CN116716212A - 一种防治柑橘酸腐病的萎缩芽孢杆菌sxygj-3、生物菌剂及应用 - Google Patents

一种防治柑橘酸腐病的萎缩芽孢杆菌sxygj-3、生物菌剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种防治柑橘酸腐病的萎缩芽孢杆菌SXYGJ‑3、生物菌剂及应用，该萎缩芽孢杆菌SXYGJ‑3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.26808。本发明的拮抗柑橘酸腐病菌的拮抗芽孢杆菌SXYGJ‑3菌株在防治柑橘酸腐病方面的作用极为显著，对柑橘酸腐病菌有很强的抑制作用，具有很好的防治柑橘酸腐病菌引起的植物病害的潜力。它作为柑橘种植区耕作土壤中菌为防治由柑橘酸腐病菌引起的植物病害提供了一条环保、简单、有效的途径，利于环境保护。

Description

一种防治柑橘酸腐病的萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3、生物菌剂及 应用
技术领域
本发明属于微生物学、生物技术和生物防治技术领域，具体涉及一种防治柑橘酸腐病的萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3、生物菌剂及应用。
背景技术
柑橘作为重要的园艺产品，因其种类繁多、营养丰富、具有医疗保健功效等特点，深受广大消费者的喜爱。柑橘主产国包括中国、巴西和美国等近40个国家，我国是柑橘的重要原产地之一，栽培历史超过年4000年，在湖南、江西、广西等省区广泛分布。柑橘产业已成为我国柑橘主产区农业经济的支柱产业之一，促进了当地农民增收和扩大居民就业，并为改善生态环境做出了贡献。但也应该看到我国柑橘生产存在品种成熟期和上市期过于集中、鲜食比例偏大等突出问题，与之相对应的是成熟期鲜果销售困难、果农经济收益减少、成熟期过后市场供应不足等现象，为延长供应期，满足柑橘生产淡季的市场需求，大量柑橘用于采后商品化处理和贮藏保鲜。在柑橘采收、贮藏到销售过程中由于病害常造成巨大损失。
柑橘酸腐病，其病原为白地霉Geotrichum citri-aurantii。柑橘酸腐病的田间症状主要表现为只危害果实，受侵部位出现水渍状斑点，病斑扩展至2cm左右时稍下陷，浅黄至深黄色，扩展迅速，短期即可导致全果腐烂，水渍状的病部呈软腐症状，外表皮易脱离，以手触之即破，发病后期病斑表面常覆盖白霜状霉层，略带皱褶，可流出汁液，酸味刺鼻，对柑橘类水果造成了严重危害。
目前，柑橘病害的防治仍以化学防治为主，长期使用化学农药不仅使植物病原菌产生抗药性，同时造成农药的残留，杀伤天敌，污染环境，威胁人类健康，破坏生态平衡。利用拮抗微生物防治植物病害对人畜无毒，不污染环境，无残留，能保持农产优良品质，对害虫天敌和有益生物安全，有助于保持生态平衡等优点。
从柑橘种植区耕作土壤分离筛选获得的对柑橘酸腐病菌有拮抗作用的生防菌株，对于柑橘酸腐病的防治具有非常重要的意义。目前，应用拮抗微生物防治植物病害已经有很多的报道，但能够有效防治柑橘酸腐病的拮抗萎缩芽孢杆菌在国内外鲜有报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一株对柑橘酸腐病有防效的萎缩芽孢杆菌，和以所述萎缩芽孢杆菌为活性成分的生物菌剂，该菌株对柑橘酸腐病菌有拮抗作用，能够用于防治柑橘酸腐病，对环境友好，无生态污染。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种防治柑橘酸腐病的萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2023年03月14日；保藏编号为：CGMCC No.26808；分类命名为：萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus。
优选的，所述萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
一种生物菌剂，其含有如上所述的萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3。
优选的，其由所述萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3经发酵而成。
如上所述的生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：将所述萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3首先接种于LB固体培养基活化，然后将活化后的防治柑橘酸腐病的萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3接种于LB液体培养基发酵培养，制成种子液，所述种子液再接种于LB液体发酵培养基中发酵培养，得到生物菌剂。
优选的，所述培养温度为25～30℃；所述种子液接种量为4～6％，所述种子液发酵培养时间为2～4d。
如上所述的防治柑橘酸腐病的萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3或如上所述的生物菌剂在抗柑橘酸腐病病原菌、或由柑橘酸腐病病原菌所导致的柑橘酸腐病中的应用。
优选的，所述病原菌为白地霉。
如上所述的应用方法，将包含所述萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3的生物菌剂，对柑橘果实病害部位进行喷洒。
优选的，所述生物菌剂的萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3的有效活菌数为1.0×106～1.0×108cfu/mL。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、本发明的拮抗柑橘酸腐病菌的拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株在防治柑橘酸腐病方面的作用极为显著，对柑橘酸腐病菌有很强的抑制作用，具有很好的防治柑橘酸腐病菌引起的植物病害的潜力。它作为柑橘种植区耕作土壤中菌为防治由柑橘酸腐病菌引起的植物病害提供了一条环保、简单、有效的途径，利于环境保护。
2、本发明解决了目前柑橘酸腐病的病害日趋严重的问题，作为一种微生物农药，可减少化学农药的污染问题，并减弱致病病菌的抗药性问题。
