CN116622653A - 一种鱼类灭活病毒疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种通过电子束辐照制备鱼类灭活病毒疫苗的方法及制备的鱼类灭活病毒疫苗。该方法包括：取分离纯化后的鱼类相关病毒稀释至设定终浓度，计为初始滴度；然后对病毒进行梯度辐照直至病毒滴度下降至初始滴度的1/10，将对应的辐照总剂量±0.15kGy计为该病毒的D10值；按照以下公式计算灭菌剂量SD值：SD＝kD10Lg(N0/N)，其中，N0为初始滴度，N取SAL＝10‑6，k为安全系数且k≥1；按照辐照累计剂量≥SD值，终浓度为所述初始滴度的纯化后的鱼类相关病毒样本进行小剂量多次辐照。上述方法灭活后的病毒免疫原性高，产品性能可靠性更佳；且该方法可以最大限度克服由于传统灭活方式造成的病毒表面蛋白、多肽、多糖等生物活性物质活性不可逆的破坏。
Description
技术领域
本发明涉及病毒灭活、疫苗制备技术领域，具体涉及一种鱼类灭活病毒疫苗以及通过电子束辐照制备该鱼类灭活病毒疫苗的方法。
背景技术
通过注射疫苗来预防病原感染，是具有特异性免疫系统的动物行之有效的无公害疾病防治技术。这一技术方法在鱼类中同样适用。一般地，鱼类疫苗多为灭活病毒疫苗，其特点是制备工艺简单、成熟，根据特定区域鱼类疾病，现制现用。
目前国内的灭活型鱼类疫苗多采用化学灭活技术，该灭活技术稳定可靠，通过使病毒表面蛋白变性等方式实现的，但这也导致了病毒免疫原性较低，制备的成品疫苗的有效性降低等缺陷，诱发鱼体产生抗体效价较低；同时，鱼类组织蛋白对病毒抗原起到干扰作用。病毒通过化学灭活后，直接注射到未患病鱼体内。传统的辐射法处理病毒，在灭活病毒的同时，同样会造成病毒表面蛋白构象的改变，从而降低其免疫原性，该方法目前通常应用于消毒灭菌领域。因此仅仅使用辐射法生产鱼类疫苗，其技术上并不占优，因此，国内外研究者甚少。
针对传统的热灭活或化学灭活病毒制备疫苗中所存在的问题，以及单纯的通过辐照灭菌手段的来灭活病毒，同样造成免疫原性较低的现状，亟需通过电子束(Electronbeam,EB)辐照技术来开发出新的鱼类病毒灭活工艺，从而获得全新的灭活型病毒疫苗的制备方法。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种通过电子束辐照制备鱼类灭活病毒疫苗的方法及制备的鱼类灭活病毒疫苗。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面是提供一种通过电子束辐照制备鱼类灭活病毒疫苗的方法，其包括如下步骤：
步骤一，病毒D10值的建立：取分离纯化后的鱼类相关病毒稀释至设定终浓度，计为初始滴度；然后对病毒进行梯度辐照直至病毒滴度下降至初始滴度的1/10，将对应的辐照总剂量±0.15kGy计为该病毒的D10值；
步骤二，按照以下公式计算灭菌剂量SD值：
SD＝kD10Lg(N0/N)，其中，N0为初始滴度，N取SAL＝10-6，k为安全系数且k≥1；
步骤三，辐照：按照辐照累计剂量≥SD值，对上述终浓度为初始滴度的纯化后的鱼类相关病毒样本进行小剂量多次辐照；
步骤四，低温脱盐和除菌，最后进行无菌灌装。
进一步地，上述初始浓度为103～104TCID50，优选为105TCID50。
进一步地，步骤一中稀释采用的稀释液中添加有半乳糖、D-异抗坏血酸钠和亚硝酸钠。
进一步地，半乳糖的浓度为1～3％，优选为2％。
进一步地，D-异抗坏血酸钠的浓度为4～7‰，优选为5‰。
进一步地，亚硝酸钠的浓度为0.5-2.0‰，优选为1‰。
进一步地，步骤一中的辐照条件为：将病毒稀释液梯度降温至-20℃，采用能量为10MeV的电子加速器进行梯度辐照。
进一步地，梯度辐照剂量为0.2kGy、0.4kGy、0.6kGy、0.8kGy、1.0kGy、1.2kGy、1.4kGy、1.6kGy。
进一步地，k＝1。
进一步地，步骤三中每次辐照的剂量不超过3kGy。
