CN116726080A - 一种治疗薄型子宫内膜的中药组合物及其应用 - Google Patents

一种治疗薄型子宫内膜的中药组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种治疗薄型子宫内膜的中药组合物及其应用。所述中药组合物，以重量份数计，包括以下中药原料：生黄芪15‑21份、当归9‑15份、丹参15‑21份、女贞子9‑15份、桑葚子9‑15份、菟丝子15‑21份、淫羊藿12‑18份、鹿角霜15‑21份、山楂6‑12份、续断9‑15份和杜仲9‑15份。本发明还公开了上述中药组合物的应用。该中药组合物可在缺氧条件下激活HIF‑1α通路，上调VEGFA和Bcl‑2的表达，诱导血管生成、调控细胞增殖及凋亡，改善薄型子宫内膜修复，提高性激素水平和子宫内膜容受性，从而更有利于提高薄型子宫内膜患者的生活质量。

Description

一种治疗薄型子宫内膜的中药组合物及其应用
技术领域
本发明涉及中医药技术领域。具体地，涉及一种治疗薄型子宫内膜的中药组合物及其应用。
背景技术
随着我国不孕症女性的逐渐增加，体外受精-胚胎移植(IVF-ET)已成为不孕症的重要治疗方式，随着控制性卵巢刺激方案的逐步完善和实验室技术的飞速发展，IVF-ET技术的妊娠率开始持续稳步上升，目前，单周期妊娠率最高可达60％，但总体妊娠率仍徘徊在30％-40％。胚胎的成功着床在保证胚胎正常的前提下，子宫内膜需处于接受态，才能允许囊胚附着、穿透，并进一步诱导间质改变导致退膜化。因子宫内膜容受性不佳引起胚胎-子宫内膜互作改变而导致的胚胎种植失败占到了三分之二，而子宫内膜厚度是影响子宫内膜容受性的最重要因素。目前，临床多认为HCG注射日或黄体中期子宫内膜厚度7mm是适宜胚胎着床的临界值。西医对于薄型子宫内膜造成的子宫内膜容受性降低的问题，多采用大剂量外源性雌激素(例如芬吗通)、改善血流灌注、促进内膜细胞增殖或再生等治疗方法。中医药治疗本病或采用滋阴养血，或补肾法，或活血法。临床使用的补肾活血方，例如淫羊藿10g、肉苁蓉10g、鹿角15g、羌活6g、细辛3g(张亚琳，补肾活血调冲法治疗肾虚血瘀型薄型子宫内膜的临床观察[D]。黑龙江中医药大学，2022。DOI:10.27127/d.cnki.ghlzu.2022.000184)，但现有技术中还缺少养血活血、调冲疏经的中药组方。
发明内容
为解决现有技术中缺少养血活血、调冲疏经的中药组方的问题，因此，本发明提供了一种治疗薄型子宫内膜的中药组合物及其应用。所述中药组合物与芬吗通相比，两者均能改善子宫内膜厚度、类型以及子宫血流动力学，但在血清激素水平、中医症候积分及HAMA评分中，本发明提供的中药组合物较芬吗通治疗效果更佳。此外，细胞实验的结果表明，本发明的中药组合物可在缺氧条件下激活HIF-1α通路，上调VEGFA和Bcl-2的表达，诱导血管生成、调控细胞增殖及凋亡，改善薄型子宫内膜修复，提高子宫内膜容受性。动物实验的结果也表明，本发明的中药组合物可通过调控薄型子宫内膜缺氧诱导血管生成和凋亡，以改善薄型子宫内膜，提高性激素水平，从而提高子宫内膜容受性。上述实验结果表明，本发明的中药组合物更有利于提高薄型子宫内膜患者的生活质量。
中医药治疗妇人不孕症效果显著，根据薄型子宫内膜患者的症状可将其归于中医“不孕”、“月经过少”、“闭经”等范畴。胡国华教授师从国医大师朱南孙，治疗女性不孕症数十年，“肾主生殖”是对生殖生理学的高度概括，女性黄体期为肾阴阳转化之期，则更应谨遵阴阳，以调达平，从整体出发，调整机体内在多系统、多途径、多靶点作用于子宫内膜，增加子宫内膜厚度，提高子宫内膜容受性。胡国华教授认为本病的病机以肾虚冲任失调为本，气血瘀滞为标。在朱氏调经促孕方的基础上进行加减，自拟本发明的中药组合物，其中，女贞子、桑葚子可滋阴益肾；淫羊藿、鹿角霜可固元助阳，菟丝子、续断、杜仲可平补肝肾之阴阳，诸药共用，扶正调体。当归养血活血，山楂健脾散瘀，生黄芪补中益气，三者合用益气活血，健脾调经。丹参活血通经，清心除烦，调经之余不忘调神。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：一种中药组合物，以重量份数计，所述中药组合物包括以下中药原料：生黄芪15-21份、当归9-15份、丹参15-21份、女贞子9-15份、桑葚子9-15份、菟丝子15-21份、淫羊藿12-18份、鹿角霜15-21份、山楂6-12份、续断9-15份和杜仲9-15份。
本发明一些实施方案中，以重量份数计，所述中药组合物包括以下中药原料：生黄芪18份、当归12份、丹参18份、女贞子12份、桑葚子12份、菟丝子18份、淫羊藿15份、鹿角霜18份、山楂9份、续断12份和杜仲12份。
本发明一些具体实施方案中，以重量份数计，所述中药组合物由上述中药原料组成。
本发明提供的技术方案之二为：一种如技术方案之一所述的中药组合物在制备治疗薄型子宫内膜的药物中的应用。
本发明一些实施方案中，所述的药物为口服制剂例如片剂、胶囊剂、汤剂、合剂、丸剂、颗粒剂、口服液或糖浆剂。
本发明一些具体实施方案中，所述的口服制剂为颗粒剂。
所述颗粒剂的制备方法包括以下步骤：