3、本发明筛选出的拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株具有巨大的经济价值，能够为农民带来更大的经济效益。
以下通过附图说明和具体实施例对本发明的技术方案进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株的形态特征；图1中a：SXYGJ-3菌株菌落；图1中b：SXYGJ-3菌株革兰氏染色。
图2为本发明拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株在PDA培养基上对柑橘酸腐病菌白地霉的拮抗效果，图2中a：受拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株影响的白地霉菌，图2中b：正常生长的白地霉菌。
图3为本发明拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株的系统进化树。
图4为本发明拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株在酪蛋白培养基上的透明水解圈。
图5为本发明拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株在淀粉培养基上的透明水解圈。
图6为本发明拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株在纤维素培养基上的透明水解圈。
图7为本发明拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3在柑橘果实上对柑橘酸腐病的防治效果；其中，从左到右依次为：SXYGJ-3菌剂、阳性药剂对照、阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下述实施例中的方法，无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例1
本实施例的拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3的分离筛选方法及其鉴定如下所述。其中本实施例的菌株采自浙江省湖州市长兴县虹星桥镇郑家村柑橘果园内耕作土壤中。
1、拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3的筛选，该筛选过程包括以下步骤：
1)将采集的柑橘种植区耕作土壤称取10g，加入装有90mL无菌水并放有玻璃珠的250mL锥形瓶中，80℃水浴30min，再充分振荡30min，10倍倍比稀释，用无菌涂布棒涂于LB培养基平板上，以无菌水为对照。纯化的细菌经革兰氏染色和芽孢染色，显示菌体呈杆状、产芽孢、G+的分离物为芽孢杆菌。将采用上述方法分离得到的芽孢杆菌编号，观察菌落形态，其中每1000mL LB培养基含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，pH 7.0～7.2。
2)将已培养7d的柑橘酸腐病病原真菌(申请人从浙江省湖州市长兴县虹星桥镇郑家村柑橘果园内发病植株分离、鉴定获得)用5mm打孔器打孔或者挑取少许菌丝，其中柑橘酸腐病菌菌饼的直径为5mm，将菌饼或者菌丝移到马铃薯琼脂培养基(PDA)中央，28℃培养24h后，在离真菌等距离的四周接上待测芽孢杆菌，放置于培养箱中，28℃恒温倒置对峙培养，每个对峙实验平行重复3次。按照式I)计算抑制率。
3)5d后观察并记录抑菌带的有无以及大小，选出对柑橘酸腐病菌具有最强抑制效果的1株菌株。
结果表明SXYGJ-3菌株的抑菌效果最好，抑菌带宽度最宽，抑菌带宽度达到19.5mm(如图2a)。
4)无菌操作从具有抑菌效果最明显的PDA平板上筛选出抑菌效果最明显(抑菌活性最强)的菌株进行纯化培养，获得一株对柑橘酸腐病菌具有强拮抗作用的菌株SXYGJ-3。
2、柑橘酸腐病菌拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株的鉴定
采用菌落形态观察、常规生理生化及分子生物学方法对SXYGJ-3菌株进行鉴定，鉴定出该菌株属于萎缩芽孢杆菌。
1)拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株在LB培养基(1000mL LB培养基含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，pH7.0～7.2)平板上呈乳白色，不透明，菌落光滑，近圆形，有褶皱，边缘完整。
2)萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3为好氧菌，通过显微镜观察表明拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌体大小约0.5～0.μm×1.5～2.5μm之间，呈杆状，无荚膜，有芽孢，芽孢呈椭圆形，周生鞭毛，能运动，革兰氏染色阳性(如图1a和图1b所示)。
3)生化实验结果表明，拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3具有运动性，好氧，V-P反应呈阳性，能液化明胶，能氧化葡萄糖、L-阿拉伯糖、甘露醇产酸，不能氧化D-木糖产酸，氧化葡萄糖但不产气，甲基红反应呈阳性，氧化酶反应呈阳性，接触酶反应呈阳性，能还原硝酸盐，水解淀粉和酪蛋白，能在0.5～10％的NaCl浓度的LB培养液(每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，pH 7.0～7.2)中生长。本实施例的拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株的生物学特性如表1所示。
表1拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株的基本生物学特性
革兰氏染色 + 接触酶 +
淀粉水解 + 甲基红反应 +
V-P测试 + 10％NaCl +
需氧性测定 + PH 5.7 +
葡萄糖 + 温度生长范围 15～45℃
阿拉伯糖 + 石蕊-牛奶 变红Red
酪氨酸水解 ﹣ 卵磷脂酶测定 +
形成吲哚 ﹣ 酪蛋白水解 +
甘露醇 + 硫化氢生成 +
柠檬酸利用 + 利用碳水化合物产酸 +
硝酸盐还原 + V-P反应后pH值 6.77～7.33
