CN116655805A - 一种靶向her2阳性肿瘤的新型car-t细胞及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种靶向HER2阳性肿瘤的新型CAR‑T细胞及制备方法和应用。本发明提供一种靶向HER2阳性肿瘤的嵌合抗原受体，包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域为靶向HER2阳性肿瘤的纳米抗体，所述胞内结构域为截短的CD3ζ与4‑1BB串联；所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种靶向HER2阳性肿瘤的新型CAR-T细胞及制备方法和应用。
背景技术
人表皮生长因子受体2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2,HER2)是一种细胞来源的原癌基因，又称为c-erbB-2基因，在多种肿瘤中过度表达和扩增。过多的HER2蛋白出现在肿瘤细胞表面会促进肿瘤细胞的分裂和生长，进而形成HER2阳性肿瘤。HER2过表达常见于乳腺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中。
CAR-T细胞疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)全称为嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是一种新型的治疗肿瘤的精准靶向疗法。研究发现，CAR-T细胞能够精准、快速、高效、特异地识别并杀伤肿瘤细胞，近几年通过优化改良在协助肿瘤的治疗上取得了良好的效果，是一种非常有前景且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗研究方向。但目前CAR-T疗法在不同肿瘤,尤其是在实体瘤的效果上仍存在争议，实体瘤是CAR-T疗法亟待攻克的一个具有挑战性的目标。
研究发现CAR结构中任何一个部分的微小改变都会对CAR-T细胞的抗肿瘤活性产生影响。其中，不同的scFv、铰链区、跨膜区、共刺激域或ITAMs都可能影响CAR-T细胞的效应性。一方面，T细胞需接受抗原刺激才能被激活和扩增,但过度激活以及对靶标的过度亲和可能导致T细胞耗竭和杀伤活性降低,影响CAR-T细胞的持久性。
1990年代后期设计的第一代CAR包含CD3ζ或FcRγ信号结构域，但由于其体外耐用性和持久性并不理想，在临床上也仅显示出有限疗效或甚至没有疗效。随后产生了具有一个共刺激结构域的第二代CAR，其在结构上与CD3ζ细胞内信号结构域串联。目前，FDA批准的CAR-T治疗产品中两个最常见的共刺激域为CD28和4-1BB(CD137)。目前临床上，第二代CAR-T主要是在多种血液系统恶性肿瘤中产生了较强的效果，在实体瘤方面则主要应用于胶质母细胞瘤、晚期肉瘤、肝转移瘤、卵巢癌等。然而，据推测，仅通过一个结构域的共刺激会产生不完全激活。因此，第三代CAR应运而生，其包含两个与CD3ζ串联的共刺激结构域，但其临床前研究产生了不同甚至相互矛盾的结果，在应用转化方面仍存在较多掣肘。
综上所述，本发明将提供一种结构改良的特异性靶向HER2阳性表达肿瘤细胞的新型CAR-T细胞，以缓解现有技术的不足。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向HER2阳性肿瘤的新型CAR-T细胞及制备方法和应用，具体技术方案如下。
一种靶向HER2阳性肿瘤的嵌合抗原受体，包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域为靶向HER2阳性肿瘤的纳米抗体(简称HER2纳米抗体)，所述胞内结构域为截短的CD3ζ与4-1BB串联；所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步，所述截短的CD3ζ为CD3ζITAM1结构域，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步，所述嵌合抗原受体还包括CD8铰链区。
进一步，所述HER2阳性肿瘤为实体瘤，包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌或肠癌等。
表达上述任一项所述的嵌合抗原受体的CAR-T细胞。
一种靶向治疗HER2阳性表达实体肿瘤的药物，所述药物包括上述CAR-T细胞和药学上允许添加的辅料和/或助剂。
上述CAR-T细胞在制备靶向HER2阳性表达肿瘤药物中的应用，所述CAR-T细胞的CD3ζITMA1结构域用于适当激活T细胞下游信号。
进一步，所述肿瘤为实体肿瘤。
进一步，所述实体肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌或肠癌等。
上述嵌合抗原受体的制备方法，包括以下步骤：
1)合成包含靶向HER2阳性肿瘤的纳米抗体、CD8铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激分子以及截短CD3ζ信号域的CAR结构；