进一步地，步骤三中将病毒样本梯度降温至-20℃，采用能量为10MeV的电子加速器进行梯度辐照。
进一步地，步骤三中辐照完成后，梯度升温至0～10℃。
进一步地，步骤三中还包括对辐照完成的病毒样本进行灭活效果测试。
本发明的第二方面是提供上述方法制备的鱼类灭活病毒疫苗。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明采用电子束对鱼类病毒进行辐照灭菌、灭活操作，灭活后的病毒免疫原性高，产品性能均一，稳定性好，批次内与批次间差异小，产品性能可靠性更佳；且本发明提供的处理方法，可以最大限度克服由于传统灭活方式造成的病毒表面蛋白、多肽、多糖等生物活性物质活性不可逆的破坏。该方法创造性的实现了辐照灭活制备疫苗的工艺，有助于提升鱼类疫苗产能与品质。
附图说明
图1显示了本发明一实施例中GiCF细胞感染CyHV-2病毒以及CyHV-2灭活病毒的细胞病变过程；图1(a)代表正常GiCF细胞培养第1、3、7天的状态；图1(b)代表GiCF细胞感染阳性对照病毒后第1、3、7天的出现细胞病变效应的状态，图1(b3)代表阳性对照病毒感染GiCF细胞后第3天出现CPE的状态，图1(b7)代表阳性对照病毒感染GiCF细胞7天后细胞死亡从细胞培养瓶瓶底脱落超过90％的情况；图1(c1,c3,c7)为1.3kGy EB辐照后病毒感染实验，1-3天GiCF细胞并未出现病感染现象，第7天发现出现CPE现象，约半数细胞死亡并脱落；图1(d1,d3,d7)为6.6kGy EB辐照后病毒感染实验组，1-7天都未发现细胞出现CPE现象，即可说明辐照后病毒已无感染能力；
图2显示了本发明一实施例中不同辐照剂量下EB辐照前后CyHV-2病毒DNA拷贝数的变化；
图3显示了本发明一实施例中SDS-PAGE检测EB辐照后CyHV-2病毒蛋白的结果，其中M表示ladder，1～6分别显示阳性对照组、以及辐照剂量为6.0、6.2、6.4、6.6、6.8的处理组；
图4显示了本发明一实施例中电子束灭活的抗原与抗血清结合的ELISA试验结果。
具体实施方式
本发明提供了一种通过电子束辐照制备鱼类灭活病毒疫苗的方法，其包括如下步骤：
步骤一，病毒D10值的建立：取分离纯化后的鱼类相关病毒稀释至设定终浓度，计为初始滴度；然后对病毒进行梯度辐照直至病毒滴度下降至初始滴度的1/10，将对应的辐照总剂量±0.15kGy计为该病毒的D10值；
步骤二，按照以下公式计算灭菌剂量SD值：
SD＝kD10Lg(N0/N)，其中，N0为初始滴度，N取SAL＝10-6，k为安全系数且k≥1；
步骤三，辐照：按照辐照累计剂量≥SD值，对上述终浓度为初始滴度的纯化后的鱼类相关病毒进行小剂量多次辐照；
步骤四，低温脱盐和除菌，最后进行无菌灌装。
在本发明一优选的实施方式中，上述初始浓度为103～104TCID50，优选为105TCID50。
在本发明一优选的实施方式中，步骤一中稀释采用的稀释液中添加有半乳糖、D-异抗坏血酸钠和亚硝酸钠，在病毒灭菌、灭活过程中这些添加剂可保护病毒免疫原性的表面蛋白、多肽或多糖的空间构象，以及在辐照后梯度升温阶段降低因盐分对局部组织的刺激作用，协助失活的免疫原性物质活性的恢复。
在本发明一优选的实施方式中，半乳糖的浓度为1～3％，优选为2％。
在本发明一优选的实施方式中，D-异抗坏血酸钠的浓度为4～7‰，优选为5‰。
在本发明一优选的实施方式中，亚硝酸钠的浓度为0.5-2.0‰，优选为1‰。
在本发明一优选的实施方式中，步骤一中的辐照条件为：将病毒稀释液梯度降温至-20℃，采用能量为10MeV的电子加速器进行梯度辐照。
在本发明一优选的实施方式中，梯度辐照剂量为0.2kGy、0.4kGy、0.6kGy、0.8kGy、1.0kGy、1.2kGy、1.4kGy、1.6kGy。
在本发明一优选的实施方式中，k＝1。
在本发明一优选的实施方式中，步骤三中每次辐照的剂量不超过3kGy。
在本发明一优选的实施方式中，步骤三中将病毒样本梯度降温至-20℃，采用能量为10MeV的电子加速器进行梯度辐照。
