CN116637171A - 热不稳定肠毒素或霍乱毒素在制备抑制致病型大肠杆菌活性制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了热不稳定肠毒素或霍乱毒素在制备抑制致病型大肠杆菌活性制剂中的应用，表现为可以通过促进共生型大肠杆菌Y18J中细菌素的表达抑制致病型大肠杆菌活性，其中细菌素为大肠杆菌素B和/或大肠杆菌素M。由于热不稳定肠毒素(LT)是霍乱弧菌Inaba569B合成的霍乱毒素(CT)的近似物，本申请发现霍乱毒素同样也具有抑制致病性大肠杆菌的活性的作用，为仔猪断奶后腹泻的治疗提供了一个新的思路。

Description

热不稳定肠毒素或霍乱毒素在制备抑制致病型大肠杆菌活性 制剂中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种热不稳定肠毒素或霍乱毒素在制备抑制致病型大肠杆菌活性制剂中的应用。

背景技术

断奶后腹泻是生猪养殖业面临的一个巨大挑战，在过往的实践生产中大量使用氧化锌进行预防和使用抗生素进行治疗。然而，由于氧化锌对环境的和细菌抗生素耐药性等的负面影响，许多国家已禁止使用氧化锌，因此，寻找替代药物变得尤为重要。

在哺乳动物肠道微生物群中，大肠杆菌是宿主出生后首批定殖在肠道中的细菌，其可能是肠道共生菌，也可能是各种疾病的诱因，其中仔猪腹泻就是由致病型大肠杆菌所引起的。肠道共生微生物群可以防止病原体的入侵与定殖，称为“定殖抵抗”。同时，病原体也已经进化出逃避共生菌抑制作用的策略。

共生型大肠杆菌Y18J是从仔猪肠道微生物中分离的一种非致病大肠杆菌，其分泌的细菌素，也叫大肠杆菌素B/M、拮抗因子B/M(Colicin B/M)对产肠毒素性大肠杆菌W25K具有抑制作用，热不稳定肠毒素(LT)是产肠毒素性大肠杆菌分泌的一种毒性蛋白，但是关于毒力因子热不稳定肠毒素在共生型大肠杆菌与致病性大肠杆菌的相互作用过程中发挥何种作用还未明确。

发明内容

为了克服现有技术中的技术问题，本发明提供一种热不稳定肠毒素或霍乱毒素在制备抑制致病型大肠杆菌活性制剂中的应用，为生猪养殖过程中抵抗断奶后仔猪的腹泻提供了新思路。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案如下：

