CN1167434C - 护肝和防治肝硬化的保健食品及中药制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组具有护肝和防治肝硬化的保健食品及中药制剂-红苓肝宝的配方及其生产工艺,红苓肝宝主要是由红花、茯苓、甘草、大枣四种既能作食品,又能作药品的药食两用的中药所组成,该制剂经实验研究证明了对慢性肝损伤所致的肝硬化具有显著的降低转氨酶作用,能使肝功能恢复、白蛋白合成回升、球蛋白含量回降、A/G比例恢复,还可使肝脏中羟脯氨酸含量显著下降,肝细胞变性坏死明显减轻,显著防止了肝纤维化和肝硬化的形成。研究还表明,本品对肝硬化所致的骨质疏松症和其他原因所致的骨质疏松均有明显的防治作用。
Description
本发明涉及一组具有保护肝脏和防治肝硬化的保健食品及中药制剂。
慢性肝炎发病率高,常常会导致肝纤维化和肝硬化,临床治疗目前还没有很好的办法,为了防治肝硬化的发生和发展,国内外学者作了大量的研究,取得了不少进展,但对此问题始终仍未找到最佳的解决方案,本课题组成员从预防入手,选用了卫生部规定的可作药用也可作食用的药食两用的中药进行研究,试图从这些中药中找到功效确切的品种,通过多年的努力,我们已找到了一种护肝作用极佳,可使因慢性肝损伤所致动物血清转氨酶显著降低,白蛋白合成回升,球蛋白含量回降,血清蛋白比例恢复正常,同时,还可使肝脏中的羟脯氨酸含量显著下降,肝脏细胞的变性环死明显减轻,且能对抗由肝硬化所致的骨质疏松症,具有保护肝脏和预防骨质疏松的保健食品。
本发明的目的是这样实现的,选用红花、茯苓、甘草、大枣四种药食两用的中药,把其组成复方,通过科学的工艺提取各药的有效成份,制成口服液或胶囊、片剂,供临床作为保健食品应用。本复方制剂中,红花活血通经,散瘀止痛,在方中作主药(君药),茯苓利水渗湿,健脾宁心,在方中作臣药。大枣补中益气,养血安神作佐药,甘草补脾益气,清热解毒作使药,此四味中药组成复方,既能活血通经,散瘀止痛,清热解毒,又能健脾宁心,补中益气,养血安神,对各种形式的慢性肝炎所致的肝纤维化或肝硬化,均有较好的护肝作用。
本方中红花已被证明有改善微循环和抑制血小板聚集和增强纤维蛋白溶解的作用,该作用在改善肝微循环和抗肝纤维化中有可能发挥重要效应。此外,红花尚有抗炎和免疫抑制作用,这些作用对延缓慢性肝炎所致的肝纤维化的形成也十分重要。茯苓、甘草和大枣对四氯化碳造成大鼠或家兔的肝损伤有一定的预防作用,可使转氨酶活性下降,肝细胞变性坏死程度减轻,茯苓还具有镇静安神和免疫调节作用,甘草则有清热解毒、抗菌消炎作用,大枣经现代药理学研究证明,本品cAMP样物质有增加白细胞内cAMP的作用,同时大枣有抗变态反应作用和中枢抑制作用,这些作用对于预防和治疗病毒性、慢性炎症或免疫性肝损伤所致的肝纤维化将会发挥十分有利的作用,本项目研究初步证明了此一点。
本项目研究的红苓肝宝的配方和生产工艺如下:
配方:红花3公斤,茯苓1公斤,大枣(去核)4公斤,甘草3公斤。
生产工艺:取红花,大枣,甘草三药混合水提三次,每次12小时,过滤,滤液浓缩至膏状,用粉碎后过100目的茯苓粉拌和,烤干,烤干后的干粉再粉碎,得细粉,该细粉可装胶囊或压片。
本项目研究中的红花,大枣,甘草和茯苓也可先提纯主要有效成份,然后再分别加进渗膏中,再按上述工艺做成胶囊剂或片剂。
本项目研究中的红花的主要有效成份的提取是通过下述方法实现的:
1、红花中槲皮素等黄酮类化合物和红花中黄色素和红色素的提取和分离主是要参考文献(杨云、冯卫生主编,中药化学成份提取分离手册,中国中医药出版社,北京,1998年8月第1版,P127)的方法进行提取。
本项目中茯苓的主要有效成份茯苓多糖的提取分离方法参考文献(中国科学院上海药物研究所,中草药有效成份的提取与分离(第二版),上海科技出版社1983;423)的方法进行提取与分离。
