CN116716395A - 一种自引物扩增串联Cas12a和[Cu(tz)]的新型生物传感平台的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及一种自引物扩增串联Cas12a和[Cu(tz)]的新型生物传感平台的制备方法，包括如下步骤：（1）合成荧光探针各个组分，将发卡探针Hp1、Hp2、Hp3水溶液于95℃水浴反应5分钟，然后自然冷却至室温；（2）制备荧光探针：将步骤（1）所得的发卡探针水溶液与目标物、Klenow fragment片段、Nt.BbvCI切刻内切酶反应后得到SDA扩增产物，加入挂锁探针PP1、PP2、PP3，T4 DNA连接酶，反应后再加入phi29 DNA聚合酶得到RCA扩增产物，再分管加入相应的crRNA、信号探针以及Cas12a；最后加入[Cu(tz)]纳米片；（3）根据荧光强度对相应目标物的浓度绘制标准曲线；（4）根据标准曲线，获得待测待测样本中let‑7a、miR‑30e、miR‑21的浓度，完成对待测人唾液样本中三种脑损伤相关miRNAs的定量检测。

Description

一种自引物扩增串联Cas12a和[Cu(tz)]的新型生物传感平台 的制备方法
技术领域
本发明属核酸扩增、荧光传感技术和生物分析检测领域，具体涉及一种基于自引物指数扩增Cas12a串联反应和[Cu(tz)]纳米片的新型生物传感平台的制备方法。
背景技术
头部损伤是一个全球普遍存在的问题，特别是在儿童和青少年中，他们在大脑发育过程中可能更容易受到长期后遗症的影响。脑震荡是轻度创伤性脑损伤(mTBI)的一种症状，影响了估计20％的青少年。不幸的是，由于传统的评估方法(如认知测试和症状量表)的症状延迟发作和主观性强，mTBI存在漏诊和漏报的问题。因此，建立一种客观、快速、准确的mTBI诊断方法具有重要意义。已经提出了几种mTBI的客观诊断技术，如血液生物标志物、电生理学、神经影像学等，但这些技术并不完善，缺乏客观性。例如，血蛋白和血脂指标的波动常被用来识别颅内出血的风险，但大多数mTBI并不会引起颅内出血。此外，血液生物标志物易降解且难以穿过血脑屏障，因此难以准确测定血液生物标志物。另一方面，电生理学和神经成像需要昂贵的设备和熟练的专家。因此，现有的这些技术都不利于mTBI的快速诊断，尤其是医学领域的即时检测。
MicroRNA(miRNA)是一种单链非编码小分子，在基因沉默和基因转录调控中起着重要作用。越来越多的研究表明，唾液miRNAs在mTBI中的表达水平存在显著差异，由于唾液可以无创获取，唾液miRNAs有望成为快速便捷诊断mTBI的理想生物标志物。然而，由于miRNAs长度短且同源性高，因此检测和区分miRNAs具有挑战性。常用的miRNAs分析技术包括逆转录聚合酶链反应、分子印迹、微阵列和下一代测序。这些方法虽然简单有效，但由于miRNAs含量较少，无法满足快速、廉价、准确诊断mTBI的要求。为了获得更好的分析性能，信号放大策略被广泛引入，如链迁移扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、杂交链式反应(HCR)和催化发夹自组装(CHA)。其中，SDA和RCA以其指数放大能力得到了广泛应用。但是，由于不能直接检测到核酸的识别，单纯的信号放大策略是不够的。有必要开发一种新的技术来传递目标识别事件，使其易于观察和确定。
规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)阵列和CRISPR相关(Cas)蛋白组成了CRISPR-Cas系统。该系统源于微生物适应性免疫系统，可以防止外源基因的攻击，并含有多种功能蛋白。其中，CRISPR-Cas12a系统利用CRISPR RNA(crRNA)特异性识别靶DNA，选择性切割外源核酸。更具体地说，Cas12a蛋白可以被与crRNA互补的单链或双链DNA(ssDNA或dsDNA)激活，并不加区分地切割系统中存在的ssDNA。基于这一特性，Cas12a蛋白可通过裂解淬灭基团和荧光基团双标记的ssDNA报告探针使得荧光恢复，转化靶标识别事件。此外，Cas12a蛋白由于其极高的酶转化率，在分子诊断中具有极好的敏感性和特异性，可以进行指数级信号放大。目前，基于CRISPR-Cas12a的检测方法已经能够检测多种生物标志物，包括蛋白质、病毒和小分子。然而，由于传统淬灭器的淬灭效率有限，这些传感器往往具有相对较高的荧光背景信号。
近年来，纳米材料因其出色的信号转导特性逐渐被应用于CRISPR-Cas检测系统中。铜(I)1,2,4-三氮酸盐配位聚合物([Cu(tz)])纳米片是在表面活性剂的辅助下合成的一种新型无孔超薄纳米片，可以通过π-π堆叠相互作用吸附DNA。在CRISPR-Cas12a检测系统中使用纳米片代替传统淬灭剂，通过荧光共振能量转移(FRET)猝灭多种荧光染料的荧光，显著降低了背景信号，实现了多目标检测。
因此，我们首创了自引物指数扩增Cas12a串联反应(SP-ExACT)，这是一种结合SDA、RCA和CRISPR的检测平台，用于检测三种mTBI相关的miRNAs。将SDA的引物和模板序列预先整合到在同一发夹DNA结构中，目标序列可诱导形成更稳定的发夹，触发分子内SDA反应，而得到的大量ssDNA产物可用于引发后续的RCA反应。通过RCA反应，生成具有重复的与crRNA序列互补的极长ssDNA用于激活Cas12a，从而对荧光基团标记的ssDNA进行任意切割。由于荧光基团标记的长ssDNA可以被[Cu(tz切割荧光基团标记的ssDNA，并且由于[Cu(tz)]纳米片对短核苷酸的弱吸附，FRET效应减弱，)]纳米片吸附，并通过FRET淬灭其荧光。而当目标物存在时，激活的Cas12a将不加区分地使得荧光基团的特征性荧光不能被有效淬灭，从而实现对目标物的超高灵敏度分析。SP-ExACT系统首次尝试开发基于[Cu(tz)]纳米片和CRISPR-Cas12a系统的mTBI相关miRNAs检测平台，并引入SDA和RCA策略成功实现指数级信号放大。本发明显著提高了mTBI相关miRNAs检测的灵敏度，利用纳米材料实现了多重检测，同时减少了非特异性背景信号。此外，多重检测mTBI相关miRNAs可显著减少假阳性/阴性诊断，从而极大地丰富了mTBI基础科学和临床诊断应用的分析工具。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种基于自引物指数扩增Cas12a串联反应和[Cu(tz)]纳米片的新型生物传感平台的制备方法，具有灵敏度高、选择性好、检测简便的优点，可应用于人唾液样本中三种脑损伤相关miRNAs的区分检测。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