a)将称取后的上述中药原料加入到8-10倍中药原料总重量的水中进行加热，待沸腾20-60分钟后，过滤得到第一次提取液，对滤渣添加4-6倍中药原料总重量的水进行加热，待沸腾10-30分钟后，过滤得到第二次提取液，将两次提取液混合得到混合提取液；
b)对a)所述的混合提取液进行加热，待沸腾5-20分钟后过滤，过滤后将滤液浓缩成清膏，干燥，制粒，得颗粒剂。
本发明一些具体实施方案中，所述制粒的操作可为本领域此类反应常规的操作，本发明优选将前述步骤b)干燥后得到的浸膏与适量的淀粉和环糊精和乙醇混合，搅拌至手捏成团，触之即散，筛选颗粒，放入烘箱干燥，制备成颗粒剂。其中，浸膏和淀粉的重量比可为1:1-1:5，例如1:2。浸膏和环糊精的重量比可为1:1-1:10，例如1:6。乙醇优选质量分数为75-85％的乙醇。浸膏与乙醇的质量比可为1:1-1:5，例如1:2.5。
本发明一些具体实施方案中，所述颗粒剂为粒径在105-500μm范围内的细颗粒剂。
本发明一些实施方案中，所述的薄型子宫内膜界定为：患者在自然周期或使用Gn的刺激周期，当由经阴道B超测得至少有1个直径＞18mm的成熟卵泡发育到排卵时子宫内膜厚度＜7mm；或在无排卵周期，除符合自然周期或使用Gn的刺激周期的条件外，还包含使用外源性雌激素刺激持续作用时间＞14天、血清E2水平＞200pg/mL和子宫内膜厚度仍＜7mm。
本发明一些实施方案中，所述患者为年龄≤40岁、有排卵且排卵日子宫内膜厚度为5-7mm者；优选地，所述患者为符合肾虚血瘀证诊断标准和超声监测排卵正常者。
本发明提供的技术方案之三为：一种药物制剂，所述的药物制剂包含如技术方案之一所述的中药组合物，以及药学上可接受的辅料。
本发明一些实施方案中，所述药学上可接受的辅料包括乳化剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂和助溶剂中的至少一种。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明的积极进步效果在于：
1、既往的中药复方均需在激素药物的基础上进行联合治疗，本发明的中药组合物可单独治疗薄型子宫内膜，且疗效显著。
2、本发明的中药组合物与芬吗通相比，两者均能改善子宫内膜厚度、类型以及子宫血流动力学，但在血清激素水平、中医症候积分及HAMA评分中，本发明的中药组合物治疗效果更佳。
3、本发明的中药组合物可在缺氧条件下激活HIF-1α通路，上调VEGFA和Bcl-2的表达，诱导血管生成、调控细胞增殖及凋亡，改善薄型子宫内膜修复，提高性激素水平和子宫内膜容受性，从而更有利于提高薄型子宫内膜患者的生活质量。
附图说明
图1为显微镜下观察原代子宫内膜基质细胞(ESC)(A薄型子宫内膜细胞、B正常子宫内膜细胞、C正常子宫内膜细胞)。
图2为FDA检测细胞活力(A对照组、B模型组、C低剂量组、D中剂量组和E高剂量组)，注：图中亮白点代表FDA阳性。
图3为FDA检测细胞增殖分析，图中***P＜0.001、**P＜0.01和*P＜0.05相较于模型组。
图4为CCK8检测细胞增殖，图中***P＜0.001、**P＜0.01和*P＜0.05相较于模型组。
图5为TUNEL检测细胞凋亡(A对照组、B模型组、C低剂量组、D中剂量组和E高剂量组)。注：图中亮白点代表TUNEL阳性。
图6为TUNEL检测细胞凋亡分析，图中***P＜0.001、**P＜0.01和*P＜0.05相较于模型组。
图7为Western Blot检测HIF-1α、VEGFA和Bcl-2的蛋白表达条带。
图8为Western Blot检测HIF-1α、VEGFA和Bcl-2的蛋白表达分析，图中***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05，ns表示无统计学意义、P＞0.05，相较于模型组。
图9为qPCR检测HIF-1α、VEGFA和Bcl-2的mRNA表达，图中***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05，ns表示无统计学意义、P＞0.05，相较于模型组。
图10为薄型子宫内膜造模手术过程(A备皮分离后暴露子宫、B注入95％乙醇后子宫迅速发白僵化、C消毒止血后缝合)。
图11为不同组别子宫形态图(A空白对照组的子宫、B造模后3天的子宫、C和D为4个治疗周期后的子宫)。
图12为不同组别子宫湿重，图中***P＜0.001、**P＜0.01和*P＜0.05相较于模型组。
图13为HE染色显示四组子宫组织光镜观察(2×，40×)，图中A和B为造模后3天；C和D为治疗4个动情周期后。
图14为治疗后各组大鼠内膜厚度(见A)及腺体数量(见B)比较，图中**P＜0.01和*P＜0.05相较于模型组。
图15为IHC显示五组子宫组织(10×，80×)。
图16为IHC检测小鼠内膜HIF-1α(见A)和VEGFA(见B)的表达，图中**P＜0.01，ns表示无统计学意义、P＞0.05，相较于模型组。
图17为IF检测小鼠内膜HIF-1α和VEGFA的表达定位，A为40×，B为100×。
图18为IF检测小鼠内膜HIF-1α(见A)和VEGFA(见B)的表达，图中***P＜0.001和*P＜0.05相较于模型组。