本发明第一方面提供热不稳定肠毒素或霍乱毒素在制备抑制致病型大肠杆菌活性制剂中的应用。

作为一种可选的实施方式，在本发明提供的应用中，所述热不稳定肠毒素或霍乱毒素通过促进共生型大肠杆菌Y18J中细菌素的表达抑制致病型大肠杆菌活性。

在相同的技术构思下，本发明还提供热不稳定肠毒素或霍乱毒素在制备促进共生型大肠杆菌Y18J中细菌素的表达的制剂中的应用。

作为一种可选的实施方式，在本发明提供的应用中，所述细菌素为大肠杆菌素B和/或大肠杆菌素M。

在相同的技术构思下，本发明还提供热不稳定肠毒素或霍乱毒素在制备治疗仔猪腹泻药物中的应用。

作为一种可选的实施方式，在本发明提供的应用中，所述热不稳定肠毒素或霍乱毒素的使用量为0.04～20μg。

本发明还提供一种抑制致病型大肠杆菌活性的制剂，所述制剂包括有效剂量的热不稳定肠毒素或霍乱毒素，以及药学上可接受的载体或辅料。

作为一种可选的实施方式，在本发明提供的抑制致病型大肠杆菌活性的制剂中，所述辅料包括赋形剂或稀释剂。

本发明还提供一种治疗仔猪腹泻的药物，所述药物包括有效剂量的热不稳定肠毒素或霍乱毒素，以及药学上可接受的载体或辅料。

作为一种可选的实施方式，在本发明提供的治疗仔猪腹泻的药物中，所述辅料包括赋形剂或稀释剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本申请发现热不稳定肠毒素可以促进共生型大肠杆菌Y18J产生的细菌素的表达来抑制致病性大肠杆菌的活性。由于热不稳定肠毒素(LT)是霍乱弧菌Inaba 569B合成的霍乱毒素(CT)的近似物，本申请发现霍乱毒素同样也具有抑制致病性大肠杆菌的活性的作用，为仔猪断奶后腹泻的治疗提供了一个新的思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为采用qRT-PCR分析W25K对大肠杆菌素B/M(Colicin B/M)表达水平的影响，其中a为单独培养的Y18J的Colicin B/M基因表达水平；b为与W25K共培养的Y18J中ColicinB/M基因的表达水平；

图2为采用qRT-PCR分析ST(热稳定毒素)与LT(热不稳定毒素)对Colicin B/M表达水平的影响，其中a为Y18J与W25K(ST^-LT^-)、b为Y18J与W25K(ST⁺LT^-)、c为Y18J与W25K(ST^-LT^-)ST⁺、d为Y18J与W25K(ST^-LT⁺)、e为Y18J与W25K(ST^-LT^-)LT⁺共培养时Colicin B/M基因表达水平；

图3为W25K(野生型和突变型菌株)的生长曲线；

图4为W25K对Y18J抑菌活性的影响，其中a为共培养体系中Y18J和W25K(野生型和突变型)菌落的比例；b为Y18J和W25K(野生型和突变型)在不同共培养时间的菌落；

图5为ST和LT对Y18J抑菌活性的影响，其中a为共培养体系中Y18J和W25K(ST⁺LT^-)或W25K(ST^-LT^-)ST⁺菌落的比例；b为共培养体系中Y18J和W25K(ST^-LT⁺)或W25K(ST^-LT^-)LT⁺菌落的比例；

图6为厌氧条件下共培养的Y18J和W25K突变体菌落的比例；

图7为琼脂孔扩散法表示Y18J对W25K(野生型和突变型)的抑制作用；

图8为Y18J与LTA(热不稳定毒素A亚基)和/或LTB(热不稳定毒素B亚基)回补型菌株共培养的结果，其中a为W25K(ST^-LT^-)、W25K(ST^-LT^-)LTA⁺和W25K(ST^-LT^-)LTB⁺的生长曲线；b为共培养体系中Y18J与W25K(LTA或LTB回补突变体)的比例；

图9为添加不同浓度的LT时Colicin B/M的相对基因表达水平；

图10为LT通过Colicin B/M基因影响Y18J的抑菌活性的结果，其中a-d为共培养体系中分别添加LT和水时，不同Y18J突变体和W25K(ST^-LT^-)菌落数之比，其中(a)为Y18J、(b)为Y18J(cliB^-M^-)、(c)为Y18J(cliB^-M^-)cliB⁺、(d)为Y18J(cliB^-M^-)cliM⁺；

图11为ST通过Colicin B/M基因影响Y18J的抑菌活性的结果，其中a-d为共培养体系中分别添加ST和水时，不同Y18J突变体和W25K(ST^-LT^-)菌落数之比，其中(a)为Y18J、(b)为Y18J(cliB^-M^-)、(c)为Y18J(cliB^-M^-)cliB⁺、(d)为Y18J(cliB^-M^-)cliM⁺；

图12为pGB-hyg-Ptet-colicinB和pGB-hyg-Ptet-colicinM质粒在Y18J(cliB^-M^-)中的稳定性结果。

图13为W25K的LTA与Inaba 569B霍乱弧菌的CtxA和W25K的LTB与Inaba 569B霍乱弧菌的CtxB之间序列比对的结果；

图14为添加不同浓度的CT时Colicin B/M的相对基因表达水平。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本发明中采用Red/ET同源重组技术构建细菌突变体，具体方法如下：

