CN116732172A - Mpped1在胶质母细胞瘤诊断及预后评估中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开MPPED1在胶质母细胞瘤诊断及预后评估中的应用。本发明采用多重免疫荧光染色检测MPPED1在肿瘤微环境的神经元细胞内特异性表达；将神经元细胞和神经胶质瘤细胞分别置于孵育箱中进行培养；将MPPED1过表达质粒转染入神经元细胞使其过表达MPPED1蛋白，取培养基上清对胶质瘤细胞进行培养；采用CCK8检测MPPED1对胶质瘤细胞增殖的影响；采用细胞划痕实验检测MPPED1对胶质瘤细胞的迁移影响。本发明提供了一种新的研究脑胶质瘤发生发展的新途径，神经元细胞过表达MPPED1能够抑制胶质母细胞瘤的发展，发现其治疗胶质瘤可能的分子机制，可应用于胶质瘤的诊断、治疗及预后。
Description
技术领域
本发明属于癌症诊断技术领域，具体涉及MPPED1在胶质母细胞瘤诊断及预后评估中的应用。
背景技术
神经胶质瘤(Glioma，也叫胶质瘤或胶质细胞瘤)，是原发性脑肿瘤，被认为起源于神经胶质干细胞或祖细胞。神经胶质瘤占所有脑肿瘤和中枢神经系统肿瘤中恶性肿瘤的80％。世界卫生组织(WHO)中枢神经系统肿瘤分类将脑胶质瘤分为Ⅰ至Ⅳ级，Ⅰ、Ⅱ级为低级别脑胶质瘤，Ⅲ、Ⅳ级为高级别脑胶质瘤。胶质母细胞瘤(GBM，glioblastoma)是胶质瘤的最高级别形式，为IV级胶质瘤。GBM是成人中最常见的神经胶质瘤，是最致命的癌症之一。高度恶性胶质瘤好发于老年人群，治愈难度大且易复发，严重危害人类身体健康，给家庭和社会带来沉重负担。目前的III期临床试验表明，胶质瘤的显著生存获益主要包括放疗、化疗和肿瘤治疗等方式，这些都是非特异性的，靶向于增殖细胞。同时，由于其高侵袭性，其浸润性肿瘤细胞始终留在周围的大脑中，导致疾病容易复发。巨噬细胞/小胶质细胞(TAM)可以浸润一半的神经胶质瘤，但它们被免疫抑制。因此，目前对神经胶质瘤的治疗仍然特别具有挑战性。再加上高级别胶质瘤预后最差，这是患者死亡的主要原因。综上所述，胶质瘤的治疗相对较困难，治疗方法相对较单一。因而迫切需要寻找新的治疗靶点和预后标志物，为神经胶质瘤的治疗提供新的思路和手段。开发新的安全有效的治疗药物、深入研究胶质瘤的调控机制，具有重要的科学和社会意义。
近年来，脑肿瘤中的神经元调控已成为肿瘤生物学的一个主要方面。有大量的数据表明，神经胶质瘤细胞使用正常的神经元信号机制来促进其自身的生长。同时许多新的研究表明，胶质瘤细胞的行为受到与神经元相互作用以及神经元活动的影响。神经胶质瘤的生长存在于一种独特的动态微环境中，并受到其调控。而神经元已经被定义为神经胶质瘤微环境的重要组成部分。此外，胶质瘤细胞可以诱导微环境重构来诱导神经元活性，由此产生的神经元活性的增加也可能反过来影响肿瘤的生长。综上所述，我们可以通过研究肿瘤的神经元调控机制来研究新的治疗方式。
据报道，MPPED1和MPPED2分别在成人和胎儿的大脑中表达，并被注释为金属磷酸酶。金属磷酸酶广泛分布于系统中，具有利用多种底物等功能。MPPED1可能具有催化作用，并可能受到细胞内5’AMP和5’GMP或环状核苷酸水平的影响。一些研究也表明，MPPED2可能会损害肿瘤的发生。MPPED1和MPPED2的编码基因从果蝇到人类都高度保守，它们独特的同源物CG16717在调节果蝇寿命中的独特作用可以推测它们可能具有重要的生理作用。目前已知的MPPED1和MPPED2都具有MPE超家族共同的保守活性位点的残基。虽然MPPED1和MPPED2具有高度的进化保守性，但其生物学功能尚不清楚。此外，很少有研究报道MPPED1和MPPED2在胶质瘤中的作用，神经元细胞特异性表达MPPED1对胶质瘤发生、发展的机制尚不清楚。
神经胶质瘤是占所有脑肿瘤和中枢神经系统肿瘤中比例最高的恶性肿瘤，目前尚无有效治疗方法和策略。针对上述情况，本发明：①从分子水平、细胞水平深入探讨MPPED1治疗胶质瘤的作用机制；②提供MPPED1在制备检测胶质瘤试剂、胶质瘤诊断、肿瘤药物以及胶质瘤预后评估等方面的应用。③本发明并非针对肿瘤细胞本身，而是针对神经元细胞介导胶质瘤的途径，为胶质瘤的诊断和治疗的提供新方法、新思路。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种MPPED1基因在制备用于胶质母细胞瘤诊断或预后评估的试剂盒中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种胶质母细胞瘤诊断或预后评估的试剂盒，包括用于检测分子标志物MPPED1基因表达水平的试剂。
