CN116621972A - 乙型冠状病毒广谱中和抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫学领域，特别是乙型冠状病毒广谱中和抗体及其应用。具体而言，本发明涉及乙型冠状病毒广谱中和抗体或其抗原结合片段，以及所述抗体或片段在诊断、预防和治疗乙型冠状病毒感染所引发的各类疾病中的应用。

Description

乙型冠状病毒广谱中和抗体及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学领域，特别是乙型冠状病毒广谱中和抗体及其应用。具体而言，本发明涉及乙型冠状病毒广谱中和抗体或其抗原结合片段，以及所述抗体或片段在诊断、预防和治疗乙型冠状病毒感染所引发的各类疾病中的应用。
背景技术
冠状病毒(CoVs)是迄今为止被鉴定出的最大的RNA病毒，可感染哺乳类人、鼠、猪、猫、犬、蝙蝠、牛和禽类脊椎动物，引起宿主呼吸道、肠道、肝和神经系统疾病。冠状病毒科分为4个属，分别为α，β，δ和γ冠状病毒，其中又以β对人类危害最严重。β冠状病毒分为β冠状病毒属又分5个亚属，即Embecovirus、Sarbecovirus、Merbecovirus、Nobecovirus和Hibecovirus。乙型冠状病毒(Sarbecovirus)亚属包括近年来肆虐全球的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)及其变异株、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)及其变异株、SARS相关的冠状病毒(SARSr-CoV)，细分如图1(DOI：10.1038/s41586-020-2294-9)。
乙型冠状病毒作为单链RNA病毒，直接在细胞内翻译和复制，比DNA病毒更容易发生突变。SARS-CoV-2自2019年底爆发以来，已产生了多种变异株，其中被世界卫生组织列为值得关注的新冠变种(Variant of concern，VOC)，已达5种：阿尔法(Alpha，B.1.1.7)、贝塔(Beta，B.1.351)、伽马(Gamma，P.1)、德尔塔(Delta，B.1.617.2)和奥密克戎(Omicron，B.1.1.529)。这些变异株因遗传序列的改变，导致病毒表面刺突蛋白的结构发生改变，从而影响病毒被抗体识别的能力或病毒对受体的亲和力，造成接种疫苗后产生抗体的中和能力降低或失效、病毒传播能力增强、病毒致病机制改变等风险，为防疫抗疫增加重重困难。持续不断的变异，在未来是有可能会带来更大的疫情风险。
因此需要寻找更为有效的、针对包括上述变异株的乙型冠状病毒广谱中和抗体，提供有效的诊断、预防和/或治疗变异株感染的手段，从而助力疫情的稳定与消除。
本发明应用免疫学、分子生物学、病毒学、蛋白结构分析等诸多领域的技术，开发出一套独有的技术路线，获得了一系列乙型冠状病毒广谱中和抗体。这些抗体来自于接种了SARS-CoV-2疫苗的SARS-CoV感染康复者的记忆B细胞，具有乙型冠状病毒广谱高结合活性和广谱高中和性的特点，能够高效中和包括新型冠状病毒、非典型性冠状病毒等致病病毒，特别适合用于诊断、预防和治疗乙型冠状病毒感染所引发的各类疾病，具有重要临床价值。
本发明通过优化的高通量酵母展示技术，成功预测了这些中和抗体在乙型冠状病毒上的结合表位和逃逸图谱，并基于这些信息找出抗体对，在冷冻电子显微镜上得到验证，从而首次报道了这些抗体的序列。
发明概述
在第一方面，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包含特定氨基酸序列的互补决定区。
在一些实施方案中，所述重链可变区和轻链可变区包含特定的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人免疫球蛋白的恒定区，例如，包含特定氨基酸序列的重链恒定区和轻链恒定区。
在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(sdAb)、嵌合抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
在第二方面，本发明还提供了分离的核酸分子，其编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
在一些实施方案中，所述核酸分子与表达调控序列可操作地连接。
在第三方面，本发明还提供了表达载体，其包含本发明的核酸分子。
在第四方面，本发明还提供了宿主细胞，其由本发明的核酸分子或本发明的表达载体转化。
在第五方面，本发明还提供了制备抗体或其抗原结合片段的方法，包括：
(1)在适合本发明的核酸分子或表达载体表达的情况下培养本发明的宿主细胞，和
(2)分离并纯化由所述核酸分子或表达载体表达的抗体或其抗原结合片段。
在第六方面，本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在第七方面，本发明还提供了预防和/或治疗乙型冠状病毒感染所引发的疾病的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物；所述受试者优选是哺乳动物，更优选是人。
在第八方面，本发明还提供了本发明的抗体或其抗原结合片段用于制备预防和/或治疗乙型冠状病毒感染所引发的疾病的药物的用途。
在一些实施方案中，所述乙型冠状病毒包括新型冠状病毒(SARS-CoV-2)及其变异株、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)及其变异株、SARS相关的冠状病毒(SARSr-CoV)。
在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2变异株选自阿尔法(Alpha，B.1.1.7)、贝塔(Beta，B.1.351)、伽马(Gamma，P.1)、德尔塔(Delta，B.1.617.2)、奥密克戎(Omicron，B.1.1.529)或其任意组合。
在第九方面，本发明还提供了缀合物，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段，以及与所述抗体或其抗原结合片段连接的可检测的标记。
在一些实施方案中，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
在第十方面，本发明还提供了试剂盒，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的缀合物。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含本发明的缀合物。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含本发明的抗体或其抗原结合片段，以及特异性识别所述抗体或其抗原结合片段的第二抗体。
在一些实施方案中，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
在第十一方面，本发明还提供了用于检测乙型冠状病毒在样品中的存在或其水平的方法，其包括：
(1)使所述样品与本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的缀合物接触；
(2)检测所述抗体或其抗原结合片段或缀合物与所述样品中的靶抗原的结合。
在一些实施方案中，通过检出所述结合代表所述样品中存在乙型冠状病毒。
在一些实施方案中，通过检出所述结合的强弱代表样品中乙型冠状病毒水平的高低。
在一些实施方案中，所述样品为来自受试者的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。
在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如是人。
在一些实施方案中，所述样品并非来自受试者的样品，例如所述样品来自疫苗样品。
在第十一方面，本发明还提供了本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的缀合物在制备用于检测乙型冠状病毒在样品中的存在或其水平的试剂盒中的用途。
附图说明
图1显示了乙型冠状病毒(Sarbecovirus)亚属细分。
发明详述
一、定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文所用，“抗体”指免疫球蛋白和免疫球蛋白片段，无论天然的或者部分或全部合成(例如重组)产生的，包括其至少包含免疫球蛋白分子的部分可变区的保留全长免疫球蛋白的结合特异性能力的任何片段。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白抗原结合结构域(抗体结合位点)同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白。抗体包括抗体片段。如本文所用，术语抗体包括合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体以及抗体片段，例如但不限于Fab片段、Fab′片段、F(ab’)2片段、Fv片段、二硫键连接的Fv(dsFv)、Fd片段、Fd’片段、单链Fv(scFv)、单链Fab(scFab)、双抗体、抗独特型(抗Id)抗体、或者上述任何抗体的抗原结合片段。本文所提供的抗体包括任何免疫球蛋白类型(例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY)、任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的成员。
如本文所用，抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”指全长抗体的任何部分，其少于全长，但是至少包含结合抗原的所述抗体的部分可变区(例如一个或多个CDR和/或一个或多个抗体结合位点)，并且因此保留结合特异性以及所述全长抗体的至少部分特异性结合能力。因此，抗原结合片段指包含与衍生抗体片段的抗体结合相同抗原的抗原结合部分的抗体片段。抗体片段包括通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物，以及合成产生的衍生物，例如重组产生的衍生物。抗体包括抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab’)2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd’片段以及其他片段，包括修饰的片段(参见，例如，Methods in Molecular Biology,Vol 207：Recombinant Antibodies forCancer Therapy Methods and Protocols(2003)；Chapter 1；p 3-25，Kipriyanov)。所述片段可以包括连接在一起的多条链，例如通过二硫键和/或通过肽接头。抗体片段一般包含至少或约50个氨基酸，并且典型至少或约200个氨基酸。抗原结合片段包括任何抗体片段，其在被插入抗体框架(例如通过置换相应区域)时获得免疫特异性地结合(即表现出至少或至少约107-108M-1的Ka)抗原的抗体。
如本文所用，“单克隆抗体”指相同抗体的群体，表示单克隆抗体群体中的每个单独的抗体分子与其他抗体分子相同。这种特性与抗体的多克隆群体的特性相反，所述抗体的多克隆群体包含具有多种不同序列的抗体。单克隆抗体可以通过许多公知的方法来制备(Smith et al.(2004)J.Clin.Pathol.57，912-917；和Nelson et al.，J Clin Pathol(2000)，53，111-117)。例如，单克隆抗体可以通过永生化B细胞来制备，例如通过与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系或者通过用诸如EBV的病毒感染B细胞。重组技术还可以用来在体外通过用携带编码抗体的核苷酸的人工序列的质粒转化宿主细胞来从宿主细胞的克隆群体制备抗体。
如本文中所用，术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”指由融合产抗体的淋巴细胞和不产抗体的癌细胞而产生的细胞或细胞系(通常为骨髓瘤或淋巴瘤细胞)。如本领域普通技术人员所知的，杂交瘤可增殖并持续供应产生特定单克隆抗体。用于产生杂交瘤的方法为本领域已知的(见例如，Harlow & Lane，1988)。当提及术语“杂交瘤”或“杂交瘤细胞”时，其还包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。
如本文所用，“常规抗体”指包含两条重链(其可以标示为H和H’)和两条轻链(其可以标示为L和L’)和两个抗原结合位点的抗体，其中每条重链可以是全长免疫球蛋白重链或保留抗原结合能力的其任何功能区(例如重链包括但不限于VH链、VH-CH1链和VH-CH1-CH2-CH3链)，并且每条轻链可以是全长轻链或任何功能区(例如轻链包括但不限于VL链和VL-CL链)。每条重链(H和H’)与一条轻链(分别为L和L’)配对。
如本文所用，全长抗体是具有两条全长重链(例如VH-CH1-CH2-CH3或VH-CH1-CH2-CH3-CH4)和两条全长轻链(VL-CL)和铰链区的抗体，例如通过抗体分泌B细胞天然产生的抗体以及合成产生的具有相同结构域的抗体。
如本文所用，dsFv指具有稳定VH-VL对的工程化分子间二硫键的Fv。
如本文所用，Fab片段是用木瓜蛋白酶消化全长免疫球蛋白所获得的抗体片段，或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。Fab片段包含轻链(包含VL和CL)和另一条链，所述另一条链包含重链的可变结构域(VH)和重链的一个恒定区结构域(CH1)。