1、构建Y18J细菌素敲除突变体的基因重组工程。

(1)首先将重组酶表达质粒pSC101-BAD-gbaA-hyg电穿孔进入Y18J。

(2)电穿孔后，向电转杯中加入1mL新鲜LB培养基，将电转细胞吸出，30℃复苏2h。使用添加潮霉素(200μg/mL)的LB平板筛选阳性转化子。

(3)制备Y18J电活性细胞。挑取转化成功的大肠杆菌Y18J单克隆至适量含有潮霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，放置恒温混匀仪中，30℃，900rpm，有氧培养过夜。次日取35μL菌液接种于含有潮霉素(100μg/mL)的1.4mL LB培养基中，30℃，900rpm培养2h，使用L-阿拉伯糖(1.4mg/mL)诱导BAD启动子。完成诱导的细胞在37℃下孵育40min，接着，按上述方法制备感受态细胞。

(4)以质粒pSC101-tetR-tetO-eGFP-km为模板，使用引物Colicin-km-loxM-3/Colicin-km-loxM-5扩增包括同源臂和卡那霉素抗性基因的DNA片段。PCR扩增体系(10μL)如下表1所示，扩增程序如下表2所示。

(5)为了进行重组，将2ng PCR产物电击转化至感受态细胞Y18J中。

(6)电穿孔后，将细胞重悬于1mL新鲜LB培养基中，37℃复苏1h后，将细菌涂布在含卡那霉素(3μg/mL)的LB固体平板上，于37℃孵育过夜。

(7)挑取平板上的单克隆重组子进行PCR鉴定，PCR扩增条带正确的阳性重组子命名为Y18J(cliB^-M^-)。用于敲除大肠杆菌素的引物如表5所示。

表1：PCR反应体系

表2：PCR扩增程序

2、构建Y18J细菌素回复突变体。

(1)首先制备线性载体，使用限制性内切酶BamHⅠ/HindIII酶切质粒pGB-amp-RK2-hyg-Ptet-Cre-cm，酶切体系如表3所示，37℃，反应3h后进行琼脂糖凝胶电泳。通过凝胶成像系统观察图像后，使用DNA纯化回收试剂盒，切胶回收大片段作为载体。

表3：酶切体系

(2)使用引物pGB-CliB-hyg-3/pGB-CliB-hyg-5和pGB-CliM-hyg-3/pGB-CliM-hyg-5分别从Y18J基因组中扩增Colicin B和Colicin M与其免疫基因相关的DNA片段，PCR体系与程序如表1和表2所示。

(3)使用上述方法获得带有重组酶表达质粒pSC101-BAD-ETgA-tet的大肠杆菌GB05-dir(GeneBridges,Dresden,Germany)感受态细胞后，将2ng PCR产物和2ng pGB线性载体共电穿孔到GB05-dir细胞中。

(4)用新鲜的LB培养液复苏1h后，涂布在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体平板上，37℃过夜培养，挑取重组子鉴定。

(5)采用碱裂解提取和乙醇沉淀制备基因组质粒。

(6)质粒pGB-hyg-Ptet-colicinB和pGB-hyg-Ptet-colicinM通过NdeI和EcoRⅠ进行酶切鉴定，酶切体系如表3。将正确的克隆进行测序验证，使用SeqMan软件进行序列比对。

(7)测序验证后，采用上述电击转化法将回补质粒(pGB-hyg-Ptet-colicinB、pGB-hyg-Ptet-colicinM)转化至Y18J(cliB^-M^-)中。菌落PCR验证阳性重组子，将大肠杆菌素回补成功的菌株命名为Y18J(cliB^-M^-)cliB⁺和Y18J(cliB^-M^-)cliM⁺。用于大肠杆菌素回补的引物如表5所示。