本项目中甘草中的主要有效成份甘草酸和甘草次酸的提取分离方法主要分别参考文献(阚毓铭,等,中药化学实验操作技术,中国医药科技出版社,1988;187)和(陆蕴如,中药化学,学苑出版社,1995;313)的工艺进行提取和分离。
本项目中的大枣和主要有效成份环磷酸腺苷(cAMP)及其黄酮类、维生素类主要根据文献由本课题组自定工艺进行提取与分离。
本项目选取上述四种药食两用的中药及经上述方法提取出的有效成份,组成红苓肝宝复方制剂,经动物实验证明,该制剂具有很好的护肝作用,同时,本品还有很好的抗骨质疏松作用,特别对由慢性肝损伤所致的骨质疏松,本品疗效更佳。
实施例一,红苓肝宝对CCl4致小鼠慢性肝损害致肝硬化的护肝作用研究。
1材料与方法
1.1实验动物:本院实验动物中心提供的普通级昆明种小白鼠,体重20-22g,雌雄兼用,随机分组。
1.2实验药物:四氯化碳(分析纯):购于广州化学试剂厂,批号为980402-25,花生油采用普通食用花生油,实验时配成40%四氯化碳花生油,即4份四氯化碳与6份花生油混匀,按0.1ml/10g皮下注射,首剂加倍,5d注射1次;红苓肝宝:自红花、茯苓、甘草、大枣四种药食两用的食品,把其组成复方,通过科学的工艺提取有效成份,制成胶囊,按人临床剂量用体表面积换法算成小鼠用量后,分别研磨配制成实验浓度,按0.1ml/10g灌胃,1次/d,用时摇匀。大黄虫丸:湛江中药厂产品,批号为980201,药量按人临床剂量用体表面积换算成小鼠剂量,研磨配制成溶液,按0.1ml/10g灌胃,1次/d,用时摇匀;
1.3主要试剂及仪器:羟脯氨酸测试盒购于南京建成生物工程研究所,丙氨酸氨基转移酶(ALT/GPT)测试盒、天冬氨酸氨基转氨酶(AST/GOT)测试盒均购于宁波市慈城生化试剂厂,总蛋白(TP)液体试剂盒和白蛋白(Alb)试剂盒均购于北京中生生物工程高技术公司,752紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂生产)。1.4实验方法:取上述小白鼠40只,随机分为4组,每组10只,雌雄各半,A组为正常对照组,给予生理盐水,B组为肝损伤模型组,给予40%四氯化碳花生油溶液按0.1ml/10g皮下注射,首剂加倍,5天注射一次,首次注射后,用生理盐水按0.1ml/10g灌胃,每天一次,连续5周。C组为大黄虫 丸防治组,按B组同法给予CCl4造模,然后给予大黄虫丸溶液,每天一次,连续给药5周,D组为红苓肝宝防治组,胺B组同法给予CCl4造模,然后给予红苓肝宝溶液,每天一次,连续给药5周,在实验过程中每天观察小鼠进食、饮水、活动情况及皮毛变化,每7d称量体重1次,于第36天实验结束时分别先从眼球取血,离心取血清作生化检查,取肝组织称重,肉眼观察后取肝右叶再称重,制成匀浆,水解,测定羟脯氨酸含量;肝左叶用玻氏液固定,石蜡包埋,切片、HE及VG染色后作病理检查。
1.5观察指标及测定方法:
1.5.1对小白鼠一般情况及体重的观察:每天观察小白鼠的一般症状,饮食变化,行为(自主活动,精神状态)及毛发变化。
1.5.2肝脏重量及肝羟脯氨酸的测定:按文献[2]测定肝组织水解后羟脯氨酸含量。
1.5.3血清学指标及检测方法:按文献[3],用赖氏法测定ALT、AST的活性,用双缩尿法测定血清TB、用溴甲酚绿法测定血清Alb含量。
1.5.4肝组织大体及镜下病理学改变按文献[4][5]肉眼观察小鼠肝脏的外型、体积、颜色及质地的改变;HE染色后显微镜下观察肝组织切片的病理变化,重点观察肝细胞变性、坏死及肝纤维化的程度,将肝纤维化分成4级,“-”:正常肝组织;“+”:肝细胞变性范围不超过肝小叶半径的1/2,以水变性为主,肝细胞呈点状或小灶状坏死,未见纤维组织的增生,汇管区炎症细胞浸润;“++”:肝细胞变性范围超过肝小叶半径的1/2,以汽球样变性为主,较多肝细胞呈碎片状坏死,伴较明显的纤维组织增生,汇管区大量炎症细胞的浸润;“+++”:肝细胞大片变性坏死,范围超过肝小叶半径的2/3,并以肝细胞的碎片状和桥接状坏死为主,肝实质内大量纤维组织增生,向内伸展包绕肝小叶,且可见中央静脉偏位。
