以用来降解烟草制品和烟草废弃物中烟碱的含量。
上述环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)在制备烟碱降解产品中的应用。
该环状芽孢杆菌Ni13能高效降解烟碱，可以用于制备烟碱降解的产品用于烟碱的降解。
一种烟碱降解的菌制剂，包含所述的环状芽孢杆菌Ni13。
该菌制剂可以实现对烟碱高效无污染降解，用于降解烟草中的烟碱时既不破坏烟叶原有的优良品质，又能增加烟叶的烟气。
上述环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)在烟草特有亚硝胺降解方面的应用。
环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)Ni13对提高烟草品质，降低烟草特有亚硝胺对维护人体健康有重要意义。
优选地，所述的烟草为雪茄烟叶。
优选地，所述的烟草特有亚硝胺为N-亚硝基去甲基烟碱、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮、N-亚硝基假木贼碱、N-亚硝基新烟草碱。
附图说明
图1是本发明实施例2中环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)Ni13发酵后降解NNN、NNK、NAB、NAT能力比较；
图2是本发明实施例3中环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)Ni13在LB培养基上的菌落形态图；
图3是本发明实施例3中环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)Ni13显微形态图(100×)；
图4是本发明实施例3中环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)Ni13使用MALDI-TOFMS鉴定的质谱指纹图谱及匹配棒状图；
图5是本发明实施例3中环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)Ni13基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树；
图6是本发明实施例5中环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)Ni13对雪茄烟叶CX-26的TSNAs各组分的降解率；
图7是本发明实施例5中环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)Ni13对雪茄烟叶CX-84的TSNAs各组分的降解率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若无特殊说明，实施例中所用的各类试剂、仪器等均为市售商品。
下述实施例及试验例中涉及到的部分生物材料、实验试剂、实验设备等情况简要介绍如下：
培养基：
烟碱富集培养基：K2HPO4 3H2O 13.3g/L，KH2PO4 4g/L，MgSO4 7H2O 0.2g/L，0.5mL/L微量元素溶液。培养基灭菌后，烟碱用0.22μm滤膜过滤除菌后按1.5g/L的含量加入。
微量元素溶液：CaCl2·2H2O 0.05g/L，CuCl2·2H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O 0.008g/L，FeSO4·7H2O 0.004g/L，ZnSO4·7H2O 0.1g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1g/L，用少量0.1mol/LHCl溶解。
烟碱分离培养基：富集培养基中加入15.0g/L琼脂粉。
LB培养基：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L。
NNN培养基：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，pH7.2～7.4，121℃灭菌30min，培养基灭菌后，NNN用0.22μm滤膜过滤除菌后按10mg/L的最终含量加入。
NNK培养基：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，pH7.2～7.4，121℃灭菌30min，培养基灭菌后，NNK用0.22μm滤膜过滤除菌后按10mg/L的最终含量加入。
NAT培养基：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，pH7.2～7.4，121℃灭菌30min，培养基灭菌后，NAT用0.22μm滤膜过滤除菌后按10mg/L的最终含量加入。
NAB培养基：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，pH7.2～7.4，121℃灭菌30min，培养基灭菌后，NAB用0.22μm滤膜过滤除菌后按10mg/L的最终含量加入。
一、一株高效降解烟碱和TSNAs的环状芽孢杆菌
一株高效降解烟碱和TSNAs的环状芽孢杆菌，该菌株为环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)Ni13，保藏编号为CCTCC NO：M 20221335；保藏日期：2022年8月26日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
实施例1降解烟碱的菌株分离、筛选
本实施例分离筛选降解烟碱能力强，具体操作如下：
1、样品筛选