第一方面，本发明保护一种区分定量检测三种脑损伤相关miRNAs的荧光探针，包括：发卡探针Hp1、Hp2、Hp3；挂锁探针PP1、PP2、PP3；crRNA-1、crRNA-2、crRNA-3；信号探针FAM-DNA、TAMRA-DNA、信号探针Quasar 670-DNA；所述信号探针的5’端分别被不同的荧光基团修饰，具体不做限定，只要能够保证不同的荧光团区分目标检测物即可。
其中，所述三种脑损伤相关miRNAs为let-7a、miR-30e和miR-21。
其中，
Hp1：
AACTATACAACCTACTACCTCATAATCACGGCTGAGGGACTAATGAGGTAGTAGGTATCC TCAGC，如SEQ ID NO：1所示；
Hp2：
CTTCCAGTCAAGGATGTTTACATAATCACGGCTGAGGGACTAATGTAAACATCCTTATCC TCAGC，如SEQ ID NO：2所示；
Hp3：
TCAACATCAGTCTGATAAGCTATAATCACGGCTGAGGGACTAATAGCTTATCAGACATCC TCAGC，如SEQ ID NO：3所示；
crRNA-1：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAUCGUUACGCUAACUAUGA，如SEQ ID NO：4所示；
crRNA-2：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGUUGCCGUACCGAUCGACC，如SEQ ID NO：5所示；
crRNA-3：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCCUGCUUAGUGAUUUCAGA，如SEQ ID NO：6所示；
PP1：
Phosphate-CTACTACCTCAGATCGTTACGCTAACTATGAGGAAAAGGGGAGAACTATACAA C，如SEQ ID NO：7所示；
PP2：
Phosphate-CTACTACCTCAGATCGTTACGCTAACTATGAGGAAAAGGGGAGAACTATACAA C，如SEQ ID NO：8所示；
PP3：
Phosphate-GGATGTTTACAAGTTGCCGTACCGATCGACCGGAAAAGGGGAGCTTCCAGTC AA，如SEQ ID NO：9所示；
FAM-DNA：FAM-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，如SEQ ID NO：10所示；
TAMRA-DNA：TAMRA-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，如SEQ ID NO：11所示；
Quasar 670-DNA：Quasar 670-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，如SEQ ID NO：12所示。
第二方面，本发明还保护前文所述的荧光探针，在如下任一所述中的应用：
(1)制备区分定量检测多种脑损伤相关miRNAs的产品；
(2)区分定量检测多种脑损伤相关miRNAs。
其中，所述多种脑损伤相关miRNAs为let-7a、miR-30e和miR-21。
第三方面，本发明还保护一种区分定量检测多种脑损伤相关miRNAs的试剂和/或试剂盒，含有前文所述的荧光探针。
第四方面，本发明还保护前文所述的试剂和/或试剂盒在区分定量检测多种脑损伤相关miRNAs中的应用，所述多种脑损伤相关miRNAs为let-7a、miR-30e和miR-21。
第五方面，本发明还保护一种基于自引物指数扩增Cas12a串联反应和[Cu(tz)]纳米片的新型生物传感平台的制备方法，包括如下步骤：
(1)首先针对目标miRNAs设计荧光探针，如发卡探针、挂锁探针、crRNA和信号探针，根据设计的荧光探针，制备荧光探针各组分，将发卡探针水溶液(1μM)于95℃水浴反应5分钟，然后自然冷却至室温；
(2)[Cu(tz)]纳米片的制备：将0.1mmol五水硫酸铜和0.5mmol抗坏血酸溶解于水中，加入氢氧化钠得到氧化亚铜纳米粒，水洗分离后分散于水中；将1mmol 1,2,4-三氮唑、聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸溶解于水中，再加入上述氧化亚铜纳米粒分散液，10℃冰浴1小时，得到[Cu(tz)]纳米片；
(3)信号扩增：将步骤(1)所得的发卡探针水溶液和与目标miRNA反应后，加入Klenow Fragment片段、Nt.BbvCI切刻内切酶、反应底物dNTPs进行SDA扩增；反应和再加入挂锁探针水溶液、T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶、反应底物dNTPs得到RCA扩增产物；之后加入相应的crRNA、信号探针以及Cas12a；最后，加入[Cu(tz)]纳米片；
(4)根据荧光强度对相应目标物的浓度绘制标准曲线；
(5)将待测样品按照步骤(3)操作，根据标准曲线，获得待测样本中目标miRNA的浓度，完成对待测人唾液中脑损伤相关miRNAs的定量检测。
在具体的实施方案中，所述目标miRNA为let-7a、miR-30e、miR-21中的一种或多种。
在具体的实施方案中，当目标miRNA为let-7a、miR-30e和miR-21时，所述生物传感平台的制备方法，包括如下步骤：
(1)首先针对目标miRNA设计荧光探针，如发卡探针、挂锁探针、crRNA和信号探针，根据设计的荧光探针，制备荧光探针各组分，将发卡探针水溶液(1μM)于95℃水浴反应5分钟，然后自然冷却至室温。
其中，let-7a组发卡探针Hp1如SEQ ID NO：1所示；挂锁探针PP1如SEQ ID NO：7所示；crRNA-1如SEQ ID NO：4所示；信号探针FAM-DNA如SEQ ID NO：10所示；
其中，miR-30e组发卡探针Hp2如SEQ ID NO：2所示；挂锁探针PP2如SEQ ID NO：8所示；crRNA-2如SEQ ID NO：4所示；信号探针TAMRA-DNA如SEQ ID NO：11所示；