如本文所用，F(ab’)2片段是在pH 4.0-4.5下用胃蛋白酶消化免疫球蛋白所导致的抗体片段，或者例如通过重组方法合成产生的具有相同结构的片段。F(ab’)2片段基本上包含两个Fab片段，其中每个重链部分包含额外的几个氨基酸，包括形成连接两个片段的二硫键的半胱氨酸。
如本文所用，Fab’片段是包含F(ab’)2片段的一半(一条重链和一条轻链)的片段。
如本文所用，scFv片段指包含通过多肽接头以任何顺序共价连接的可变轻链(VL)和可变重链(VH)的抗体片段。接头长度使得两个可变结构域基本不干扰地桥接。示例性接头是分散有一些Glu或Lys残基以增加溶解性的(Gly-Ser)n残基。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列源自一个物种，恒定区序列源自另一物种，如其中可变区序列源自小鼠抗体及恒定区序列源自人抗体的抗体。
“人源化”抗体是指非人(例如小鼠)抗体形式，其是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或者其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或者抗体的其它抗原结合亚序列)，含有源自非人免疫球蛋白的最小序列。优选地，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者抗体的互补决定区(CDR)的残基由来自具有希望的特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或者兔的CDR残基置换。
此外，在人源化中，还可能对VH和/或VL的CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，由此改善抗体的一或多种结合特性(例如亲和性)。可进行例如PCR介导的突变引入突变，其对抗体结合或其它功能特性的影响可利用本文所述的体外或体内测试评估。通常，引入保守性突变。此类突变可为氨基酸取代、添加或缺失。另外，CDR内的突变通常不超过一个或两个。因此，本发明所述人源化抗体还涵盖CDR内包含1或2两个氨基酸突变的抗体。
如本文所用，术语“表位”指抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常包含分子的化学活性表面分型，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
如本文所用，可变结构域或可变区是抗体重链或轻链的特定Ig结构域，其包含在不同抗体之间变化的氨基酸序列。每条轻链和每条重链分别具有一个可变区结构域VL和VH。可变结构域提供抗原特异性，并且因此负责抗原识别。每个可变区包含CDR和框架区(FR)，CDR是抗原结合位点结构域的部分。
如本文所用，“抗原结合结构域”和“抗原结合位点(antigen-binding site)”同义地用来指识别并与同种(cognate)抗原物理相互作用的抗体内的结构域。天然的常规全长抗体分子具有两个常规抗原结合位点，每个包含重链可变区部分和轻链可变区部分。常规抗原结合位点包含连接可变区结构域内反向平行的β链的环。抗原结合位点可以包含可变区结构域的其他部分。每个常规抗原结合位点包含3个来自重链的高变区和3个来自轻链的高变区。高变区也称为互补决定区(CDR)。
如本文所用，“高变区”、“HV”、“互补决定区”、“CDR”和“抗体CDR”可交换地用来指一起形成抗体的抗原结合位点的每个可变区内的多个部分中的一个。每个可变区结构域包含3个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。例如，轻链可变区结构域包含3个CDR，命名为VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3；重链可变区结构域包含3个CDR，命名为VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。可变区中的3个CDR沿线性氨基酸序列是不连续的，但是在折叠的多肽中接近。CDR位于连接可变结构域的β折叠的平行链的环内。如本文所述，本领域技术人员知道并且可以基于Kabat或Chothia编号鉴定CDR(参见例如，Kabat，E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH Publication No.91-3242，和Chothia，C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。
如本文所用，框架区(FR)是位于β折叠内的抗体可变区结构域内的结构域；在氨基酸序列方面，FR区比高变区相对更保守。
如本文所用，“恒定区”结构域是抗体重链或轻链中的结构域，其包含比可变区结构域的氨基酸序列相对更保守的氨基酸序列。在常规全长抗体分子中，每条轻链具有单个轻链恒定区(CL)结构域，而每条重链包含一个或多个重链恒定区(CH)结构域，包括CH1、CH2、CH3和CH4。全长IgA、IgD和IgG同种型包含CH1、CH2、CH3和铰链区，而IgE和IgM包含CH1、CH2、CH3和CH4。CH1和CL结构域延伸抗体分子的Fab臂，因此有助于与抗原相互作用以及转动抗体臂。抗体恒定区可以服务于效应子功能，例如但不限于清除该抗体特异性结合的抗原、病原体和毒素，例如通过与各种细胞、生物分子和组织相互作用。
如本文所用，抗体的功能区是包含该抗体的至少VH、VL、CH(例如CH1、CH2或CH3)、CL或铰链区结构域或者至少其功能区的抗体部分。
如本文所用，VH结构域的功能区是保留完整VH结构域的至少部分结合特异性(例如通过保留完整VH结构域的一个或多个CDR)的完整VH结构域的至少一部分，从而所述VH结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VL结构域)或其区域组合地结合抗原。示例性VH结构域的功能区是包含VH结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
如本文所用，VL结构域的功能区是保留完整VL结构域的至少部分结合特异性(例如通过保留完整VL结构域的一个或多个CDR)的完整VL结构域的至少一部分，从而所述VL结构域的功能区单独地或者与另一抗体结构域(例如VH结构域)或其区域组合地结合抗原。示例性VL结构域的功能区是包含VL结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的区域。
如本文所用，关于抗体或其抗原结合片段的“特异性结合”或“免疫特异性地结合”在本文中可交换使用，并且指抗体或抗原结合片段通过抗体和抗原的抗体结合位点之间的非共价相互作用与同种抗原形成一个或多个非共价键的能力。所述抗原可以是分离的抗原或存在于生物学样品中。通常，免疫特异性地结合(或特异性结合)抗原的抗体是以约或1×107M-1或1x108M-1或更大的亲和常数Ka(或者1x10-7M或1×10-8M或更低的解离常数(Kd))结合所述抗原。亲和常数可以通过抗体反应的标准动力学方法来测定，例如，免疫测定、表面等离子共振(SPR)(Rich and Myszka(2000)Curr.Opin.Biotechnol 11：54；Englebienne(1998)Analyst.123：1599)、等温滴定量热法(ITC)或本领域已知的其他动力学相互作用测定(参见，例如，Paul，ed.，Fundamental Immunology，2nd ed.，Raven Press，New York，pages 332-336(1989)；还参见描述用于计算抗体的结合亲和力的示例性SPR和ITC方法的美国专利第7,229,619号)。用于实时检测和监测结合速率的仪器和方法是已知的，并且可商购(参见，BiaCore 2000，Biacore AB，Upsala，Sweden and GE Healthcare LifeSciences；Malmqvist(2000)Biochem.Soc.Trans.27：335)。
如本文所用，关于抗体的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合片段以与第二抗体或其抗原结合片段足够相似的方式结合一个表位，由此第一抗体与其关联表位的结合结果在存在第二抗体的条件下与不存在第二抗体的条件下相比可检测地降低。或者，在第二抗体与其表位的结合在存在第一抗体条件下也可检测地降低的情况中，可以但不必需是这种情况。也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，而不用第二抗体抑制第一抗体与其各自表位的结合。然而，在每个抗体均可检测地抑制另一抗体与其关联表位或配体的结合的情况中，无论是相同、更高或更低程度，所述抗体被称为彼此“交叉竞争”结合其各自的表位。竞争及交叉竞争抗体均涵盖在本发明中。无论这种竞争或交叉竞争发生的机制如何(例如位阻、构象改变或者结合共同表位或其片段)，本领域技术人员基于本发明提供的教导将意识到这种竞争和/或交叉竞争抗体涵盖在本发明中且可用于本发明揭示的方法中。
如本文所用，“多肽”指共价连接的两个或更多个氨基酸。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可交换使用。
“分离的蛋白质”、“分离的多肽”或“分离的抗体”指所述蛋白质、多肽或抗体：(1)不与在其天然状态下伴随其天然相关成分关联，(2)不含来自相同物种的其它蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不在天然中发生。因此，经化学合成的多肽或在不同于多肽的天然来源细胞的细胞系统中合成的多肽将会与其天然相关成分“分离”。还可通过分离以使蛋白质实质上不含天然相关成分，即使用本领域众所周知的蛋白质纯化技术。
在肽或蛋白中，合适的保守氨基酸取代是本领域技术人员已知的，并且一般可以进行而不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见，例如，Watson et al.，Molecular Biology ofthe Gene，4th Edition，1987，The Benjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。
如本文中所使用的，术语“保守取代”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸取代。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守取代。保守氨基酸取代包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的取代，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的取代。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守取代的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94：412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition，E.S.Golub and D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸分子”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
如本文所用，分离的核酸分子是从存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。诸如cDNA分子的“分离的”核酸分子可以在通过重组技术制备时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。本文所提供的示例性分离的核酸分子包括编码所提供的抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
序列“相同性”具有本领域公认的含义，并且可以利用公开的技术计算两个核酸或多肽分子或区域之间序列相同性的百分比。可以沿着多核苷酸或多肽的全长或者沿着该分子的区域测量序列相同性。(参见，例如：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and GenomeProjects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis ofSequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，NewJersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，AcademicPress，1987；and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，MStockton Press，New York，1991)。虽然存在许多测量两个多核苷酸或多肽之间的相同性的方法，但是术语“相同性”是技术人员公知的(Carrillo，H.& Lipman，D.，SIAM J AppliedMath 48：1073(1988))。
如本文所用，关于核酸序列、区域、元件或结构域的“可操作地连接”表示核酸区域互相功能相关。例如，启动子可以可操作地连接至编码多肽的核酸，从而所述启动子调控或介导所述核酸的转录。
如本文所用，“载体”是可复制的核酸，当载体转化入适当的宿主细胞时，可以从该载体表达一种或多种异源蛋白。关于载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。关于载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体用来将编码多肽的核酸引入宿主细胞，用于扩增核酸或者用于表达/展示核酸所编码的多肽。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。这类媒介物的选择和用途是本领域技术人员公知的。