1.5.5胶原纤维的相对量的判定:VG染色后,按如下半定量标准判断胶原纤维增生程度[6],“-”示正常肝组织,无胶原纤维增生;“+”示胶原纤维明显增多,从汇管区或中央静脉呈星状向外延伸,无纤维隔形成;“++”示胶原纤维明显增多形成彼此不连接的不完全性纤维隔;“+++”示胶原纤维增多形成完全的相互连接的纤维隔,分割肝实质。
1.6统计学上处理 所有实验数据均用电脑软件进行统计学处理,本文实验结果均采用X±S(均数±标准差)表示,组间差异性用t检验,半定量指标采用等级秩和检验。
2、实验结果
2.1红苓肝宝对小白鼠一般情况及体重和肝重的影响:实验过程中发现注射了四氯化碳后,小鼠表现烦躁、易激怒,但约5h后趋于平静,活动减少,尤以B组小鼠明显,2d后情况改善,第4天基本恢复正常。进食量及饮水量各组小鼠没有明显的区别。实验过程中各组小鼠无死亡记录,但B组小鼠毛发蓬松,C、D组小鼠在外观上与A组小鼠比较无明显差异。各组小鼠的体重和肝重指数(肝重g/10g体重)结果见表1:
表1 红苓肝宝对肝损害小鼠体重、肝重指数的变化(n=10)
组别 实验前体重 实验后体重 肝总重 肝重/体重
(g) (g) (g) (g/10g)
A.对照组 21.3±0.5 30.9±5.4 1.69±0.30 0.55±0.05
B.肝损害组 21.2±0.4 29.1±2.9 2.48±0.47 0.85±0.13
变化率A% -5.8 46.3*** 55.3***
C.大黄 虫丸 21.2±0.5 30.54±4.8 2.40±0.39 0.80±0.15
变化率A% -1.0 45.1*** 46.5***
变化率B% 5.09 -0.85 -5.65
D.红苓肝宝组 21.2±0.6 28.8±3.4 2.18±0.24 0.73±0.08
变化率A% -3.3 29.0*** 33.4***
变化率B% 2.6 -11.8 -14.5**
注:变化率A是与对照组比较;变化率A=(待比较组/A组-1)×100%;
*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。变化率B是与肝损害B组比较;变化率B=(待比较组/B组-1)×100%,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。下同
从表1可见,肝慢性损害后,对小鼠的体重影响不大,但肝脏总重量和肝脏指数变化显著,分别增加了46.3%和55.3%,P<0.001;红苓肝宝组防治组对肝慢性损伤后肝重的增加有显著的减轻作用(-14.5%,P<0.01),大黄虫丸防治组对肝重变化无显著影响。
2.2红苓肝宝对小鼠慢性肝损伤血清ALT、AST和肝羟脯氨酸含量的影响肝损害后,小鼠血清ALT升高了243%,P<0.001;AST升高了408%,P<0.001;肝羟脯氨酸的含量也有显著升高126%,P<0.001;红苓肝宝组和大黄 虫丸防治组上述三项指标也比对照组明显升高,但和模型组比较,此三项指标均明显下降了,差异非常显著,提示两组中药防治组有一定程度的降酶作用和减轻肝纤维化的作用。红苓肝宝对小鼠慢性肝损伤血清ALT、AST和肝羟脯氨酸含量的影响详见表2
表2 红苓肝宝对肝损伤小鼠ALT、AST和肝羟脯氨酸的影响
(n=10)
组别 ALT(g/l) AST(g/l) 肝羟脯氨酸(ug/g)
A.对照组 0.116±0.031 0.049±0.015 0.12±0.02
B.肝损害组 0.398±0.035 0.248±0.092 0.27±0.31
变化率A% 243.1*** 407.6*** 126***
C大黄 虫丸组 0.361±0.035 0.146±0.049 0.18±0.05