图19为WB检测子宫内膜HIF-1α、VEGF-α和Bcl-2蛋白表达，图中***P＜0.001、**P＜0.01和*P＜0.05相较于模型组。
图20为qPCR法检测子宫内膜HIF-1α、VEGFA和Bcl-2的表达，图中***P＜0.001相较于模型组。
图21为ELISA法检测血清E2(见A)、LH(见B)水平，图中***P＜0.001，以及ns表示无统计学意义、P＞0.05，相较于模型组。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。下述实施例中，涉及本发明的中药组合物，如无特别说明，均是根据临床试验第2部分方法中提到的颗粒剂的制备方法，制得颗粒剂，按照用药需求进行调配。
实施例
一、临床试验
1、临床资料
1.1研究对象
选取2021年1月至2021年12月就诊于上海市中医医院妇科门诊的60例肾虚血瘀型薄型子宫内膜患者作为研究对象。随机分为试验组30例和对照组30例。本研究通过上海市中医医院伦理委员会批准(NO：2021SHL-KY-07-01)。
1.2诊断标准
1.2.1西医诊断标准：
薄型子宫内膜界定标准(参考文献：赵静、黄国宁、孙海翔等，《辅助生殖技术中异常子宫内膜诊断的中国专家共识》[J]。生殖医学杂志，2018，27(11):1057-1064)：
患者在自然周期或使用Gn的刺激周期，当由经阴道B超测得至少有1个直径＞18mm的成熟卵泡发育到排卵时子宫内膜(EM)厚度＜7mm；无排卵周期，除前面所述，还包含使用外源性雌激素刺激持续作用时间＞14天，血清E2水平＞200pg/mL，EM厚度仍＜7mm者。较佳地，所述患者为①年龄≤40岁、②有排卵且排卵日(HCG日)EM厚度5-7mm者；更佳地，所述患者为①符合肾虚血瘀证诊断标准、②超声监测排卵正常者。
1.2.2中医诊断标准：肾虚血瘀诊断标准：
参照《中医妇科学》和《中药新药临床研究指导原则》拟定肾虚血瘀证辨证标准。
主症：月经周期不定，月经量多少不定；经色紫暗夹块、经行不畅；
次症：小腹疼痛、有定处；腰膝酸软，胫酸膝软或足跟痛；头晕，耳聋耳鸣；小便时间长而清澈，夜间有频尿症，畏寒肢冷。
舌脉：舌质紫暗、淡暗，或伴瘀点瘀斑。脉沉涩。
具备主症及两项以上次症，结合舌脉即可辨证。
1.3纳入标准
①年龄≤40岁；②有排卵且排卵日(HCG日)子宫内膜厚度5-7mm者；③符合肾虚血瘀证诊断标准；④超声监测排卵正常者；⑤患者签署知情同意书。
1.4排除标准
①未经宫腔镜治疗或未治愈的子宫及宫腔病变者；②既往移植失败≥3次者；③复发性流产者；④子宫腺肌症、内异症；⑤对治疗药物过敏者；⑥不接受中医治疗者。
1.5病例的退出或脱落标准与处理
①未完成试验而中途退出者；②未按规定方案治疗，或合并使用其他疗法或药物而无法判定疗效者；③严重不良反应者。
2、方法
2.1分组与治疗
采用随机数字表法将患者按照入组时间编号为1～60，随机分为试验组和对照组各30例。对照组予以芬吗通(雌二醇/雌二醇地屈孕酮，2mg/2mg:10mg；生产商家：AbbottHealthcare Products B.V.，批号：H20150346)，服用方法：从月经周期(或撤退性出血)第3天服用芬吗通红片(雌二醇2mg)，每天一次，每次一片。排卵后，口服黄片(雌二醇2mg和地屈孕酮10mg)每天一次，每次一片，服用10天。
试验组予以中药组合物，其中中药组合物的原料为：生黄芪18g、当归12g、丹参18g、女贞子12g、桑葚子12g、菟丝子18g、淫羊藿15g、鹿角霜18g、山楂9g、续断12g、杜仲12g，制备成粒径在105-500μm范围内的细颗粒剂于月经来潮第1天开始服用，每日1剂(1剂的量为40g颗粒剂，分上下午两次服用，每次20g颗粒剂加200mL水)，治疗3个月。
所述颗粒剂的制备方法包括以下步骤(具体可参见专利文献CN109453329A，并进行调整)：
a)将称取后的上述中药原料加入到8倍中药原料总重量的水中进行加热，待沸腾20分钟后，过滤得到第一次提取液，对滤渣添加4倍中药原料总重量的水进行加热，待沸腾10分钟后，过滤得到第二次提取液，将两次提取液混合得到混合提取液；
b)对a)所述的混合提取液进行加热，待沸腾5分钟后过滤，过滤后将滤液浓缩成清膏，干燥，干燥后得到的浸膏与2重量份的淀粉(以浸膏重量计)和6重量份的环糊精(以浸膏重量计)和2.5重量份(以浸膏重量计)的85％的乙醇混合，搅拌至手捏成团，触之即散，筛选颗粒，放入烘箱干燥，得颗粒剂。
2.2检测指标
2.2.1主要观测指标：
①子宫内膜厚度：治疗前后使用彩色多普勒超声诊断仪测量黄体转化日子宫内膜，子宫内膜厚度为子宫的中矢状平面中测量子宫内膜-子宫肌层连接的2个界面之间的最大距离。
②子宫内膜类型：治疗前后子宫内膜形态，取正中矢状面时内膜的最大前后径，分为三型。A型：外-中-内层分别为高-低回声，与宫腔中线明显回声呈三线征；B型：均匀高回声，中线回声不明显；C型：均质强回声，内无中线回声；A型和B型的子宫内膜形态优于C型。
③子宫血流动力学：治疗前后黄体转化日子宫动脉血流阻力(RI)和搏动指数(PI)，收缩期峰值流速/舒张期流速(S/D)。
2.2.2次要观测指标：
①血清性激素水平：治疗前后月经第3天检测患者性激素水平，抗缪勒管激素(AMH)、促卵泡激素(FSH)、促黄体生成素(LH)和雌二醇(E2)。