如本文所用，载体还包括“病毒载体”或“病毒的载体”。病毒的载体是工程化的病毒，其可操作地连接至外源基因以将外源基因转移(作为媒介物或穿梭(shuttle))入细胞。
如本文所用，“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。多肽的表达水平可以利用本领域已知的任何方法来评价，包括例如测定从宿主细胞产生的多肽的量的方法。这类方法可以包括但不限于通过ELISA定量细胞裂解物中的多肽，凝胶电泳之后考马斯蓝染色，Lowry蛋白测定以及Bradford蛋白测定。
如本文所用，“表达载体”包括能够表达DNA的载体，所述DNA与诸如启动子区的能够影响这类DNA片段表达的调控序列可操作地连接。这类额外的片段可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆DNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。
“密码子优化”是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个密码子同时维持该天然氨基酸序列而修饰核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的方法。不同的物种对于特定氨基酸的某些密码子展示出特定的偏好。密码子偏好性(在生物之间的密码子使用的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖于被翻译的密码子的性质和特定的转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞内选定的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的密码子。因此，可以将基因定制为基于密码子优化在给定生物中的最佳基因表达。密码子利用率表可以容易地获得，例如在www.kazusa.orjp/codon/上可获得的密码子使用数据库(“Codon Usage Database”)中，并且这些表可以通过不同的方式调整适用。参见，Nakamura Y.等，“Codon usage tabulatedfrom the international DNA sequence databases：status for the year2000.Nucl.Acids Res.，28：292(2000)。
如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制和扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达载体所编码的多肽。当宿主细胞分裂时，载体中所含的核酸复制，从而扩增核酸。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于CHO细胞、各种COS细胞、HeLa细胞、HEK细胞例如HEK 293细胞。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR，19thed.Pennsylvania：Mack Publishing Company，1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，SARS-CoV-2感染)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文所用，“疗效”表示由个体的治疗所导致的效果，其改变、通常改良或改善疾病或疾病状况的症状，或者治愈疾病或疾病状况。
如本文所用，“预防有效量”或“预防有效剂量”指在施用于对象时会具有预期的预防效果的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量，例如，防止或延迟疾病或症状的发生或复发，减少疾病或症状发生或复发的可能性。完全预防有效剂量不必通过施用一个剂量发生，并且可以仅在施用一系列剂量之后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
如本文中所使用的，术语“受试者”优选是指哺乳动物，例如人。在某些实施方案中，所述受试者(例如人)患有SARS-CoV-2感染或与SARS-CoV-2感染相关的疾病(例如COVID-19)，或者，具有患有上述疾病的风险。
如本文中所使用的，“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)”，旧称为“新型冠状病毒”或“2019-nCov”，属于其β冠状病毒属，为含包膜的单链正义RNA病毒。SARS-CoV-2至少含有三种膜蛋白，包括表面刺突蛋白(S)、整合膜蛋白(M)和膜蛋白(E)。SARS-CoV-2的受体与SARS-CoV一样，均是通过S蛋白上的受体结合结构域(Receptor binding domain，RBD)与宿主细胞上的血管紧张素转移酶2(ACE2)特异性结合后接到了病毒的膜融合和入胞，在病毒感染细胞过程中起着至关重要的作用。
在本文中，术语“SARS-CoV-2”包含已知的各种分离株，例如既包括原始毒株(例如第一个被测序的分离株GenBank：MN908947.3)，也包括后续被发现的变异株。在某些实施方案中，术语“SARS-CoV-2”既包含其S蛋白不包含突变(例如与参照株MN908947.3相比)的分离株，也包含在其S蛋白中包含突变(例如与参照株MN908947.3相比的氨基酸取代，例如K417N、E484K、N501Y、L452R、T478K或其任意组合)的分离株。在某些实施方案中，所述变异株优选地选自在其S蛋白中包含突变(例如氨基酸取代，例如K417N、E484K、N501Y、L452R、T478K或其任意组合)的分离株。在某些示例性实施方案中，所述变异株选自阿尔法(Alpha，B.1.1.7)、贝塔(Beta，B.1.351)、伽马(Gamma，P.1)、德尔塔(Delta，B.1.617.2)和奥密克戎(Omicron，B.1.1.529)。
如本文中所使用的，术语“新型冠状病毒肺炎”和“COVID-19”是指，因SARS-CoV-2感染而导致的肺炎，二者具有相同的含义，可互换使用。
如本文中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。
二、抗体或其抗原结合片段
本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包含特定氨基酸序列的互补决定区(CDR)，或相对于特定氨基酸序列具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链可变区和轻链可变区包含特定的氨基酸序列或其变体。其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加，例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的取代、缺失或添加，或具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性的序列；优选地，所述的取代是保守取代。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含来源于人免疫球蛋白的恒定区，例如，包含特定氨基酸序列的重链恒定区和轻链恒定区。
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中，具体涉及21种抗体(编号分别为BD55-1239、BD55-3372、BD55-3500、BD55-3546、BD55-4637、BD55-5242、BD55-5263、BD55-5300、BD55-5386、BD55-5477、BD55-5483、BD55-5484、BD55-5514、BD55-5549、BD55-5558、BD55-5585、BD55-5591、BD55-5640、BD55-5697、BD55-5700、BD55-5840)的VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3序列以及VH、VL序列。这21种抗体具有共同的CH(SEQ ID NO：169)和CL(SEQ ID NO：170)序列。
表1：序列的描述
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三、抗体的制备
本发明的抗体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。
本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto etal.，J.Biochem.Biophys.Methods 24：107-117(1992)and Brennan et al.，Science 229：81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed inHudson，Curr.Opin.Immunol.11：548-557(1999)；Little et al.，Immunol.Today，21：364-370(2000))。比如，Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得；可以将Fab’片段化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter et al.，Bio/Technology，10：163-167(1992))。另外，Fv、Fab或F(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
在一些实施方案中，所述分离的核酸分子包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的第一核苷酸序列和编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列存在于相同或不同的分离的核酸分子上。当所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列存在于不同的分离的核酸分子上时，本发明所述的分离的核酸分子包含含有所述第一核苷酸序列的第一核酸分子以及含有所述第二核苷酸序列的第二核酸分子。
在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含如上所述的分离的核酸分子。在一些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。
在一些实施方案中，所述载体包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的第一核苷酸序列和编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链或轻链可变区的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列存在于相同或不同的载体上。当所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列存在于不同的载体上时，本发明所述的载体包含含有所述第一核苷酸序列的第一载体以及含有所述第二核苷酸序列的第二载体。
在一些实施方案中，所述载体包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的第一核苷酸序列，和/或编码本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的第二核苷酸序列；其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被提供在相同或不同的载体上。
在一些实施方案中，所述载体包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段的重链的第一核苷酸序列，和/或编码本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链的第二核苷酸序列；其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列被提供在相同或不同的载体上。
在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其由本发明的核酸分子或本发明的表达载体转化。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如细菌细胞(如大肠杆菌细胞)，以及真核细胞例如真菌细胞(例如酵母细胞)，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO细胞、各种COS细胞、HeLa细胞、HEK细胞例如HEK 293细胞。。
在另一个方面，提供了制备本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在适合本发明的核酸分子或表达载体表达的情况下培养本发明的宿主细胞，和分离并纯化由所述核酸分子或表达载体表达的抗体或其抗原结合片段。
四、药物组合物
本文使用的“药学上可接受的载体和/或赋形剂”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体和/或赋形剂适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体分子、免疫缀合物包裹于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。
