CN116635531A - 含三肽的酵母提取物及其制备方法 - Google Patents

含三肽的酵母提取物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种酵母提取物及其制备方法，其中使用含有三肽的酵母细胞以使酵母提取物具有高三肽含量和高干物质含量。

Description

含三肽的酵母提取物及其制备方法
技术领域
本发明涉及使用含有三肽的酵母细胞的具有高三肽含量和高干产物含量的酵母提取物及其制备方法。
背景技术
谷胱甘肽(L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酸，GSH)是一种存在于细胞中的生理活性物质，以由谷氨酸(glutamate)、半胱氨酸(cysteine)和甘氨酸(glycine)三种氨基酸组成的三肽形式存在。在体内，它以两种形式存在：还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)。谷胱甘肽以0.1-10mM的浓度存在于动物、植物和微生物的细胞中，并且占细胞的全部非蛋白活性成分的90％以上。谷胱甘肽的各种功能不仅在农业方面很重要，而且在医学的许多领域中也是重要的，包括酶学、运输、药理学、治疗学、毒理学、内分泌学和微生物学。
谷胱甘肽可以主要通过使用微生物的发酵或酶促合成方法来生产。由于生产成本高，酶促合成方法尚未商业化，而培养微生物并从细胞中提取谷胱甘肽的方法则在工业领域得到广泛使用。作为用于生产谷胱甘肽的微生物菌株，细胞内谷胱甘肽含量高且被认为是用于食品生产的安全微生物的酵母已经得到广泛使用。特别地，酵母属(Saccharomyces)菌株和假丝酵母(Candida)属菌株具有代表性。就这些酵母的野生型菌株而言，谷胱甘肽浓度已经相当高，约为干重的0.1-1％，以及高密度细胞培养和在低成本培养基中快速生长的优势使得使用酵母进行发酵生产的方法更具竞争力。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的一个实施方案涉及具有高三肽含量的三肽提取物，例如谷胱甘肽提取物，以及制备该三肽提取物的方法。
本发明的进一步实施方案涉及具有高干物质含量同时保持三肽含量的酵母提取物及其制备方法。
本发明的进一步实施方案是提供使用具有高三肽含量和高干物质含量的酵母提取物的食品、食品添加剂、饮料、饮料添加剂、健康功能性食品或药物。
解决技术问题的技术手段
本发明的一个实施方案涉及从含有高含量三肽的酵母细胞中获得的三肽提取物，例如谷胱甘肽提取物，以及该三肽提取物的制备方法。
本发明的进一步实施方案包括在60℃-90℃下使用水抽提含有谷胱甘肽的酵母细胞或该细胞的悬浮液所获得的溶剂提取物，并且涉及含谷胱甘肽的酵母提取物，其中谷胱甘肽含量优选为基于固含量的0.5-20重量％的谷胱甘肽。
本发明的进一步实施方案是用于生产含谷胱甘肽的酵母提取物的方法，其包括获得溶剂提取物的步骤，所述溶剂提取物是在60℃-90℃的温度下使用水抽提含有谷胱甘肽的酵母细胞或该细胞的悬浮液而获得的。优选地，谷胱甘肽含量为基于固含量的0.5-20重量％的谷胱甘肽。
在另一个实施方案中，该溶剂提取物可以通过用蛋白水解酶处理酵母细胞并用水抽提出，具体而言，初级提取物是通过用60℃-90℃的热水抽提含谷胱甘肽的酵母细胞获得的，并且次级提取物是通过用蛋白水解酶处理从初级提取物中回收的酵母细胞然后用水抽提获得的。
本发明涉及使用含有谷胱甘肽的酵母进行的谷胱甘肽抽提和由此制得的谷胱甘肽提取物，其中使用热水抽提方法制得的酵母提取物产率高，并且可以任选地进行热水抽提和蛋白水解酶处理以获得更高产率的提取物，并且可以通过制备具有高蛋白含量的酵母提取物而用于各种应用，例如食品和保健功能产品。
由于生产酵母提取物的目的是应用于核酸和调味物质，本发明旨在提供一种通过对酵母细胞进行热处理和酶处理来高效抽提酵母细胞，从而生产含有三肽(谷胱甘肽)的酵母提取物的方法。