其中，miR-21组发卡探针Hp3如SEQ ID NO：3所示；挂锁探针PP3如SEQ ID NO：9所示；crRNA-3如SEQ ID NO：6所示；信号探针Quasar 670-DNA如SEQ ID NO：12所示。
(2)[Cu(tz)]纳米片的制备：将0.1mmol五水硫酸铜和0.5mmol抗坏血酸溶解于水中，加入氢氧化钠得到氧化亚铜纳米粒，水洗分离后分散于水中。将1mmol 1,2,4-三氮唑、聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸溶解于水中，再加入上述氧化亚铜纳米粒分散液，10℃冰浴1小时，得到[Cu(tz)]纳米片。
(3)信号扩增：将步骤(1)所得的发卡探针Hp1、Hp2、Hp3水溶液和与目标物反应后，。加入Klenow Fragment片段、Nt.BbvCI切刻内切酶、反应底物dNTPs进行SDA扩增；反应和再加入挂锁探针PP1、PP2、PP3水溶液、T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶、反应底物dNTPs得到RCA扩增产物；之后分管加入相应的crRNA、信号探针以及Cas12a；最后，加入[Cu(tz)]纳米片。
随着相应目标物的加入，520nm处荧光随着目标物let-7a浓度逐渐增加而逐渐增强，580nm处荧光随着目标物miR-30e浓度逐渐增加而逐渐增强，670nm处荧光随着目标物miR-21浓度逐渐增加而逐渐增强。
(4)根据荧光强度对相应目标物的浓度绘制标准曲线；根据520nm处荧光强度对let-7a的浓度绘制标准曲线，根据580nm处荧光强度对miR-30e的浓度绘制标准曲线，根据670nm处荧光强度对miR-21的浓度绘制标准曲线。
(5)将待测样品按照步骤(2)操作，根据标准曲线，获得待测待测样本中let-7a、miR-30e、miR-21的浓度，完成对待测人唾液中三种脑损伤相关miRNAs的定量检测。
具体的，通过动物miRNA提取试剂盒提取人唾液中的miRNAs，将获得的提取液按照步骤(3)操作，根据520nm处荧光强度对唾液let-7a浓度绘制标准曲线，根据580nm处荧光强度对唾液miR-30e浓度绘制标准曲线，根据670nm处荧光强度对唾液miR-21浓度绘制标准曲线，完成对人唾液中三种脑损伤相关miRNAs的定量检测。
在更具体的实施方案中，目标let-7a组所用Hp1的浓度为0-5pM且大于0；KlenowFragment片段的浓度为0-5U且大于0、Nt.BbvCI切刻内切酶的浓度为0-10U且大于0；PP1的浓度为0-10nM且大于0；T4 DNA连接酶的浓度为0-10U且大于0；phi29 DNA聚合酶的浓度为0-10U且大于0；Cas12a的浓度为0-30nM且大于0；crRNA1的浓度为0-30nM且大于0。
在更具体的实施方案中，目标miR-30e组所用Hp2的浓度为0-5pM且大于0；KlenowFragment片段的浓度为0-5U且大于0、Nt.BbvCI切刻内切酶的浓度为0-10U且大于0；PP2的浓度为0-10nM且大于0；T4 DNA连接酶的浓度为0-10U且大于0；phi29 DNA聚合酶的浓度为0-10U且大于0；Cas12a的浓度为0-30nM且大于0；crRNA2的浓度为0-30nM且大于0。
在更具体的实施方案中，目标miR-21组所用Hp3的浓度为0-5pM且大于0；KlenowFragment片段的浓度为0-5U且大于0、Nt.BbvCI切刻内切酶的浓度为0-10U且大于0；PP3的浓度为0-10nM且大于0；T4 DNA连接酶的浓度为0-10U且大于0；phi29 DNA聚合酶的浓度为0-10U且大于0；Cas12a的浓度为0-30nM且大于0；crRNA3的浓度为0-30nM且大于0。
第六方面，本发明还保护前文所述的一种基于自引物指数扩增Cas12a串联反应和[Cu(tz)]纳米片的新型生物传感平台的制备方法制备得到的传感平台。
第七方面，本发明还保护前文所述的传感平台在区分检测三种脑损伤相关miRNAs中的应用。
在具体的实施方案中，所述脑损伤相关miRNAs为let-7a、miR-30e和/或miR-21。
本发明区分检测三种脑损伤相关miRNAs的原理是：
首先，我们根据let-7a的序列，设计了发卡探针Hp1。双功能整合发卡Hp1具有目标识别区和一半的Nt.BbvCI识别区，可以结合目标并引起多重SDA。与使用分离引物和模板的传统SDA相比，该设计将它们整合为一体，显著提高了反应效率。在5’末端暴露的单链片段被设计为let-7a识别的立足点。引入let-7a后，通过其与Hp1暴露的目标识别区域的精确杂交打开茎。因此，3’端Nt.BbvCI识别区与原环序列的一部分杂交将产生另一个发夹结构。此外，该片段甚至作为引物与Klenow Fragment片段引发分子内定向聚合。因此，靶序列可以被释放和循环利用。同时，Nt.BbvCI由于形成完整的识别位点而产生间隙，随后发生多轮聚合和链位移。这样，在靶标回收的同时，通过SDA可以同时生成多个与靶标序列相同的ssDNA，信号被极大地放大。得到的ssDNA连同let-7a序列作为引物用于后续的RCA反应。挂锁DNA探针PP1含有与靶let-7a互补的序列，通过T4 DNA连接酶形成环状DNA模板。然后在phi29DNA聚合酶存在下启动原位RCA反应。Cas12a激活子的互补序列也被设计在PP1上，这样RCA就可以扩增出具有重复的激活子序列的长ssDNA，与crRNA1结合，从而触发Cas12a的反式切割活性。此时，系统中FAM标记的ssDNA被不加区分地切割。加入[Cu(tz)]纳米片后，由于[Cu(tz)]纳米片对短链的吸附能力较弱，与完整的FAM-DNA相比，断裂的FAM-DNA与[Cu(tz)]纳米片之间的距离增加。FRET效应减弱，FAM的绿色荧光恢复。实现高灵敏的let-7a定量分析。
类似的，我们根据miR-30e、miR-21序列，设计发卡探针Hp2、Hp3、挂锁探针PP2、PP3、crRNA2、crRNA3。在miR-30e、miR-21存在的情况下，激活Cas12a后释放TAMRA、Quasar670的荧光，实现高灵敏miR-30e、miR-21定量分析。最后，根据520nm处荧光强度对let-7a的浓度进行定量检测，根据580nm处荧光强度对miR-30e的浓度进行定量检测，根据670nm处荧光强度对miR-21的浓度进行定量检测。
本发明所述DNA是指：脱氧核糖核苷酸。
有益效果