本发明的第三个目的是提供一种用于检测MPPED1基因的试剂在制备用于胶质母细胞瘤诊断或预后评估的试剂盒中的应用。
作为优选，所述检测MPPED1基因的试剂选自对MPPED1基因具有检测特异性的探针、引物或基因芯片。
本发明的第四个目的是提供上述MPPED1在制备神经胶质母细胞瘤治疗或预后评估药物中的应用。
作为优选，MPPED1通过在神经元特异性过表达参与抑制胶质母细胞瘤的生长。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明采用免疫应荧光双重染色确定MPPED1为神经元细胞特异性表达蛋白；采用westernblot检测人胶质瘤样本中MPPED1表达情况；将神经元细胞、神经胶质瘤细胞置于孵育箱中分别进行培养；将MPPED1质粒转染入神经细胞；采用CCK8、免疫荧光、细胞克隆来检测神经元细胞特异性表达的MPPED1对胶质瘤细胞增殖的影响；采用细胞划痕和transwell实验检测神经元细胞特异性表达的MPPED1对胶质瘤细胞的迁移影响。
本发明研究神经元细胞特异性表达的MPPED1对胶质瘤细胞生长的影响，经研究发现，MPPED1可明显抑制胶质瘤的生长，可通过抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移来实现。因此，本发明既可为胶质瘤的治疗提供了新的思路，也可为抗肿瘤药物的开发提供物质基础。
所述神经胶质瘤细胞为人胶质瘤细胞株U251,U87,A172,DBTRG，大鼠胶质瘤细胞株C6及小鼠的胶质瘤细胞株GL261等，神经元细胞为人神经元细胞Neuro2A，SH-SY5Y或小鼠神经细胞HT22或原代培养的人/小鼠的神经元细胞。
所述孵育箱中CO2浓度为5％，培养温度为37℃，细胞培养基为含10％FetalBovineSerum(FBS)以及1％Penicillin-Streptomycin(PS)的DMEM。
因此，本发明具有以下有益效果：
(1)通过MPPED1转染入神经细胞，取用其上清处理胶质瘤细胞，易于操作，并且成功率高，效果良好；
(2)既可为胶质瘤的研究和诊断提供了新的思路，也可为抗肿瘤药物的开发提供物质基础。
附图说明
图1为MPPED1蛋白在不同组织中的富集结果，其中(A)为MPPED1在正常脑组织和神经胶质瘤组织中的多重免疫荧光染色；(B)为A中MPPED1总强度的量化(每组n＝10)；(C)为Westernblotting检测正常脑组织和神经胶质瘤组织中MPPED1的表达；(D)为MPPED1蛋白免疫印迹结果的量化，如(C)所示(每组n＝5)。数据为平均值±s.e.m.*p<0.05,***p<0.001.(E)为MPPED1在各类神经细胞中的表达。
图2为神经元细胞中MPPED1蛋白过表达对胶质母细胞瘤影响结果，其中(A)为胶质母细胞瘤细胞在Neuro2a上清液培养基中培养12小时、24小时后的CCK8测定结果；(B)为MPPED1过表达后和正常情况下细胞克隆实验检测的胶质瘤细胞数量；(C)为B中CCK8胶质瘤细胞数量得量化；(D)为PH3在MPPED1过表达和正常情况下神经胶质瘤组织中得多重免疫荧光染色；(E)为D中PH3总强度得量化；(F)为U251细胞正常情况下和MPPED1过表达情况下得伤口愈合试验；(G)为F中细胞在12h、24h的迁移率。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。下述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于下述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
本发明MPPED1基因的DNA序列如下：