在下文中，将更详细地描述本发明。
本发明的一个实施方案涉及含有谷胱甘肽的酵母提取物，其包含通过用60℃-90℃的热水抽提含有谷胱甘肽的酵母细胞或该细胞的悬浮液而获得的溶剂提取物。
本发明的进一步实施方案涉及谷胱甘肽提取物或含有谷胱甘肽的酵母提取物，其包括通过用60℃-90℃的热水抽提含有谷胱甘肽的酵母细胞或该细胞的悬浮液来获得溶剂提取物的步骤。
该酵母提取物中基于固含量的谷胱甘肽含量为0.5-20重量％、1-20重量％、1.5-20重量％、2.0-20重量％、2.5-20重量％、3.0-20重量％、3.5-20重量％、4.0-20重量％、4.5-20重量％、0.5-18重量％、1-18重量％、1.5-18重量％、2.0-18重量％、2.5-18重量％、3.0-18重量％、3.5-18重量％、4.0-18重量％、0.5-16重量％、1-16重量％、1.5-16重量％、2.0-16重量％、2.5-16重量％、3.0-16重量％、3.5-16重量％、4.0-16重量％、4.5-16重量％、0.5-15重量％、1-15重量％、1.5-15重量％、2.0-15重量％、2.5-15重量％、3.0-15重量％、3.5-15重量％、4.0-15重量％、0.5-14重量％、1-14重量％、1.5-14重量％、2.0-14重量％、2.5-14重量％、3.0-14重量％、3.5-14重量％、4.0-14重量％或4.5至14重量％。在本发明中，由于酵母细胞具有产生三肽如谷胱甘肽的能力，因此可以通过使用酵母细胞中含有谷胱甘肽的酵母作为抽提原料来以高含量和高产量抽提谷胱甘肽，从而制备谷胱甘肽含量高的酵母提取物。
酵母提取物可以是溶剂提取物本身、浓缩液体或通过额外进行干燥过程而获得的干燥产品。浓缩和干燥过程没有特别的限制，但是由于包含肽和蛋白，所以低温处理是优选的，并且包括例如热风干燥或冷冻干燥。
用于制备酵母提取物的抽提原料可以是含有谷胱甘肽的酵母，具体而言，可以是酵母细胞或细胞的悬浮液。酵母可以是选自下列项中的至少一种：酵母属(Saccharomyces)菌株(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、假丝酵母属(Candida)菌株(例如，产朊假丝酵母(Candida utilis))和毕赤酵母属(Pachia)菌株。优选地，它可以为产朊假丝酵母(Candida utilis)。
当使用酵母细胞悬浮液作为抽提原料时，在600nm下测得的细胞浓度的光密度(OD)值为50至500、50至450、50至400、50至350、100至500、100至450、100至400、100至350、150至500、150至450、150至400或150至350。或者，细胞浓度可以为基于细胞干重(DCW)的40-200g/L或40-160g/L。细胞悬浮液可以通过将细胞悬浮在水中来制备，具体而言，可以通过从细胞培养基中回收细胞并将细胞悬浮在水中来制备。
溶剂提取物是通过在60℃-90℃下用水抽提制备的。当用乙醇作为抽提溶剂时，用作食品或药物的酵母提取物需要去除乙醇的步骤，因此存在工业应用的限制和低生产能力的问题。在本发明中，酵母提取物是以水作为抽提溶剂而制备的，因此可以立即摄取，并且通过简单的干燥就可以容易地去除水，这对于工业应用是有利的。
酵母提取物的抽提温度可以使用60℃-90℃的水来调节，例如60℃-90℃，62℃-90℃，64℃-90℃，60℃-98℃，62℃-80℃，64℃-80℃，60℃-75℃，62℃-75℃，64℃-75℃，或65-75℃，但不限于此。
在本发明的进一步实施例中，在60℃-90℃的温度下用水抽提含谷胱甘肽的酵母细胞或细胞的悬浮液获得溶剂提取物的步骤可以通过用蛋白酶处理细胞并用水抽提细胞而获得。