本发明利用CRISPR-Cas12a系统的反式裂解活性，结合信号放大技术链迁移扩增和滚环扩增，并利用[Cu(tz)]纳米片代替传统淬灭剂，构建了一种用于区分定量检测人唾液中三种脑损伤相关miRNAs的荧光探针。与传统的检测方法相比，不仅具有选择性好、检测简便的优点，还可降低不期望的背景信号，并且减少实际检测中假阳性或假阴性的出现。
附图说明
图1是实施例3中let-7a组分反应体系各成分浓度优化图，其中：
图1A是实施例3中Hp1浓度优化图；图1B是实施例3中SDA反应时间优化图；图1C是实施例3中phi29 DNA聚合酶浓度优化图；图1D是实施例3中RCA反应时间优化图；图1E是实施例3中Cas12a浓度优化图；图1F是实施例3中crRNA1浓度优化图。
图2是实施例4中miR-30e组分反应体系各成分浓度优化图，其中：
图2A是实施例4中Hp2浓度优化图；图2B是实施例4中SDA反应时间优化图；图2C是实施例4中phi29 DNA聚合酶浓度优化图；图2D是实施例4中RCA反应时间优化图；图2E是实施例4中Cas12a浓度优化图；图2F是实施例4中crRNA2浓度优化图。
图3是实施例5中miR-21组分反应体系各成分浓度优化图，其中：
图3A是实施例5中Hp3浓度优化图；图3B是实施例5中SDA反应时间优化图；图3C是实施例6中phi29 DNA聚合酶浓度优化图；图3D是实施例5中RCA反应时间优化图；图3E是实施例5中Cas12a浓度优化图；图3F是实施例5中crRNA3浓度优化图。
图4是实施例6中三种脑损伤相关miRNAs与荧光探针的相关图，其中：
图4A是实施例6中let-7a浓度与荧光探针的荧光强度变化荧光图；图4B是实施例6中let-7a浓度与荧光探针荧光强度的相关图；图4C是实施例6中miR-30e浓度与荧光探针的荧光强度变化荧光图；图4D是实施例6中miR-30e浓度与荧光探针荧光强度的相关图；图4E是实施例6中miR-21浓度与荧光探针的荧光强度变化荧光图；图4F是实施例6中miR-21浓度与荧光探针荧光强度的相关图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
Klenow Fragment片段、Nt.BbvCI切刻内切酶、T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶、dNTPs混合物、EnGen Lba Cas12a(Cpf1)、NEBuffer 2缓冲液、T4 DNA连接酶缓冲液、phi29DNA聚合酶缓冲液(NEB(北京)有限公司)；寡核苷酸(生工生物工程(上海)股份有限公司)。
当目标miRNA为let-7a、miR-30e和miR-21时，基于自引物指数扩增Cas12a串联反应和[Cu(tz)]纳米片的新型生物传感平台的制备方法，包括如下步骤：
(1)首先针对目标miRNA设计荧光探针，如发卡探针、挂锁探针、crRNA和信号探针，根据设计的荧光探针，制备荧光探针各组分，将发卡探针水溶液(1μM)于95℃水浴反应5分钟，然后自然冷却至室温。
其中，let-7a组发卡探针Hp1如SEQ ID NO：1所示；挂锁探针PP1如SEQ ID NO：7所示；crRNA-1如SEQ ID NO：4所示；信号探针FAM-DNA如SEQ ID NO：10所示；
其中，miR-30e组发卡探针Hp2如SEQ ID NO：2所示；挂锁探针PP2如SEQ ID NO：8所示；crRNA-2如SEQ ID NO：4所示；信号探针TAMRA-DNA如SEQ ID NO：11所示；
其中，miR-21组发卡探针Hp3如SEQ ID NO：3所示；挂锁探针PP3如SEQ ID NO：9所示；crRNA-3如SEQ ID NO：6所示；信号探针Quasar 670-DNA如SEQ ID NO：12所示。
(2)[Cu(tz)]纳米片的制备：将0.1mmol五水硫酸铜和0.5mmol抗坏血酸溶解于水中，加入氢氧化钠得到氧化亚铜纳米粒，水洗分离后分散于水中。将1mmol 1,2,4-三氮唑、聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸溶解于水中，再加入上述氧化亚铜纳米粒分散液，10℃冰浴1小时，得到[Cu(tz)]纳米片。
(3)信号扩增：将步骤(1)所得的发卡探针Hp1、Hp2、Hp3水溶液和与目标物反应后，。加入Klenow Fragment片段、Nt.BbvCI切刻内切酶、反应底物dNTPs进行SDA扩增；反应和再加入挂锁探针PP1、PP2、PP3水溶液、T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶、反应底物dNTPs得到RCA扩增产物；之后分管加入相应的crRNA、信号探针以及Cas12a；最后，加入[Cu(tz)]纳米片。
随着相应目标物的加入，520nm处荧光随着目标物let-7a浓度逐渐增加而逐渐增强，580nm处荧光随着目标物miR-30e浓度逐渐增加而逐渐增强，670nm处荧光随着目标物miR-21浓度逐渐增加而逐渐增强。
(4)根据荧光强度对相应目标物的浓度绘制标准曲线；根据520nm处荧光强度对let-7a的浓度绘制标准曲线，根据580nm处荧光强度对miR-30e的浓度绘制标准曲线，根据670nm处荧光强度对miR-21的浓度绘制标准曲线。
(5)通过动物miRNA提取试剂盒提取人唾液中的miRNAs，将获得的提取液按照步骤(3)操作，根据520nm处荧光强度对唾液let-7a浓度绘制标准曲线，根据580nm处荧光强度对唾液miR-30e浓度绘制标准曲线，根据670nm处荧光强度对唾液miR-21浓度绘制标准曲线，完成对人唾液中三种脑损伤相关miRNAs的定量检测。
下文举例说明本发明优选的技术方案，但本发明不限于此。
实施例1荧光探针组分的设计和制备
针对目标miRNA序列设计荧光探针，如发卡探针、挂锁探针、crRNA和信号探针。其中，let-7a组发卡探针Hp1如SEQ ID NO：1所示；挂锁探针PP1如SEQ ID NO：7所示；crRNA-1如SEQ ID NO：4所示；信号探针FAM-DNA如SEQ ID NO：10所示；
其中，miR-30e组发卡探针Hp2如SEQ ID NO：2所示；挂锁探针PP2如SEQ ID NO：8所示；crRNA-2如SEQ ID NO：4所示；信号探针TAMRA-DNA如SEQ ID NO：11所示；
