FI80211C

FI80211C - Metod foer inaktivering av hepatit b virusin plasma och plasmaderivat.

Info

Publication number: FI80211C
Application number: FI831146A
Authority: FI
Inventors: Alfred Mayer Prince
Original assignee: New York Blood Center Inc
Priority date: 1982-04-14
Filing date: 1983-04-05
Publication date: 1990-05-10
Also published as: ZA832239B; EP0099445B2; FI831146A0; DK164537B; EP0099445B1; US4481189A; EP0099445A3; DE3382042D1; NO831304L; DK164537C; AU561900B2; ES521431A0; NO163514B; CA1207229A; NZ203878A; JPS58222023A; AU1346283A; NO163514C; ATE58835T1; ES8403722A1

Description

80211

MENETELMÄ HEPATIITTI B-VIRUKSEN INAKTIVOIMISEKSI PLASMASSA JA PLASMAJOHDANNAISISSA

Keksinnön tausta

Keksinnön piiri

Keksintö koskee nisäkkäiden veriplasmaa. Lähemmin keksintö koskee hepatiitti B tai non-A, non-B virusten inaktivointia ihmisen veriplasmassa sekä tuloksena olevia tuotteita. Nimenomaan keksintö koskee veriplasman sterilointia sen tekemiseksi käytännöllisesti katsoen vapaaksi aktiivisten hepatiittivirusten suhteen niin, että sen sisältämät arvokkaat proteiinit, kuten esimerkiksi faktori VIII, eivät olennaisesti denaturoidu.

Aiempaa tutkimusta koskeva tarkastelu

On tehty lukuisia yrityksiä inaktivoida viruksia, kuten esimerkiksi nisäkkäissä, erityisesti variplasmassa esiintyvää hepatiitti B virusta (HBV). Joissakin maissa on käytäntönä inaktivoida veriplasmassa esiintyvä hepatiitti-B-virus saattamalla plasma kosketuksiin viruksen inaktivoiman aineen kanssa, joka on tyypiltään sellainen, että se kytkee ristiin hepatiitti B viruksen proteiiniosan tai joka on vuorovaikutuksessa viruksen nukleiinihapon kanssa. Esimerkiksi tunnettuja ovat yritykset inaktivoida hepatiitti B virus saattamalla se kontaktiin jonkin aldehydin, esimerkiksi formaldehydin, kanssa, jolloin saadaan aikaan ristikytkentä proteiiniin ja hepatiitti B virus inaktivoituu. On myös tunnettua saada viruksen inaktivointi aikaan saattamalla virus kosketuksiin beta-propiolaktonin (BPL), aineen joka vaikuttaa viruksen nukleiinihappoon, kanssa. Edelleen tunnetaan ultraviolettivalon käyttö erityisesti beta-propiolaktonikäsitte-lyn jälkeen.

Valitettavasti näillä aineilla on vain rajoitettu kyky inaktivoida viruksia, ja niillä on myös vahingollinen vaikutus 2 80211 muihin arvokkaisiin plasman proteiinikomponentteihin. Esimerkiksi sellaisissa inaktivoitumistapahturaissa faktori VIII in-aktivoituu tai denaturoituu 50-90 prosenttisesti, tai sitä suurempi osa käsittelemättömässä plasmassa olevasta faktori Villistä inaktivoituu tai denaturoituu. Näiden viruksia inak-tivoivien aineiden denaturoivien vaikutusten vuoksi on, valmistettaessa johdannaisia potilaille suoritettavaa annostelua varten, välttämätöntä konsentroida suuria määriä plasmaa niin, että potilaalle annettavassa materiaalissa on tehokasta hoitokäsittelyä varten riittävä denaturoitumattoman proteiinin konsentraatio. Tämä konsentraatio ei kuitenkaan vähennä denaturoidun proteiinin määrää. Tämän seurauksena potilas ei saa ainoastaan denaturoitumatonta proteiinia vaan denaturoitunutta proteiinia usein moninkertaisen määrän denaturoi tumattomaan proteiinimäärään verrattuna.

Esimerkiksi, jos ihmisen veriplasmassa esiintyvää hepatiitti B virusta inaktivoidaan/3-propiolaktonilla, tuloksena saa-daan plasmaa, jonka faktori VIII on inaktivoitunut 75 prosenttisesti, jäljellejäävä 25$ faktori VIII:a on niin pieni konsentraatio plasman toimintona sinänsä, että on välttämätöntä konsentroida suuria määriä faktori VIII:a riittävän konsentraation saamiseksi, jolla on terapeuttista arvoa.