变化率A% 211.4*** 199.2*** 53.3***
变化率B% -9.05* -41.1*** -32**
D红苓肝宝组 0.294±0.073 0.188±0.03 0.16±0.03
变化率A% 153.5*** 284.8*** 35.9***
变化率B% --26*** -24 -39.9***
2.3红苓肝宝对小鼠慢性肝损伤后血清蛋白含量的影响 肝损害后小鼠血清总蛋白无显著性变化,但白蛋白显著减少(-36.7%,P<0.01)而球蛋白明显增加(25.2%,P<0.01),A/G比值明显降低,呈典型的肝损害蛋白血像,用红苓肝宝和大黄 虫丸防治后,白蛋白有显著回升(P<0.01),球蛋白也有下降的趋势,A/G比值有所增加(P<0.01),提示两组中药防治组均有一定的作用,但仍不能使肝损害组恢复至损伤前的水平。红苓肝宝对小鼠慢性肝损伤后,血清总蛋白、白蛋白、球蛋白及A/G比值的影响见表3。
表3红苓肝宝对肝损害小鼠血清蛋白含量的变化(n=10)
组别 总蛋白 白蛋白 球蛋白 A/G比值
(g/l) (g/l) (g/l)
A.对照组 50.4±3.43 23.7±1.85 26.7±3.37 0.90±0.14
B.肝损害组 48.4±2.44 15.0±2.02 33.4±1.87 0.45±0.07
变化率A% -3.9 -36.7** 25.2** -50**
C.大黄 虫丸组 50.6±2.58 18.8±2.31 31.85±1.41 0.59±0.08
变化率A% 0.36 -21** 19.3** -34**
变化率B% 4.48 24** -4.68 30.7**
D.红苓肝宝组 50.2±2.48 19.5±1.69 30.68±1.69 0.64±0.06
变化率A% 0.45 -18*** 14.9*** -29***
变化率B% 3.64 30** -8.19 41.2**
2.4红苓肝宝对小鼠慢性肝损伤后肝脏组织的病理学观察 肝脏组织的肉眼观察:正常对照组A组肝脏呈红褐色,表面光滑,质软,光镜下肝组织结构正常(见图1-1);慢性肝损伤组B组肝脏明显肿胀,色苍黄,部分肝表面呈结节状,质硬,油腻,HE镜下可见肝细胞大片变性、坏死,部分肝细胞呈结节样异常再生,汇管区大量淋巴细胞浸润,中央静脉偏位或缺如,肝组织正常结构破坏,肝小叶排列紊乱,纤维组织显著增生(见图1-2);肝细胞变性、坏死及肝组织纤维增生与A组比较均有显著差异(P<0.005);大黄 虫丸组C组和红苓肝宝组D组部分肝脏轻度肿大,黄褐色,表面尚光滑,镜下肝组织结构较完整,肝细胞变性、坏死情况较B组轻(P<0.05),尤以红苓肝宝组D组明显(见图1-3);。VG染色可见A组小鼠肝组织内无纤维组织增生,(见图2-1);B组小鼠肝组织内汇管区和肝实质内大量胶原纤维增生,并向肝实质内延伸,形成假小叶(见图2-2);大黄 虫丸组C组和红苓肝宝组D组小鼠肝组织的胶原纤维增生程度较B组轻,且差异具有显著意义(P<0.05~0.005),而红苓肝宝组的纤维增生仅局限于汇管区(见图2-3)。各组小鼠肝组织镜下表现见表4,肝组织纤维增生程度见表5。
表4各组小鼠肝脏HE染色病理变化(n=10)
组别 肝细胞变性 肝细胞坏死
- + ++ +++ - + ++ +++
A组 8 2 0 0 9 1 0 0
B组 0 0 0 10 0 0 3 7
C组 1 2 5 2 2 3 4 1
D组 2 5 2 1 2 6 1 1
表4数据表明B组小鼠肝细胞严重变性、坏死,程度比C、D两组要明显,经等级秩和检验,发现两者有非常显著差异(P<0.005),说明B组肝细胞严重受损,而大黄虫丸组和红苓肝宝组的肝细胞的变化则明显减轻,说明这两种中药有良好的保护肝细胞的作用;D组小鼠的肝细胞发生严重变性、坏死的数目比C组的要少,有更好的保护肝细胞的作用。