根据国内外主要品牌和规格的手工雪茄烟产品和雪茄烟叶生产情况，考虑不同国别、不同烟支与烟叶样品质量、不同品种与不同年份烟叶的差异，选择和搜集代表性手工雪茄烟和雪茄烟叶样品，并对国内代表性产地待初次发酵烟叶样品进行采集，冷藏备用；所筛样品名称、类型及来源如下表1。
表1筛菌样品来源
2、初筛
将国内外不同品种、地区的雪茄烟叶剪碎后加入无菌水，在室温下振荡提取3h，得到提取悬浊液，离心取上清液60℃水浴加热30min，定向保留耐热菌株。取加热后上清液加入以烟碱为唯一碳氮源的富集培养基中，富集培养2d。取离心后菌悬液用稀释平板的方法分离能在烟碱分离培养基上生长的菌株。将筛选出的菌株用LB培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落。
3、复筛
挑取分离保存的菌株接种于液体LB中，37℃培养12h做种子液。将种子液以3％(V/V)的接种量接种至初始浓度为1.5g/L的烟碱发酵培养基中，37℃培养24h，以不接种菌的作为对照。菌液离心取上清液，在72h时使用紫外分光光度法检测上清液中烟碱含量，其原理是高锰酸钾与烟碱能在NaOH溶液中反应形成水溶性绿色产物，绿色产物在610nm处有最大吸收值。测试完成计算烟碱降解率：
烟碱降解率＝(原培养液中烟碱含量－发酵液中烟碱含量)/原培养液中烟碱含量×100％
将初筛得到的可以利用烟碱生长的菌株发酵，进一步复筛获得一株可以高效降解烟碱的菌株Ni13，复筛得到高效降解烟碱菌株的烟碱降解率如表2。J10为同批次筛选出来的菌株。
表2高效降解烟碱菌株的降解率
| 菌株编号 | 烟碱降解率 |
| J10 | 22.34％ |
| Ni13 | 56.35％ |
实施例2降解烟草特有亚硝胺(TSNAs)菌株的评价
本实施评价上述筛选出的Ni13菌株对TSNAs的降解能力，具体操作如下：
取上述降解烟碱能力强的菌株Ni13接种至LB培养基上，37℃培养12h得到发酵种子，然后将发酵种子接种至液体LB培养基中，37℃培养12h作为种子液，将种子液以3％(V/V)的接种量分别接种至5mL NNN培养基(NNN 10mg/L)、5mL NNK培养基(NNK10 mg/L)、5mLNAT培养基(NAT 10mg/L)、5mL NAB培养基(NAB 10mg/L)中进行培养，37℃培养72h，以不接种菌的作为对照。发酵后菌液离心取上清液，测试NNN、NNK、NAT、NAB的含量，计算NNN、NNK、NAT、NAB的降解率，比较环状芽孢杆菌Ni13对TSNAs各组分的降解能力。
TSNAs的检测方法：HPLC条件：流动相A：水溶液，流动相B：甲醇溶液，流速为0.8mL/min，柱温40℃，进样量为10μL，检测波长235nm，色谱柱Poroshell EC-C18(4.6*250mm4um)。下表3为梯度洗脱的条件。
表3 HPLC梯度洗脱条件
| 时间(min) | 流速(mL/min) | A(％) | B(％) |
| 0.00 | 0.8 | 90 | 10 |
| 10.0 | 0.8 | 10 | 90 |
| 14.00 | 0.8 | 10 | 90 |
| 19.00 | 0.8 | 90 | 10 |
| 25.00 | 0.8 | 90 | 10 |
通过HPLC检测分析，并计算出对照样品和发酵后样品中NNN、NNK、NAT、NAB含量，计算出NNN、NNK、NAT、NAB降解率如图1。从图中可以看出Ni13对TSNAs的关键组分10mg/L的NNN的降解率为33.23％；对TSNAs的关键组分10mg/L的NNK的降解率为21.36％；对TSNAs的关键组分10mg/L的NAT的降解率为39.45％；对TSNAs的关键组分10mg/L的NAB的降解率为42.19％，与对照菌株相比，具有较明显优势。
实施例3环状芽孢杆菌Ni13的鉴定
本实施例从形态学、MALDI-TOF MS和分子生物学对Ni13进行鉴定，具体操作如下：
1、形态学鉴定
将上述筛选获得的Ni13接种到LB固体培养基平板上，培养后观察菌落形态。结果如图2、图3所示，由图中可知Ni13菌体呈现长条状，培养基上菌落菌落圆形，淡黄色，光滑湿润，菌落相对较小。
2、MALDI-TOF MS鉴定
制备Ni13的单菌落，使用“提取法”获得菌株悬液，吸取1μL样本至靶板点位，晾干后滴加1μL基质溶液，使用全自动微生物质谱检测系统(Autof ms2000，安图生物科技有限公司公司)进行菌株鉴定。Ni13经Autof ms2000鉴定为环状芽孢杆菌，质谱指纹图谱及匹配棒状图如图4所示。
3、分子生物学鉴定
将Ni13菌株接种于液体LB培养基震荡培养12小时，离心收集菌体，用16S rDNA通用引物正向引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，对其16S rDNA基因进行PCR扩增，PCR条件为：95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，90s，30循环；95℃，40s，55℃，45s，72℃，1.5min，30循环；72℃，5min，10℃，5min。PCR产物长度为1454bp，其核苷酸序列表如序列表SEQ ID NO：1所示。