具体而言，溶剂提取物可以包括通过在60℃-90℃下用水抽提含谷胱甘肽的酵母细胞而获得的初级提取物，和通过用蛋白水解酶处理从初级提取物中回收的细胞并用水对它们进行抽提而获得的次级提取物。更具体地，溶剂提取物可以是从初级提取物中获得的上清液和次级提取物的混合物，其中初级提取物是通过在60℃-90℃下用水抽提含谷胱甘肽的酵母细胞而获得的，次级提取物是通过用蛋白水解酶处理从初级提取物中回收的细胞并在60℃-90℃下用水抽提它们而获得的。
对蛋白水解酶没有特别的限制，只要它具有切割肽键的活性即可，但是可以使用内切蛋白酶、外切蛋白酶、它们的混合酶或具有两种活性的复合活性的酶，或者优选可以是内切蛋白酶或内切蛋白酶和外切蛋白酶的混合酶。外切蛋白酶包括作用于氨基末端的氨基末端水解酶和作用于羧基末端的羧基末端水解酶。根据活性位点的氨基酸类型，内切蛋白酶是丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬酰胺蛋白酶和金属蛋白酶。
本发明的蛋白水解酶是指水解食物原料的蛋白的酶。优选地，蛋白水解酶可以选自MULTIFECT、碱性蛋白酶(Alcalase)、复合蛋白酶(Protamex)、中性蛋白酶(Neutrase)、益瑞蛋白酶(Esperase)、风味蛋白酶(Flavourzyme)和真菌蛋白酶(Fungal protease)。碱性蛋白酶是一种丝氨酸型内切蛋白酶，而MULTIFECT是一种金属蛋白酶。本发明中同时具有内肽酶(endopeptidase)和外肽酶(exopeptidase)的复合活性的酶是指同时表现出内肽酶和外肽酶活性的肽酶，并且优选可以选自碱性蛋白酶、风味蛋白酶和真菌蛋白酶，更优选碱性蛋白酶或风味蛋白酶。
在本发明中，为了额外抽提菌株中的有用成分，在用水对细胞进行溶剂抽提后，通过用蛋白水解酶处理进行额外抽提，从而具有增加酵母提取物的干物质产率的优点。酵母提取物的干物质产量主要包括以水作为抽提溶剂洗脱的作为水溶性成分的蛋白和肽。因为本说明书中的酵母提取物包括溶剂提取物，所以它包括从酵母细胞洗脱并溶于水的水溶性物质，例如蛋白和肽。因此，根据本发明的酵母提取物可以包含基于100％的基于固形物的酵母提取物的40重量％以上、50重量％以上、60重量％以上的蛋白和肽含量，并且蛋白和肽含量的上限可以为95重量％以下、90重量％以下、85重量％以下、80重量％以下、75重量％以下或70重量％以下。
在酶处理步骤中，酶的合适量可以是0.5-5ul/ml，但不限于此。
在根据本发明的用于生产酵母提取物的方法中，酵母提取物的干物质产率可以为20重量％至65重量％或者具体是30重量％至45重量％。
在根据本发明的用于制备酵母提取物或溶剂提取物的方法中，用水抽提的步骤为3分钟至240分钟、3分钟至220分钟、3分钟至210分钟、3分钟至200分钟、5分钟至240分钟、5分钟至220分钟、5分钟至210分钟、5分钟至200分钟、7分钟至240分钟、7分钟至220分钟、7分钟至210分钟、7分钟至200分钟、9分钟至240分钟、9分钟至220分钟、9分钟至210分钟、9分钟至200分钟、9分钟至190分钟、9分钟至180分钟、9分钟至170分钟、9分钟至160分钟、9分钟至150分钟、9分钟至140分钟、9分钟至130分钟或9分钟至125分钟，或例如10分钟至120分钟。
在根据本发明的酵母提取物的制造方法或溶剂提取物中，由于酵母提取物包含大量的蛋白和肽，所以通过调节抽提时间和抽提温度，优选在高温抽提的情况下调整至短时间，或者在相对低温抽提的情况下调整至长时间，可以确保获得最大抽提产率。例如，当使用80℃-90℃的水进行抽提时，可以设定为60分钟以下，这是相对较短的时间，例如3-60分钟或5-30分钟。或者，当在85℃以下的温度条件下，例如在60℃-85℃、60℃-80℃或60℃-75℃下进行抽提时，则可以通过适当选择条件来进行7-240分钟、9-240分钟或10-240分钟的抽提。