表5各组小鼠VG染色肝脏胶原纤维相对量比较(n=10)
组别 胶原纤维增生程度
- + ++ +++
A组 9 1 0 0
B组 0 0 0 10
C组 1 4 5 0
D组 1 6 3 0
表5的数据经等级秩和检验后有非常明显的差异(P<0.005),B组小鼠的肝纤维化率达到100%,甚至肝硬化程度,而C、D两组小鼠仅有少数达到肝纤维化早期的改变,D组的效果更优于C组。
3讨论
本实验以四氯化碳花生油溶液给小白鼠染毒,造成小白鼠肝损害的模型。实验证明,单纯用四氯化碳作模型组(B组)的小白鼠,五周后与对照组(A组)相比,肝重明显增加,血清ALT、AST的活性显著增强,肝组织羟脯氨酸的含量增高;病理组织学检查可见肝细胞出现大量变性、坏死,胶原纤维增生程度显著增加,出现了典型的慢性肝损伤后肝硬化的早期表现。
大黄 虫丸为祛瘀生新之名方,主要用于活血化瘀、通经消痞,文献报道本品对四氯化碳造成的大白鼠实验性肝损伤有显著的预防和治疗作用[1],故本研究选取本品作为抗肝纤维化的阳性对照药物,研究表明,对四氯化碳染毒的小白鼠,同时服用大黄 虫丸后,小鼠血清的谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量分别下降了9.1%和41.1%,P<0.001,肝羟脯氨酸的含量也下降了32%,P<0.01;血清白蛋白含量增加了24%,P<0.01;A/G比值增高30.7%,P<0.01;病检也证明肝脏细胞变性、坏死和纤维化程度均有明显的减轻,提示了大黄虫丸对小鼠慢性肝损伤后所致的肝纤维化有一定的预防作用。
红苓肝宝是本项目组研制的一组以护肝、抗肝纤维化为目标的保健食品,研究表明,红苓肝宝对四氯化碳染毒的小白鼠有很好的降酶和抗肝纤维化作用,服用红苓肝宝后,四氯化碳染毒的小鼠血清的谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量分别下降了26%和24%,前者P<0.001,肝羟脯氨酸的含量也下降了40%,P<0.01;血清白蛋白含量增加了30%,P<0.01;A/G比值增高41.2%,P<0.01;病检也证明肝脏细胞变性、坏死和纤维化程度均有明显的减轻,提示了红苓肝宝对小鼠慢性肝损伤后所致的肝纤维化有一定的预防作用,该作用比大黄 虫丸更好。
实施例二,红苓肝宝抗骨质疏松作用研究
通过动物实验已经证明,红苓肝宝对小鼠慢性肝损伤后所致的骨质疏松有明显的预防作用,对去卵巢大鼠所致的骨质疏松也有明显的预防和治疗作用。
本研究表明,由中药红花、茯苓、甘草、大枣组成的复方制剂红苓肝宝,对四氯化碳造成的小鼠慢性肝损伤性纤维化有显著的预防作用,应用红苓肝宝后,可使中毒的小鼠转氨酶下降,白蛋白合成回升,球蛋白含量下降,A/G比值恢复,此外,本品还可使肝脏中的羟脯氨酸含量显著下降,阻止了肝纤维化的形成,病理检查证明本品可使中毒小鼠肝脏细胞的变性坏死明显减轻,汇管区和肝小叶内纤维组织增生明显减少,个别动物还可回复至正常水平,对照实验表明,红苓肝宝的护肝作用与阳性对照药大黄 虫丸的作用相近,在降酶和护肝方面甚至更佳,研究提示本品的这种降酶护作用可作为防止慢性肝炎所致的肝纤维化的保健食品应用。研究还表明红苓肝宝对小鼠慢性肝损伤后所致的骨质疏松有明显的预防作用,对去卵巢大鼠所致的骨质疏松也有明显的预防和治疗作用。
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Claims (2)
1、一种具有护肝和防治肝硬化功效的保健食品,其特征在于是由以下配比的原料制成:红花3,茯苓1,甘草3,大枣4。
2、一种具有护肝和防治肝硬化的中药复方制剂,其特征在于是由以下配比的原料制成:红花3,茯苓1,甘草3,大枣4。
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