明胶 + L-阿拉伯糖 +
最适生长pH 7 最适生长温度 28℃
丙二酸盐利用 + 利用葡萄糖产气 ﹣
氧化酶试验 + pH生长范围 4～10
D-木糖产酸 ﹣
注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。
4)拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株的分子生物学鉴定
16S rDNA基因序列测定及其系统进化树的构建。提取细菌基因组DNA为模板，以7F(5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')和1540R(5'-AGGAGGTGAT CCAGCCGCA-3')(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)为上、下游引物扩增菌株的16S rDNA。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后送往该公司进行序列测定。测得该菌株的16S rDNA核苷酸序列长度为1459bp(如SEQ ID NO:1所示)，GenBank登录号为OQ345827。将该序列与GenBank中相关数据进行相似性分析，通过与NCBI中菌株的16S rDNA序列比对分析和系统发育树的构建(如图3所示)，可以发现：菌株SXYGJ-3与萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus(GenBank登录号为NR024689.1)聚类在同一大分支内(支持率100％)，说明该菌株与萎缩芽孢杆菌菌株相似性最高。
综合菌株的培养特征、形态和生理生化特征及16S rDNA序列分析结果，最终确定SXYGJ-3菌株为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus。
以上述拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3，微生物保藏号为CGMCC No.26808为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。
本发明萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3菌种通过下述培养基培养得到的培养物、发酵液或菌剂，用于抑制柑橘酸腐病病菌，柑橘离体防效防病实验通过施用拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌剂也具有很好的防治效果。
培养方法具体为：将萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3首先接种于LB固体培养基活化，然后将活化后的萎缩芽孢杆菌接种于LB液体培养基发酵培养，制成种子液，种子液再接种于LB液体培养基中发酵培养，得到生物菌剂。
优选的，培养温度为25～30℃；种子液接种量为4～6％，种子液发酵培养时间为2～4d。液体培养基为LB培养基。1000mL LB液体培养基含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0～7.2，固体培养基按1.5％添加琼脂。高压灭菌后备用。
进一步地，本实施例提供一种优选的培养方法，具体包括以下步骤：
将本发明的拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株先经过LB固体培养基活化，于28℃下培养36h，将经活化后的萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3菌株接种于LB液体培养基中于28℃下150r/min振荡培养24h，制成种子液，种子液按5％的接种量接入装有100mLLB液体培养基的250mL三角瓶中，150r/min振荡培养28℃下，进行恒温发酵培养，培养3d后的发酵液可用于拮抗葡萄灰霉病菌，所述的拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌剂为稀释至有效成分含量1.0×106～1.0×108cfu/mL后使用。
抑制柑橘酸腐病病菌是指抑制柑橘酸腐病菌的生长，拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株对柑橘酸腐病菌白地霉Geotrichum citri-aurantii的拮抗活性较好，抑菌带宽19.5mm，甚至培养10天后依然能保持较高的抑菌效果，拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌剂在柑橘离体接种柑橘酸腐病病原菌后预防防治效果为61.75％。
本发明的拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株的发酵液中及菌剂中含有对柑橘酸腐病菌有高效抑制作用的活性成分，表明拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株在发酵培养过程中产生了对柑橘酸腐病菌有抑制作用、致畸作用的代谢产物。
本发明的拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，在10～45℃、pH 4～10的范围内都具有拮抗柑橘酸腐病菌的能力。本发明的菌株来源于柑橘种植区耕作土壤，容易培养和保持，能拮抗柑橘酸腐病菌。
实施例2
本实施例的拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株对柑橘酸腐病菌的拮抗作用进行如下实验。
对峙培养试验：将直径为5mm的新鲜的柑橘酸腐病菌(申请人浙江省湖州市长兴县虹星桥镇郑家村柑橘果园内发病植株分离、鉴定获得)菌饼或者挑取少许菌丝置于PDA平板中央，28℃培养24h后，在离真菌等距离的四周接上待测拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株，对照组为不接种拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株；将PDA平板放入28℃培养箱中进行对峙培养，培养5d后，观察拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株的拮抗效果。