其中，miR-21组发卡探针Hp3如SEQ ID NO：3所示；挂锁探针PP3如SEQ ID NO：9所示；crRNA-3如SEQ ID NO：6所示；信号探针Quasar 670-DNA如SEQ ID NO：12所示。
DNA链的具体合成交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例2[Cu(tz)]纳米片的制备
将0.1mmol五水硫酸铜和0.5mmol抗坏血酸溶解于水中，加入氢氧化钠得到氧化亚铜纳米粒，水洗分离后分散于水中。将1mmol 1,2,4-三氮唑、300mg聚乙烯吡咯烷酮、10mg抗坏血酸溶解于水中，再加入上述氧化亚铜纳米粒分散液，10℃冰浴1小时，得到[Cu(tz)]纳米片。
实施例3考察let-7a反应体系中各成分浓度对目标物响应的影响实验，步骤如下:
将let-7a(10pM)、Hp1(0、1、2、3、4、5pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育40min，加入PP1(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29 DNA聚合酶(4U)。孵育2h后，在上述体系中加入Cas12a(1nM)、crRNA1(1nM)、FAM-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定520nm处FAM的荧光强度。考察Hp1的浓度对目标物响应的影响实验，结果如图1A所示，随着Hp1浓度增大，荧光信倍比逐渐增大然后再减小。
将let-7a(10pM)、Hp1(2pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育(20、30、40、50、60min)，加入PP1(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29 DNA聚合酶(4U)。孵育2h后，在上述体系中加入Cas12a(1nM)、crRNA1(1nM)、FAM-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定520nm处FAM的荧光强度。考察SDA反应时间对目标物响应的影响实验，结果如图1B所示，随着SDA反应时间延长，荧光信倍比逐渐增大然后再减小。
将let-7a(10pM)、Hp1(2pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育40min，加入PP1(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29DNA聚合酶(0、1、2、3、4、5U)。孵育2h后，在上述体系中加入Cas12a(1nM)、crRNA1(1nM)、FAM-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定520nm处FAM的荧光强度。考察phi29 DNA聚合酶的浓度对目标物响应的影响实验，结果如图1C所示，随着phi29 DNA聚合酶浓度增大，FAM荧光强度逐渐增大然后趋于稳定。
将let-7a(10pM)、Hp1(2pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育40min，加入PP1(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29DNA聚合酶(4U)。孵育0.5、1、1.5、2、2.5、3h后，在上述体系中加入Cas12a(1nM)、crRNA1(1nM)、FAM-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定520nm处FAM的荧光强度。考察RCA聚合时间对目标物响应的影响实验，结果如图1D所示，随着RCA反应时间延长，FAM荧光强度逐渐增大然后趋于稳定。
将let-7a(10pM)、Hp1(2pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育40min，加入PP1(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29DNA聚合酶(4U)。孵育2h后，在上述体系中加入Cas12a(0、0.5、1、1.5、2、2.5nM)、crRNA1(1nM)、FAM-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定520nm处FAM的荧光强度。考察Cas12a的浓度对目标物响应的影响实验，结果如图1E所示，随着Cas12a浓度增大，FAM荧光强度逐渐增大然后趋于稳定。
将let-7a(10pM)、Hp1(2pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育40min，加入PP1(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29DNA聚合酶(4U)。孵育2h后，在上述体系中加入Cas12a(1nM)、crRNA1(0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5nM)、FAM-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定520nm处FAM的荧光强度。考察crRNA1的浓度对目标物响应的影响实验，结果如图1F所示，随着crRNA1浓度增大，FAM荧光强度逐渐增大然后趋于稳定。
实施例4考察miR-30e反应体系中各成分浓度对目标物响应的影响实验，步骤如下:
将miR-30e(10pM)、Hp2(0、1、2、3、4、5pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育40min，加入PP2(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29 DNA聚合酶(3U)。孵育2.5h后，在上述体系中加入Cas12a(1.4nM)、crRNA2(1nM)、TAMRA-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定580nm处TAMRA的荧光强度。考察Hp2的浓度对目标物响应的影响实验，结果如图2A所示，随着Hp2浓度增大，荧光信倍比逐渐增大然后再减小。