②肾虚血瘀型中医证候量表积分：主症：月经周期不定；月经量多少不定；经色紫暗夹块、经行不畅；按照重、中、轻、无，分别计为6、4、2、0分。次症：小腹疼痛、有定处；腰膝酸软，胫酸膝软或足跟痛；头晕，耳聋耳鸣；小便时间长而清澈，夜间有频尿症，畏寒肢冷，按照重、中、轻、无，分别计为3、2、1、0分。
③汉密尔顿焦虑量表(HAMA)：患者治疗前后HAMA评分。
2.3.2安全性观测指标：
治疗前后患者血常规、尿常规、肝功能、肾功能检测。
2.4统计方法
本试验采用SPSS 21.0软件进行统计分析，计数资料以均值±标准差(Mean±s)表示，两组资料符合正态分布和方差齐性用t检验方法，未符合正态分布和方差齐性用非参数Mann-Whitney U检验，组内比较采用配对资料秩和检验。计数资料采用频数(构成比)表示，组间比较采用卡方检验；等级资料采用非参数检验。双侧检验，检验水平α＝0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。
3、结果
3.1一般资料分析
本研究共纳入符合标准的60例肾虚血瘀型薄型子宫内膜患者，随机分为试验组30例和对照组30例，两组患者年龄、BMI差异均不具有统计学意义(P＞0.05)。
表1两组患者基本资料比较(Mean±s)
组别 n 年龄(岁) BMI(kg/m2)
对照组 30 32.20±3.71 20.23±0.87
试验组 30 30.73±3.55 20.34±0.86
t 1.564 -0.541
P 0.123 0.591
3.2子宫内膜厚度：两组患者治疗前子宫内膜厚度无统计学差异(P＞0.05)，治疗后子宫内膜厚度均较治疗前增加(P＜0.001)，两组患者治疗后子宫内膜厚度无明显差异(P＞0.05)。
表2两组患者子宫内膜厚度比较(Mean±s)
注：与治疗前相比，***P＜0.001。
3.3子宫内膜类型：两组患者治疗前子宫内膜类型无明显差异(P＞0.05)，治疗后两组患者子宫内膜A型、B型均较治疗前比例增加(P＜0.05)，差异有统计学意义。
表3两组患者子宫内膜类型比较(n，％)
3.4子宫血流动力学：两组患者治疗前子宫动脉血流阻力(RI)和搏动指数(PI)，收缩期峰值流速/舒张期流速(S/D)均无明显差异(P＞0.05)，治疗后两组患者RI、PI、S/D值均较治疗前降低(P＜0.01)，且治疗后试验组RI、PI、S/D值较对照组降低更明显(P＜0.05)，差异有统计学意义。
表4两组患者血流动力学比较(Mean±s)
注：与治疗前相比，**P＜0.01；与对照组相比，#P＜0.05。
3.5血清性激素水平：两组患者治疗前促卵泡激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)和抗缪勒管激素(AMH)均无明显差异(P＞0.05)，两组治疗后患者FSH、LH值较治疗前无明显差异(P＞0.05)，治疗后E2和AMH值较治疗前降低(P＜0.05)，且试验组较对照组降低更明显(P＜0.05)，差异有统计学意义。
表5两组患者性激素水平比较(Mean±s)
注：与治疗前相比，*P＜0.05；与对照组相比，#P＜0.05。
3.6中医症候评分量表：两组患者治疗前中医症候评分均无明显差异(P＞0.05)，治疗后两组患者中医症候评分均较治疗前降低(分别为P＜0.05和P＜0.001)，且试验组患者中医症候评分较对照组患者降低更明显(P＜0.001)，差异有统计学意义。
表6两组患者中医症候评分比较(Mean±s)
注：与治疗前相比，*P＜0.05，***P＜0.001，与对照组相比，###P＜0.001。
3.7汉密尔顿焦虑量表(HAMA)：两组患者治疗前HAMA评分均无明显差异(P＞0.05)，治疗后两组患者HAMA评分均较治疗前降低(P＜0.001)，且试验组患者HAMA评分较对照组患者降低更明显(P＜0.01)，差异有统计学意义。
表7两组患者中HAMA评分比较(Mean±s)
注：与治疗前相比，***P＜0.001，与对照组相比，##P＜0.01。
4、小结
与芬吗通(对照组)相比，给肾虚血瘀型薄型子宫内膜患者施用本发明的中药组合物(试验组)后，两组患者子宫内膜厚度均较治疗前增厚(P＜0.001)，且两组子宫内膜厚度无明显差异(P＞0.05)。治疗后，两组患者子宫内膜A型和B型均较治疗前比例增加(P＜0.05)。但治疗后，试验组RI、PI、S/D值、血清性激素水平(E2、AMH值)较对照组降低更明显(P＜0.05)。且试验组患者肾虚血瘀型中医症候评分和HAMA评分较对照组患者降低更明显(分别为P＜0.001和P＜0.01)。可见，本发明的中药组合物与芬吗通相比在改善子宫内膜厚度、类型以及子宫血流动力学方面的疗效相当，但在血清激素水平、中医症候积分及HAMA评分中，较芬吗通疗效更佳。
二、细胞实验：
1、样本获取
(1)薄型子宫内膜组织样本采集
选取正常(对照组)及薄型子宫内膜(模型组和中药组合物给药组)患者子宫内膜组织。经阴道超声监测至排卵后第7天，告知患者并签署知情同意，用一次性4.5mm宫腔组织吸引管抽取内膜组织。将抽取到的子宫内膜用0.9％氯化钠溶液彻底冲洗干净后，立即放入1.5mL离心管至-80℃冰箱冻存，直到提取细胞。
(2)原代细胞获取
