CN116716368A - 一种提升黏着剑菌发酵生产vb12生物合成速率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提升黏着剑菌发酵生产VB12生物合成速率的方法,属于生物发酵领域。该方法包括在黏着剑菌发酵期间补加葡萄糖酸钠或者葡萄糖酸钠和葡萄糖的混合组分的步骤。本发明在黏着剑菌摇瓶分批发酵培养过程中,以5g/L补加模式分批多次补加累计总量为15g/L葡萄糖酸钠,能有效促进黏着剑菌合成维生素B12,糖转化率提高20.2%;在发酵罐连续补料分批发酵实验条件下,当补料碳源中葡萄糖和葡萄糖酸钠添加比例为16:1时效果最好,VB12生物合成量高达331.3±5.6mg/L,转化效率能达到1.53±0.13mg/g,该方法能够稳定产物的合成速率,大幅度降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵领域,特别是涉及一种提升黏着剑菌发酵生产VB12生物合成速率的方法。
背景技术
维生素B12(VB12)是结构最复杂的天然维生素之一,在DNA合成、脂肪酸合成、氨基酸代谢和能量产生等各种生化过程中起着重要的辅助作用,VB12已被广泛应用于食品和医药领域。自从1973年Eschenmoser首次完成了维生素B12的全化学合成以来,针对维生素生物合成的化学法和维生素法的研究在世界范围内持续发展。微生物发酵相较于化学合成,具有成本可控,可借助菌株扩大培养的优势,被广泛用于化学品的生产,从小有机酸到大蛋白质,包括生物制药、生物化学品和生物燃料。目前,应用在工业上发酵生产维生素B12的菌株主要是黏着剑菌(曾命名脱氮假单胞菌),费氏丙酸杆菌,或中华根瘤菌。目前,这些菌株有几方面限制因素,如发酵周期长,氧传质效率低,缺乏适合菌株工程的遗传系统。多年来,研究人员通过建立用于VB12高产菌株筛选的高通量筛选方法、利用代谢组学技术分析培养基成分、利用基因工程手段提高维生素B12合成表达等策略提高维生素B12产量。虽然VB12产量比野生型有所提高,但VB12生产普遍存在原料消耗高、底物转化率低和发酵过程VB12合成速率低的现实问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种提升黏着剑菌发酵生产VB12生物合成速率的方法,以解决上述现有技术存在的问题,本发明采用在黏着剑菌生物合成VB12过程中,在发酵次级代谢产物合成期通过分批或流加补料分批发酵过程中一次性或分批补加一定浓度的葡萄糖酸钠,能够显著提升VB12生物合成速率,大幅度降低生产成本。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种提升黏着剑菌发酵生产VB12生物合成速率的方法,包括在黏着剑菌发酵期间补加葡萄糖酸钠的步骤;或者,包括在黏着剑菌发酵期间补加含有葡萄糖酸钠和葡萄糖的混合组分的步骤。
进一步地,在黏着剑菌发酵期间补加葡萄糖酸钠的步骤具体为:将黏着剑菌接种至发酵培养基进行摇瓶发酵培养,待发酵稳定后,一次性或者多次分批补加葡萄糖酸钠;所述多次分批补加的方式为:每次补加葡萄糖酸钠3-5g/L,补加3-5次。
进一步地,每次补加葡萄糖酸钠5g/L,补加3次。
进一步地,所述葡萄糖酸钠的补加总量为15g/L。
进一步地,在黏着剑菌发酵期间补加含有葡萄糖酸钠和葡萄糖的混合组分的步骤具体为:将黏着剑菌接种至发酵培养基进行发酵罐发酵培养,之后连续流加含有葡萄糖酸钠和葡萄糖的混合组分,控制发酵液残留总糖浓度维持在30-50g/L。
进一步地,所述葡萄糖酸钠和葡萄糖的质量比为1:25-1:10。
进一步地,所述葡萄糖酸钠和葡萄糖的质量比为1:16。
进一步地,所述含有葡萄糖酸钠和葡萄糖的混合组分包含以下组分:葡萄糖550g/L,葡萄糖酸钠22-55g/L,氯化钴0.60g/L和DMBI 0.60g/L。