将miR-30e(10pM)、Hp2(2pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育(20、30、40、50、60min)，加入PP2(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29 DNA聚合酶(3U)。孵育2.5h后，在上述体系中加入Cas12a(1.4nM)、crRNA2(1nM)、TAMRA-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定580nm处TAMRA的荧光强度。考察SDA反应时间对目标物响应的影响实验，结果如图2B所示，随着SDA反应时间延长，荧光信倍比逐渐增大然后再减小。
将miR-30e(10pM)、Hp2(2pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育40min，加入PP2(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29DNA聚合酶(0、1、2、3、4、5U)。孵育2.5h后，在上述体系中加入Cas12a(1.4nM)、crRNA2(1nM)、TAMRA-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定580nm处TAMRA的荧光强度。考察phi29 DNA聚合酶的浓度对目标物响应的影响实验，结果如图2C所示，随着phi29 DNA聚合酶浓度增大，TAMRA荧光强度逐渐增大然后趋于稳定。
将miR-30e(10pM)、Hp2(2pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育40min，加入PP2(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29DNA聚合酶(3U)。孵育0.5、1、1.5、2、2.5、3h后，在上述体系中加入Cas12a(1.4nM)、crRNA2(1nM)、TAMRA-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定580nm处TAMRA的荧光强度。考察RCA聚合时间对目标物响应的影响实验，结果如图2D所示，随着RCA反应时间延长，TAMRA荧光强度逐渐增大然后趋于稳定。
将miR-30e(10pM)、Hp2(2pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育40min，加入PP2(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29DNA聚合酶(3U)。孵育2.5h后，在上述体系中加入Cas12a(0、0.2、0.6、1、1.4、2、3nM)、crRNA1(1nM)、TAMRA-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定580nm处TAMRA的荧光强度。考察Cas12a的浓度对目标物响应的影响实验，结果如图2E所示，随着Cas12a浓度增大，TAMRA荧光强度逐渐增大然后趋于稳定。
将miR-30e(10pM)、Hp2(2pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育40min，加入PP2(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29DNA聚合酶(3U)。孵育2.5h后，在上述体系中加入Cas12a(1nM)、crRNA2(0、0.2、0.6、1、1.4、2、3nM)、TAMRA-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定580nm处TAMRA的荧光强度。考察crRNA2的浓度对目标物响应的影响实验，结果如图2F所示，随着crRNA2浓度增大，TAMRA荧光强度逐渐增大然后趋于稳定。
实施例5考察miR-21反应体系中各成分浓度对目标物响应的影响实验，步骤如下:
将miR-21(10pM)、Hp2(0、1、2、3、4、5pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育50min，加入PP3(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29 DNA聚合酶(4U)。孵育2.5h后，在上述体系中加入Cas12a(2nM)、crRNA3(1.4nM)、Quasar 670-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定670nm处Quasar 670的荧光强度。考察Hp3的浓度对目标物响应的影响实验，结果如图3A所示，随着Hp3浓度增大，荧光信倍比逐渐增大然后再减小。
将miR-21(10pM)、Hp3(2pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育(20、30、40、50、60min)，加入PP3(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29 DNA聚合酶(4U)。孵育2.5h后，在上述体系中加入Cas12a(2nM)、crRNA3(1.4nM)、Quasar 670-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定670nm处Quasar 670的荧光强度。考察SDA反应时间对目标物响应的影响实验，结果如图3B所示，随着SDA反应时间的延长，荧光信倍比逐渐增大然后再减小。
将miR-21(10pM)、Hp3(2pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育50min，加入PP3(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29DNA聚合酶(0、1、2、3、4、5U)。孵育2.5h后，在上述体系中加入Cas12a(2nM)、crRNA3(1.4nM)、Quasar 670-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定670nm处Quasar 670的荧光强度。考察phi29 DNA聚合酶的浓度对目标物响应的影响实验，结果如图3C所示，随着phi29 DNA聚合酶浓度增大，Quasar 670荧光强度逐渐增大然后趋于稳定。