用含有双抗的4℃的1×DPBS清洗、消化、滤除碎片。所得滤液为子宫内膜间质细胞，洗筛网分离的腺上皮细胞，收滤液，弃上清，用DMEM/F12完全培养基重悬细胞。3小时等基质细胞贴壁，取上层培养基离心、消化，FD培养基清洗并且悬浮，制单细胞液。传代培养。
(3)灌胃中药组合物的制备
将1剂中药组合物(1剂的原料含生黄芪18g、当归12g、丹参18g、女贞子12g、桑葚子12g、菟丝子18g、淫羊藿15g、鹿角霜18g、山楂9g、续断12g、杜仲12g，按照临床试验第2部分方法中提到的颗粒剂的制备方法，制得颗粒剂)，根据小鼠一天生药量的需求加水进行调配。
(4)含药血清制备
C57BL/6雌性小鼠15只(8-10周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，给药(中药组合物颗粒剂)剂量为0.5908g/mL，每只小鼠每次灌胃量为0.3mL，2次/日，连续给药7次。于最后一次给药后1-2小时下腔静脉取血，3000rmp离心分离血清并将其经56℃、30分钟灭活后，采用0.22μm微孔滤膜进行过滤，置于-20℃冰箱冻存待用。
(5)实验分组
取体外培养的子宫内膜干细胞设对照组(于DMEM/F12完全培养基中培养)，模型组(于DMEM/F12完全培养基中培养)，中药组合物低、中和高剂量组(于DMEM/F12完全培养基+含药血清中培养)，低、中和高剂量组中DMEM/F12完全培养基与含药血清的体积比分别为1:0.1、1:0.15和1:0.2。
(6)缺氧环境细胞培养
提取原代内膜细胞，细胞计数后以1×105/cm2的密度用含10％胎牛血清和含1％青/链霉素的DMEM培养基，培养温度37℃，缺氧环境构建为5％ CO2、95％ N2混合气体，取对数生长期细胞制备细胞悬液，以5×103/孔接种于96孔板。
2、结果
(1)原代子宫内膜基质细胞(ESC)提取拍照
倒置显微镜下可见到正常子宫内膜细胞大多为轮廓清晰的梭形、胞浆丰富而透明、胞核椭圆并居中；薄型子宫内膜细胞呈梭形细胞、椭圆形及圆形，形态欠统一，胞浆透明性较正常内膜细胞差。实验结果见图1。
(2)FDA检测细胞活力
FDA检测细胞活力，相比对照组，模型组细胞活力显著减弱(高度统计学意义，P＜0.001)，用低、中和高剂量含药血清处理细胞后，均可显著提高细胞活力(有统计学意义，分别为P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001)。实验结果见图2和图3。
(3)CCK8检测细胞增殖
ESC在缺氧条件下培养(5％ CO2，95％ N2混合气体)，并分别用低、中和高剂量组含药血清处理48小时(血清经56℃水浴30分钟灭活补体，0.22μm微孔滤膜过滤除菌)，通过CCK8法检测细胞增殖。相比对照组，模型组增殖水平显著下降(高度统计学意义，P＜0.001)；与模型组相比，含药血清处理后低剂量组增殖水平有所上升(差异有统计学意义，P＜0.05)，同时中剂量和高剂量组增殖能力显著上升，均有显著差异(分别为P＜0.01和P＜0.001)，且增殖能力有随浓度呈现上升趋势。实验结果见图4。
(4)TUNEL检测凋亡
TUNEL检测各组子宫内膜细胞凋亡。相比对照组，模型组细胞凋亡率增加(高度统计学意义，P＜0.001)，用低、中和高剂量含药血清处理细胞后，均可抑制细胞凋亡(有统计学意义，分别为P＜0.05、P＜0.001和P＜0.001)，且随血清中药物浓度增加细胞凋亡率(TUNEL阳性)有下降趋势。实验结果见图5和图6。
(5)WB、qPCR检测HIF-1α、VEGFA和Bcl-2的蛋白及mRNA表达
与对照组相比较，模型组细胞HIF-1α、VEGFA和Bcl-2的蛋白水平显著减少(差异有统计学意义，分别为P＜0.05、P＜0.001和P＜0.001)。其中，低剂量含药血清处理并不影响HIF-1α表达(P＞0.05)，但是中剂量与高剂量含药血清处理细胞，可显著提高HIF-1α表达(分别为P＜0.01和P＜0.001)。与模型组比较，低剂量、中剂量和高剂量含药血清处理细胞，均可提高VEGFA和Bcl-2的蛋白水平(有统计学意义，分别为P＜0.01、P＜0.01和P＜0.05，以及P＜0.01、P＜0.001和P＜0.001)。实验结果见图7和图8。
与对照组相比较，模型组细胞HIF-1α、VEGFA和Bcl-2mRNA水平均显著减少(均为P＜0.001)，其中低剂量含药血清处理并不影响VEGFA表达(P＞0.05)，但是中剂量和高剂量含药血清处理细胞，均可提高VEGFA的表达(差异有统计学意义，分别为P＜0.05和P＜0.001)。与模型组比较，中剂量和高剂量含药血清处理细胞，均可显著提高HIF-1α和Bcl-2的mRNA水平(差异有高度统计学意义，均为P＜0.001)，实验结果见图9。
3、小结