Koska sellaiset eristystekniikat eivät tehokkaasti poista denaturoitunutta faktori VIII:a denaturoitumattomasta faktori Villistä, potilaalle annettu materiaali saattaa sisältää *: enemmän denaturoitunutta proteiinia kuin denaturoitumatonta *. proteiinia. Ilmeisesti sellainen inaktivointi on arvokasta hepatiitti B virusinfektion riskin vähenemisen kannalta, kuitenkin se edellyttää plasman suurien erien käyttöä ja merkitsee arvokkaiden proteiinikomponenttien merkittävää huk-kaa. Edelleen denaturoituneiden proteiinien suurien määrien : antaminen tekee nämä antigeenisiksi isäntää kohtaan ja aikaansaa täten autoimmuunisairauksia, esim. nivelreumaa tai vasta-aineen muodostuksen denaturoitunutta faktori VIII:a itseään vastaan.

3 80211 Näiden arvokkaiden proteiinikomponenttien menetys ei rajoitu ainoastaan faktori VIII:aan, nisäkkään veriplasman arvokkaista proteiineista labiileimpaan. Samanlaista proteiinien denaturoitumista on todettu seuraavien muiden arvokkaiden plasma-komponenttien suhteen; hyytymistekijät II, VII, IX, X, plas-miini, fibrinogeeni, IgM, jne.

Faktori VIII kuitenkin denaturoituu suuremmassa määrin kuin muut veriplasman arvokkaat proteiinit.

Seurauksena edellä esitetystä, pastörointia kestävän seerumin albumiinin ja stabiilin plasmaproteiiniliuoksen valmistusta lukuunottamatta, Yhdysvalloissa on tällä hetkellä käytäntönä veriplasman ja sen johdannaisten valmistuksen suhteen olla steriloimatta plasmaa hepatiittivirusten inakti-voimiseksi. Sen seurauksena faktori VIII:n, gamnaglobulii-nin, faktori IX:n, fibrinogeenin jne. vastaanottajien täytyy ; hyväksyä riski, että annettavat arvokkaat proteiinikomponen- tit saattavat olla hepatiittivirusten kontaminoimia. Siitä on seurauksena, että näillä vastaanottajilla on vaarana tulla näiden virusten infektoimiksi ja joutua kärsimään virusten maksalle aiheuttamasta vauriosta ja siitä seuraa-vasta toimintakyvyttömyydestä ja sairaudesta, joka saattaa johtaa kuolemaan BPL/UV-inaktivointimenetelmää, jota edellä on käsitelty, ei ole Yhdysvalloissa otettu käyttöön lukuisista syistä, joista yksi perustuu siihen seikkaan, että monet tutkijat uskovat BPL:n itsensä olevan vahingollisen, koska sitä ei voida täydellisesti poistaa inaktivoinnin jälkeen, ja täten se saattaa jäädä plasmaan ja plasmajohdannaisiin suuremmassa kuin vähäpätöisessä määrässä. BPL on eläimillä osoitettu : karsinogeeniseksi.

Tunnetaan muita menetelmiä plasmassa esiintyvän hepatiitti 3 viruksen inaktivoimiseksi, mutta ne ovat tavallisesti , 80211 4 epäkäytännöllisiä. Erääseen menetelmään sisältyy vasta-aineiden lisäys plasmaan, jolloin immuunikompleksi muodostuu. Vasta-aineen muodostuksen ja puhdistamisen kustannukset lisäävät merkittävästi plasman valmistuskustannuksia, edelleen ei ole mitään varmuutta siitä, että riittävä määrä hepatiitti B tai non-A, non-B virusta inaktivoituu. Tällä hetkellä ei ole olemassa mitään testiä non-A, non-B vasta-aineiden suhteen (vaikka on olemassa testi viruksen suhteen), sen tähden ei ole mahdollista valita plasmaa, joka sisältää anti non-A, non-B vasta-aineen korkeita tiittereitä.

On selvää, että plasmassa sijaitsevien hepatiittivirusten in-aktivointiongelmat eroavat plasmassa samanaikaisesti sijaitsevien, toivottujen proteiinikomponenttien vuoksi itse virusten inaktivoinnista. Täten samalla kun tiedetään, miten in-aktivoidaan hepatiitti B virus ristikytkyaineilla esim. glutaarialdehydillä, nukleiinihapon kanssa reagoivilla aineilla, esim. BPL:llä tai formaldehydillä tai hapettimilla esim. kloroksilla, näiden menetelmien ei ole uskottu soveltuvan viruksen inaktivointiin plasmassa, mikä johtuu havainnosta, että useimmat näistä inaktivoivista aineista (natriumhypokloriitti, formaldehydi, beta-propiolaktoni) denaturoivat plasman arvokkaita proteiinikomponentteja.