将miR-21(10pM)、Hp3(2pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育50min，加入PP3(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29DNA聚合酶(4U)。孵育0.5、1、1.5、2、2.5、3h后，在上述体系中加入Cas12a(2nM)、crRNA3(1.4nM)、Quasar 670-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定670nm处Quasar 670的荧光强度。考察RCA聚合时间对目标物响应的影响实验，结果如图3D所示，随着RCA反应时间延长，Quasar 670荧光强度逐渐增大然后趋于稳定。
将miR-21(10pM)、Hp3(2pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育50min，加入PP3(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29DNA聚合酶(4U)。孵育2.5h后，在上述体系中加入Cas12a(0、0.2、0.6、1、1.4、2、3nM)、crRNA3(1.4nM)、Quasar 670-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定670nm处Quasar 670的荧光强度。考察Cas12a的浓度对目标物响应的影响实验，结果如图3E所示，随着Cas12a浓度增大，Quasar 670荧光强度逐渐增大然后趋于稳定。
将miR-21(10pM)、Hp3(2pM)、Klenow Fragment片段与Nt.BbvCI于NEBuffer 2缓冲液中孵育50min，加入PP3(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29DNA聚合酶(4U)。孵育2.5h后，在上述体系中加入Cas12a(2nM)、crRNA3(0、0.2、0.6、1、1.4、2、3nM)、Quasar 670-DNA(100nM)孵育1h，最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h，测定670nm处Quasar 670的荧光强度。考察crRNA2的浓度对目标物响应的影响实验，结果如图3F所示，随着crRNA2浓度增大，Quasar 670荧光强度逐渐增大然后趋于稳定。
实施例6对3种脑损伤相关miRNAs的区分定量检测，步骤如下：
将let-7a、miR-30e、miR-21与Hp1(2pM)、Hp2(2pM)、Hp3(2pM)、Klenow fragment、Nt.BbvCI、dNTPs(0.02mM)于、NEBuffer 2缓冲溶液中孵育40min，加入PP1(5nM)、PP2(5nM)、PP3(5nM)、T4 DNA连接酶及其缓冲体系，于37℃反应1h后加入phi29 DNA聚合酶(4U)。孵育1h后，在上述体系中加入Cas12a(20nM)、激活链-1(30nM)、信号探针-T(30nM)孵育2.5h。分管加入Cas12a(1nM),crRNA1(crRNA2 or crRNA3)(1nM)，FAM-DNA(TAMRA-DNA or Quasar670-DNA)(100nM)37℃孵育1h。最后加入0.24mg mL-1[Cu(tz)]纳米片孵育0.5h。测定520nm处FAM的荧光强度。所得荧光图如图4A所示，随着let-7a浓度增大，520nm处荧光逐渐增强。荧光强度与let-7a浓度的相关性如图4B所示，随着let-7a浓度增大，荧光强度逐渐增强，在0.0125-1pM范围内，let-7a浓度与荧光强度呈线性相关。测定580nm处TAMRA的荧光强度。所得荧光图如图4C所示，随着miR-30e浓度增大，580nm处荧光逐渐增强，荧光强度与miR-30e浓度的相关性如图4D所示，随着miR-30e浓度增大，荧光强度逐渐增强，在0.0125-1pM范围内，miR-30e浓度与荧光强度呈线性相关。测定580nm处Quasar 670的荧光强度。所得荧光图如图4E所示，随着miR-21浓度增大，670nm处荧光逐渐增强。荧光强度与miR-21浓度的相关性如图4F所示，随着miR-21浓度增大，荧光强度逐渐增强，在0.0125-1pM范围内，miR-21浓度与荧光强度呈线性相关。
实施例7实际人唾液样本中3种脑损伤相关miRNAs的区分定量检测，步骤如下：
通过动物miRNA提取试剂盒提取人唾液样本中的miRNAs。然后，通过标准加入法，在提取液中加入不同浓度的miRNAs，按照三种脑损伤相关miRNAs检测步骤进行分析。根据标准曲线计算得到人唾液样本中三种脑损伤相关miRNAs的含量，其回收率结果如表1所示。
表1是实施例5中人唾液样本中3种脑损伤相关miRNAs检测的回收率结果，如表所示，回收率均在90％到109％之间，a代表let-7a，b代表miR-30e，c代表miR-21(n＝3)，说明复杂基质对检测不产生明显干扰，该方法具有良好的选择性，能用于实际样品的测定。
表1
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种区分定量检测三种脑损伤相关miRNAs的荧光探针，其特征在于，包括：发卡探针Hp1、Hp2、Hp3；挂锁探针PP1、PP2、PP3；crRNA-1、crRNA-2、crRNA-3；信号探针FAM-DNA、TAMRA-DNA、Quasar 670-DNA；所述信号探针的5’端分别被不同的荧光基团修饰；
所述三种脑损伤相关miRNAs为let-7a、miR-30e和miR-21。
2.根据权利要求1所述的一种区分定量检测三种脑损伤相关miRNAs的荧光探针，其特征在于，
Hp1：AACTATACAACCTACTACCTCATAATCACGGCTGAGGGACTAATGAGGTAGTAGGTATCCTCAGC，如SEQ ID NO：1所示；
Hp2：CTTCCAGTCAAGGATGTTTACATAATCACGGCTGAGGGACTAATGTAAACATCCTTATCCTCAGC，如SEQ ID NO：2所示；