细胞实验表明本发明的中药组合物可在缺氧条件下激活HIF-1α通路，上调VEGFA和Bcl-2的表达，诱导血管生成、调控细胞增殖及凋亡，改善薄型子宫内膜修复，提高子宫内膜容受性。提取细胞后显微镜观察原代子宫内膜基质细胞(ESC)，可见正常子宫内膜细胞与薄型子宫内膜细胞形态学及胞浆透明度差异。ESC在缺氧条件下培养，治疗组分别用低剂量、中剂量和高剂量含药血清处理48小时：①FDA法检测细胞活力，模型组细胞较对照组活力明显减少(P＜0.001)，各浓度药物血清处理细胞均可明显提高细胞活力(分别为P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001)。②CCK8检测细胞增殖，与对照组相比模型组显著下降(P＜0.001)；含药血清处理后，与模型组相比，各组增殖能力均明显上升(分别为P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001)，且增殖能力随浓度呈现上升趋势。③TUNEL检测细胞凋亡，与对照组比较，模型组细胞凋亡率显著增加(P＜0.001)，用低、中或高剂量含药血清处理细胞均可抑制细胞凋亡(分别为P＜0.05、P＜0.001和P＜0.001)，且随血清中药物浓度增加细胞凋亡率(TUNEL阳性)有下降趋势。④WB检测相关蛋白表达，与对照组比较，模型组细胞HIF-1α、VEGFA和Bcl-2的蛋白水平均减少(分别为P＜0.05、P＜0.001和P＜0.001)，低剂量含药血清处理并不影响HIF-1α表达(P＞0.05)，但是中剂量与高剂量含药血清处理细胞，可显著提高HIF-1α表达(分别为P＜0.01和P＜0.001)。与模型组比较，低剂量、中剂量和高剂量含药血清处理细胞，均可提高VEGFA和Bcl-2的蛋白水平(分别为P＜0.01、P＜0.01和P＜0.05，以及P＜0.01、P＜0.001和P＜0.001)。⑤qPCR检测相关mRNA表达，与对照组相比较，模型组细胞相关mRNA表达均显著减少(P＜0.001)，低剂量含药血清处理并不影响VEGFA表达(P＞0.05)，但是中剂量与高剂量含药血清处理细胞，可提高其表达(P＜0.05和P＜0.001)。与模型组比较，中剂量和高剂量含药血清处理细胞，均可显著提高HIF-1α和Bcl-2的mRNA水平(均为P＜0.001)。
三、动物实验：
1、动物分组
采用随机数字表法将筛选出动情周期规律的60只C57BL/6雌性小鼠(8-10周龄，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)随机分成5组：对照组、模型组和中药组合物低、中和高剂量治疗组，每组12只。对照组不予以处理，其余4组通过95％乙醇注射宫腔的造模方法建立薄型子宫内膜模型。造模第3天，每组各取3只进行造模结果鉴定(结果见3、一般情况观察)。中药组合物低、中和高剂量治疗组于造模第4天开始予以中药组合物治疗，治疗后的第四个动情周期处死取材，进行子宫组织分析实验。
2、灌胃中药组合物的制备
将1剂中药组合物(1剂的原料含生黄芪18g、当归12g、丹参18g、女贞子12g、桑葚子12g、菟丝子18g、淫羊藿15g、鹿角霜18g、山楂9g、续断12g、杜仲12g，按照临床试验第2部分方法中提到的颗粒剂的制备方法，制得颗粒剂)，根据小鼠一天生药量的需求加水进行调配。
低、中和高剂量给药组的剂量分别为：0.5908g/mL，1.1816g/mL和2.3632g/mL，每只小鼠每次灌胃量为0.3mL。
3、一般情况观察
3.1术前、注射中及术后观察
术前，小鼠子宫外观呈粉红色，内部充盈液体但不肿胀，粗细均匀，富有弹性光泽；注射过程中，小鼠子宫逐渐变白，组织僵化；注射完毕后，小鼠子宫发白，质地变硬；与同一小鼠另一侧未手术子宫对比，手术子宫明显失去光泽，质地僵化，严重脱水，变白。造模术后3天，小鼠均无死亡或感染。实验结果见图10。
术后观察各组子宫形态，对照组子宫呈粉红色，内部充盈液体但不肿胀，粗细均匀，弹性有光泽；模型组和中药组合物低、中和高剂量治疗组的小鼠造模后3天子宫发白或灰白色，部分可见出血点，质地变硬或僵化，弹性变差，粗细不均，或出现不同程度的宫腔粘连；治疗4个周期后子宫呈淡粉色，弹性质地，内部充盈，粗细不均，或由注射点物理损伤或炎症所致。实验结果见图11。
3.2取材日子宫湿重称重
取材日进行子宫湿重称重比较，五组小鼠子宫湿重比较后可见，对照组子宫湿重显著高于模型组(差异有统计学意义，P＜0.001)，经过本发明的中药组合物治疗后，子宫湿重较模型组均有明显提高(差异有统计学意义，分别为P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001)，并随着低、中和高剂量的变化呈现递增趋势。实验结果见图12。
4、HE染色观察子宫内膜
4.1治疗前(造模后3天)HE染色
对照组小鼠子宫横切面示宫腔形态规则，最内层为内膜层，向外扩展依次为肌层、浆膜层。内膜层由单层柱状上皮细胞和间质组成，柱状上皮排列整齐，间质内可见腺体和血管。内膜层见大量蓝紫色基质细胞核呈均匀密集型分布，子宫腺体较多，子宫腺体腺腔截面为椭圆形，腺腔细胞规则整齐排列围绕而成。内膜血管丰富，分布均匀。与对照组比较，造模后各组子宫腔变宽大(2×，见图13)，皱襞减少，为失去弹性所致。基质细胞大量减少，上皮细胞排列错乱稀疏，呈低柱状或扁平状，腺体少见或不可见，血管稀疏(40×，见图13)。
4.2治疗4个动情周期后HE染色
治疗4个动情周期后，对照组各时间点内膜层、基质层厚度均无明显差异，上皮细胞排列整体，腺体及血管丰富且分布均匀，