Sen tähden haluttiin kehittää nisäkkäiden veriplasman steri-'· loimiseksi menetelmä, joka ei oleellisesti denaturoi plasman arvokkaita komponentteja eikä tuo mukanaan mahdollisesti karsinogeenisen aineen käyttöä. Lähemmin olisi toivottavaa hankkia veriplasmaa, jossa kaikki hepatiittivirukset ovat in-aktivoituneet ja jossa denaturoitunut proteiini, kuten esimerkiksi faktori VIII vastaa vain pientä osaa näiden proteii-: nien kokonaismäärästä plasmassa.

Ehdotetun menetelmän lisäetuna on se seikka, että plasma tai näin käsitellyt plasmaproteiinien liuokset tulevat täysin ti 5 80211 kirkkaiksi ja läpinäkyviksi plasman lipidien poistamisen tuloksena. Edelleen kirkkaus säilyy epämääräisen ajan varastossa 4QC:ssa. Tällä on tärkeitä etuja käsittelemättömään plasmaan tai plasmaproteiiniliuoksiin nähden siinä, että: (1) on helppo havaita bakteerikontaminaatio tarkastelun perusteella, mikä on vaikeaa sameiden suspensioiden ollessa kysymyksessä; ja (2) estetään saostuneiden lipoproteiinien mikroaggregaattien kehittyminen, mikä tapahtuu normaalisti käsittelemättömien plasma- tai plasmaproteiiniliuosten kylmävarastoinnin yhteydessä, täten vältetään sellaisten mikroaggregaattien infuu-sion mahdolliset haitalliset vaikutukset, joissa aggregaatit saattavat kerääntyä keuhko-, munuais- ja aivokapillaareihin ja tukkia ne.

Lopuksi, ehdotetut menetelmät tekevät mahdolliseksi virusperäisen infektisyyden inaktivoinnin lähdeplasmassa, joka on peräisin hepatiitti B viruksen kroonisilta kantajilta ja jota käytetään HBV-virusrokotteiden valmistukseen, suoden : : turvallisemman valmistusmenetelmän ja turvallisemman tuot teen. Yllä kuvatut perusteet ja käsitteet on kuvattu kuvassa 1.

Keksinnön yhteenveto

On havaittu, aivan odottamatta, että kun viruksia inaktivoi-vat aineet denaturoivat faktori VIII:n ja muita arvokkaita plasmaproteiineja, niin kaikilla viruksia inaktivoivilla aineilla ei ole sellaista vaikutusta. On havaittu, että jos ; veriplasmaa käsitellään koostumuksella, joka on valittu ryh- mästä, joka käsittää ei-anionisia detergentteja, eettereitä tai niiden seoksen, niin plasmassa läsnäolevat virukset ovat itseasiassa täysin inaktivoituneet muiden proteiinien 6 80211 oleellisesti denaturoitumatta. Erityisesti on havaittu, että plasman ollessa kosketuksissa ei-anionisen detergentin, eettereiden tai niiden seosten kanssa, jonka jälkeen inakti-voivat aineet poistetaan, että sekä hepatiitti B että non-A, non-B virukset ovat oleellisesti inaktivoituneet.

Ennen poolatun ihmisen veriplasman käsittelyä sen aktiivisen hepatiitti B viruksen määrä on 101 - 103 viruspartikkelia millilitrassa ja veriplasmassa on huomattavat (101 - 102) määrät non-A, non-B viruspartikkeleita. Käsittelyn jälkeen ei jää jäljelle yhtään eläviä viruspartikkeleita.

Keksinnön mukaisella inaktivointimenettelyllä itseasiassa kaikki plasman sisältämät hepatiittivirukset inaktivoituvat. Prince A.M., Stephen W., Brotman B. sekä van der Ende M.C. käsittelevät infektiivisyystasojen määritysmenetelmää in vivo kokeissa simpansseilla julkaisussa Evaluation of the effect of Betapropiolactone/Ultraviolet Irradiation (BPL/UV) Treatment of Source Plasma on Hepatitis Transmission by Factor IV Complex in Schimpanzees, Thrombosis and Haemostasis 44: 138-142, 1980.

Inaktivoidut hepatiittivirukset on inaktivoitu käsittelemällä spesifisesti tutkituilla inaktivoivilla aineilla, eivätkä ne ole inaktivoituneet plasman sisältämien vasta-aineiden johdosta, jotka sitovat hepatiittiviruksia ja muodostavat immuunikomplekseja, vaikka tämä saattaa myös tapahtua.