3、W25K毒素的敲除。

(1)首先以质粒pR6K-lox71-cm-lox66为模板，使用引物ST-cm-loxM-3/ST-cm-loxM-5扩增包括同源臂和卡那霉素抗性基因的DNA片段，PCR体系与程序如表1和2。

(2)将2ng DNA片段电穿孔至含有pSC101-BAD-gbaA-amp质粒的W25K感受态细胞中。经菌落PCR鉴定后，成功敲除热稳定肠毒素基因的菌株命名为W25K(ST^-LT⁺)。

(3)以pR6K-Tps-gentaR-tetR-T7RP为模板，使用引物对LT-AB-loxM-genta-3/LT-AB-loxM-genta-5扩增带有同源臂及庆大霉素抗性基因的DNA片段，PCR体系与程序如表1和2。采取同样的方法敲除热不稳定毒素，转化成功的菌株命名为W25K(ST⁺LT^-)。

(4)为了敲除构建W25K(ST^-LT⁺)时PCR产物上携带的抗性基因，我们将质粒pSC101-BAD-Cre-ccdA-amp电穿孔至W25K(ST^-LT⁺)中。然后将(3)中扩增得到的带有同源臂及庆大霉素的DNA片段电转至敲除抗性基因的W25K(ST^-LT⁺)中，转化成功的菌株命名为W25K(ST^-LT^-)。用于敲除毒素的引物如表5所示。

4、W25K毒素的回补。

(1)首先通过限制性内切酶EcoRⅠ/ApaLⅠ酶切质粒p15A-amp-km-BAD-Sac-SAM，切胶回收大片段作为表达载体，酶切体系如表2-5所示。

(2)使用引物ST-3/ST-5，LT-AB-3/LT-AB-5，ltxA-his-3/ltxA-his-5和ltxB-his-3/ltxB-his-5分别从W25K基因组中扩增热稳定毒素，热不稳定毒素AB亚基，热不稳定毒素A亚基，热不稳定毒素B亚基与其免疫基因相关的DNA片段，PCR体系与程序如表1和2。

(3)制备GB05-dir(pSC101-BAD-ETgA-tet)感受态细胞后，将2ng PCR产物和2ng线性载体共电穿孔到L-阿拉伯糖诱导的GB05-dir细胞。

(4)将细胞在37℃恒温混匀仪上复苏1h，然后将细胞涂布在含有适当抗生素的培养皿上，37℃培养过夜。

(5)次日，挑取重组子鉴定。制备基因组质粒，将质粒p15A-hyg-LT，p15A-hyg-ST，p15A-km-BAD-LTA和p15A-km-BAD-LTB测序验证后，采用电击转化法将回补质粒转化至W25K(ST^-LT^-)中。将复苏的电转细胞涂布在含有适当抗生素的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜。

(6)菌落PCR验证阳性重组子，命名为W25K(ST^-LT^-)ST⁺，W25K(ST^-LT^-)LT⁺,W25K(ST-LT-)LTA和W25K(ST-LT-)LTB。表5列出了用于毒素回补的引物。

5、Y18J对W25K突变体抑菌试验。

按照如上所述的方法获得Y18J，W25K(ST-LT-)，W25K(ST-LT+)和W25K(ST-LT-)LT+的过夜培养菌液。分别将2μL W25K(ST^-LT^-)，W25K(ST^-LT⁺)和W25K(ST^-LT^-)LT⁺与15mL LB固体培养基混合均匀后倒平板，并在室温下放置30min。在每个平板均匀的三个点上分别添加1μL Y18J。然后将平板在37℃的有氧条件下培养，次日观察抑菌效果。