进一步地,所述发酵培养基包含以下组分:蔗糖100g/L,玉米浆55g/L,硫酸铵2.0g/L,硫酸镁1.16g/L,氧化镁0.58g/L,硫酸锌0.09g/L,磷酸二氢钾0.88g/L,尿素1.0g/L,磷酸氢二铵0.58g/L,甘油磷酸2.64g/L,氯化铁0.7g/L,甜菜碱20.9g/L,DMBI 0.058g/L,氯化钴0.086g/L和碳酸钙1.16g/L,pH 7.2~7.4。
本发明公开了以下技术效果:
本发明采用在黏着剑菌(Ensifer adhaerens)生物合成维生素B12(VB12)过程中,在发酵次级代谢产物合成期,通过分批或流加补料分批发酵过程中一次性或分批补加一定浓度的葡萄糖酸钠能够显著提升VB12生物合成速率。在摇瓶分批培养过程中,以5g/L补加模式下分批多次补加累计添加量为15g/L葡萄糖酸钠,能有效促进黏着剑菌合成维生素B12,糖转化率提高20.2%。在发酵罐连续补料分批发酵实验条件下,当补料碳源中葡萄糖和葡萄糖酸钠添加比例为16:1时效果最好,VB12生物合成量高达331.3±5.6mg/L,转化效率能达到1.53±0.13mg/g,比纯葡萄糖实验组提升了30.1%,该混合碳源的连续流加工艺能够稳定产物的合成速率,大幅度降低生产成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为初始添加葡萄糖酸钠对Ensifer adhaerens发酵过程的影响;从左到右依次为pH、OD值影响结果;
图2为葡萄糖酸钠对Ensifer adhaerens稳定发酵过程pH的影响;
图3为葡萄糖酸钠对Ensifer adhaerens稳定发酵过程OD的影响;
图4为葡萄糖酸钠对Ensifer adhaerens维生素B12合成的影响;从左到右依次为维生素B12合成量和单位菌体产量;
图5为葡萄糖酸钠对Ensifer adhaerens发酵过程耗糖速率的影响;
图6为葡萄糖酸钠补加模式对Ensifer adhaerens菌体生长的影响;
图7为葡萄糖酸钠补加速率对Ensifer adhaerens维生素B12合成的影响;从左到右依次为维生素B12合成量和单位菌体产量;
图8葡萄糖酸钠补加速率对Ensifer adhaerens耗糖速率的影响;
图9为50L发酵罐中添加葡萄糖酸钠对黏着剑菌VB12发酵的影响,从左到右依次为氧消耗速率(OUR)和二氧化碳释放速率(CER);
图10为50L发酵罐中添加葡萄糖酸钠对黏着剑菌发酵的影响,从左到右依次为pH、OD值影响结果;
图11为50L发酵罐中添加葡萄糖酸钠对黏着剑菌VB12发酵的影响,从左到右依次为氨基氮和VB12产量。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值,以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1
1 实验方法
1.1实验菌种
黏着剑菌(Ensifer adhaerens),购自美国典型培养物保藏中心(ATCC),菌种名称ATCC 21921。
1.2培养基设计
平板:甜菜糖蜜80g,硫酸镁1.5g,硫酸锌0.02g,硫酸锰0.2g,硫酸铵0.7g,磷酸氢二铵2.3g,六水合氯化钴0.02g,DMBI 0.009g,蔗糖18g,琼脂20g;pH 7.2~7.4。
一级种子培养基(L-1):甜菜糖蜜114.28g,蔗糖25.72g,硫酸镁2.14g,氯化钴0.028g,DMBI 0.014g,硫酸锌0.028g,硫酸锰0.28g,硫酸铵1.0g,磷酸氢二铵3.28g,消泡剂1.42g;pH 7.2~7.4。
二级种子培养基(L-1):甜菜糖蜜83g,蔗糖20.8g,硫酸铵2.3g,硫酸镁1.5g,硫酸锰0.156g,硫酸锌0.02g,磷酸氢二铵0.7g,碳酸钙2.95g,甜菜碱4.2g,DMBI 0.004g,氯化钴0.02g,消泡剂0.15g;pH 7.2~7.4。