在根据本发明的酵母提取物的制造方法或溶剂提取物中，抽提时间可以根据抽提液的量进行适当调整。例如，当抽提液的量为10-1000ml时，抽提时间可以调整至约25分钟，当抽提液的量为1000-2000ml时，抽提时间可以调整至约35分钟，但不限于此。
在根据本发明的酵母提取物的制造方法或溶剂提取物中，可以在搅拌或混合抽提溶液的同时进行抽提。例如，可以在使用磁力搅拌器以100-1000转/分(rpm)搅拌的同时进行抽提，以便将溶液充分混合。
本发明涉及使用含有谷胱甘肽的酵母进行谷胱甘肽抽提，并涉及由此制备的谷胱甘肽提取物，使用热水抽提法获得的产率为20重量％以上、22重量％以上或25重量％以上，例如20重量％至45重量％。此外，通过与热水抽提一起进行酶处理，可以获得高产率的提取物，即具有65％或更高的高蛋白含量的酵母提取物。该提取物可用于各种应用领域，如食品和保健功能产品等。
发明效果
本发明涉及使用含有谷胱甘肽的酵母的谷胱甘肽抽提和由此制备的谷胱甘肽提取物，其中使用热水抽提法制备的提取物产率高。此外，通过与热水抽提一起进行酶处理，可以获得干物质产率为60％以上的提取物。该提取物可用于各种应用，如食品和保健功能产品。
附图说明
图1示出了根据本发明的一个实施例，在使用90℃的热水抽提期间，三肽(谷胱甘肽)含量随时间推移的图。
图2示出了根据本发明的一个实施例，在使用80℃热水抽提期间，三肽(谷胱甘肽)含量随时间推移的图。
图3示出了根据本发明的一个实施例，在使用70℃热水抽提期间，三肽(谷胱甘肽)含量随时间推移的图。
图4示出了根据本发明的一个实施例，在使用65℃热水抽提期间，三肽(谷胱甘肽)含量随时间推移的图。
图5示出了根据本发明的一个实施例，在使用60℃热水抽提期间，三肽(谷胱甘肽)含量随时间推移的图。
图6为示出在本发明的实施例中根据蛋白酶的类型和浓度获得的干燥提取物含量的产率(重量/重量％)的图。
具体实施方式
本发明将参照以下实施例进行更详细地解释，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：产谷胱甘肽微生物的制备
1-1：菌株制备
为了筛选产谷胱甘肽的微生物，从韩国各地的传统市场购买米酒(马格利酒(Makgeolli))、酒曲和传统豆瓣酱，并使用它们作为样品。将1g样品悬浮在10mL的0.85％NaCl中，将100μl的悬浮液涂布在YPD(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，右旋糖20g/L，pH6.5至6.8)琼脂平板上，并在30℃下进行固体培养2天。通过选择不同形状和大小的菌落从在固体培养基上生长的菌落中分离出150个单菌落，然后在含有YPD肉汤(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，右旋糖20g/L)的试管中于30℃下搅拌培养24小时，以获得菌株培养物。
通过测量菌株培养物在600nm处的吸光度来确定细胞浓度，测得的吸光度(细胞光密度，OD)为17.8。
1-2：谷胱甘肽含量分析
将菌株培养液离心以除去上清液，并且用蒸馏水洗涤一次来收集细胞。向收集到的细胞中加入40～70％的乙醇，用精细混合器抽提细胞内谷胱甘肽10～30分钟。将抽提液离心后，取上清液与溶于0.5M pH8.0的磷酸钾缓冲液中的10mM DTNB(5,5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)在40℃下反应20分钟，通过测量412nm处的吸光度来确定谷胱甘肽含量(GSHmg/L)。通常用于谷胱甘肽含量分析的DTNB，被称为Ellman试剂，用于检测硫醇化合物。GSH与DTNB反应生成黄色的2-硝基-5-苯甲酸和GSSG，可以通过测量412nm处的OD值计算出GSH的浓度。测得的谷胱甘肽含量为112mg/mL。
1-3：每克细胞干重(g)的谷胱甘肽含量的测量