2)用限制性内切酶分别对质粒载体和合成的CAR结构进行双酶切，以T4连接酶连接后进行转化和筛选培养，将得到的阳性克隆进行测序鉴定。
进一步，所述截短CD3ζ信号域为CD3ζITAM1结构域。
有益技术效果
本发明提供的CAR结构是一种新型的二代CAR结构，截短的CD3ζ信号域仅与一个4-1BB胞内信号域相连，但却在靶向HER2阳性表达的实体肿瘤上证实具有较好的效果。CD3ζ信号域包括CD3ζITAM1、ITAM2和ITAM3，目前尚未见只采用CD3ζITAM1部分合成的CAR及制备的CAR-T细胞在靶向HER2阳性表达肿瘤中具有良好效果的相关报道，因此本发明具有一定的开创性。
其次，本发明的CAR-T细胞仅保留CD3ζITAM1结构域，实验证明已到达足以激活T细胞下游信号，促进CAR-T细胞对肿瘤细胞进行有效杀伤的效果。此外，截短的CD3ζ信号域又可以避免T细胞下游信号过度激活对CAR-T细胞造成损伤，进而更好的发挥肿瘤杀伤作用。因此本发明制备的CAR-T细胞不仅具有有效的杀伤能力，还具有较好的杀伤持久性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明合成的CAR结构(Her2 VH-BBZ(short))示意图；
图2为本发明合成的CAR阳性表达率结果图(APC为荧光染料，H代表高度；横坐标代表荧光强度)；
图3为CAR-T细胞体外杀伤(LDH)效果图；
图4为肿瘤细胞与CAR-T细胞在1:1的效靶比下杀伤24小时效果图；
图5为统计肿瘤细胞与CAR-T细胞在1:1的效靶比下连续杀伤情况的曲线图；
图6为肿瘤细胞与CAR-T细胞在1：2.5的效靶比下杀伤24小时效果图；
图7为统计肿瘤细胞与CAR-T细胞在1：2.5的效靶比下连续杀伤情况的曲线图；
图8为肿瘤细胞与CAR-T细胞在1：5的效靶比下杀伤24小时效果图；
图9为统计肿瘤细胞与CAR-T细胞在1：5的效靶比下连续杀伤情况的曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本文中“和/或”包括任何和所有一个或多个列出的相关项的组合。
本文中“多个”意指两个或两个以上，即其包含两个、三个、四个、五个等。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
本发明所述的“适当激活”是指对T细胞下游信号起到有效激活的作用，使CAR-T细胞能对肿瘤细胞进行有效杀伤；但同时又避免对T细胞下游信号过度激活从而对CAR-T细胞本身造成损伤。
实施例1
本实施例提供一种CAR-T细胞的制备方法
1.CAR表达载体的构建
1)CAR结构由胞外HER2纳米抗体，CD8铰链区、跨膜区，胞内4-1BB共刺激分子以及CD3ζ截短信号域(CD3ζITAM1)/CD3ζ全长结构域构成，结构片段采用基因合成的方法制备。
2)用限制性内切酶EcoR I和BamH I分别对Pwpxld载体和CAR结构片段进行双酶切，以T4连接酶连接后进行转化和筛选培养，将得到的阳性克隆进行测序鉴定，最终获得HER2 CAR(short)-Pwpxld表达载体和HER2 CAR(full)-Pwpxld对照载体(含有CD3ζ全长)，本发明的CAR结构见图1。
本实施例中合成/扩增得到的各片段序列如表1所示。
表1
2.慢病毒包装
1)复苏培养293T细胞，融合度达到80％左右时进行病毒包装。
2)按照培养基(DMEM+10％FBS)的量加入氯喹溶液，使终浓度为100μmol/L。
3)病毒包装体系(10cm培养皿)为：50μl CaCl2、20μg构建的核心质粒、10μgPspax2、5μg PMD2.0G、500μl Nuclease-free wate(无核酸酶水)、500μl 2X BBS。
4)10h左右换新鲜预温培养基(DMEM+10％FBS)。
5)收集培养了48h和72h病毒液，0.22μm滤膜过滤去除杂质。
6)超速离心，用病毒原液1/400的DPBS重悬浓缩的病毒，并按后续用量进行分装，-80℃冻存备用。
3.外周血细胞分离
1)提前一天孵育T细胞培养方瓶(T25)，4℃孵育过夜。T细胞培养基中含有抗人CD3和CD8D单克隆抗体：3ml DPBS、4μg/mL CD3、2μg/mL CD28。
2)抽取适量健康志愿者新鲜血液。
3)取15mL BD管，加入5mL Ficoll，轻缓加入5mL新鲜血液。
4)常温离心，升1降1，1000g，30min。
5)离心后小心吸取中间层(白色)的外周血淋巴细胞。
6)加入三倍体积预温的DPBS洗涤，300g，10min。
7)可选地加入5mL红细胞裂解液，室温裂解5min，加入等体积预温DPBS。
8)细胞计数，常温离心，100g，10min。
9)按2*10^6/mL加入适量T细胞培养液(X-vivo，5％AB血清，400IU IL2)重悬细胞。
10)吸除T25方瓶中的抗体孵育液，加入T细胞培养液重悬的T细胞，37℃正常培养48h左右。
4.CAR-T细胞制备
1)提前一天孵育T细胞培养板，4℃孵育过夜。采用24孔板，每一孔中加入0.5mlDPBS和10μl RetroNectin(1mg/mL)。
2)吸除RetroNectin溶液。