6、体外微生物-病原体相互作用模型。

首先按照上述方法将绿色荧光蛋白(GFP)表达质粒pNCS-NeonGreen-amp电穿孔入菌株W25K野生型及突变株中。带有GFP表达质粒的菌株、Y18J野生型和突变型菌株在合适的培养基中培养12-16h后，取36μL带有GFP表达质粒的菌株培养液分别与6μL Y18J野生型及其突变株培养液混合并转移至含有氨苄西林(10μg/mL)的1mL新鲜LB液体培养基中，根据实验设计添加不同的试剂，在不同的共培养时间(包括初始时间，1h，2h和3h)收获100μL共培养细胞悬液。将稀释后的共培养细胞悬液接种在含有氨苄西林(5μg/mL)的LB固体平板上。37℃孵育24h后，计数不发荧光和发荧光的菌落数量，计算二者的比例。

7、细菌生长曲线。

接种大肠杆菌菌株至1mL LB培养基中，900rpm，37℃培养过夜。次日，测量过夜菌在600nm处的光密度，均一初始OD值，计算OD值为0.085时所需过夜菌体积，将其转接至适量的新鲜LB培养基中，37℃，900rpm培养。用紫外分光光度计每间隔60min测量一次600nm处的光密度。每个样品分析三份。

8、实时定量PCR

(1)首先获得W25K(野生型和突变型)与Y18J(野生型和突变型)的过夜培养物。

(2)取400μL W25K(野生型和突变型)与400μL Y18J(野生型和突变型)混合并转移至400μL新鲜的LB培养基中，在不同的共培养时间(包括初始时间，20min，40min，1h，2h和3h)收获共培养细胞悬液。根据RNA提取试剂盒制造商的说明，从共培养的细胞中提取总RNA。

(3)使用PrimeScript^TMRT with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒将1μg总RNA逆转录为cDNA。

(4)为了评估肠毒素和细菌素的转录水平，选择在Applied Biosystems RealTime PCR系统中进行实时PCR。引物序列如表5，引物用灭菌水稀释至10μM。参考基因为rpsL和recA。RT-qPCR的反应体系和反应程序如表4所示。反应结束后用2^-ΔΔCt法计算目的基因mRNA的相对表达量。

表4：RT-qPCR反应体系和反应程序

9、统计分析

数据用GraphPad Prism 9(GraphPad Software，San Diego，CA，United States)处理。用Student-t检验来比较两组的平均值。星号编码如下：^*P≤0.05，^**P≤0.01，^***P≤0.001，^****P≤0.0001。所有数据均以平均值±SEM表示。

表5：引物序列表

实施例1

W25K对Colicin B/M表达量的影响。

为了确认W25K对Colicin B/M的影响，本实施例同样进行了共同培养实验。结果表明，在不同的培养时间内，单独培养的Y18J的Colicin B/M的表达量没有变化，如图1a所示。然而，当Y18J与W25K共培养时，Colicin B/M的表达呈现出明显的先下降后上升的趋势(P<0.05)，如图1b所示。

为进一步探讨ST和LT能否影响Colicin B/M的表达以及各自发挥何种作用，本实施例将Y18J和W25K突变体共同培养以观察其表达量变化。如图2a所示，当Y18J与W25K(ST^-LT^-)共培养时，Colicin B/M的表达量保持相对稳定，这与单独培养的Y18J中基因的表达情况相似。然而，当Y18J与W25K(ST⁺LT^-)共培养时，与起始时间相比，Colicin B/M的表达量在共培养的1h，2h，3h均显著降低(P<0.05)，如图2b所示；同样地，当与W25K(ST^-LT^-)ST⁺共培养时，Colicin B/M的表达量在共培养的1h，2h，3h也显著低于起始值(P<0.001)，如图2c所示。当Y18J与W25K(ST^-LT⁺)或W25K(ST^-LT^-)LT⁺共同培养时，Colicin B/M的表达明显增加(P<0.05)，如图2d和2e所示，这表明ST能下调Colicin B/M的表达，而LT能上调Colicin B/M的表达。