将菌株培养液离心以去除上清液，并且用蒸馏水洗涤一次以收集微生物细胞。对收集到的细胞测量吸光度，并根据吸光度值计算干燥后的细胞重量。具体地，为了测量细胞干重(g)，将细胞培养液离心以去除上清液，而仅收集微生物细胞。用0.9％NaCl洗涤收集到的细胞，并用蒸馏水稀释以制备吸光度值为0.1-1的样品。在600nm处测量稀释后的细胞样品的吸光度，并根据吸光度值计算细胞干重。测量吸光度后，用0.2μm滤纸在减压下过滤细胞。将保留有细胞的滤纸在60℃下干燥12小时以上，在含有硅胶的干燥器中放置6小时以上，然后测量细胞重量。通过计算空滤纸和过滤出细胞的滤纸之间的重量差来确定干燥细胞的量。因此，可以根据吸光度值来确定干燥细胞浓度(g/L)。
测量吸光度后，以与实施例1-2基本相同的方式从细胞中抽提谷胱甘肽，并将抽提液离心以取上清液，然后测量产生的谷胱甘肽的产量(g/L)。将测得的谷胱甘肽的产量除以计算得到的干细胞浓度(g/L)，然后乘以100以计算每干细胞重量(g)的GSH％。该菌株的每克干细胞重量(g)的谷胱甘肽含量(生产率，GSH(％)/g-细胞)为1.6％。
1-4：醇脱氢酶(ADH)活性测定
使用ADH活性测定试剂盒(艾博抗公司)分析ADH活性。具体地，在YPD培养基中于30℃下培养24-48小时后，收集细胞至1×106CFU/ml。用蒸馏水洗涤收集到的细胞，然后加入ADH分析缓冲液，用珠搅拌器(bead beater)破碎细胞壁。作为反应溶液的成分，将50μl样品或NADH标准物质与82μl ADH分析缓冲液(assay buffer)、8μl显色液(Developer)和10μl异丙醇混合。在37℃下反应3分钟后，在450nm处测量实验组(A0)和对照组的吸光度。在37℃下额外反应30分钟后，测量450nm处吸光度的变化，并计算每单位时间(分钟)产生的NADH的量。
因此，该菌株是具有高OD值和高谷胱甘肽产量的SYC-PR20菌株，其为登记号为KCCM 12777P的产朊假丝酵母(Candida utilis)SYC-PR20。该菌株具有优异的特性，例如谷胱甘肽产量为1.6％，ADH活性为0.26mU/ml，并且具有SEQ ID NO:1的18S rDNA序列。
1-5：细胞的获取
作为种子培养物，称取3mL的菌株培养物，接种到含有50mL的YPD培养基的三角烧瓶中。在30℃下振荡培养48小时，取样1ml培养液，并在12000rpm下离心5分钟。去除上清液的培养基成分，用等量的蒸馏水洗涤细胞，并在12000rpm下离心5分钟获得细胞。
实施例2：依赖于抽提温度的谷胱甘肽的抽提
2-1：抽提样品
作为回收细胞中三肽(谷胱甘肽)的方法，加入蒸馏水使细胞悬浮以将细胞浓度调整到一定浓度，并在不同抽提温度下进行抽提以确定三肽(谷胱甘肽)的最佳抽提条件。
使用实施例1中获得的产谷胱甘肽菌株产朊假丝酵母SYC-PR20，并且以与实施例1中相同的方式获得细胞并悬浮在蒸馏水中，以将OD600值调整到100，从而制备稀释的细胞溶液。使用稀释后的细胞溶液作为热水抽提的样品。
2-2：谷胱甘肽抽提
将细胞悬浮在蒸馏水中以将OD600值调整到100，从而将制得的细胞稀释液用作抽提样品，并用90℃、80℃、70℃、65℃和60℃五种温度的热水对样品进行谷胱甘肽抽提。
具体地，使用恒温水浴调整抽提温度，并且通过将抽提液的量调整到100mL来进行抽提。在抽提过程中，使用磁力搅拌器以100至1000rpm搅拌溶液以充分混合。在抽提过程中，以5分钟或10分钟的间隔取出待分析的样品，并通过DTNB显色方法对提取物中包含的谷胱甘肽的含量进行定量。