发酵培养基(L-1):蔗糖100g,玉米浆55g,硫酸铵2.0g,硫酸镁1.16g,氧化镁0.58g,硫酸锌0.09g,磷酸二氢钾0.88g,尿素1.0g,磷酸氢二铵0.58g,甘油磷酸2.64g,氯化铁0.7g,甜菜碱20.9g,DMBI 0.058g,氯化钴0.086g,碳酸钙1.16g;pH 7.2~7.4。
碳源补料培养基A(补料A,g/L):葡萄糖550,葡萄糖酸钠22-55,氯化钴0.60,DMBI0.60。
前体补料培养基B(补料B,g/L):甜菜碱250g/L,氯化钴2.5,DMBI 2.5,氨水调pH至6.0。
1.3方案设计与工艺控制
实验具体方案:
1)摇瓶发酵培养:选用500mL发酵摇瓶,发酵培养基装液量50mL,将黏着剑菌菌种活化后以接种量10%接种。保证发酵液中残留总糖浓度维持在40-50g/L,从72小时开始每天用补料B补加甜菜碱量为1.1g/L,每24h取样,测量pH,OD,总糖,发酵120-168h。
2)50L发酵罐培养:分别利用一级和二级种子培养基配方在500mL和15L发酵罐中逐级培养脱氮假单胞菌种子,二级种子长好后(光密度OD700达到10-14),按照接种量10%接种到装有25L发酵培养基的50L发酵罐中,32℃、转速350转/分钟、通气比1vvm进行发酵培养。发酵过程中通过流加补料A控制发酵液残留总糖浓度维持在30-50g/L,通过补加补料B维持甜菜碱浓度在3-5g/L,发酵214h。
2摇瓶发酵培养条件优化和结果分析
2.1不同初始葡萄糖酸钠浓度对生长的影响
在初始发酵培养基中,分别以0%,5%,10%,15%的质量浓度梯度的葡萄糖酸钠部分替代发酵培养基底糖中的蔗糖进行发酵实验,对应发酵培养基中葡萄糖酸钠的浓度分别为0g/L,5g/L,10g/L,15g/L,替代同用量的蔗糖。发酵实验结果(图1)显示,随着初始培养基中葡萄糖酸钠底物浓度的增加,黏着剑菌的生长速率受到一定的抑制,发酵结束时菌浓明显低于对照未添加组。
发酵168h,VB12的产量结果如表1所示,初始添加葡萄糖酸钠对VB12发酵液含量无明显促进作用。但当初始葡萄糖酸钠5g/L的添加量时,单位菌体VB12合成最高量达到了2.80mg/g。
表1初始添加葡萄糖酸钠组生长以及合成参数
2.2菌体生长进入稳定期一次性补加工艺对合成的影响
通过在发酵过程48h菌体生长进入稳定期,一次性补加葡萄糖酸钠浓度为0g/L、10g/L、15g/L、25g/L,探究葡萄糖酸钠对黏着剑菌发酵过程中菌体生长、耗糖速率、产物合成的影响。
2.2.1葡萄糖酸钠添加对发酵过程pH的影响
图2是不同葡萄糖酸钠补加浓度下pH变化情况,48h前,由于未开始进行葡萄糖酸钠的补料,4组在pH变化和值上基本保持一致。48h后,随着不同浓度葡萄糖酸钠的补加,发酵液的pH变化上出现明显差异,葡萄糖酸钠补加组pH高于对照组,且随着葡萄糖酸钠浓度越高,发酵液pH越高,当一次性补加25g/L时,pH升高达到了8.0左右,对黏着剑菌的生长呈现了一定抑制。
2.2.2葡萄糖酸钠添加对发酵过程OD的影响
从图3上可以看出,在菌体生长转入稳定期后,随着葡萄糖酸钠的一次性添加,当添加量大于15g/L时,黏着剑菌的生长受到了抑制,但补加量10g/L与15g/L时,黏着剑菌的生长几乎不受葡萄糖酸钠的抑制。
2.2.3葡萄糖酸钠添加对维生素B12合成的影响
发酵过程VB12产量变化曲线显示(图4),48h补加葡萄糖酸钠后,VB12合成速率开始呈现明显差异,葡萄糖酸钠能够显著促进VB12的合成。其中补加15g/L的葡萄糖酸钠VB12的合成速率最高,并且维持合成时间较长,最终发酵产量最高达到了116mg/L,比对照组高出了21%。单位菌体的VB12合成量显示,15g/L的葡萄糖酸钠添加量条件下,单位菌体产量最高达到了2.11mg/g,比不添加的对照组提升了25%。因此,在进入发酵过程菌体生长转向稳定期补加合适的葡萄糖酸钠能有效促进黏着剑菌合成维生素B12。