Plasman käsittelyyn kytkeytyy ei-ionisen detergentin, eetterin, tai niiden seoksen lisäys. Tämän käsittelyn tuloksena saattaa jäädä jäljelle pieni tähde tällaista ei-ionista : detergenttiä tai eetteriä. Sen tähden keksinnönmukaiselle veriplasmalle on ominaista, että se sisältää ei-ionisen detergentin tai eetterin jäämän, mutta sellaista ei-ionista detergenttiä tai eetteriä on läsnä alle 1 %\r\ konsen-traationa, mieluummin vähemmän kuin 0,001 %.

7 8021 1

Suorittamalla keksinnön mukainen käsittely luovuttajilta saadut plasmat voidaan yhdistää ilman erityisiä varotoimenpiteitä sen seikan varmistamiseksi, että aktiivista hepatiitti B virusta sisältävää plasmaa ei lisätä pooliin. Tämä helpottaa plasman käsittelyä ja mahdollistaa useiden vaiheiden poistamisen, mm. luovuttajalta saadun verierän ensitestauksen. Se sallii plasman suurien erien käsittelyn samalla säästäen kustannuksia.

Käsittelyn aikana plasman hepatiittivirukset inaktivoidaan käsittelemällä anionittomalla detergentillä tai eetterillä tai niiden seoksella. Mieluummin käytetään detergentin ja eetterin seosta.

Yleensä käsittelyaine käsittää mieluummin 0,1-10 painoprosenttia detergenttiä käsiteltävän plasman tai plasmajoh-dannaisten tilavuuden perusteella laskettuna. Erityisesti on tarkasteltu käsittelyaineen käyttöä, joka koostuu detergentin Ja eetterin seoksesta, jossa detergenttiä on seoksen 0,1-10 % määrä, mieluummin 0,1-1,0 %t käsiteltävän plasman tai plasmajohdannaisen tilavuuden perusteella laskettuna.

Eetteriä voidaan lisätä 5-50 % tilavuudesta, mieluummin 20-40 tilavuusprosenttia, käsiteltävän plasman tai plasmajohdannaisen tilavuuden perusteella laskettuna.

Yleensä inaktivointiaineen liuoksen, dispersion tai suspension pH on 6,0:sta 8,Oraan.

Keksinnön mukaiseen inaktivointiin erityisesti mahdollisia eettereitä ovat ne, joilla on kaava

Rl - 0R2 jossa

Rl ja R2 ovat itsenäisesti C1-C18 alkyyli tai alkenyyli, 8 80211 joka voi sisältää ketjussa O- tai S-atomin, mieluummin C1-C8 alkyyli tai alkenyyli. Erityisesti mahdollisia eettereitä ovat dimetyylieetteri, dietyylieetteri, etyylipropyylieet-teri, metyyli-butyylieetteri, metyyli-isopropyylieetteri ja metyyli-isobutyylieetteri.

Mahdollisiin ionittomiin detergentteihln kuuluvat ne, jotka dispergoivat vallitsevassa lämpötilassa 0,1 painoprosenttia rasvaa vesiliuoksessa, Joka sisältää 0,1 painoprosenttia rasvaa, kun siihen tuodaan lg 100 ml:aa kohti detergenttiä. Erityisesti mahdollisia detergenttejä ovat sellaiset, joihin sisältyy rasvahappojen polyoksietyleeni-johdannaisia, sorbi-tolianhydridien osittaisestereitä, esim. tuotteita, jotka kaupallisesti tunnetaan Tween 80:nä ja Tween 20:nä, ioniton öljyliukoinen, vesiliukoinen detergentti kuten esimerkiksi kaupallisesti tavaramerkillä "Triton X 100" tunnettu detergentti. Mahdollinen on myös natriumdesoksikolaatti sekä "Zwittergentit”, Jotka ovat synteettisiä zwitterionideter-genttejä, Jotka tunnetaan "sulfobetaniineina" kuten esim. N-dodekyyli-N, N-dimetyyli-2-ammonio-l-etaanisulfonaatti ja sen johdannaiset tai ionoitumattomat detergentit kuten esimerkiksi oktyyli-beta-D-glukopyranosidi.

Muita mahdollisia ionittomia detergenttejä ovat detergentit, joissa on noin 15-35, mieluummin noin 18-33 oksietyleeniyk-sikköä molekyylissä, erityisesti merkaptaani-pelkistimen läsnäollessa, kuten esim. merkaptoetanoli, ditiotreitoli, ditio-erytritoli sekä ditio-oktanoi-happo. Sopivia ionoitumattomia pinta-aktiivisia aineita ovat oksietyloidut alkyylifenolit, polyoksietyleenisorbitaanirasvahapon esterit,