3)每孔加入1mL 2％ BSA溶液，37℃封闭30min。
4)吸除封闭液，使用DPBS洗涤一次。
5)每孔(非黏附孔板)加入200μl 400X病毒，300μl X-vivo完全培养基，32℃，1000g升2降2离心2h。
6)每孔加入2-2.5*10^6个激活48h左右的T细胞，X-vivo完全培养基补足至1mL/孔，32℃，300g升2降2离心15min。
本发明合成的CAR-T细胞简称为Her2 VH-BBZ(short)，对照CAR-T简称为Her2 VH-BBZ(full)。
7)37℃正常培养72h左右，流式检测CAR阳性表达率，见图2。结果显示，Her2 VH-BBZ(short)的阳性表达率为76.0％；Her2VH-BBZ(full)的阳性表达率为60.9％。
实施例2
本实施例提供体外杀伤检测试验
1)96孔板杀伤：肿瘤细胞1*10^4/孔，用本发明合成的CAR-T细胞，分别按照与肿瘤细胞以效靶比1:1、2.5:1、5:1进行铺板，每个效靶比3个复孔，并做空白T细胞(Mock)对照。
本实施例采用Skov3-mCherry细胞系，其为一种具有广泛代表性的细胞模型。
2)使用活细胞动态检测仪连续检测CAR-T细胞体外杀伤情况。
3)24h左右取培养上清检测LDH以计算肿瘤裂解率。
实验结果见图3-图9。
图3显示，本发明合成的CAR-T和对照CAR-T均能对HER2阳性表达的肿瘤细胞发挥有效杀伤，但本发明合成的Her2VH-BBZ(short)明显具有更好的肿瘤杀伤能力，其中效靶比E:T＝1:1时就明显优于Her2 VH-BBZ(full)；而在效靶比E:T＝5:1时，呈现出呈爆发趋势的的杀伤效果，而在一点在同样效靶比的Her2VH-BBZ(full)上未观察到。
图4-图9显示了不同的效靶比下的连续杀伤效果。从中可以看出，以效靶比E:T＝1:1时(E代表Effector cell，即效应细胞；T代表Target cell，即肿瘤细胞)为例，在连续杀伤24小时时，Her2VH-BBZ(short)和Her2 VH-BBZ(full)效果差别不大，但24h后Her2VH-BBZ(short)的杀伤效果呈现出逐渐优于Her2 VH-BBZ(full)的趋势，在连续杀伤48h最为明显。这说明截短的CD3ζ信号域发挥了足以激活T细胞下游信号，促进CAR-T细胞对肿瘤细胞进行有效杀伤的效果，同时又避免了T细胞下游信号过度激活对CAR-T细胞造成损伤，进而发挥出更好的肿瘤杀伤持续性。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
Claims (10)
1.一种靶向HER2阳性肿瘤的嵌合抗原受体，包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其特征在于，所述胞外结构域为靶向HER2阳性肿瘤的纳米抗体，所述胞内结构域为截短的CD3ζ与4-1BB串联；所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述截短的CD3ζ为CD3ζITAM1结构域，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括CD8铰链区。
4.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述HER2阳性肿瘤为实体瘤，包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌或肠癌。
5.一种CAR-T细胞，其特征在于，表达如权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体。
6.权利要求5所述的CAR-T细胞在制备靶向HER2阳性表达肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述CAR-T细胞的CD3ζITAM1结构域用于适当激活T细胞下游信号。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为实体肿瘤。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述实体肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌或肠癌。
9.权利要求4所述的嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成包含靶向HER2阳性肿瘤的纳米抗体、CD8铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激分子以及截短CD3ζ信号域的CAR结构；
2)用限制性内切酶分别对质粒载体和合成的CAR结构进行双酶切，以T4连接酶连接后进行转化和筛选培养，将得到的阳性克隆进行测序鉴定。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述截短CD3ζ信号域为CD3ζITAM1结构域。
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