低剂量、中剂量和高剂量组子宫内膜形态、腺体随治疗均有所改善，子宫内膜较造模后3天取材相比有所增厚，内膜层皱襞增多，管腔变小，弹性较好，上皮层及基质层厚度均增加，腺体及血管较多，分布较均匀，上皮细胞排列较整齐，少量呈低柱状或扁平状。
模型组子宫损伤明显，各时间点自身有一定修复，上皮细胞扁平，内膜层、基质层均见明显变薄，腺体及血管少见，内膜层皱襞较少，弹性略有恢复，个别部位出现纤维化，上皮细胞排列错乱，柱状上皮细胞较前缩短或呈现扁平状。或有出现宫腔粘连。
采用K-Viewer图像分析软件处理计算子宫内膜横切厚度、内膜腺体数量。分析得出，模型组子宫内膜厚度和腺体数量明显低于对照组(均有显著性差异，分别为P＜0.001和P＜0.01)。各治疗组子宫内膜厚度及腺体数量恢复明显优于模型组，且均有差异(分别为P＜0.05、P＜0.01和P＜0.05，以及P＜0.05、P＜0.01和P＜0.05)。
实验结果见图13和图14。
5、IHC、IF法检测子宫组织HIF-1α、VEGFA的表达定位
通过IHC、IF实验检测各组子宫组织HIF-1α、VEGFA的表达定位。计算平均光密度值，评估本发明的中药组合物对子宫组织HIF-1α、VEGFA表达的影响。
IHC检测阳性表达主要呈棕黄色或棕褐色颗粒，HIF-1α主要在内膜上皮细胞的胞浆中表达，在有氧环境下极易降解；VEGFA定位于腺上皮及血管内皮细胞的胞浆中，周围间质细胞的胞浆中也有散在分布。
IHC检测模型组HIF-1α表达明显低于对照组，P＜0.05，差异具有统计学意义；本发明的中药组合物干预薄型子宫内膜小鼠后，三组HIF-1α的表达通过IHC检测平均光密度值与模型组相比均有增加趋势。其中高剂量组HIF-1α表达明显高于模型组，P＜0.01，差异有统计学意义；低剂量组、中剂量组HIF-1α表达与模型组比较均无明显差异，P＞0.05。
IHC检测模型组VEGFA表达明显低于对照组，P＜0.01，差异有统计学意义；本发明的中药组合物干预薄型子宫内膜小鼠后，三组VEGFA的表达通过IHC检测平均光密度值发现均有比模型组增加的趋势。其中低剂量组和高剂量组VEGFA表达较模型组相比均有明显增加，P＜0.05，差异具有统计学意义；中剂量组VEGFA表达与模型组比较无明显差异，P＞0.05。
IF检测模型组HIF-1α、VEGFA表达通过平均光密度值比较均明显低于对照组(P＜0.001，差异具有高度统计学意义)；经本发明的中药组合物治疗后，低、中和高剂量组的HIF-1α的表达均比模型组显著增加(均为P＜0.001，差异具有高度统计学意义)；VEGFA的表达比模型组均有不同程度的增加(分别为P＜0.05、P＜0.001和P＜0.001，差异有统计学意义)。
实验结果见图15、图16、图17、图18，表8和表9。
表8.IHC检测小鼠内膜HIF-1α、VEGFA表达的平均光密度值
注：*P＜0.05和**P＜0.01相较于模型组。
表9.IF检测小鼠内膜HIF-1α、VEGFA表达的平均光密度值
注：*P＜0.05和***P＜0.001相较于模型组。
6、WB及PCR法检测子宫内膜HIF-1α、VEGFA和Bcl-2的表达量
获取各组小鼠子宫组织，RIPA裂解液提取蛋白，Trizol裂解提取总RNA，分别通过WB实验和qPCR实验测定HIF-1α、VEGFA和Bcl-2蛋白及mRNA的表达量。
WB检测五组小鼠内膜组织均可见HIF-1α、VEGFA和Bcl-2蛋白的表达，但与对照组进行灰度值对比分析发现模型组中的表达明显减少(差异具有统计学意义，均为P＜0.001)，而经过本发明的中药组合物灌胃治疗后，低、中和高剂量治疗组中HIF-1α、VEGFA和Bcl-2的表达均明显高于模型组(差异均有统计学意义，分别为P＜0.001、P＜0.001和P＜0.001，P＜0.01、P＜0.001和P＜0.001，以及P＜0.05、P＜0.001和P＜0.001)，但与浓度增加关系不明显。WB实验结果见图19。
qPCR检测五组小鼠内膜组织均可见HIF-1α、VEGFA和Bcl-2mRNA的表达，但与对照组进行对比分析发现模型组中的表达明显减少(差异具有统计学意义，均为P＜0.001)，而经过本发明的中药组合物灌胃治疗后，低、中和高剂量治疗组均可见HIF-1α、VEGFA和Bcl-2mRNA的表达随浓度升高而有增加趋势，且均显著高于模型组的表达(差异均有统计学意义，均为P＜0.001)。qPCR实验结果见图20。
7、ELISA法检测血清E2、LH水平
ELISA检测五组血清均可见E2、LH的表达，但与对照组进行对比分析发现模型组中的表达明显减少(差异具有统计学意义，均为P＜0.001)，而经过本发明的中药组合物灌胃治疗后，低、中和高剂量治疗组可见E2、LH水平随浓度升高而有增加趋势，且高于模型组(除E2低剂量组外，差异均有统计学意义，分别为P＜0.001和P＜0.001，以及P＜0.01、P＜0.001和P＜0.001)，但仍低于对照组。实验结果见图21。
8、小结