U

9 80211 polyoksietyleeni-hapot, polyoksietyleeni-alkoholit, polyoksi-etyleeni-öljyt sekä polyoksietyleenioksipropyleeni-rasvaha-pot. Joitakin spesifisiä esimerkkejä ovat seuraavat: alkyylifenoksipolyetoksi (30) etanoli polyoksietyleeni (2) sorbitaanimonolauraatti polyoksietyleeni (20) sorbitaanimonopalmitaatti polyoksietyleeni (20) sorbltaanimonostearaatti polyoksietyleeni (20) sorbitaanitristearaatti polyoksietyleeni (20) sorbitaanimono-oleaatti polyoksietyleeni (20) sorbitaanitrloleaatti polyoksietyleeni (20) palmitaatti polyoksietyleeni (20) lauryylieetteri polyoksietyleeni (20) setyylieetteri polyoksietyleeni (20) stearyylieetterl polyoksietyleeni (20) oleyylieetteri ; polyoksietyleeni (25) hydrattu risiiniöljy polyoksietyleeni (25) oksipropyleenimonostearaatti.

Plasman käsittely inaktivoivalla aineella suoritetaan -5°C:n ja 50°C:n välisessä lämpötilassa, mieluummin l-4°C:ssa ainakin yhden minuutin ajan, mieluummin ainakin 16 tuntia ja yleensä 16-24 tuntia. Käsittely suoritetaan normaalisti ilmakehän paineessa, vaikka alipaineita ja ylipaineita voidaan myös käyttää.

Normaalisti käsittelyn jälkeen virusta inaktivoiva aine poistetaan, vaikka se ei ole välttämätöntä kaikissa tapauksissa, riippuen virusta inaktivoivan aineen luonteesta ja aiotusta plasman jatkokäsittelystä.

Eetterin poistamiseksi plasmasta plasmaan yleensä kohdistetaan 4-37°C:n lämpötila sekä heikko tyhjiö, Jota käytetään hyväksi vetämään pois eetteriJäännös. Mieluummin käytetään keinoja levittämään plasma ohuena kalvona, jotta varmistutaan maksimaalisesta kontaktista ja eetterin poistamisesta.

10 80211

Muihin menetelmiin inaktivoivan aineen sisältämän eetterin poistamiseksi kuuluu: (1) typpikaasun kupliminen; (2) suodatus käyttämällä eetteriin liukenemattomia (esim. teflon) mikrohuokoisia membraaneja, jotka pidättävät plasman proteiinit; (3) toivottujen plasman komponenttien absorbtlo kromatografisille tai affiniteettikromatografisille alustoille; (4) saostaminen esim. plasmaproteiinien suolasaostuksen avulla; (5) lyofilisaatio, jne.

Kun inaktivoivassa aineessa käytetään ionittomia deter-genttejä, ne poistetaan yllä esitettyjen kohtien (2) - (5) mukaisesti.

Yleensä kaikki alussa läsnäoleva eetteri poistetaan ennen detergentin poistamista. Eetteri saatetaan saada takaisin uudelleenkäyttöä varten käyttämällä sopivia, tunnettuja tislaus/jäähdytin-järjestelmiä.

Jos detergenttiin sisältyy eetteriä, eetteri poistetaan ' normaalisti.

Kuten yllä on kuvattu, veriplasmaa voidaan karakterisoida denaturoidun faktori Villin suhteellisella määrällä denaturoidun ja denaturoitumattoman faktori Villin summan suhteen. Erityisesti denaturoidun faktori Villin painoprosentti denaturoidun ja denaturoitumattoman faktori Villin summan suhteen on vähemmän kuin 50¾. Denaturoidun faktori Villin määrä η 80211 selvitetään määrittämällä suhde faktori VIII antigeeni (CAG) sisällä (faktori VIII proteiinin mitta) ja faktori VIII aktiivisuuden (denaturoltumattoman faktori VIII:n mitta) välillä. Suhde qäg"antigeeni- on ihanteellisesti 1,0, kun mitään denaturoitumista ei tapahdu, ja sen tulisi olla vähemmän kuin 0,5·

Yllä esitetyt määritykset suoritetaan standardimenetelmin, esim. kuten on kirjoitettu julkaisussa Haemostatis and Thrombisis, A.L. Bloom, D.P. Thomas, Edw. Churchill -Livingstone, London, 1981.