对峙培养试验结果发现：对照组柑橘酸腐病菌生长正常(如图2b)，处理组即本发明筛选得到的拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株对柑橘酸腐病菌有很强的拮抗作用(如图2a)，抑菌带宽度达到19.5mm，抑制率达到57.69％。
实施例3
将培养1d的拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株点接在纤维素培养基、酪蛋白培养基和淀粉培养基上，每皿接3株菌，30℃培养2～7d，以空白作对照，设3个重复；观察菌落周围有无透明圈产生，其中淀粉培养基在观察之前应滴加数滴碘液，纤维素酶活性的测定用1g/L的刚果红染10～15min，然后，倒掉染液，再用1mol/L的NaCl浸泡15min，检查透明圈的有无，培养过程中发现：拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株在蛋白酶培养基、淀粉酶培养基和纤维素酶培养基上都能正常生长而且菌落周围有明显的水解圈产生，从图4、图5和图6中明显观察到，表明拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株在生长代谢过程中分泌产生了蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶从而水解了培养基中的蛋白质、淀粉及纤维素，导致菌落周围出现透明降解圈，这表明拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3在抑制柑橘酸腐病病原菌生长、防治植物病害时产生了一系列酶类。
本实施例中，所述产蛋白酶培养基为酪蛋白培养基(1000mL)：脱脂奶粉20g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，琼脂16g，水1000mL，pH7.0。
本实施例中，所述产淀粉酶培养基为淀粉培养基(1000mL)：可溶性淀粉20g，蛋白胨10g，葡糖糖5g，NaCl 5g，牛肉膏5g，琼脂16g，水1000mL，pH 7.0。
本实施例中，所述产纤维素酶培养基为羧甲基纤维素培养基(1000mL)：CMC-Na5.0g，MgSO4·7H2O 0.1g，(NH4)2SO4 0.5g，K2HPO4 0.25g，琼脂16g，水l000mL。
实施例4
菌株SXYGJ-3对柑橘果实上柑橘酸腐病的防治效果:
病斑面积(mm2)＝病斑长度(mm)×病斑宽度(mm)×3.14/4
防治效果(％)＝(对照病斑面积-处理病斑面积)/对照病斑面积×100II)
选取大小均匀、无机械伤口的柑橘果实，品种为赣南脐橙，用75％乙醇擦拭柑橘果实进行消毒，晾干。用无菌手术刀划出3cm×3cm的伤口刻痕，待伤口晾干后接种实施例1中制备的SXYGJ-3菌剂(有效活菌数1.0×108cfu/mL)10μL，室温下(18～25℃)保湿培养使药剂充分吸收，24h后接种直径5mm的灰霉菌饼，25℃保湿培养，3～5d后统计各处理柑橘果实发病面积，并按照式II)计算防治效果。以50％多菌灵500倍液为阳性药剂对照，以无菌水为阴性对照，处理方法和用量同SXYGJ-3菌剂(表2)。每个处理5个果实，3次重复。
表2SXYGJ-3在柑橘果实上对柑橘酸腐病菌的防治效果
处理 病斑面积 防效(％)
空白对照 4710.01±6.72a -
WLKYSY-4菌剂 1801.56±5.43b 61.75±3.65b
多菌灵 1417.71±9.12c 69.90±8.43a
注：表中数据为平均值±标准差。同列数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著。
通过柑橘离体试验，进一步证明拮抗芽孢杆菌SXYGJ-3菌株对由白地霉Geotrichum citri-aurantii引起的柑橘酸腐病有较好的防治效果，作为微生物农药具有一定的开发应用前景。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种防治柑橘酸腐病的萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.26808。
2.如权利要求1所述的萎缩芽孢杆菌，其特征在于，所述萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种生物菌剂，其特征在于，其含有如权利要求1～2任一项所述的萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3。
4.如权利要求3所述的生物菌剂，其特征在于，其由所述萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3经发酵而成。
5.如权利要求3～4所述的生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3首先接种于LB固体培养基活化，然后将活化后的防治柑橘酸腐病的萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3接种于LB液体培养基发酵培养，制成种子液，所述种子液再接种于LB液体发酵培养基中发酵培养，得到生物菌剂。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述培养温度为25～30℃；所述种子液接种量为4～6％，所述种子液发酵培养时间为2～4d。
7.如权利要求1～2任一项所述的防治柑橘酸腐病的萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3或如权利要求3～4任一项所述的生物菌剂在抗柑橘酸腐病病原菌、或由柑橘酸腐病病原菌所导致的柑橘酸腐病中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述病原菌为白地霉。
9.如权利要求8所述的应用方法，其特征在于，将包含所述萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3的生物菌剂，对柑橘果实病害部位进行喷洒。
10.如权利要求9所述的应用方法，其特征在于，所述生物菌剂的萎缩芽孢杆菌SXYGJ-3的有效活菌数为1.0×106～1.0×10 8cfu/mL。
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