本发明的药物组合物也可含有药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。
可以通过灭菌程序或通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止存在微生物。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。常规介质或试剂，除了任何与活性化合物不相容的范围外，都可能在本发明的药物组合物中。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。
治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。
可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗的对象和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接受的载体相组合。
可以调节剂量方案以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一推注，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的对象的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。
对于抗体分子的给药而言，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至20mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重，10mg/kg体重或20mg/kg体重，或在1-20mg/kg范围内。示例性的治疗方案需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次、每3-6个月一次、或起始给药间隔略短(如每周一次至每三周一次)后期给药间隔加长(如每月一次至每3-6个月一次)。
或者，本发明的抗体分子也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况中需要频率较低的给药。剂量和频率根据抗体分子在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体表现出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔给予较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给患者给药。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。
本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明的抗体优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或输注。本文使用的短语“肠胃外给药”是指除肠和局部给药以外的给药模式，通常是注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
或者，本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。
活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专利保护或者通常为本领域技术人员所公知。参见，例如，Sustainedand controlledRelease Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
治疗性组合物可应用本领域公知的医疗装置给药。例如，在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针皮下注射装置给药，如在美国专利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的公知的植入物和模块的例子包括：美国专利No.4,487,603，该专利公开了用于以受控速率分散药物的可植入微量输注泵；美国专利No.4,486,194，该专利公开了用于通过皮肤给药的治疗装置；美国专利No.4,447,233，该专利公开了用于以精确的输注速率递送药物的医用输注泵；美国专利No.4,447,224，该专利公开了用于连续递送药物的变流可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，该专利公开了具有多腔区室的渗透药物递送系统：和美国专利No.4,475,196，该专利公开了一种渗透药物递送系统。这些专利引入本文作为参考。本领域技术人员公知许多其他这样的植入物、递送系统和模块。
在一些实施方案中，本发明的抗体可配制为确保在体内的正确分布。例如，血-脑屏障(BBB)阻止了许多高度亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物能够跨过BBB(如果需要时)，可将它们配制在如脂质体中。至于制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂质体包含可被选择性地转运入特定细胞或器官内的一个或多个靶向部分，从而增强靶向药物递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。靶向部分的例子包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob.AgentsChemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
五、疾病预防和/或治疗用途
本发明的抗体或其抗原结合片段可用于体外或在受试者体内中和乙型冠状病毒，阻断或抑制乙型冠状病毒对细胞的感染，从而达到预防和/或治疗受试者的乙型冠状病毒感染或与乙型冠状病毒感染相关的疾病的目的。
在另一个方面，本发明提供了预防和/或治疗乙型冠状病毒感染所引发的疾病的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物。
在一些实施方案中，所述乙型冠状病毒包括新型冠状病毒(SARS-CoV-2)及其变异株、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)及其变异株、SARS相关的冠状病毒(SARSr-CoV)。
在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2包括变异株。在一些实施方案中，所述变异株的S蛋白含有突变，例如氨基酸取代、缺失或添加。在一些实施方案中，所述变异株的S蛋白包含选自K417N、E484K、N501Y、L452R、T478K中的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2变异株选自阿尔法(Alpha，B.1.1.7)、贝塔(Beta，B.1.351)、伽马(Gamma，P.1)、德尔塔(Delta，B.1.617.2)、奥密克戎(Omicron，B.1.1.529)或其任意组合。
在一些实施方案中，所述受试者优选是哺乳动物，更优选是人。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段、或所述药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂(例如另外的抗病毒剂)联合使用。本发明的抗体或其抗原结合片段、或本发明的药物组合物与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。
在另一个方面，本发明提供了用于中和乙型冠状病毒、阻断或抑制乙型冠状病毒对ACE2受体的结合、或阻断或抑制乙型冠状病毒对细胞的感染的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。所述方法可用于在体外或受试者(例如人)体内中和乙型冠状病毒、阻断或抑制乙型冠状病毒对ACE2受体的结合或阻断或抑制乙型冠状病毒对细胞的感染。
在一些实施方案中，所述方法用于中和样品中乙型冠状病毒的毒力、阻断或抑制乙型冠状病毒对ACE2受体的结合、或阻断或抑制乙型冠状病毒对细胞的感染。在一些实施方案中，所述方法包括：将包含乙型冠状病毒的样品与本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物接触。
在另一个方面，本发明涉及本发明的抗体或其抗原结合片段用于制备预防和/或治疗乙型冠状病毒感染所引发的疾病的药物的用途，所述药物用于下列的一项或多项：
(1)在体外或受试者(例如人)体内中和乙型冠状病毒；
(2)阻断或抑制乙型冠状病毒对ACE2受体的结合；
(3)阻断或抑制乙型冠状病毒对细胞的感染；和/或
(4)用于预防和/或治疗受试者的乙型冠状病毒感染或与乙型冠状病毒感染相关的疾病(例如COVID-19)。
本发明的抗体或其抗原结合片段、或本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
本发明的抗体或其抗原结合片段、或本发明的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段或药物组合物通过静脉注射或推注给予。
在本文中，可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。
六、缀合物
本发明的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对乙型冠状病毒的结合。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(PEG)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。
因此，在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有可检测标记。
在本文中，本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、钌衍生物如三联吡啶钌)、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。
在一些实施方案中，所述可检测的标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在一些实施方案中，所述可检测的标记可以选自酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白，如FITC、TRITC或PE)、放射性核素或生物素。
在一些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。
七、试剂盒及检测用途
本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合乙型冠状病毒的S蛋白的RBD，从而可用于检测乙型冠状病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD，以及任选地根据上述检测结果来诊断受试者是否感染了乙型冠状病毒。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段、或本发明的缀合物。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含本发明的缀合物。
在另一些实施方案中，所述试剂盒包含本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段不包含可检测的标记。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含特异性识别本发明的抗体或其抗原结合片段的第二抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
在一些实施方案中，所述第二抗体对本发明的抗体或其抗原结合片段所包含的恒定区所来自的物种(例如人)的抗体是特异的。
在一些实施方案中，所述第二抗体是抗-免疫球蛋白(例如人的免疫球蛋白)抗体，例如抗IgG抗体。在一些实施方案中，所述第二抗体是抗人IgG抗体。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒可以进一步包含用于使相应可检测的标记被检测到的试剂。例如，当所述可检测的标记为酶时，所述试剂盒还可以包含相应酶的显色底物，例如用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS或鲁米诺类化合物，或用于碱性磷酸酶的对硝基苯磷酸酯(p-NPP)或AMPPD。例如当所述可检测的标记为化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)时，所述试剂盒还可以包含用于化学发光的预激发液和/或激发液。
在另一个方面，本发明提供了检测乙型冠状病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD、或被乙型冠状病毒感染的细胞在样品中的存在或其水平的方法，其包括使所述样品与本发明的抗体或其抗原结合片段或缀合物接触；检测所述抗体或其抗原结合片段或缀合物与所述样品中的靶抗原的结合；其中通过检出所述结合代表所述样品中存在乙型冠状病毒，或者通过检出所述结合的强弱代表样品中乙型冠状病毒水平的高低。
在一些实施方案中，所述方法是免疫学检测，例如酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。