Keksinnön mukainen menetelmä tekee mahdolliseksi ihmisen veriplasman yhdistämisen ja yhdistetyn ihmisen veriplasman käsittelyn tällaisen poolatun plasman muodossa. Se tekee myös mahdolliseksi verituotteiden johdannaisten tuottamisen, kuten esimerkiksi faktori VIII:n, gammaglobuliinin, faktori IX:n tai faktori IX kompleksin (faktorit II, VII, IX, X), fibrinogeenin Ja minkä tahansa muun verijohdannaisen HBsAg mukaanluettuna, Jota on käytetty LEV-rokotteen valmistuk-.· seen, joista mikään ei sisällä yhtään tarttuvia hepatiitti- virusten jäännöksiä. Täten keksintö edelleen tekee mahdolliseksi yhdistetyn plasman erillisten komponenttien saannin, jolloin kutakin komponenteista luonnehditaan seuraavasti: (a) läsnä ei ole pieniä määriä viruksia inaktivoivaa ainetta, joka ristikytkee viruksen proteiiniosan ja vaikuttaa viruksen nukleiinihappoon; ja/tai (b) läsnä on havaittavia määriä ionitonta detergenttiä .virusta inaktivoivaa ainetta tai eetteriä, ^ mutta määrältään vähemmän kuin 1 painoprosenttia; ja/tai (c) läsnä on inaktivoitu hepatiitti B ja/tai non-A, non-B viruksia; ja/tai 12 80211 (d) läsnä ei ole tarttuvia (eläviä) hepatiittiviruksia.

Seuraavat esimerkit esitetään valaisemaan tähdelliseramin keksinnön luonnetta ja sen käytännön soveltamistapaa:

Esimerkki 1 Hepatiitti B sekä non-A, non-B virusten in- aktivointi plasmassa A Hepatiitti B virus

New York Blood Centerin standardi HBV-viruksen sisältämä plasma 78-564, joka on saatu viruksen krooniselta kantajalta, laimennettiin 1:10 tuoreella, normaalilla (chimp 222) simpanssin plasmalla, josta puuttuu vasta-aine HBsAgrlle.

Tämä laimennus sisältää 10*7,9 simpanssia infektoivia annoksia (CID50) millilitraa kohti, lisättiin Tween 80:a, jotta lopulliseksi konsentraatioksi saatiin 1# (tilav./tilav.), ja sitten lisättiin etyylieetteriä (Malindeyodt, anesteesi laatua) siten, että lopulliseksi konsentraatioksi tuli 20# (tilav./tilav.). Liuos sekoitettiin hyvin kierukkasekoitti-! mella, ja sitten sitä pidettiin 4°C:ssa 16 tunnin ajan.

Sitten eetteri poistettin tyhjiössä, liuoksia sentrifugoi-tiin 10 minuutin ajan 4000 kierroksella minuutissa, ja kirkas plasma kerättiin. 1 ,25 nil ruiskutettiin suonensisäisesti kahteen seronegatiiviseen simpanssiin, joita ei koskaan aiemmin oltu käytetty missään kokeessa. Näitä seurattiin hepatiitti B serologisten merkkausaineiden avulla (HBsAg, anti-/ HBs, anti-HBc) sekä seerumin transaminaasitasojen (AST, ALT)

avulla 12 kuukauden ajan. Plasman loppuosa testattiin faktori VIII prokoagulaatti-aktiivisuuden, faktori VIII : (CAg) antigeeni-aktiivisuuden sekä HBsAgrn (hepatiitti B

pinta-antigeeni) määrän suhteen. Kaksi muuta simpanssia sai samaa tartuttavaa plasmaa laimennettuna 10~2f mutta käsittelemättömänä. Tulokset on esitetty taulukossa I.

Il is 80211 *

I—I

E + bO \ oo < E Ή

to bC -H

tH pa 3 O r-i co ffi w σ\ co < >: *

Eh >: ^

Eh «H M VS.

< Cd M

s: c m I -h + CD Cd > tH C cr>

Eh 40 0) O +1 m c -h c φ o in O cd 5-. < bC «π CT\

> E O

I—I CO 40 I O

Eh d! ^ Ή ^ -H

« rH CO > VS. +0 < fu pH tH 4 rt 2: ·η co <n cd M 40 3 Ο -H f- X 3 Ο UD 40 c «< w ή <n c .. φ bC--»

< cd C

w H-5 C O

CQ Φ ^

CC C C C

• · · · -H (cd < co ο ε ε b (Q ffl >; *d Ä W 40 40

C I I 40 tH

•Η tH tH TO

M 40 +0 x; ^ ^ CO

M C C Φ I I tH

H C < ϋ +4 ra > β m cd I 2

• cc 40 E

O «H -H «O

EH Cd Λ rt

« -HO) r-. tH

<S 40 Λί tH cd P« G C w t-3 rt

•H C Λ! O CC

:< o ·· Φ X Ή o

hJ .O M ra M +0 CO

Cl 3 < Ή rl +£ Ti m ϋ n E rl ^v^-vCxd PC C 03 tv > I l cue.

W m K 401 —' 03- ma) EH o O.