实施例2

W25K对Y18J的抗菌活性的影响。

本实施例构建了由Y18J和W25K组成的共培养体系，用来评估共培养体系中存在或者不存在ST和LT时Y18J的拮抗活性。Y18J和W25K(野生型或突变型)菌落以1：6的比例混合并进行共培养，在1h，2h，3h收获共培养菌液，然后进行梯度稀释并铺在平板上。次日计数Y18J(没有荧光的菌落)与W25K(野生型和突变型)(有绿色荧光的菌落)的菌落数，计算二者比例，以此反映Y18J抑制W25K生长的活性。

首先，各种W25K突变体的生长曲线显示其生长趋势是相同的，如图3所示。Y18J和W25K的菌落数比例反映了Y18J的抑菌能力：比值越大，说明共培养体系中Y18J含量越高或者W25K含量越少，即能反映此时Y18J抑菌能力越强；相反地，比值越小，说明共培养体系中Y18J含量越低或者W25K含量越高，即能反映此时Y18J抑菌能力越弱。首先将Y18J与W25K共培养，以Y18J与W25K(ST^-LT^-)共培养组为对照，结果显示Y18J的抑菌能力在共培养第1h显著降低(P<0.05)，在第2h与对照组相比无明显差异，在第3h显著增强(P<0.05)，如图4a所示，结果说明W25K通过表达ST和LT基因影响Y18J的抑菌能力。其平板结果也展示在图像上，如图4b所示。

实施例3

ST/LT对Y18J的抗菌活性的影响。

本实施例通过将Y18J与不同W25K突变体(敲除/回补毒素)共培养，进一步验证ST与LT在调节Y18J拮抗活性中发挥的作用。以Y18J与W25K(ST^-LT^-)共培养组为对照，当Y18J与W25K(ST⁺LT^-)或W25K(ST^-LT^-)ST⁺共培养时，抑菌能力显著下降(P<0.05)，如图5a所示，而与W25K(ST^-LT⁺)或W25K(ST^-LT^-)LT⁺共培养时，Y18J的抑菌能力明显增强，如图5b所示。这些结果证明ST减弱Y18J的抑菌活性而LT增强抑菌活性。

由于肠道是厌氧环境，因此本实施例在厌氧条件下同样进行了细菌-病原菌共培养试验，发现W25K(ST⁺LT^-)在厌氧条件下仍然明显降低Y18J的抑菌活性，而W25K(ST^-LT⁺)则仍然增强Y18J的抑菌作用，如图6所示。

同时本实施例还用琼脂孔扩散试验来评价Y18J的拮抗活性，结果发现，当被测细菌为W25K(ST^-LT⁺)或W25K(ST^-LT^-)LT⁺时，Y18J能产生更强的抑菌活性，如图7所示。

LT由两个亚单位组成，包括LTA和LTB。为探究LTA和LTB对Y18J拮抗活性的影响，本实施例将W25K(ST^-LT^-)LTA⁺或W25K(ST^-LT^-)LTB⁺与Y18J共培养，以及三种菌株共同培养并分别测定了生长曲线。结果表明，W25K(ST^-LT^-)、W25K(ST^-LT^-)LTA⁺和W25K(ST^-LT^-)LTB⁺的生长曲线几乎是相同的，如图8a所示。与W25K(ST^-LT^-)相比，只有当Y18J与W25K(ST^-LT^-)LTA⁺和W25K(ST^-LT^-)LTB⁺三者一起培养时，Y18J对W25K的比例才会明显增加，如图8b所示，表明LTA和LTB对于提高Y18J的拮抗活性都是必不可少的。

实施例4

ST/LT通过Colicin B/M影响Y18J的抗菌活性。

上述实施例中证实ST降低Colicin B/M的表达，并且降低了Y18J的抑菌活性，而LT可以增加Colicin B/M的表达，促进了Y18J的抑菌活性。在此基础上，本实施例假设ST和LT通过改变Colicin B/M的表达来调节Y18J的拮抗活性。