在一些实施方案中，所述方法包括使用本发明的缀合物。
在另一些实施方案中，所述方法包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段不包含可检测的标记。在一些实施方案中，所述方法还包括使用带有可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素)的第二抗体来检测所述抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述第二抗体对本发明的抗体或其抗原结合片段所包含的恒定区所来自的物种(例如人)的抗体是特异的。
在一些实施方案中，所述第二抗体是抗-免疫球蛋白(例如人的免疫球蛋白)抗体，例如抗IgG抗体。在一些实施方案中，所述第二抗体是抗人IgG抗体。
在一些实施方案中，所述方法可以用于诊断目的，例如可以根据乙型冠状病毒在样品中的存在或其水平来诊断受试者是否感染了乙型冠状病毒。在此类实施方案中，所述样品可以为来自受试者的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。
在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在一些实施方案中，所述方法可以用于非诊断目的，例如所述样品并非来自受试者的样品，例如疫苗样品。
在一些实施方案中，所述乙型冠状病毒包括新型冠状病毒(SARS-CoV-2)及其变异株、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)及其变异株、SARS相关的冠状病毒(SARSr-CoV)。
在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2包括变异株。在一些实施方案中，所述变异株的S蛋白含有突变，例如氨基酸取代、缺失或添加。在一些实施方案中，所述变异株的S蛋白包含选自K417N、E484K、N501Y、L452R、T478K中的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2变异株选自阿尔法(Alpha，B.1.1.7)、贝塔(Beta，B.1.351)、伽马(Gamma，P.1)、德尔塔(Delta，B.1.617.2)、奥密克戎(Omicron，B.1.1.529)或其任意组合。
在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的缀合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测乙型冠状病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD、或被乙型冠状病毒感染的细胞在样品中的存在或其水平，和/或用于诊断受试者是否感染了乙型冠状病毒。
在一些实施方案中，所述方法是免疫学测定，例如酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。
在一些实施方案中，所述试剂盒通过如上所述的检测方法来检测乙型冠状病毒或其S蛋白或S蛋白的RBD、或被乙型冠状病毒感染的细胞在样品中的存在或其水平，以及任选地根据所述检测结果诊断受试者是否感染了乙型冠状病毒。
在一些实施方案中，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，优选人)的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。
在一些实施方案中，所述乙型冠状病毒包括新型冠状病毒(SARS-CoV-2)及其变异株、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)及其变异株、SARS相关的冠状病毒(SARSr-CoV)。
在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2包括变异株。在一些实施方案中，所述变异株的S蛋白含有突变，例如氨基酸取代、缺失或添加。在一些实施方案中，所述变异株的S蛋白包含选自K417N、E484K、N501Y、L452R、T478K中的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2变异株选自阿尔法(Alpha，B.1.1.7)、贝塔(Beta，B.1.351)、伽马(Gamma，P.1)、德尔塔(Delta，B.1.617.2)、奥密克戎(Omicron，B.1.1.529)或其任意组合。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley & Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：记忆B细胞分离
对接种了SARS-CoV-2疫苗的SARS-CoV感染康复者进行全血采集，首先用含有2％FBS(Gibco)的PBS(Invitrogen)稀释血样，并进行Ficoll(Cytiva)梯度离心。在裂解和洗涤后，用含有2％FBS(Gibco)的PBS(Invitrogen)重新悬浮进行下游B细胞分离，或加入含有10％DMSO(Sigma-Aldrich)的FBS中长期保存于-80℃。利用CD19+B细胞分离试剂盒(STEMCELLS)通过阳性选择富集B细胞。富集的B细胞在FACS缓冲液(1×PBS、2％FBS、1mMEDTA)中用以下人源抗原和抗体染色：FITC抗CD19抗体(Biolegend)、FITC抗CD20抗体(Biolegend)、Brilliant Violet 421 anti-CD27 Antibody(Biolegend)、PE/Cyanine7anti-IgM和荧光团标记的RBD(SARS340 CoV-2和SARS-CoV RBD，Sino Biological Inc.)和卵清蛋白(Ova)冰上放置30分钟。细胞在分选前用7-AAD染色10分钟，在Astrios EQ(BeckMan Coulter)上将单个CD19或CD20+CD27+IgM-Ova-RBD-PE+RBD-APC+B细胞分选到含有30％FBS的PBS中。在流式细胞分选后对获得的细胞进行5′-mRNA和单细胞V(D)J文库制备，基于Hiseq 2500平台上采用26bp(Barcode)+91bp(插入序列)的双侧测序模式进一步进行illumina测序。
实施例2：抗体序列的获得和鉴定
利用Cell Ranger(版本6.1.1)软件参考人类序列GRCh38数据库处理原始FASTQ文件。使用具有默认参数的“cellranger multi”或“cellranger vdj”生成序列。然后提取蛋白质序列并通过IMGT/DomainGapAlign(版本4.10.2)进行处理，以获得V(D)J、CDR区域和突变频率的注释。V基因氨基酸突变率＝突变计数/V基因肽的长度。
实施例3：抗体制备和纯化
将从10X Genomics V(D)J测序和分析中获得的配对免疫球蛋白重链和轻链基因提交给重组单克隆抗体合成。基于Gibson组装将重链和轻链序列分别克隆到表达载体中，随后将两个质粒共转染到HEK293F细胞中。然后通过Protein A亲和层析纯化细胞培养基中分泌的单克隆抗体。
实施例4：抗体广谱结合活性评估
4.1 ELISA
通过ELISA结合确定分析这些抗体或血浆的特异性结合能力。简而言之，在用0.03μg/mL和1μg/mL将22种目前已知sarbecovirus病毒(见表2)的RBD包被、封闭和洗涤后，将1μg/mL抗体或连续稀释的血浆样品添加到ELISA板。
表2：乙型冠状病毒刺突蛋白的基因名称和在NCBI上的登录号
孵育和洗涤后，将96孔板与稀释的goat anti-human IgG 373(H+L)/HRP抗体(JACKSON)一起孵育。然后加入四甲基联苯胺(TMB，Solarbio)显色10分钟后，加入2M H2SO4停止显影反应，使用PerkinElmer Ensight HH3400型号酶标仪在450nm处测量吸光度，通过GraphPad Prism 8.0软件计算EC50(见表3)。
4.2生物层干涉分析动力学实验
使用蛋白质分析系统(Fortebio)进行生物层干涉分析动力学实验，采用的传感器为protein A生物传感器(Fortebio 18-5010)。首先将传感器在缓冲器中浸泡10分钟(缓冲器ForteBio 18-1105)完成传感器自检步骤，然后在缓冲器中浸泡30秒完成基线。在抗体捕获步骤，传感器浸入浓度为2μg/ml的抗体300s，阈值设为0.4nm。随后传感器仅在缓冲器中浸泡120秒完成基线。紧接着是抗原结合步骤，传感器在RBD蛋白的连续稀释液中浸泡60秒。随后的解离步骤中，传感器转到缓冲液中浸泡600秒。最后将传感器在再生缓冲液(10mM盐酸甘氨酸，pH值1.5)中浸泡30秒，然后在缓冲液中浸泡30秒，重复2次完成再生步骤。使用软件Data Acquisition 11.1(Fortebio)记录数据，软件Data Analysis HT11.1(Fortebio)进行数据分析(见表4)。
实施例5：抗体广谱中和活性评估
利用假病毒法筛选广谱结合的抗体进行中和测定以评估抗体和血浆的中和能力。一系列二倍稀释的抗体分别与七种sarbecovirus刺突蛋白的VsV假病毒(带有荧光素酶标记)一起孵育1小时，然后将混合物与Huh-7细胞一起孵育。在37℃培养箱中培养24h后，收集细胞并用荧光素酶底物(PerkinElmer)裂解，然后通过酶标仪进行发光强度测量。IC50由四参数非线性回归模型确定(见表5)。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
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Claims (25)

1.抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，
(1)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：1所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：1具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：2具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：3具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：4具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：5所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：5具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：6具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(2)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：9所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：9具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：10所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：10具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：11所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：11具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：12所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：12具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：13所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：13具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：14所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：14具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(3)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：17所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：17具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：18所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：18具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：19所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：19具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：20所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：20具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