Eh---Sh 3 m ω -h a

W 40 rH

O \ 40 C Cd « o ή o cd

Z co ·η in EC

CD 40 /S Cl CO O

.. J Z cd Eh \ rt CD W G iJ CD ^^rHcd

< Cd 0) < M I I g CO

Eh3e CC t-H 4+ — -H ^ M

. : PH CO

----;cd "f3

H >J CC tH E

:'. Eh tH :cd :cd CD G :0 2: Cd) sdxd oo o 40c m cd 40 4040 40 40 φ cd O E 40 ή tH C 40 xdocti

> co-H EE φφ E w E

m cd ra φ φ = φ Di cd

Eh.CO iHsä tH tH S H 3 Φ :: fctscs ¢( ϋ φ o E-t-H φ C >! - - CC 3 40 β Di

. ; 2: co 40 φ tH

M Ή I I C3 —t tHEO

> c O 40 o COHG

2: tH cd g 40 in cr\ oo ct\ σ\ *d cd h

fr] i(4 Φ O t t t t 1 I ' O

Q40 > C0 40 tH MD MD V- C Sh cd. ie; pa o o o 00 o o 3 >1 m CD < K C ϋ ^ i I iH « I -H 4040·σ > CO 40 c G,-----tH Φ cd

Eh -H cd T3 40

Eh co E (cd co cc m H «d < β M co ru

Eh rt ^ I G 41 > E · v- md 00 cq tH o mm or md * CC CO Z rH (—I rHiH** + h 80211

Molemmat simpanssit, jotka saivat käsittelemätöntä HBV:ä, kehittivät hepatiitti B infektion 4 viikon inkubaatio-jakson kuluessa. Varsinaiset tulokset on esitetty kuvassa 2.

Tälle vastakohtana kumpikaan eläimistä, jotka saivat Tween 80/eetterillä käsiteltyä, HBV:n tartuttamaa plasmaa, joka alunperin sisälsi 10 kertaisen määrän tarttuvaa HBV:ä, joka oli rokotettu kontrolleihin, eivät kehittäneet mitään merkkiä HBV-infektioista, mikä ilmaisi sen seikan, että tarttuvat virukset olivat inaktivoituneet. Tämän menetelmän teho on täten 1θ7>9, ts. vähintään 100 miljoonaa tarttuvaa annosta voi inaktivoitua. Tästä tavattomasta sterilointiak-tiivisuudesta huolimatta, saatiin takaisin olleellisesti täydellisenä faktori VIII prokoagulantti-aktiivisuus, faktori VIΙΙ-proteiini sekä HBsAg. Olisi huomattava, että HBsAg-aktiivisuuden säilyminen ilmaisee tätä menetelmää voi-tavan käyttää parannettuna menettelytapana valmistettaessa hepatiitti B rokotetta HBV-kantajien plasmasta.

B Non-A, non-B hepatiittiviruksen inaktivointi ; plasmassa Tämä koe tehtiin yhdenmukaisesti yllä esitetyn kokeen kanssa ja käytettiin hyväksi yhdenmukaista metodiikkaa paitsi että: 1. Tarttuva plasma oli 10-1 laimennus HUTCHINSON KANNAN (7-12-77) non-A, non-B virusta, joka oli saatu jäädytettynä kuivajäässä tohtori Robert Purcellilta, Hepatitis Laboratory, National Institute for Allergy & Infectious -] Diseases, N.I.H., Bethesda, Maryland, johtajalta. Tämä materiaali aikaansai non-A, non-B hepatiitin simpansseissa inkubointi-jakson ollessa ennen ALT:n kohoamista noin 5-7 viikkoa. Tällä materiaalilla on todettu simpansseissa noin 10^ CID^o/mlrn tiitteri, ja silkkiapinoissa tiitteri oli noin 108 ID^q, (Feinstone, S. & Purcell R.H. , henkilökohtainen tiedonanto). Täten käsitellyllä plasmalla, joka ,5 80211 sisälsi 10~2 laimennuksen Hutchinson plasmaa, tarttuvan viruksen määrä oli 1 0^-1 0^ ID^q/111!· 2. Rokotettuja simpansseja oli aiemmin käytetty formaliinilla inaktivoidun HBV-rokotteen turvallisuustestiin, mutta niitä ei ollut käytetty mihinkään muuhun kokeeseen. Niitä seurattiin joka toinen viikko suoritetuin testein kaikkien yllä mainittujen merkkiaineiden suhteen 12 kuukauden ajan. Kahdeksan kontrolli simpanssia on rokotettu samalla Hutchin-son-kannan sisältämällä rokotteella, ja niitä on seurattu samalla tavalla. Tulokset on esitetty taulukossa II.