ATGTGGCGCTCTAGGTGGGATGCCAGCGTCCTGAAGGCGGAGGCCCT
GGCCCTCCTCCCCTGCGGCCTGGGCATGGCATTCTCCCAGTCCCACGTGAT
GGCCGCTCGGCGGCACCAGCACAGCCGGCTCATCATCGAGGTGGACGAGT
ACAGCTCCAACCCCACCCAGGCCTTCACCTTCTACAACATCAACCAGGGCC
GCTTCCAGCCACCGCATGTGCAGATGGTGGACCCGGTGCCTCACGATGCCC
CCAAACCTCCAGGCTACACCCGCTTCGTCTGCGTCTCTGATACCCACTCGA
GGACGGACCCCATCCAGATGCCGTACGGCGACGTGCTGATCCACGCTGGG
GACTTCACTGAGCTGGGGCTCCCGAGCGAGGTGAAGAAGTTCAACGAGTG
GCTGGGCAGCCTGCCCTACGAGTACAAGATCGTGATCGCAGGCAACCACG
AGCTGACCTTTGACCAGGAGTTCATGGCCGACCTCATCAAGCAGGACTTTT
ACTACTTCCCATCTGTGTCGAAGCTGAAGCCGGAGAACTATGAGAATGTGC
AGTCGCTGCTGACCAACTGCATCTACCTTCAGGACTCGGAGGTCACCGTGC
GGGGCTTCCGGATCTATGGCTCCCCATGGCAGCCCTGGTTCTACGGCTGGG
GCTTCAACCTCCCGCGAGGCCAAGCCCTGCTGGAGAAATGGAACCTCATT
CCCGAAGGCGTAGACATCCTGATAACCCATGGACCACCACTGGGCTTCCTG
GACTGGGTCCCCAAGAAGATGCAGCGGGTGGGCTGTGTGGAGCTGCTCAA
CACGGTGCAGAGGCGCGTCCAGCCGCGGTTACATGTCTTTGGCCACATCCA
CGAAGGGTATGGTGTCATGGCAGATGGGACGACCACCTATGTGAATGCGTC
CGTATGCACTGTGAACTACCAGCCCGTGAACCCGCCCATAGTCATCGACCT
CCCCACACCCCGGAACTCCTGA。
实施例1：MPPED1与胶质瘤发生发展的相关性
通过多重免疫荧光染色、WesternBlot检测MPPED1与胶质瘤发生发展的相关性。具体操作如下：
1)免疫荧光
将脑和胶质母细胞瘤组织置于4％PFA中2天，在30％蔗糖中脱水直至沉到底部，然后使用Thermo冷冻切片机切成10μm冠状切片。将切片置于98℃恒温浴中的1×柠檬酸钠抗原修复溶液中30分钟后，将切片在室温下用0.3％TritonX-100的含5％BSA的PBS封闭和透化1小时。随后，切片与MPPED1(1:200,13677-1-AP,Proteintech)在4℃下孵育过夜。第二天，切片在PBS中洗涤3次，然后在室温下用二抗洗涤1小时。最后，用封固剂密封。通过使用共聚焦显微镜(Olympus，FV3000)获得图像。通过ImageJ软件测量荧光的总密度。
2)蛋白质印迹
用冷RIPA缓冲液裂解培养的细胞并在4℃下孵育30分钟，然后在12,000×g下离心20分钟。用BCA定量蛋白质浓度用5×上样缓冲液提取蛋白质，在100℃水中煮沸10分钟，然后使用10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并转移到聚偏二氟乙烯PVDF膜(MerckMillipore)上。用5％脱脂奶粉封闭1小时后，将膜与MPPED1(1:2000，13677-1-AP,Proteintech)在4℃下孵育过夜。在TBST中洗涤3次后，将膜与二抗在室温下孵育1小时。在TBST中再洗涤3次后，使用电化学发光成像分析系统(GelView6000Plus，BLT)检测蛋白信号。通过ImageJ软件测量印迹。
实施例2：MPPED1对胶质瘤细胞增殖和迁移的影响
为了检测MPPED1对胶质瘤增殖是否有影响，通过质粒转染、CCK8实验、划痕实验检测MPPED1对胶质瘤的增殖作用。具体操作如下：