动物实验表明本发明的中药组合物通过调控薄型子宫内膜缺氧诱导血管生成和凋亡改善薄型子宫内膜，提高性激素水平，提高子宫内膜容受性。①术后观察子宫形态，造模后子宫出现损伤、缺血甚至粘连表现；治疗后子宫呈现恢复趋势。②取材日子宫称重比较，对照组子宫湿重显著高于模型组(P＜0.001)，经过本发明的中药组合物治疗后子宫湿重较模型组均有显著提高(分别为P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001)，并随着低、中、和高剂量的变化呈现递增趋势。③HE染色观察子宫内膜经过本发明的中药组合物治疗后有所改善，模型组子宫损伤明显。模型组子宫内膜厚度和腺体数量明显低于对照组(分别为P＜0.001和P＜0.01)，各治疗组子宫内膜厚度及腺体数量恢复明显优于模型组，且均有差异(分别为P＜0.05、P＜0.01和P＜0.05，以及P＜0.05、P＜0.01和P＜0.05)。④IHC、IF实验检测子宫组织HIF-1α、VEGFA表达定位，HIF-1α主要定位在上皮细胞胞浆，在有氧环境下极易降解；腺上皮及血管内皮细胞的胞浆中多见VEGFA表达，少数散在分布于周围间质细胞。IOD值比较各组表达水平，模型组HIF-1α及VEGFA表达均明显低于对照组(分别为P＜0.05和P＜0.01)；通过IHC检测，高剂量组HIF-1α表达显著高于模型组(P＜0.01)，低和中剂量组表达与模型组差异不明显(P＞0.05)；低剂量和高剂量组VEGFA表达明显高于模型组(P＜0.05)，中剂量组差异不明显(P＞0.05)。通过IF比较本发明的中药组合物治疗后，低、中和高剂量组HIF-1α的表达均明显高于模型组(均为P＜0.001)；VEGFA的表达比模型组也均有不同程度的增加(分别为P＜0.05、P＜0.001和P＜0.001)。⑤WB法检测子宫组织HIF-1α、VEGFA和Bcl-2的表达，与对照组进行灰度值对比分析发现模型组中的表达明显减少(均为P＜0.001)，而经过本发明的中药组合物治疗后，低、中和高剂量治疗组中HIF-1α、VEGFA和Bcl-2的表达均明显高于模型组(分别为P＜0.001、P＜0.001和P＜0.001，P＜0.01、P＜0.001和P＜0.001，以及P＜0.05、P＜0.001和P＜0.001)，但与浓度增加关系不明显。qPCR检测模型组较对照组表达明显减少(均为P＜0.001)，本发明的中药组合物治疗后可见HIF-1α、VEGFA和Bcl-2mRNA的表达随浓度升高而有增加趋势，且均显著高于模型组的表达(均为P＜0.001)。⑥ELISA法检测C57BL/6小鼠血清E2、LH水平，模型组相比对照组明显呈现低水平(均为P＜0.001)，而经过本发明的中药组合物治疗后，治疗组可见E2、LH水平随浓度升高而有增加趋势，且高于模型组(除E2低浓度组外，差异均有统计学意义，分别为P＜0.001和P＜0.001，以及P＜0.01、P＜0.001和P＜0.001)。

Claims (10)

1.一种中药组合物，其特征在于，以重量份数计，所述中药组合物包括以下中药原料：生黄芪15-21份、当归9-15份、丹参15-21份、女贞子9-15份、桑葚子9-15份、菟丝子15-21份、淫羊藿12-18份、鹿角霜15-21份、山楂6-12份、续断9-15份和杜仲9-15份。
2.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，以重量份数计，所述中药组合物包括以下中药原料：生黄芪18份、当归12份、丹参18份、女贞子12份、桑葚子12份、菟丝子18份、淫羊藿15份、鹿角霜18份、山楂9份、续断12份和杜仲12份。
3.如权利要求1或2所述的中药组合物，其特征在于，以重量份数计，所述中药组合物由所述中药原料组成。
4.一种如权利要求1-3中任一项所述的中药组合物在制备治疗薄型子宫内膜的药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物为口服制剂例如片剂、胶囊剂、汤剂、合剂、丸剂、颗粒剂、口服液或糖浆剂。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的口服制剂为颗粒剂。
7.如权利要求4-6中任一项所述的应用，其特征在于，所述的薄型子宫内膜界定为：患者在自然周期或使用Gn的刺激周期，当由经阴道B超测得至少有1个直径＞18mm的成熟卵泡发育到排卵时子宫内膜厚度＜7mm；或在无排卵周期，除符合自然周期或使用Gn的刺激周期的条件外，还包含使用外源性雌激素刺激持续作用时间＞14天、血清E2水平＞200pg/mL和子宫内膜厚度仍＜7mm。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述患者为年龄≤40岁、有排卵且排卵日子宫内膜厚度为5-7mm者；优选地，所述患者为符合肾虚血瘀证诊断标准和超声监测排卵正常者。
9.一种药物制剂，其特征在于，所述的药物制剂包含如权利要求1-3中任一项所述的中药组合物，以及药学上可接受的辅料。
10.如权利要求9所述的药物制剂，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括乳化剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、调味剂、着色剂和助溶剂中的至少一种。
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