将抽提液离心后，取上清液并在40℃下与溶解在0.5M pH8.0的磷酸钾缓冲液中的10mM DTNB(5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸))反应20分钟，通过测量412nm处的吸光度来确定谷胱甘肽含量并测量所述谷胱甘肽含量(GSH mg/L)。DTNB主要用于谷胱甘肽分析，被称为设计用于检测硫醇化合物的Ellman试剂。DTNB与GSH反应生成黄色的2-硝基-5-苯甲酸和GSSG，通过测量412nm处的OD值可以计算出GSH的浓度。GSSG被谷胱甘肽还原酶还原成GSH，并形成一个再循环系统，再次与DTNB反应。图1至图5中分别示出了提取物中谷胱甘肽含量随热水温度变化的分析结果。图1至图5所示根据热水温度抽提得到的谷胱甘肽的最大含量和达到该最大含量的时间在下面的表1中示出。
[表1]
根据表1和图1至图5中的抽提结果，在80℃和90℃的抽提温度下达到最大GSH含量的抽提时间为约5分钟，并且谷胱甘肽含量随着抽提时间的推移而略微降低。因此，优选在高温和短时间内抽提谷胱甘肽。此外，随着抽提温度的降低，达到最大GSH含量的抽提时间趋于增加，并且最大谷胱甘肽抽提含量在60℃以下的温度下逐渐降低。
因此，考虑到谷胱甘肽的最大抽提含量和达到谷胱甘肽最大抽提含量的时间，以及当在工业上应用时升高温度的成本和当在高温下短时间抽提时控制温度的容易程度，推荐抽提温度为70℃。在抽提温度为70℃的条件下，当抽提时间为10分钟以上时，谷胱甘肽的抽提含量最大，并且直到20分钟几乎保持恒定。
实施例3：根据细胞浓度测量干物质产率
在本实施例中，根据用于抽提的样品的细胞浓度，通过测量酵母提取物的干物质含量、干物质产率和GSH含量来设定最佳抽提条件。
具体地，在制备实施例2-1中制备的抽提样品的过程中，将细胞悬浮在蒸馏水中以将OD600值调整到100至500，以制备具有不同细胞浓度的六种稀释的细胞溶液(表2)。
使用制得的稀释的细胞溶液，以与实施例2-2中基本相同的方式，使用70℃的热水抽提谷胱甘肽，并从所得抽提液中除去糊状物(PASTE)以获得粗抽提液，测量粗抽提液的体积并示于表2中。将粗抽提液冷冻干燥以制备粗提物的干粉。将10ml粗抽提液在高速真空浓缩机中冷冻干燥，并测量所得干粉的重量，干重(g/L)示于下表2中。表2示出了从粗提物中获得的干物质的总干重(g)，其通过将干物质重量乘以回收的液体量而得到。将获得的总干重(g)输入下面的等式1得到干物质产率，并在下面的表2中以重量/重量％表示。在下面的等式1中，OD是在600nm波长下测得的光密度，表示细胞浓度。
[等式1]
干物质的产率＝干物质的总重量(g)/(OD*0.4)*100
[表2]
如表2中所示，经证实，对于500的OD600，酵母提取物的干物质产率为23.92％(重量/重量)，并且对于250的细胞浓度OD600值，酵母提取物的干物质产率最高。因此，由于总干物质含量和GSH含量％随着细胞浓度的增加而增加，细胞浓度(OD)值越高越有利。然而，随着细胞OD值的增加，回收的液体量减少，干物质产率降低。因此，优选通过考虑干燥产物的产率来适当调整细胞浓度。因此，考虑到作为上述实验结果的干物质产率和GSH含量，可以在OD值为50至500，或优选100至400下进行抽提。
实施例4：使用蛋白酶抽提谷胱甘肽
在本实施例中，试图通过用蛋白水解酶(蛋白酶)处理来增加谷胱甘肽的抽提含量并增加酵母提取物的干物质产率。因此，在进行热水抽提之前的步骤中，用酶处理稀释的细胞溶液，并将抽提和洗脱的GSH含量确定为测量指标，以便直接测试酶的效果。使用蛋白酶加速细胞降解以快速洗脱细胞内谷胱甘肽，而洗脱的谷胱甘肽会随时间降解，导致含量低。因此，试图选择一种随着时间的推移谷胱甘肽含量大幅减少且酶量增加的酶。。
作为蛋白水解酶，选择并测试了总共4种类型，包括诺维信公司(Novozyme)的碱性蛋白酶(商品名)和风味蛋白酶(商品名)两种类型，以及Multifect(商品名)和木瓜蛋白酶两种类型。蛋白酶的一般特征表现为内切型(碱性蛋白酶)和外切型(木瓜蛋白酶)两种类型，风味蛋白酶是这两种类型的混合物。
