CN116711659B - 假交替单胞菌在促进珊瑚幼虫高产生物膜和诱导珊瑚幼虫附着生长中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了假交替单胞菌在促进珊瑚幼虫高产生物膜和诱导珊瑚幼虫附着生长中的应用。假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)SCSIO 43740具有高产生物膜活性，并可以高效诱导珊瑚幼虫的附着生长，24h内可诱导鹿角杯形珊瑚幼虫附着生长，附着率为23.75％；显著提高珊瑚幼虫的存活率(100％)。菌株高产生物膜和促附着生长的功能特性使其具有能够开发为微生物功能制剂的巨大潜力，用于珊瑚礁生态系统的保护与修复中，促进珊瑚礁生态系统的健康发育，提高珊瑚礁生态系统的稳定性。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及假交替单胞菌在促进珊瑚幼虫高产生物膜和诱导珊瑚幼虫附着生长中的应用。
背景技术
珊瑚礁生态系统具有极高的初级生产力和生物多样性，被誉为“海洋中的热带雨林”，能够为众多海洋生物提供了栖息地和食物源，在生物多样性保护、营养循环等方面发挥重要的作用。珊瑚礁还能够吸收大量二氧化碳，起到重要的碳汇作用，同时还能够保护海岸线免受风浪侵蚀。此外，珊瑚礁还可以通过渔业、旅游业和海岸线保护等途径在人类生产和生活中发挥着重要的作用，因此具有重要生态价值、经济和社会价值。然而由于受到全球气候变化和人类活动的影响，目前在全世界范围内珊瑚礁生态系统面临着退化的压力。据2020年发布的全球性珊瑚礁现状研究报告，在经历了1998年、2010年和2016年这三次有记录的大规模珊瑚白化事件之后，全球珊瑚礁生态系统平均石珊瑚覆盖率呈现逐年下降趋势。根据2018年公布的国际珊瑚礁监测网络(GCRMN)报告，全球珊瑚礁的平均石珊瑚覆盖率已下降至不到一半的水平，约为13.8％。与2006年相比，下降了大约30％。在全球珊瑚礁生态系统衰退的大背景下，我国造礁石珊瑚覆盖率也由于受到人类活动、气候变化和自然灾害等多种因素的综合影响，普遍处于下降趋势。
珊瑚礁生态系统的恢复主要包括主动恢复和被动恢复两种。目前主动恢复起始于20世纪60年代，主要方式是珊瑚移植。随着微生物学、分子生物学等技术的发展，多种技术开始被应用于辅助珊瑚礁的恢复，特别是微生物组学技术，其具体是指对单个微生物、微生物群落或其宿主进行实验操作主要通过以下方法来实现：对宿主微生物组进行人工选择、向宿主接种有益微生物、应用基因工程特定微生物菌株，或是将这些方法结合使用。该技术的主要理论依据是益生菌假说和珊瑚有益微生物(Beneficial Microorganisms forCorals，BMC)概念。通过微生物接种以促进珊瑚的生长、改善珊瑚宿主的免疫力、栖息地的微生境和营养状态，改善珊瑚的性能和适应性，促进珊瑚礁的恢复和提高其稳定。
珊瑚幼虫的附着生长是珊瑚礁生态系统幼体补充的重要前提，是珊瑚礁恢复的重要一环，其对珊瑚礁生态系统的健康发育具有重要的作用。然而，自然海区的珊瑚幼虫附着率较低。已有研究表明假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)广泛分布于包括极地以及深海等低营养、高盐和寒冷等各种海洋环境，其隶属于γ变形菌纲假交替单胞菌科，为革兰氏阴性菌。这类微生物能够分泌大量的胞外多糖(Exopoly Saccharides，EPS)，从而在一些生命或非生命物质表面形成微生物被膜，从而诱导海螺和贻贝等海洋生物幼虫的附着生长；其还具有较强的拮抗弧菌的能力，因此有助于珊瑚的健康生长。
因此，本专利旨在通过分离获得源于珊瑚礁生态系统的假交替单胞菌，为促进珊瑚幼虫生长附着提供可用的微生物资源，提高珊瑚幼虫附着的比例，推动珊瑚礁生态系统恢复。
发明内容
本发明的目的在于提供一株从中国海南省三亚鹿回头珊瑚礁区鹿角杯形珊瑚(Pocillopora damicornis)分离获得的具有高产生物膜和高效诱导珊瑚幼虫附着生长的假交替单胞菌SCSIO 43740。本发明中的假交替单胞菌SCSIO 43740，具有高产生物膜活性，在24和48h呈现出具有产生物膜的能力。通过是否能够在瓷砖、铁片、玻璃、聚乙烯塑料和聚丙烯塑料等多种材质上形成生物膜为研究对象，应用扫描电镜法对生物膜最适载体进行筛选，发现该菌在不同载体上都有较好的产膜能力。