在本发明一优选的实施方式中，步骤三中辐照完成后，梯度升温至0～10℃。
在本发明一优选的实施方式中，步骤三中还包括对辐照完成的病毒样本进行灭活效果测试，包括但不限于进行细胞感染实验观察细胞病变效应或进行荧光定量PCR。
本发明的第二方面是提供上述方法制备的鱼类灭活病毒疫苗。
在本发明中，“梯度降温”优选每小时降温10℃，“梯度升温”优选每小时升温10℃。
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例一种通过电子束辐照制备鱼类鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)灭活疫苗的方法，其包括以下步骤：
步骤一：病毒D10值的建立：从明显患病的鲤鱼肝脏中提取鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)，分离、纯化后扩增培养；将纯化后的鲤疱疹病毒2型采用稀释液进行稀释至终浓度为105TCID50/mL；稀释液内添加2％的半乳糖、5‰的D-异抗坏血酸钠以及1‰的亚硝酸钠以灭菌过程中为尽可能地保护表面抗原ORF92的空间构象；将上述病毒含量的稀释液进行梯度降温至-20℃，采用能量为10MeV的电子加速器进行梯度辐照，梯度辐照剂量为0.2kGy、0.4kGy、0.6kGy、0.8kGy、1.0kGy、1.2kGy、1.4kGy、1.6kGy；测定出不同辐照总剂量下的病毒滴度。以倍比稀释后未辐照的病毒样本，与以不同剂量辐照后的样本的滴度进行比较。经病毒辐照后滴度测定，该病毒滴度由105TCID50/mL下降至104TCID50/mL所需的平均剂量在0.52至0.59kGy，实践中，为安全起见，取0.6kGy为该病毒在该辐照条件下的D10值。
步骤二：计算该病毒的灭菌剂量SD值；SD＝kD10Lg(N0/N)，其中N0为辐照前病毒的滴度，鱼类病毒，N取SAL＝10-6，k取1。滴度为105TCID50/mL的1ml病毒样本的电子束灭菌剂量SD＝1*0.6*11＝6.6kGy。
步骤三：梯度降温后辐照灭菌工艺的建立：根据灭菌剂量SD值，以及样品装载方式的剂量分布确定辐照加工工艺；将装有滴度为105TCID50/mL的1ml病毒样本的2ml规格的西林瓶均匀排布在2cm厚的泡沫板中，每个样本周边间距为2.5cm，装有样本的泡沫板上下采用厚度为5cm泡沫板保温。该病毒样本梯度降温至-20℃后冷冻辐照，辐照采用小剂量多次的累计辐照方式，每次辐照表面剂量不超过3kGy，辐照累计剂量达到加工工艺要求的最低6.6kGy时，辐照完成。辐照后再梯度升温至0～10℃；梯度降温为每小时降温10℃，梯度升温每小时升温10℃。
步骤四，低温脱盐；对辐照灭菌、灭活彻底的样本进行0～10℃低温脱盐处理以降低因盐分对局部组织的刺激作用。
步骤五，低温超滤除菌及无菌灌装：对低温脱盐处理后的样品进行0～10℃低温过滤除菌，并进行低温无菌灌装后即为备用疫苗，制备完成的灭活疫苗-20℃保存。
实施例2灭菌后样本灭活效果测试
(1)采用实施例1步骤三灭活后样本进行细胞感染试验，未辐照的病毒作为阳性对照，添加病毒培养基的正常细胞作为阴性对照，记录细胞出现细胞病变效应(cytopathogenic effect,CPE)的状态。以GiCF细胞为样本进行实验，培养3天后显微镜下观察CPE效应，盲传3次后显微镜下观察仍无CPE效应，同时辅以荧光定量以证明病毒是否在细胞中进行增殖；结果可得：3次细胞培养无病变(图1)。
(2)EB辐照实际吸收剂量为6.35kGy及以上时，病毒的拷贝数几乎为零，甚至检测不到。将经EB照射后的CyHV-2病毒再次感染GiCF细胞，并提取感染前后的病毒DNA进行荧光定量PCR。结果表明(如图2)，当EB辐照剂量为1.71kGy时比较再次感染前后病毒DNA的拷贝数，显示拷贝数下降极显著(P<0.001)，且6.35kGy辐照组同2.18kGy组相比下降趋势同样极显著(P<0.001)。6.35kGy组及更大的剂量组病毒DNA拷贝数接近于零。即证明经6.6kGy辐照后的病毒已失去在细胞内增殖的能力，代表病毒灭活彻底。