具体地，以与实施例2-1中相同的方式制备用于酶处理和抽提的样品。将制备的细胞稀释样品分装到1.5ml反应体积的E管中，并将四种酶分别以0、1、2、5、10和15μl/ml的量添加到分装的细胞稀释溶液中。酶反应在50℃的温度下进行120分钟，在30分钟、60分钟和120分钟时取样，并使用DTNB显色方法以与实施例2-2中基本相同的方式分析谷胱甘肽含量。表3示出了取决于四种酶的类型和使用量(ul/ml)的GSH含量(uM)。
[表3]
酶 分钟 0ul/ml 1ul/ml 2ul/ml 6ul/ml 10ul/ml 15ul/ml
碱性蛋白酶 30 0.87 0.67 0.60 0.45 0.34 0.27
碱性蛋白酶 60 0.65 0.38 0.30 0.17 0.10 0.07
碱性蛋白酶 120 0.31 0.03 0.03 0.02 0.01 0.01
风味蛋白酶 30 0.80 0.76 0.71 0.60 0.45 0.33
风味蛋白酶 60 0.65 0.57 0.52 0.40 0.25 0.16
风味蛋白酶 120 0.28 0.19 0.15 0.08 0.05 0.04
Multifec 30 0.83 0.82 0.81 0.81 0.77 0.71
Multifec 60 0.64 0.63 0.62 0.62 0.57 0.49
Multifec 120 0.28 0.24 0.25 0.24 0.19 0.12
木瓜蛋白酶 30 0.83 0.82 0.86 1.31 1.99 2.56
木瓜蛋白酶 60 0.63 0.51 0.53 0.97 1.64 2.22
木瓜蛋白酶 120 0.29 0.10 0.10 0.35 0.91 1.46
当用4种类型的蛋白酶处理含谷胱甘肽的细胞时，研究了GSH含量随蛋白酶浓度变化而变化的情况。在碱性蛋白酶和风味蛋白酶的情况下，根据酶浓度检测GSH含量的变化，这间接证实了它们对细胞壁的作用。另一方面，multifec没有根据酶浓度的变化。木瓜蛋白酶影响GSH显色方法，因此被排除在实验之外。选择GSH含量变化显著的两种酶(碱性蛋白酶和风味蛋白酶)。
实施例5：使用蛋白酶和热水抽提谷胱甘肽
在使用热水对细胞进行溶剂抽提后，通过用蛋白水解酶处理进行额外的抽提，以额外抽提细胞中的有用成分，从而增加酵母提取物的干物质的产率。酵母提取物的干物质产率主要包括蛋白和肽，它们是以水作为抽提溶剂洗脱的水溶性成分。
具体地，通过以与实施例2-1中相同的方式将细胞悬浮在蒸馏水中以将OD600值调整到100来制备用于酶处理和抽提的样品，以制备100mL细胞稀释样品。将制得的样品分别分装到三个30-35ml的flacon管中。以与实施例2中基本相同的方式，在70℃下使用热水从分装到flacon管中的细胞稀释液中抽提谷胱甘肽25分钟。将抽提物离心并回收上清液以制备粗提物。
在向回收上清液后剩余的细胞糊状物中加入90mL蒸馏水后，分别以1ul/ml(0.001％)、5ul/ml(0.005％)和10ul/ml(0.01％)的酶浓度加入两种诺维信公司(Novozyme)的碱性蛋白酶和风味蛋白酶，并在50℃的温度下进行酶反应120分钟。
使用70℃的热水对酶反应产物溶液进行25分钟的谷胱甘肽二次抽提。将二次抽提物离心并回收上清液以制备二次粗提物。
以与实施例2-2中基本相同的方式，通过DTNB显色法分析通过混合第一粗提物和第二粗提物获得的提取物样品中包含的谷胱甘肽含量。
此外，将混合样品冻干以制备粗提物的干粉，并测量在高速真空浓缩机中冷冻干燥10ml粗提液后获得的干粉的重量以获得干重(g/L)。通过干重乘以回收的液体量来计算粗提物干物质的总重量(g)。将上文获得的总干物质重量(g)输入等式1以获得干物质产率(重量/重量％)，其在表4中以重量/重量％示出。此外，依赖于蛋白酶类型和浓度的提取物的干物质产率示于图6中。
[表4]
如表4中所示，当在用蛋白水解酶处理后通过热水抽提获得二次抽提物时，可以以高产率有利地获得干酵母提取物，而不会降低谷胱甘肽的含量，并且碱性蛋白酶更优选作为蛋白水解酶。在实验范围内，酵母提取物的干物质产率随着处理酶量的增加而增加。