1)质粒转染和细胞培养：
Neuro2a细胞母细胞瘤细胞系和胶质母细胞瘤细胞系U251的培养基是含有10％胎牛血清(FBS，Gibco)和1％青霉素/链霉素(Gibco)的DMEM培养基，在37℃和5％CO2的环境中培养。当六孔板中的Neuro2a细胞密度达到80％时，我们使用Lipofectamine3000转染试剂(ThermoFisherScientific)转染MPPED1质粒(购自苏州生物研究创新中心，克隆到pEGFP-N2)6-8小时。转染24h后，去除培养液，加入无血清DMEM培养24h。最后收集细胞培养液，离心去除浮游细胞，用于后续实验。
2)伤口愈合试验：
对于伤口愈合试验，U251细胞在六孔板中，直到细胞汇合达到90％。用200μL塑料移液器吸头在每个板上制作一个伤口。然后将收集的经过不同处理的Neuro2a细胞培养基加入到六孔板中。在刮伤后0h、12h、24h用光学显微镜(Olympus，CKX53)拍摄照片，通过测量伤口的宽度计算迁移率。
3)细胞活力测定：
通过CCK-8细胞计数试剂盒(A311-01/02，VazymeBiotech)检测细胞活力。简而言之，将细胞以每孔约3,000个细胞的密度接种到96孔板中并培养24小时，然后用无血清培养基饥饿24小时，并加入转染后的Neuro2a细胞上清液，并培养24小时。随后，向每孔中加入10μLCCK-8溶液，并在37℃下孵育2h。使用酶标仪(VarioskanFlash，ThermoScientific，USA)在450nm波长下测量细胞的光密度。
上述结果如图1-2所示。本发明通过蛋白质印迹和免疫荧光检查了神经胶质瘤患者组织样本中MPPED1蛋白的表达模式。MPPED1在神经胶质瘤组织中的总荧光强度明显弱于正常脑组织(图1A、B)。此外，从蛋白质印迹分析的结果中，我们发现神经胶质瘤患者的MPPED1蛋白显著低于正常脑组织(图1C和D)。同时我们还发现MPPED1主要在神经元中特异性表达(图1E)。因此，这些结果表明神经元特异性表达的MPPED1蛋白在神经胶质瘤患者样本中表达量明显降低。
为了探索神经元细胞中MPPED1对胶质母细胞瘤的影响，本发明进行了CCK8、免疫荧光和伤口愈合试验。对于CCK8测定，本发明测试了胶质母细胞瘤细胞在Neuro2a上清液培养基中培养后12小时、24小的OD450值。结果表明，MPPED1对U251细胞的增殖有明显的抑制作用(图2A)。本发明同时利用细胞克隆实验检测了胶质瘤细胞的数量，结果显示MPPED1的过表达明显减少了胶质瘤细胞的数量(图2B和C)。免疫荧光染色实验结果显示，MPPED1的过表达抑制了U251细胞的增殖，ph3的表达明显降低(图2D和E)。同时，如图2F和G所示，伤口愈合试验表明，与对照相比，MPPED1的过表达可以抑制U251细胞的迁移。总之，结果表明神经元细胞的MPPED1可以抑制U251细胞的增殖和迁移。
综上所述，本发明提供了一种新的研究脑胶质瘤发生发展的新途径，神经元细胞过表达MPPED1能够抑制胶质母细胞瘤的发生和发展，发现其治疗胶质瘤可能的分子机制，寻找胶质瘤的靶向治疗药物和治疗手段，可应用于胶质瘤的诊断、治疗及预后。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (6)
1.MPPED1基因在制备用于胶质母细胞瘤诊断或预后评估的试剂盒中的应用。
2.一种胶质母细胞瘤诊断或预后评估的试剂盒，其特征在于，包括用于检测分子标志物MPPED1基因表达水平的试剂。
3.一种用于检测MPPED1基因的试剂在制备用于胶质母细胞瘤诊断或预后评估的试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测MPPED1基因的试剂选自对MPPED1基因具有检测特异性的探针、引物或基因芯片。
5.MPPED1在制备胶质母细胞瘤治疗或预后评估药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，MPPED1通过在神经元特异性过表达参与抑制胶质母细胞瘤的生长和转移。
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