为验证上述假设，本实施例将W25K(ST^-LT^-)与Y18J(野生型和突变型)共同培养，并且向共培养体系中加入纯化的LT或ST后，对照组加入等体积的ddH₂O。为了确定LT的适当浓度，我们建立了浓度梯度，把不同浓度的LT添加至Y18J菌液中，培养2h，其中LT母液浓度为50μg/ml，在1ml共培养体系中加入0.04μg、0.1μg、1μg和25μg。结果发现，微量的LT即可增加Colicin B/M的表达，并选择了0.1μg/mL的浓度进行以下研究，如图9所示。

当Y18J与W25K(ST^-LT^-)共培养时，与对照组相比，LT显著增加了Y18J的抑菌活性(P<0.05)，如图10a所示，但它不能对Y18J(cliB^-M^-)起作用，如图10b所示。此外，纯化的LT在1h和2h内都能显著提高Y18J(cliB^-M^-)cliB⁺以及Y18J(cliB^-M^-)cliM⁺的回补突变体的抗菌活性(P<0.05)，如图10c和10d所示。

同样地，在Y18J与W25K(ST^-LT^-)的共培养体系中加入纯化的ST能显著降低Y18J的抑菌能力(P<0.05)，如图11a所示，但当Y18J(cliB^-M^-)与W25K(ST^-LT^-)共培养时，ST不能发挥降低抑菌能力的作用，如图11b所示。纯化的ST也显著降低了Y18J(cliB^-M^-)cliB⁺(P<0.01)和Y18J(cliB^-M^-)cliM⁺(P<0.05)共培养前2h的抑菌能力，如图11c和11d所示。

同时也发现，ST和LT在3h均未能发挥作用，这可能是因为回补的质粒随着孵化时间的延长而丢失，如图12所示。

实施例5

由于LT是霍乱弧菌Inaba 569B合成的霍乱毒素(CT)的近似物，两者同属AB5毒素家族，而且我们比较了CT和LT的蛋白序列，发现相似度超过80％，图13所示。所以在本实施例中加入商业化的CT代替LT。为了验证CT也可以通过改变Colicin B/M的表达来调节Y18J的拮抗活性，本实施例将W25K(ST^-LT^-)与Y18J(野生型和突变型)共同培养，并且向共培养体系中加入CT，对照组加入等体积的ddH₂O。为了确定CT的适当浓度，我们建立了浓度梯度，把不同浓度的CT添加至Y18J菌液中，培养2h，其中CT母液浓度为50μg/ml，在1ml共培养体系中加入0.04μg、0.1μg、1μg和25μg。结果发现，微量的CT即可增加Colicin B/M的表达，结果如图14所示。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.热不稳定肠毒素或霍乱毒素在制备抑制致病型大肠杆菌活性制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述热不稳定肠毒素或霍乱毒素通过促进共生型大肠杆菌Y18J中细菌素的表达抑制致病型大肠杆菌活性。

3.热不稳定肠毒素或霍乱毒素在制备促进共生型大肠杆菌Y18J中细菌素的表达的制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述细菌素为大肠杆菌素B和/或大肠杆菌素M。

5.热不稳定肠毒素或霍乱毒素在制备治疗仔猪腹泻药物中的应用。

6.根据权利要求1-5任一所述的应用，所述热不稳定肠毒素或霍乱毒素的使用量为0.04～20μg。

7.一种抑制致病型大肠杆菌活性的制剂，其特征在于，所述制剂包括有效剂量的热不稳定肠毒素或霍乱毒素，以及药学上可接受的载体或辅料。

8.一种治疗仔猪腹泻的药物，其特征在于，所述药物包括有效剂量的热不稳定肠毒素或霍乱毒素，以及药学上可接受的载体或辅料。

9.根据权利要求8所述的治疗仔猪腹泻的药物，其特征在于，所述辅料包括赋形剂或稀释剂。