菌株Ni13的16S rDNA基因片段经PCR扩增、纯化回收，由北京擎科生物科技有限公司完成DNA测序工作。将测得的序列用NCBI的Blastn程序进行序列相似性分析，从Genbank数据库和核糖体数据库选取相近种属的代表性菌株的16S rDNA基因序列，通过MEGA7.0软件进行系统发育分析，用邻接法(Neighbor Joining)构建基于16S rDNA基因序列的系统发育树，用于检验自举支持率(Bootstrap)的重复抽样次数为1000次。测序所得Ni13的16SrDNA基因序列有1454个碱基，同源性分析结果显示菌株Ni13的16S rDNA基因序列与环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)高度相似，且通过MEGA7.0软件构建系统发育树，系统进化树如图5所示，显示菌株Ni13属于环状芽孢杆菌。结合形态学特点和16S rDNA基因序列分析，该菌株被鉴定为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，命名为环状芽孢杆菌Ni13，已于2022年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M20221335。
二、一种用于烟碱降解的菌制剂
一种烟碱降解的菌制剂，包括环状芽孢杆菌Ni13，所述环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)Ni13，保藏编号为CCTCC NO：M 20221335。
实施例4一种烟碱降解菌制剂
本实施例的烟碱降解菌制剂，包括环状芽孢杆菌Ni13和辅料。所述环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)Ni13，保藏编号为CCTCC NO：M 20221335；辅料可以使本领域常见的辅料。
三、环状芽孢杆菌Ni13在降解雪茄烟叶TSNAs中的应用
环状芽孢杆菌Ni13可以降解TSNAs，将其喷洒在雪茄烟叶的表面，经过一段时间发酵后，经检测相比于对照组，喷洒环状芽孢杆菌Ni13的雪茄烟叶中TSNAs显著降低。
实施例5环状芽孢杆菌Ni13降解雪茄烟叶中TSNAs能力分析
将环状芽孢杆菌Ni13接种至LB平板上活化培养12h，将活化后的Ni13接种到液体LB培养基中在37℃，180rpm的摇床中发酵12h制备发酵液。将发酵液在12000rpm，离心5min，除去上清液，收集菌体。将收集的菌体进行重悬，使用分光光度计测定菌体浓度，将菌体浓度稀释为108cfu/mL，即为Ni13的发酵菌剂。称取一定量的两种高TSNAs含量的雪茄烟叶(CX-26和CX-84)，使用无菌剪刀剪碎至三角瓶中作为雪茄烟叶发酵培养基，以保持雪茄烟叶共含水量为60％的量，施加一定量的菌剂，均匀喷洒在烟叶上，在37℃、RH75％发酵72h。
发酵结束后，取雪茄烟叶，60℃烘干3h后，磨碎，过60目筛，取样，通过YQ/T 29—2013《烟草及烟草制品烟草特有N-亚硝胺的测定高效液相色谱-串联质谱联用法》检测发酵后雪茄烟叶中NNN、NNK、NAT、NAB含量，计算得出各成分降解率，分析环状芽孢杆菌Ni13对代表性雪茄烟叶TSNAs的降解能力。
通过高效液相色谱-串联质谱联用法的检测分析，环状芽孢杆菌Ni13对不同种类的的雪茄烟叶中TSNAs各组分的降解能力如下表4。
表4Ni13在不同种类雪茄烟叶的作用效果
注：CX-26为楚雪26号雪茄烟品种；CX-84为楚雪84号雪茄烟品种。CK代表对照组。
由上表可知，环状芽孢杆菌Ni13对不同种类高TSNAs含量的雪茄烟叶(CK-26和CK-84)中TSNAs均具有较强的降解效果，对雪茄烟叶CX-26、CX-84降解效率分别如图6、7所示，其总TSNAs的降解率分别为23％和34％，具有较好的应用价值。
综上所述，本发明所述的菌株Ni13既可高效降低烟碱的含量，又对TSNAs的各组份NNN、NNK、NAT、NAB有较高的降解能力，并且在雪茄烟的实际应用中也表现出了较好的降解性能。该菌在雪茄烟叶及其产品的降害方面，具有极大的应用潜力，可为后续菌剂发酵工艺优化及雪茄发酵改良奠定基础。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (7)
1.一株高效降解烟碱和烟草特有亚硝胺的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)Ni13，其特征在于：所述菌株为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)Ni13，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221335。
2.一种如权利要求1所述的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)在烟碱降解方面的应用。
3.一种如权利要求1所述的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)在制备烟碱降解产品中的应用。
4.一种用于烟碱降解的菌制剂，其特征在于：包含权利要求1所述的环状芽孢杆菌Ni13。
5.一种如权利要求1所述的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)在烟草特有亚硝胺降解方面的应用。
6.根据权利要求5所述的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)在烟草特有亚硝胺降解方面的应用，其特征在于：所述的烟草为雪茄烟叶。
7.根据权利要求5所述的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)在烟草特有亚硝胺降解方面的应用，其特征在于：所述的烟草特有亚硝胺为N-亚硝基去甲基烟碱、4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮、N-亚硝基假木贼碱、N-亚硝基新烟草碱。
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