2.2.4葡萄糖酸钠添加对过程糖耗速率的影响
补加葡萄糖酸钠前,各组的糖耗速率基本保持一致,而在48h一次性补加葡萄糖酸钠浓度为10g/L、15g/L、25g/L条件下,实验组的糖耗速率均下降且低于对照组,统计结果显示,发酵168h,对照组糖转化率(Yp/s)达到了1.02±0.021mg/g,一次性葡萄糖酸钠添加15g/L时的糖转化率为1.13±0.031mg/g,比不添加的对照组提高12.7%(图5)。
2.3菌体生长进入稳定期葡萄糖酸钠分批多次补加模式对发酵的影响
为了进一步降低一次性葡萄糖酸钠添加对黏着剑菌生长的抑制,在摇瓶实验中,进一步考察了不同添加频率和添加量对发酵代谢的影响。发酵48h开始补加,分别设置每次的添加浓度分别为3g/L、5g/L、7.5g/L,在摇瓶培养48h后,1)分别在48、56、74、92、120h补加3g/L的葡萄糖酸钠,2)分别在48、78、108h补加5.0g/L的葡萄糖酸钠,3)分别在48、96h分别补加7.5g/L的葡萄糖酸钠,每种模式分别累计补加葡萄糖酸钠的总浓度为15g/L,考察葡萄糖酸钠添加模式对黏着剑菌生长和产物合成的影响。
2.3.1不同葡萄糖酸钠补加模式下菌体生长情况
从不同葡萄糖酸钠补加工艺下菌体的生长情况(图6)显示,当单次补加量不超过5g/L时,菌体的生长不受影响,但当单次补加浓度为7.5g/L的情况下,菌体的生长将会受到一定的抑制。因此,在发酵过程中采用分批流加的补加方式将可以消除发酵液中葡萄糖酸钠浓度高对菌体生长的抑制作用。
2.3.2不同葡萄糖酸钠补加模式下维生素B12合成
从效价曲线变化发现(图7),48-72时4组效价基本保持一致,且合成速率较为缓慢,合成中后期4组在效价上开始出现显著差异,单次补加3g/L以及5g/L组效价和比产量持续升高,至发酵结束均高于对照组,这表明低速率补加促进了黏着剑菌合成维生素B12。其中3g/L模式补加葡萄糖酸钠最有利于黏着剑菌合成维生素B12,单次补加7.5g/L组效价偏低,可能由于高pH下OD值降低,导致产物合成速率减慢。因此低速率补加葡萄糖酸钠能有效促进黏着剑菌合成维生素B12。
2.3.3不同葡萄糖酸钠补加模式下耗糖速率
补加葡萄糖酸钠前,各组糖耗速率基本保持一致。单次3g/L补加模式时耗糖速率在发酵过程中低于对照组,且效价高于对照组,表明以低速率持续补加葡萄糖酸钠,有利于菌体呼吸代谢以及产物合成的稳定。发酵中后期,菌体产物合成速率较快,实验组糖耗速率均低于对照组。本批摇瓶发酵周期为144h,至发酵结束,对照组糖转化率Yp/s为1.19±0.021mg/g,5g/L速率补加组Yp/s=1.43±0.017mg/g。以低速率补加葡萄糖酸钠相比对照组的糖转化率提高20.2%。
2.4发酵罐发酵过程中葡萄糖酸钠连续流加对发酵的影响
在50L发酵罐中进行连续流加补料分批发酵实验,当残留葡萄糖浓度低于3.5%时开始流加补料A,发酵过程中在碳源补料A中按照葡萄糖和葡萄糖酸钠的重量16:1的比例配成葡萄糖补料溶液,通过补加混合液控制残糖浓度,控制发酵液残留总糖浓度维持在30-50g/L,通过补加补料B维持甜菜碱浓度在3-5g/L。发酵过程中检测氧消耗速率(OUR)、二氧化碳释放速率(CER)、菌体浓度OD值、VB12产量等系列参数。发酵过程代谢变化见图9、图10和图11。
维持实验组与对照组相同的供氧条件,21h溶氧跌零,发酵液中的氧摄取速率接近于氧传递速率。葡萄糖酸钠添加组前期OUR与对照组基本一致,对应时间段菌体浓度几乎相同,表明葡萄糖酸钠的流加模式,没有出现菌体生长的限制作用。发酵后期葡萄糖酸钠添加组CER高于对照组,表明二氧化碳释放速率增多,在相同的菌体浓度下,葡萄糖酸钠有利于维持菌体呼吸代谢的稳定,延缓菌体的衰亡,使得产物合成时间延长。