本发明的第一个目的是提供假交替单胞菌SCSIO 43740在促进珊瑚幼虫高产生物膜、提高珊瑚幼虫存活率和/或诱导珊瑚幼虫附着生长中的应用。
优选，所述的珊瑚幼虫是鹿角杯型珊瑚幼虫。
优选，所述的假交替单胞菌SCSIO 43740是含有假交替单胞菌SCSIO 43740的微生物菌剂。
优选，假交替单胞菌SCSIO 43740在制备促进珊瑚幼虫高产生物膜、提高珊瑚幼虫存活率和/或诱导珊瑚幼虫附着生长的制剂中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种促进珊瑚幼虫高产生物膜、提高珊瑚幼虫存活率和/或诱导珊瑚幼虫附着生长的方法，其是将假交替单胞菌SCSIO 43740或含有它的微生物菌剂释放于珊瑚幼虫的培养体系中。
优选，所述的珊瑚幼虫是鹿角杯型珊瑚幼虫。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的假交替单胞菌SCSIO 43740是来源于海洋环境，从健康的鹿角杯形珊瑚中分离获得，其具有高产生物膜和促进珊瑚幼虫附着的功能，其24h生物膜产量为0.94，珊瑚幼虫附着率为23.75％±0.1，能够在铁片等多种材质载体上形成生物膜，因此具有应用于野外珊瑚礁生态系统环境中促进珊瑚幼虫附着生长的巨大潜能，可以有效提高受损珊瑚礁生态系统幼体补充量，促进珊瑚礁生态系统的恢复和可持续发展。
保藏说明
本发明的Pseudoalteromonas piscicida SCSIO 43740，于2022年4月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编为：430072，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022435，该菌株公开于专利申请号CN202210742392.3，发明名称为一株珊瑚来源产群体感应抑制剂的假交替单胞菌株SCSIO 43740及其应用的中国专利中。
附图说明
图1是假交替单胞菌Pseudoalteromonas piscicida SCSIO 43740菌株的固液生物膜形成速率。D1、D2、D3和D4分别表示24h、48h、72h和96h。
图2是假交替单胞菌Pseudoalteromonas piscicida SCSIO 43740菌株的固液生物膜结晶紫染色。a对照组(含培养基)，b菌株添加组(含培养基)，c对照组染色(弃液体培养物)，d菌株添加组染色(弃液体培养物)。
图3是假交替单胞菌Pseudoalteromonas piscicida SCSIO 43740菌株在无机材料上生物膜形成的情况。a瓷砖对照组，b铁片对照组，c瓷砖实验组，d铁片实验组。
图4是假交替单胞菌Pseudoalteromonas piscicida SCSIO 43740菌株在有机材料上生物膜形成的情况。a聚乙烯对照组，b玻璃对照组，c聚丙烯对照组，d聚乙烯实验组，e玻璃实验组，f聚丙烯实验组。
图5是假交替单胞菌Pseudoalteromonas piscicida SCSIO 43740菌株对珊瑚幼虫附着生长和存活率的影响(CK是对照组，bB12是假交替单胞菌Pseudoalteromonaspiscicida SCSIO 43740处理组)。
具体实施方式
以下是对本发明的内容结合实施案例进行进一步的阐述，但不是对本发明的限制。
以下实施例所述的2216E固体培养基的组成如下：5g蛋白胨，1g酵母粉，0.1g柠檬酸铁，25g氯化钠，18g琼脂，1000mL ddH2O；将上述培养基的成分混合，灭菌，即得。
以下实施例所述的MA液体培养基的组成如下：18g 2216E液体培养基，9g氯化钠，1000mL ddH2O；将上述培养基的成分混合，灭菌，即得。
实施例1假交替单胞菌Pseudoalteromonas piscicida SCSIO 43740生物膜产生特性