Claims (16)

1.一种制备酵母提取物的方法，所述酵母提取物含有基于固含量的0.5-20重量％的谷胱甘肽，所述方法包括在60℃-90℃下用水抽提含有谷胱甘肽的酵母细胞或所述细胞的悬浮液来获得溶剂提取物的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述获得溶剂提取物的步骤包括获得初级提取物和次级提取物，其中所述初级提取物通过在60℃-90℃下用水抽提含谷胱甘肽的酵母细胞获得，并且所述次级提取物通过用蛋白水解酶处理从所述初级提取物中回收的细胞并用水抽提获得。
3.根据权利要求1所述的方法，其还包括通过干燥所述溶剂提取物获得干燥产物的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述酵母提取物的干物质产率为20重量％-65重量％。
5.根据权利要求3所述的方法，其中在所述获得溶剂提取物的步骤中，用水抽提的时间为10分钟至120分钟。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在600nm下测得的所述细胞的悬浮液的细胞浓度的光密度(OD)值为50至500。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述酵母为产朊假丝酵母(Candida utilis)。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述蛋白水解酶为内切蛋白酶或内切蛋白酶和外切蛋白酶的混合酶。
9.根据权利要求2所述的方法，其中所述蛋白水解酶的处理量为0.5-5ul/ml。
10.一种酵母提取物，其包含在60℃-90℃的温度下使用水对含有谷胱甘肽的酵母细胞或所述细胞的悬浮液进行抽提而得到的溶剂提取物，并且含有基于固含量的0.5-20重量％的谷胱甘肽。
11.根据权利要求10所述的酵母提取物，其中所述溶剂提取物通过用水抽提经蛋白水解酶处理的酵母细胞或所述细胞的悬浮液而获得。
12.根据权利要求11所述的酵母提取物，其中所述溶剂提取物包括初级提取物和次级提取物，其中所述初级提取物通过在60℃-90℃下用水抽提含谷胱甘肽的酵母细胞获得，并且所述次级提取物通过用蛋白水解酶处理从所述初级提取物中回收的细胞并用水抽提获得。
13.根据权利要求11所述的酵母提取物，其中所述蛋白水解酶为内切蛋白酶或内切蛋白酶和外切蛋白酶的混合酶。
14.根据权利要求11所述的酵母提取物，其中所述蛋白水解酶的处理量为0.5-5ul/ml。
15.根据权利要求10所述的酵母提取物，其中所述酵母为产朊假丝酵母。
16.根据权利要求10所述的酵母提取物，其中所述酵母提取物为通过干燥所述溶剂提取物获得的干燥产物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2004283125A (ja) * 2003-03-25 2004-10-14 Kohjin Co Ltd 酸化型グルタチオン高含有酵母エキス及びその製造方法
KR101150148B1 (ko) * 2010-04-23 2012-06-08 샘표식품 주식회사 글루타치온 함량이 증대된 신규 효모 변이주, 그 제조 방법 및 용도
JPWO2016186010A1 (ja) * 2015-05-15 2018-03-01 味の素株式会社 酵母エキス含有乾燥組成物及びその製造方法
JP6789214B2 (ja) * 2015-05-29 2020-11-25 三菱商事ライフサイエンス株式会社 血管弛緩作用を有する酵母エキス
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