CN1166655C - 从红豆杉细胞培养液滤液中富集提取紫杉醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从红豆杉细胞培养液滤液中富集提取紫杉醇的方法，其技术要点是将大孔吸附树脂与红豆杉细胞培养液滤液充分混合进行吸附富集，或让红豆杉细胞培养液滤液多次通过装有大孔吸附树脂的柱子进行吸附富集，有机溶剂洗脱被树脂吸附的紫杉醇，浓缩可得到高含紫杉醇的浓缩物。本发明简化了工艺、降低了提取分离紫杉醇的成本，简便、高效、易于工业化并可节省大量有机溶剂、减少设备费用、节约能源，避免污染环境。
Description
技术领域
本发明涉及一种从红豆杉植物细胞培养液滤液中提取紫杉醇的方法。
背景技术
紫杉醇是一种临床上治疗乳腺癌、卵巢癌、肺癌等癌症的抗癌药，具有良好疗效，而毒副作用较小，我国及世界多国已批准生产和应用，需求量日增。但目前，其主要来源为植物，植物资源量极为有限，且得到保护，与需要量相距甚远。为开辟紫杉醇的新来源，申请人利用植物生物技术，进行了红豆杉植物细胞培养生产紫杉醇的研究，取得预期进展，显示了实现生产的可能性。通过试验证明，在申请人设定的培养基和培养条件下，红豆杉细胞在培养过程中合成的紫杉醇不断释放到培养液中，约80％的量被吸附在培养液的胶体微粒上。在此情况下，若用有机溶剂CH2CL2对其中的紫杉醇进行提取，不仅消耗大量CH2CL2溶剂，萃取效率低，而且需要大型设备，消耗大量能源。申请人使用絮凝剂对培养液进行快速絮凝澄清、过滤，有效地解决了吸附大量紫杉醇的微粒固形物与液体的分离问题(申请人已申请专利，申请号00122083.7)。处理小体积的高度富集紫杉醇的固体物要比萃取大量培养液方便、经济得多。由于进行固液分离后的大量滤液尚含一定量的紫杉醇，但体积大，含量低。使用常规的有机溶剂萃取方法，就会遇到上述所提及的同样的不利情况。
发明内容
本发明的目的就是提供一种从红豆杉细胞培养液滤液中富集提取紫杉醇的方法，也就是说，用大孔吸附树脂从含紫杉醇的红豆杉细胞培养液的过滤液中或者其他含紫杉醇的水溶液以及含紫杉醇的红豆杉细胞培养液提取物的甲醇水溶液中吸附提取紫杉醇的方法。
本发明可由如下方式来实现：将大孔吸附树脂放入红豆杉细胞培养液滤液中，摇动吸附5～6小时，红豆杉细胞培养液滤液的PH值为5.5～6.5，吸附完成后，用有机溶剂洗脱被树脂吸附的紫杉醇，浓缩后得到含紫杉醇浓缩物。也可以将大孔吸附树脂装柱，让红豆杉细胞培养液滤液流经柱中的大孔吸附树脂进行吸附5～6小时，红豆杉细胞培养液滤液的PH值为5.5～6.5，吸附完成后，用有机溶剂洗脱被树脂吸附的紫杉醇，浓缩后同样得到含紫杉醇的浓缩物。大孔吸附树脂是S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9、LD605、XAD-4。S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9由南开大学化工厂生产，LD605由中国蓝星晨光化工研究院生产，XAD-4由美国Rohm-Haas生产。被LD605树脂吸附的紫杉醇，用甲醇或50％乙醇洗脱。被S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9或XAD-4树脂吸附的紫杉醇，用无水乙醇洗脱。红豆杉细胞培养液滤液为细胞培养液絮凝后的过滤液，含紫杉醇的50％甲醇溶液，为从细胞培养液中提取的含紫杉醇提取物的50％甲醇溶液。
本发明简化了工艺，降低了提取分离紫杉醇的成本，具有简便、高效和易于工业化的优点，可以节省大量的有机溶剂，减少大型设备费用和节约能源，避免污染环境。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步的描述。
本发明的方法是：①大孔吸附树脂先后用蒸馏水、1mol的NaoH溶液、蒸馏水、1mol的HCL溶液、蒸馏水、无水乙醇、蒸馏水等处理洗涤去杂。②将定量已处理好的大孔吸附树脂放入定量的含紫杉醇的红豆杉植物细胞培养液的滤液中或含紫杉醇的红豆杉植物细胞培养液提取物的甲醇水溶液中或其他含紫杉醇的水溶液中，摇动吸附5～6小时，红豆杉细胞培养液滤液PH值为5.5～6.5，或将大孔吸附树脂装填层析柱后，使上述红豆杉细胞培养液滤液通过层析柱对紫杉醇进行吸附。③过滤，分别收集已吸附紫杉醇的大孔吸附树脂与被吸附过的红豆杉细胞培养液滤液。④用无水乙醇或甲醇洗脱吸附了紫杉醇的大孔吸附树脂，同时用CH2CL2萃取被吸附过的红豆杉细胞培养液滤液，将无水乙醇或甲醇洗脱液定容备测；回收CH2CL2至干，用甲醇溶解洗涤并定容备测。⑤HPLC检测已定容的无水乙醇或甲醇洗脱液中的紫杉醇量。⑥由上述检测的被大孔吸附树脂吸附的紫杉醇的洗脱量及被吸附过的红豆杉细胞培养液滤液中的紫杉醇残留量和红豆杉细胞培养液滤液中的紫杉醇原有含量，计算出大孔吸附树脂的吸附量、单位重量树脂的吸附量、洗脱率等。