：21所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：21具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：22所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：22具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(4)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：25所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：25具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：26所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：26具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：27所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：27具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：28所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：28具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：29所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：29具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：30具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(5)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：33所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：33具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：34所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：34具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：35所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：35具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：36所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：36具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：37所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：37具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：38所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：38具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(6)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：41所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：41具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：42所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：42具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：43所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：43具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：44所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：44具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：45所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：45具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：46所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：46具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(7)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：49所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：49具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：50所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：50具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：51所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：51具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：52所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：52具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：53所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：53具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：54所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：54具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(8)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：57所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：57具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：58所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：58具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：59所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：59具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：60所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：60具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：61所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：61具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：62所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：62具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(9)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：65所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：65具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：66所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：66具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：67所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：67具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：68所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：68具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：69所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：69具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：70所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：70具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(10)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：73所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：73具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：74所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：74具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：75所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：75具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：76所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：76具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：77所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：77具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：78所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：78具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(11)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：81所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：81具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：82所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：82具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：83所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：83具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：84所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：84具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：85所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：85具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：86所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：86具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(12)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：89所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：89具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：90所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：90具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：91所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：91具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：92所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：92具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：93所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：93具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：94所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：94具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(13)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：97所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：97具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：98所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：98具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：99所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：99具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：100所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：100具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：101所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：101具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：102所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：102具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(14)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：105所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：105具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：106所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：106具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：107所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：107具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：108所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：108具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：109所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：109具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：110所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：110具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(15)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：113所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：113具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：114所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：114具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：115所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：115具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：116所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：116具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：117所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：117具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：118所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：118具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(16)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：121所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：121具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：122所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：122具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：123所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：123具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：124所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：124具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：125所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：125具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：126所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：126具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(17)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：129所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：129具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：130所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：130具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：131所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：131具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：132所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：132具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：133所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：133具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：134所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：134具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(18)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：137所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：137具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：138所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：138具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：139所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：139具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：140所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：140具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：141所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：141具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：142所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：142具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(19)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：145所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：145具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：146所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：146具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：147所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：147具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：148所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：148具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：149所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：149具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：150所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：150具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(20)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：153所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：153具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：154所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：154具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：155所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：155具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：156所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：156具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：157所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：157具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：158所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：158具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；或者