实施例3抗原活性测定
(1)经过蛋白纯化后的实施例1中灭活病毒的衣壳蛋白ORF92过SDS-PAGE进行分析，辐照剂量在6.0kGy-6.8kGy的范围内时，在55kDa处显示出了目的条带(图3)，证实其空间结构破坏较小，即其衣壳蛋白保留完整，仍有较好的抗原活性。
(2)ELISA实验：用CyHV-2病毒与抗血清反应时的抗原抗体反应，抗原抗体反应阳性表现为P/N大于2.1，且值越大，表示能够与抗体结合的抗原数量越多，即抗原的免疫原性好。将电子束处理过的抗原进行间接ELISA试验，未经过处理的纯化病毒作为阴性对照。如图4所示，电子束组的P/N值与未经过任何处理的病毒组(即阴性对照)相比有显著下降趋势(P<0.05)。但电子束组的P/N值大于2.1，可证明病毒依然保有较好的抗原活性。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (11)
1.一种通过电子束辐照制备鱼类灭活病毒疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，病毒D10值的建立：取分离纯化后的鱼类相关病毒稀释至设定终浓度，计为初始滴度；然后对病毒进行梯度辐照直至病毒滴度下降至初始滴度的1/10，将对应的辐照总剂量±0.15kGy计为所述病毒的D10值；
步骤二，按照以下公式计算灭菌剂量SD值：
SD＝kD10Lg(N0/N)，其中，N0为初始滴度，N取SAL＝10-6，k为安全系数且k≥1；
步骤三，辐照：按照辐照累计剂量≥SD值，对终浓度为所述初始滴度的纯化后的鱼类相关病毒样本进行小剂量多次辐照；
步骤四，低温脱盐和除菌，最后进行无菌灌装。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初始浓度为103～104TCID50，优选为105TCID50。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中将分离纯化后的鱼类相关病毒进行扩增培养后，进行滴度的测定；测定的过程中采用的稀释液中添加有半乳糖、D-异抗坏血酸钠和亚硝酸钠。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，半乳糖的浓度为1～3％，优选为2％；D-异抗坏血酸钠的浓度为4～7‰，优选为5‰；亚硝酸钠的浓度为0.5-2.0‰，优选为1‰。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中的辐照条件为：将病毒稀释液梯度降温至-20℃，采用能量为10MeV的电子加速器进行梯度辐照。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，梯度辐照剂量为0.2kGy、0.4kGy、0.6kGy、0.8kGy、1.0kGy、1.2kGy、1.4kGy、1.6kGy。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，k＝1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中每次辐照的剂量不超过3kGy。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中将病毒样本梯度降温至-20℃，采用能量为10MeV的电子加速器进行梯度辐照。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中辐照完成后，梯度升温至0～10℃。
11.一种如权利要求1-10任一项所述方法制备的鱼类灭活病毒疫苗。
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