Hp3：TCAACATCAGTCTGATAAGCTATAATCACGGCTGAGGGACTAATAGCTTATCAGACATCCTCAGC，如SEQ ID NO：3所示；
crRNA-1：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAUCGUUACGCUAACUAUGA，如SEQ ID NO：4所示；
crRNA-2：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAGUUGCCGUACCGAUCGACC，如SEQ ID NO：5所示；
crRNA-3：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCCUGCUUAGUGAUUUCAGA，如SEQ ID NO：6所示；
PP1：Phosphate-CTACTACCTCAGATCGTTACGCTAACTATGAGGAAAAGGGGAGAACTATACAAC，如SEQ ID NO：7所示；
PP2：Phosphate-CTACTACCTCAGATCGTTACGCTAACTATGAGGAAAAGGGGAGAACTATACAAC，如SEQ ID NO：8所示；
PP3：Phosphate-GGATGTTTACAAGTTGCCGTACCGATCGACCGGAAAAGGGGAGCTTCCAGTCAA，如SEQ ID NO：9所示；
FAM-DNA：FAM-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，如SEQ ID NO：10所示；
TAMRA-DNA：TAMRA-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，如SEQ ID NO：11所示；
Quasar 670-DNA：Quasar 670-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT，如SEQ ID NO：12所示。
3.权利要求1或2所述的荧光探针，在如下任一所述中的应用：
（1）制备区分定量检测多种脑损伤相关miRNAs的产品；
（2）区分定量检测多种脑损伤相关miRNAs。
4.一种区分定量检测多种脑损伤相关miRNAs的试剂和/或试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的荧光探针。
5.权利要求4所述的试剂和/试剂盒在区分定量检测多种脑损伤相关miRNAs中的应用。
6.一种基于自引物指数扩增Cas12a串联反应和[Cu(tz)]纳米片的新型生物传感平台的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备权利要求1或2所述的荧光探针各个组分，将Hp1、Hp2、Hp3水溶液于95℃水浴反应5分钟，然后自然冷却至室温；
（2）[Cu(tz)]纳米片的制备：将五水硫酸铜和抗坏血酸溶解于水中，加入氢氧化钠得到氧化亚铜纳米粒，水洗分离后分散于水中；将1,2,4-三氮唑、聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸溶解于水中，再加入上述氧化亚铜纳米粒分散液，10℃冰浴1小时，得到[Cu(tz)]纳米片；
（3）信号扩增：将步骤（1）所得的发卡探针Hp1、Hp2、Hp3水溶液与目标物反应后，加入Klenow Fragment片段、Nt.BbvCI切刻内切酶、反应底物dNTPs进行SDA扩增；再加入挂锁探针PP1、PP2、PP3水溶液、T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶、反应底物dNTPs得到RCA扩增产物；之后分管加入相应的crRNA、信号探针以及Cas12a；最后，加入[Cu(tz)]纳米片；
（3）根据荧光强度对相应目标物的浓度绘制标准曲线；根据520 nm处荧光强度对let-7a的浓度绘制标准曲线，根据580 nm处荧光强度对miR-30e的浓度绘制标准曲线，根据670nm处荧光强度对miR-21的浓度绘制标准曲线；
（4）将待测样品按照步骤（3）操作，根据标准曲线，获得待测样本中三种脑损伤相关miRNAs的浓度，完成对待测人唾液样本中三种脑损伤相关miRNAs的定量检测。
7.根据权利要求6所述的一种基于自引物指数扩增Cas12a串联反应和[Cu(tz)]纳米片的新型生物传感平台的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
目标物let-7a组所用Hp1的浓度为0-5 pM且大于0；Klenow Fragment片段的浓度为0-5U且大于0；Nt.BbvCI切刻内切酶的浓度为0-10 U且大于0；PP1的浓度为0-10 nM且大于0；T4DNA连接酶的浓度为0-10 U且大于0；phi29 DNA聚合酶的浓度为0-10 U且大于0；Cas12a的浓度为0-30 nM且大于0；crRNA1的浓度为0-30 nM且大于0。
8.根据权利要求6所述的一种基于自引物指数扩增Cas12a串联反应和[Cu(tz)]纳米片的新型生物传感平台的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
目标物miR-30e组所用Hp2的浓度为0-5 pM且大于0；Klenow Fragment片段的浓度为0-5 U且大于0、Nt.BbvCI切刻内切酶的浓度为0-10 U且大于0；PP2的浓度为0-10 nM且大于0；T4 DNA连接酶的浓度为0-10 U且大于0；phi29 DNA聚合酶的浓度为0-10 U且大于0；Cas12a的浓度为0-30 nM且大于0；crRNA2的浓度为0-30 nM且大于0；
优选的，目标物miR-21组所用Hp3的浓度为0-5 pM且大于0；Klenow Fragment片段的浓度为0-5 U且大于0、Nt.BbvCI切刻内切酶的浓度为0-10 U且大于0；PP3的浓度为0-10 nM且大于0；T4 DNA连接酶的浓度为0-10 U且大于0；phi29 DNA聚合酶的浓度为0-10 U且大于0；Cas12a的浓度为0-30 nM且大于0；crRNA3的浓度为0-30 nM且大于0。
9.权利要求6-8任一所述的制备方法制备得到的传感平台。
10.权利要求9所述的传感平台在区分定量三种脑损伤相关miRNAs中的应用。
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