参考曾振顺(2015)的生物膜测定方法并进行了适当改进，从2216E固体平板上挑取新划线长好的假交替单胞菌SCSIO 43740单克隆接种于25mL的MA液体培养基中，28℃180rpm摇床过夜培养。转接过夜培养的菌液至MA液体培养基中并稀释OD 600nm始值为0.05，加入250μL培养液于96孔聚苯乙烯微孔培养板中，另加入3个平行的无菌的培养基做空白对照，该实验每组设置3个重复，每个重复取3个平行。静置放置在设置好温度的培养箱中，孵育至设定的时间后读取OD 620nm值。然后，将培养液轻轻倒出，用1L的去离子水轻轻浸洗96孔板3次，自然风干后加入300μL的0.1％的结晶紫溶液，室温静置放置30分钟后，将结晶紫溶液倒掉，继续用1L的去离子水轻轻浸洗96孔板3次，将96孔培养板倒置在滤纸上除去残余的去离子水，待自然风干后，加入300μL的无水乙醇，静置放置15分钟使结晶紫充分溶解，读取OD 540nm值。固液生物被膜的数值计算采用[Sample(OD 540nm)-Blank(OD 540nm)]/[Sample(OD620nm)-Blank(OD 620nm)]，其具体结果见图1和图2。
载体处理：将瓷砖、铁片、玻璃、聚乙烯塑料和聚丙烯塑料裁剪成约20mm×20mm的正方形，不锈钢网格及盖玻片放入洁净的小烧杯中121℃，灭菌20min，聚氯乙烯塑料及静电纺丝膜置于紫外下灭菌1h。
菌株的生物膜制备：取预处理后的载体添加到MA液体培养基中，按2％(v/v)的比例接种假交替单胞菌SCSIO 43740菌液于MA液体培养基中，使其附着在载体表面形成成熟生物膜，对照组不添加菌株。
生物膜清洗：先弃去之前的MA液体培养基，用镊子轻取已经在表面形成生物膜的载体，将其放入到50mL带盖的螺口离心管，加入10mL 0.85％的无菌生理盐水，清洗固体载体表面，弃去液体，重复三次。用无菌生理盐水清洗，目的是清洗载体表面细菌生物膜可能带有的游离细菌，以此确保菌落计数的准确性。
生物膜观察：将表面长有成熟生物膜的载体用无菌生理盐水清洗3次，将载体置于2.5％的戊二醛溶液中浸泡，隔夜处理(一般大于8h)，去除戊二醛溶液后，用0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液冲洗三次，分别用30％、50％和70％乙醇水溶液浸泡10min，再用无水乙醇浸泡三次，待脱水过程结束后置于37℃干燥，用扫描电子显微镜进行观察(图3和图4)。与图3a、图4c对照组相比，图3c和图4f分别显示的为菌株附着在瓷砖和聚丙烯上形成生物膜后分泌的物质。与图3b对照组相比，图3d铁片上形成的生物膜比较致密，生物膜表面趋于平坦，同时可以看到在铁片表面有少量菌株聚集。从图4a、图4b和图4d、图4e的对比来看，菌株在聚乙烯和玻璃上不形成生物膜。
实施例2假交替单胞菌SCSIO 43740促珊瑚幼虫附着生长
将SCSIO 43740单菌落以体积比2％的接种量至250mL MA液体培养基中使得菌株的终浓度为2×108CFU/ml，28℃180rpm摇床培养，每2h进行一次取样，绘制其生长曲线，待其生长到对数生长期时，待菌液培养至平台期，将液体置于离心管中，8000rpm离心5min去除上清液，进行珊瑚幼虫的促附着实验。将6孔培养板置于光照250photons·m-2，将6孔分为2组：实验组中每个培养孔中包含10只鹿角杯型珊瑚珊瑚幼虫和10mL菌液，共3个重复，对照组中每个培养孔中包含10只幼虫和10mL无菌海水。温度为珊瑚28℃±1℃，应用解剖镜观察24h后珊瑚幼虫的附着率和存活率，结果显示菌株添加组的幼虫存活率为100％，附着率为23.75％±0.1，对照组为存活率为80％，附着率为0％，菌株添加组的存活率和附着率显著高于对照组(图5)。
综上所述，本发明的假交替单胞菌SCSIO 43740具有较好地产生物膜活性，其可以在多种固体载体材质生长并且产生生物膜，并且有效提高鹿角杯型珊瑚幼虫的存活率和附着率，从而提高鹿角杯型珊瑚幼体补充量，具有应用于珊瑚人工养殖以及珊瑚礁生态修复和保护工程中的巨大潜力。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.假交替单胞菌SCSIO 43740在提高珊瑚幼虫存活率中的应用，所述的珊瑚幼虫是鹿角杯型珊瑚幼虫，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022435。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的假交替单胞菌SCSIO 43740是含有假交替单胞菌SCSIO 43740的微生物菌剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，假交替单胞菌SCSIO 43740在制备提高珊瑚幼虫存活率的制剂中的应用。
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