TAULUKKO II

Non-A, non-B virustarttuvuuden inaktivointi faktori VIII aktiivisuuden inaktivoitumatta

Hepatiitti PLASMAN ANALYYSI;

Simpans- NANB vi- Käsit- (Inkuboin- Faktori VIII* sit rusannos tely tiaika Aktii- Anti rokotet- ALT:hen >50) visuus geeni tu (1050) $ <f>

Simpans- 1θ3-1θ5 ei mi- 3-21 N.D. N.D.

sit tään 157 104-106 Tween (-) 97±10+ 98±10+ !-! 80 + 164 eetteri (-) * ilmaistu prosentteina käsittelemättömästä plasmasta + ±2 standardipoikkeamaa Täten jälleen käsitelty plasma ei ollut tarttuvaa, ja se ie 80211 säilytti vielä faktori Villin aktiivisuuden. Menetelmän tehokkuus non-A, non-B viruksen inaktivoimiseksi tämän kokeen perusteella on >_ 10^-10^ t.s. ainakin 10 000 -1 000 000 tarttuvaa annosta on voitu inaktivoida.

Esimerkki II Konsentroidun faktori Villin (Lyoc®, The

New York Blood Center) käsittely Tveen 80/eetterillä faktori VIII prokoagulantti-aktiivisuuden säilyessä täydellisesti

LyocCD on faktori Villin väkevöite, jolle on myönnetty lupa kliinistä käyttöä varten hemofilian hoidossa, lyoc on valmistettu ilman hepatiittivirusten sterilointiyritystä, ja se on luultavasti ei-immuunivastaanottajia yhdenmukaisesti tartuttava. Lyoc-näyte käsiteltiin Tween 80/eetterillä kuten yllä on kuvattu, sen seikan määrittämiseksi, säilyisikö siihen sisältyvä faktori Villin aktiivisuus. Tulokset on esitetty taulukossa III

• Taulukko III

Faktori Villin konsentraatin Tween 80/eetterikäsittelyn vaikutus faktori Villin aktiivisuuteen

Materiaali Faktori VIII prokoagulanttiaktiivi- suus ($ käsittelemättömästä)

Lyoc - käsittelemätön 1 00 + 10

Lyoc - Tween 80/eette- 110+ 10 rillä käsitelty

Faktori Villin aktiivisuus saatiin olennaisesti kokonaan takaisin.

,7 8021 1

Kyseessä oleva keksintö on käyttökelpoinen inaktivoitaessa muita veressä esiintyviä viruksia, kuten esim. sytoraegalo-viruksia, Epstein-Barrin viruksia, maitohappodehydrogenaasi-viruksia, herpes-ryhmän viruksia, rhabdoviruksia, leukoviruksia, myksoviruksia, alfaviruksia, arboviruksia (ryhmä B), paramyksoviruksia, arenaviruksia, koronaviruksia.

Claims

1. Menetelmä hepatiitti B viruksen inaktivoimiseksi nisäkkäiden veriplasmassa, tunnettu siitä, että mainittu veriplasma saatetaan kosketuksiin inaktivoivan aineen kanssa, joka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat (1) eetteri, (2) ei-ioninen detergentti ja (3) ei-ioninen detergentti + eetteri.

2- Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että plasma saatetaan kosketuksiin lisäksi ionoitumat-toman detergentin kanssa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eetterillä on kaava r1_0-r2 jossa kaavassa R1 ja R2 ovat itsenäisesti Ci-Ci8-al*yy1;*· tai alkenyyli, joka alkyyli tai alkenyyli voi sisältää ketjussa happi- tai rikki-atomin.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että plasma saatetaan kosketuksiin ionoitumattoman detergentin ja eetterin muodostaman seoksen kanssa.

5- Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu kontakti ionoitumattoman detergentin ja eetterin kanssa tapahtuvat peräkkäin.

6- Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu plasma jää kosketuksiin eetterin kanssa ajan, joka on vähintään yksi minuutti, ja on kosketuksissa -5°C:n ja 50°C:n välisessä lämpötilassa. ti 19 8021 1

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virusta inaktivoivaa ainetta on läsnä ainakin 0,1 tilavuusprosenttia käsiteltävän plasman tilavuutta kohden.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virusta inaktivoivaa ainetta on määrältään 0,1-50 tilavuusprosenttia plasman tilavuutta kohden.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun käsittelyn jälkeen eetteri poistetaan.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu nisäkkäiden veriplasma on ihmisen veriplasmaa tai plasmajohdannaista.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että mainittu ihmisen veriplasma on yhdistettyä veriplasmaa tai plasmajohdannaista, joka on saatu tällaisista ihmisen plasman pooleista.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitun menetelmän kohteeksi tuleva veriplasma sisältää non-A, non-B hepatiittiviruksia. 20 8021 1