实施例一
大孔吸附树脂对中国红豆杉细胞培养液的紫杉醇提取物的50％甲醇溶液的吸附性能试验。其操作为：量取一定体积含定量紫杉醇(用HPLC检测)的中国红豆杉细胞培养液紫杉醇提取物的甲醇溶液加入三角瓶中，再加入等量蒸馏水(PH值为6)，摇匀，使其成为含紫杉醇的50％甲醇溶液，再加入经过称量预先处理好的大孔吸附树脂，所试大孔吸附树脂完全按照其医药使用技术要求进行处理，本试验的大孔吸附树脂有S-8、AB-8、X-5、XAD-4、D4020、NKA-9、LD605等。加入树脂的红豆杉细胞培养液滤液放置于摇床上摇动吸附5小时。过滤，分离吸附了紫杉醇的树脂，除了LD605树脂吸附的紫杉醇是用甲醇或50％乙醇洗脱外，其他树脂吸附的紫杉醇均采用无水乙醇洗脱5次，定容后用HPLC检测紫杉醇的洗脱量；被树脂吸附过的红豆杉细胞培养液滤液用CH2CL2萃取3次，浓缩至干，甲醇溶解并洗涤，定容后用HPLC检测该红豆杉细胞培养液滤液中的紫杉醇残留量，结合红豆杉细胞培养液滤液中紫杉醇原始含量，计算出大孔吸附树脂的吸附量、洗脱率。
①吸附量＝红豆杉细胞培养液滤液原含量-红豆杉细胞培养液滤液残留量
②洗脱率＝洗脱量/吸附量×100％
试验结果见表一，红豆杉细胞培养液滤液中紫杉醇量简称紫杉醇量，红豆杉细胞培养液滤液中紫杉醇残留量简称紫杉醇残留量，下同。
| 树脂名称 | 树脂量(干重)(g) | 紫杉醇量(mg/ml) | 紫杉醇残留量(mg) | 吸附量(mg) | 1克树脂吸附量(mg) | 洗脱量(mg) | 洗脱率(％) |
| S-8 | 0.13 | 2.12/12 | 0.9562 | 1.1638 | 8.9 | 0.978 | 84.03 |
| AB-8 | 0.22 | 2.136/40 | 0.2792 | 1.8568 | 8.4 | 1.7436 | 93.90 |
| X-5 | 0.20 | 2.165/40 | 0.4488 | 1.7162 | 7.8 | 1.6820 | 98.0 |
| XAD-4 | 0.58 | 3.576/50 | 0.291 | 3.285 | 5.66 | 3.125 | 95.59 |
| D4020 | 0.20 | 2.136/40 | 0.621 | 1.515 | 7.58 | 1.423 | 93.92 |
| NKA-9 | 0.15 | 0.9381/10 | 0.0693 | 0.8688 | 5.79 | 0.815 | 93.81 |
| LD605 | 0.30 | 1.4145/20 | 0.190 | 1.2245 | 4.08 | 1.181 | 96.44 |
从表一数据看出，7种大孔吸附树脂在中国红豆杉细胞培养液的紫杉醇提取物的50％甲醇溶液中均能够吸附紫杉醇，但每克干树脂的吸附量存在差异；其中S-8和AB-8两种树脂每克的吸附量较其他树脂为高，分别为8.9mg和8.4mg。LD605、NKA-9、XAD-4等3种树脂每克的吸附量较低，分别是4.08mg、5.79mg、5.66mg。而7种大孔吸附树脂所吸附紫杉醇的洗脱率除S-8为84％以外，其余树脂均在93％以上。X-5为98％，LD605为96.44％，XAD-4为95.59％。
实施例二
大孔吸附树脂用于富集提取中国红豆杉细胞培养液的絮凝澄清过滤后的滤液中的紫杉醇。其操作过程如下：量取中国红豆杉细胞培养液经絮凝澄清的过滤液加入三角瓶中，HPLC方法测定其紫杉醇含量，PH值为5.8，再加入称量的湿基大孔吸附树脂，放在摇床摇动吸附5小时，过滤，所得滤液用CH2CL2萃取3次，回收CH2CL2至干，用甲醇溶解洗涤并定容，HPLC方法检测紫杉醇含量，即为红豆杉细胞培养液滤液中经大孔吸附树脂吸附后紫杉醇的残留量；吸附了紫杉醇的树脂用无水乙醇洗脱5次，定容。用HPLC方法检测被吸附紫杉醇的洗脱量。由以上数据计算出大孔吸附树脂在中国红豆杉细胞培养液的絮凝澄清过滤后的滤液中对紫杉醇的吸附量、洗脱量、洗脱率以及回收率。
回收率＝洗脱量/试液原含量×100％