葡萄糖酸钠添加组pH在发酵中后期维持在6.9-7.2范围内,氨氮浓度维持在40-70mg/L。氮源的主要功能是构成菌体细胞和含氮的代谢产物,前期氨基氮浓度的消耗为菌体生长代谢提供营养成分。葡萄糖酸钠添加组发酵中后期产物合成速率高于对照组,48hVB12产量出现差异。发酵后期氨氮消耗高于对照组,表明实验组持续进行菌体生长和产物合成代谢。至发酵结束,葡萄糖酸钠流加组VB12产量到达331.4mg/L,比对照组提高16%。
2.5不同葡萄糖和葡萄糖酸钠组分比例溶液连续流加对发酵的影响
发酵过程中,不同葡萄糖和葡萄糖酸钠重量比补料碳源溶液的发酵实验结果如表2所示,葡萄糖酸钠的添加对菌体生长的影响较小,随着葡萄糖酸钠添加比例的增加,进入产物快速合成期时,发酵过程pH呈现上升的趋势,菌体的呼吸代谢略有下降;但产物VB12的合成速率显著增强,所有添加组的发酵产量均高于纯葡萄糖补料批次,而且碳源底物转化率也明显高于纯葡萄糖实验组。当比例为16:1时效果最好,转化效率达到了1.53±0.13mg/g,比纯葡萄糖实验组提升了30.1%。该工艺能够大幅度降低生产成本。
表2葡萄糖和葡萄糖酸钠比例对发酵的影响
注:转化效率:按葡萄糖计(葡萄糖酸钠按照碳元素摩尔相同折算成葡萄糖),每克葡萄糖合成产物VB12的量。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种提升黏着剑菌发酵生产VB12生物合成速率的方法,其特征在于,包括在黏着剑菌发酵期间补加葡萄糖酸钠的步骤;或者,包括在黏着剑菌发酵期间补加含有葡萄糖酸钠和葡萄糖的混合组分的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在黏着剑菌发酵期间补加葡萄糖酸钠的步骤具体为:将黏着剑菌接种至发酵培养基进行摇瓶发酵培养,待发酵稳定后,一次性或者多次分批补加葡萄糖酸钠;所述多次分批补加的方式为:每次补加葡萄糖酸钠3-5g/L,补加3-5次。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,每次补加葡萄糖酸钠5g/L,补加3次。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述葡萄糖酸钠的补加总量为15g/L。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在黏着剑菌发酵期间补加含有葡萄糖酸钠和葡萄糖的混合组分的步骤具体为:将黏着剑菌接种至发酵培养基进行发酵罐发酵培养,之后连续流加含有葡萄糖酸钠和葡萄糖的混合组分,控制发酵液残留总糖浓度维持在30-50g/L。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述葡萄糖酸钠和葡萄糖的质量比为1:25-1:10。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述葡萄糖酸钠和葡萄糖的质量比为1:16。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述含有葡萄糖酸钠和葡萄糖的混合组分包含以下组分:葡萄糖550g/L,葡萄糖酸钠22-55g/L,氯化钴0.60g/L和DMBI 0.60g/L。
9.根据权利要求2或5所述的方法,其特征在于,所述发酵培养基包含以下组分:蔗糖100g/L,玉米浆55g/L,硫酸铵2.0g/L,硫酸镁1.16g/L,氧化镁0.58g/L,硫酸锌0.09g/L,磷酸二氢钾0.88g/L,尿素1.0g/L,磷酸氢二铵0.58g/L,甘油磷酸2.64g/L,氯化铁0.7g/L,甜菜碱20.9g/L,DMBI 0.058g/L,氯化钴0.086g/L和碳酸钙1.16g/L,pH 7.2~7.4。
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