(21)所述重链可变区包含：
VH CDR1，其包含SEQ ID NO：161所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：161具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VH CDR2，其包含SEQ ID NO：162所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：162具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VH CDR3，其包含SEQ ID NO：163所示氨基酸序列或包含相对于SEQ ID NO：163具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含：
VL CDR1，其包含SEQ ID NO：164所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：164具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，
VL CDR2，其包含SEQ ID NO：165所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：165具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列，和
VL CDR3，其包含SEQ ID NO：166所示氨基酸序列或相对于SEQ ID NO：166具有1或2个氨基酸残基取代、缺失或添加的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中
(1)所述重链可变区包含SEQ ID NO：7所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQID NO：8所示的序列或其变体；或者
(2)所述重链可变区包含SEQ ID NO：15所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQID NO：16所示的序列或其变体；或者
(3)所述重链可变区包含SEQ ID NO：23所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQID NO：24所示的序列或其变体；或者
(4)所述重链可变区包含SEQ ID NO：31所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQID NO：32所示的序列或其变体；或者
(5)所述重链可变区包含SEQ ID NO：39所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQID NO：40所示的序列或其变体；或者
(6)所述重链可变区包含SEQ ID NO：47所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQID NO：48所示的序列或其变体；或者
(7)所述重链可变区包含SEQ ID NO：55所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQID NO：56所示的序列或其变体；或者
(8)所述重链可变区包含SEQ ID NO：63所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQID NO：64所示的序列或其变体；或者
(9)所述重链可变区包含SEQ ID NO：71所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQID NO：72所示的序列或其变体；或者
(10)所述重链可变区包含SEQ ID NO：79所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO：80所示的序列或其变体；或者
(11)所述重链可变区包含SEQ ID NO：87所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO：88所示的序列或其变体；或者
(12)所述重链可变区包含SEQ ID NO：95所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO：96所示的序列或其变体；或者
(13)所述重链可变区包含SEQ ID NO：103所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO：104所示的序列或其变体；或者
(14)所述重链可变区包含SEQ ID NO：111所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO：112所示的序列或其变体；或者
(15)所述重链可变区包含SEQ ID NO：119所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO：120所示的序列或其变体；或者
(16)所述重链可变区包含SEQ ID NO：127所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO：128所示的序列或其变体；或者
(17)所述重链可变区包含SEQ ID NO：135所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO：136所示的序列或其变体；或者
(18)所述重链可变区包含SEQ ID NO：143所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO：144所示的序列或其变体；或者
(19)所述重链可变区包含SEQ ID NO：151所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO：152所示的序列或其变体；或者
(20)所述重链可变区包含SEQ ID NO：159所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO：160所示的序列或其变体；或者
(21)所述重链可变区包含SEQ ID NO：167所示的序列或其变体；所述轻链可变区包含SEQ ID NO：168所示的序列或其变体；
其中，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加，例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的取代、缺失或添加，或具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相同性的序列；优选地，所述的取代是保守取代。
3.权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含来源于人免疫球蛋白的恒定区；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链包含来源于人免疫球蛋白(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的重链恒定区，所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含来源于人免疫球蛋白(例如κ或λ)的轻链恒定区；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：169所示的重链恒定区和/或如SEQ ID NO：170所示的轻链恒定区。
4.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(sdAb)、嵌合抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
5.分离的核酸分子，其编码权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
6.权利要求5的分离的核酸分子，所述核酸分子与表达调控序列可操作地连接。
7.表达载体，其包含权利要求5或6所述的核酸分子。
8.宿主细胞，其由权利要求5或6的核酸分子或权利要求7的表达载体转化。
9.制备抗体或其抗原结合片段的方法，包括，
(1)在适合所述核酸分子或表达载体表达的情况下培养权利要求8的宿主细胞，和
(2)分离并纯化由所述核酸分子或表达载体表达的抗体或其抗原结合片段。
10.药物组合物，其包含权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
11.预防和/或治疗乙型冠状病毒感染所引发的疾病的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求10的药物组合物。
12.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段用于制备预防和/或治疗乙型冠状病毒感染所引发的疾病的药物的用途。
13.权利要求11的方法或权利要求12的用途，其中所述乙型冠状病毒包括新型冠状病毒(SARS-CoV-2)及其变异株、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)及其变异株、SARS相关的冠状病毒(SARSr-CoV)。
14.权利要求13的方法或用途，其中所述SARS-CoV-2变异株选自阿尔法(A1pha，B.1.1.7)、贝塔(Beta，B.1.351)、伽马(Gamma，P.1)、德尔塔(Delta，B.1.617.2)、奥密克戎(Omicron，B.1.1.529)或其任意组合。
15.权利要求11的方法，其中所述受试者是哺乳动物，例如人。
16.缀合物，其包含权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及与所述抗体或其抗原结合片段连接的可检测的标记。
17.权利要求16的缀合物，其中所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
18.试剂盒，其包含权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求16-17任一项所述的缀合物。
19.权利要求18的试剂盒，其中所述试剂盒包含权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及特异性识别所述抗体或其抗原结合片段的第二抗体。
20.权利要求19的试剂盒，其中所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。
21.用于检测乙型冠状病毒在样品中的存在或其水平的方法，其包括：
(1)使所述样品与权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求16所述的缀合物接触；
(2)检测所述抗体或其抗原结合片段或所述缀合物与所述样品中的靶抗原的结合；
其中通过检出所述结合代表所述样品中存在乙型冠状病毒，或者通过检出所述结合的强弱代表样品中乙型冠状病毒水平的高低。
22.权利要求21的方法，其中所述样品为来自受试者的血液样品(例如，全血、血浆或血清)、排泄物、口腔或鼻腔分泌物、或肺泡灌洗液。
23.权利要求22的方法，其中所述受试者是哺乳动物，例如人。
24.权利要求21的方法，其中所述样品并非来自受试者的样品，例如所述样品来自疫苗样品。
25.权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求16-17任一项所述的缀合物在制备用于检测乙型冠状病毒在样品中的存在或其水平的试剂盒中的用途。
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Denomination of invention: Broad spectrum neutralizing antibodies against COVID-19 and their applications

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