试验结果见表二
| 树脂名称 | 树脂量(干重)(g) | 紫杉醇量(mg/ml) | 紫杉醇残留量(mg) | 吸附量(mg) | 洗脱量(mg) | 洗脱率(％) | 回收率(％) |
| S-8 | 5.44 | 2.52/400 | 0.1 | 2.42 | 2.40 | 99.2 | 95.2 |
| AB-8 | 0.82 | 0.325/100 | 未检出 | 0.325 | 0.3172 | 97.6 | 97.6 |
| X-5 | 0.39 | 0.1625/50 | 未检出 | 0.1625 | 0.1368 | 84.2 | 84.2 |
| XAD-4 | 2.3 | 1.26/200 | 0.376 | 0.889 | 0.831 | 93.5 | 65.95 |
| D4020 | 0.25 | 0.2255/50 | 未检出 | 0.2255 | 0.2230 | 98.89 | 98.89 |
| NKA-9 | 1.68 | 1.26/200 | 0.123 | 1.134 | 1.122 | 98.9 | 82.69 |
| LD605 | 0.15 | 0.1625/50 | 未检出 | 0.1625 | 0.1585 | 97.54 | 97.54 |
从表二数据看出，在实施例一试验基础上，7种大孔吸附树脂用于富集提取中国红豆杉细胞培养液滤液中的紫杉醇时，在树脂稍过量情况下，半数以上红豆杉细胞培养液滤液中紫杉醇可被完全吸附；被树脂吸附紫杉醇的洗脱率，除X-5为84.2％以外，其余均在93.5％以上，S-8高达99.2％；被树脂吸附并洗脱紫杉醇相对红豆杉细胞培养液滤液中原有紫杉醇的回收率，除XAD-4和X-5分别为65.9％和84.2％，NKA-9为82.69％以外，其余回收率都高达95.2％～97.6％之间，说明适宜的大孔吸附树脂能够高效富集提取并回收红豆杉细胞培养液滤液中的紫杉醇。
实施例三
量取2份各5ml中国红豆杉细胞培养液的紫杉醇提取物的甲醇溶液加入三角瓶中，HPLC方法测定紫杉醇含量为0.76mg/5ml，再加入5ml蒸馏水，摇匀备用，PH值为5.8。另外分别称取已处理好的湿基大孔吸附树脂X-5及AB-8各1g(0.4g干重)。分别装入2根40cm×0.8cm的玻璃柱中，用蒸馏水平衡后，使上述备好的2份红豆杉细胞培养液滤液分别5次通过柱中的大孔吸附树脂进行吸附，HPLC检测流出液不含紫杉醇为止。用无水乙醇洗脱解吸被树脂吸附的紫杉醇6次，乙醇洗脱液定容50ml，用HPLC检测其中紫杉醇洗脱量。
试验结果见表三
| 树脂名称 | 紫杉醇量(mg) | 吸附量(mg) | 洗脱量(mg) | 洗脱率(％) | 回收率(％) |
| X-5 | 0.76 | 0.76 | 0.703 | 92.5 | 92.5 |
| AB-8 | 0.76 | 0.76 | 0.70 | 92.1 | 92.1 |
从表三数据看出，利用大孔吸附树脂柱对红豆杉细胞培养液紫杉醇提取物的50％甲醇溶液中的紫杉醇进行吸附和洗脱，在树脂稍过量的情况下将其中的紫杉醇完全吸附，洗脱量和回收率均在92％以上。与实施例一、二中利用大孔吸附树脂分散在试液中摇动吸附和洗脱的效果基本一致。
Claims (5)
1、从红豆杉细胞培养液滤液中富集提取紫杉醇的方法，其特征在于将大孔吸附树脂放入含紫杉醇的红豆杉细胞培养液滤液中，摇动吸附5～6小时，或将大孔吸附树脂装柱，让红豆杉细胞培养液滤液流经柱中的大孔吸附树脂进行吸附，红豆杉细胞培养液滤液的PH值为5.5～6.5，吸附完成后，用有机溶剂洗脱被树脂吸附的紫杉醇，浓缩后得到含紫杉醇的浓缩物。
2、依权利要求1所述的从红豆杉细胞培养液滤液中富集提取紫杉醇的方法，其特征在于大孔吸附树脂是S-8、AB-8、X-5、XAD-4、D4020、NKA-9或LD605。
3、依权利要求1所述的从红豆杉细胞培养液滤液中富集提取紫杉醇的方法，其特征在于红豆杉细胞培养液滤液为含紫杉醇的50％甲醇溶液。
4、依权利要求2所述的从红豆杉细胞培养液滤液中富集提取紫杉醇的方法，其特征在于用甲醇或50％乙醇洗脱被LD605树脂吸附的紫杉醇。
5、依权利要求2所述的从红豆杉细胞培养液滤液中富集提取紫杉醇的方法，其特征在于用无水乙醇洗脱被S-8、AB-8、X-5、D4020、NKA-9或XAD-4大孔吸附树脂吸附的紫杉醇。
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