CN116606350B - 一种海参肽及其生产方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肽的生产和利用领域，公开了一种海参肽及其生产方法和应用，海参肽包括以下两种多肽中的一种或两种混合，多肽一：WQIEATEPFGYG，多肽二：VDEKAADMSP。通过酶解提取海参肽，并进一步将未酶解部分进行混合菌株发酵提取有效物质。
Description
技术领域
本发明属于生物加工技术领域，具体涉及一种海参肽及其生产方法和应用。
背景技术
海参属于无脊椎动物、棘皮动物门、海参纲，全球有900多种，我国约140种。海参化学成分研究表明海参体内不但富含氨基酸、维生素和化学元素等人体所需的50多种营养成分，还含有多种生物活性物质如酸性粘多糖、皂苷和胶原蛋白等，且海参活性物质的药理活性十分广泛。目前对海参体内各种物质及其功效的研究已经十分普遍，但很多研究成果并未应用在实际生产中，并且很多海参功效物质的具体结构也并未完全了解，导致海参对人体的有益功效未能发挥到更高水平。例如中国发明专利申请CN116218936A所公开的一种具有DPP-IV抑制活性的海参肽及其制备方法，只是通过多种酶解获取海参多肽，并证明其具有DPP-IV抑制活性，并不清楚其具体肽段的组成。中国发明专利申请CN114934090A公开了一种具有保湿作用的海参肽及其制备方法，通过酶解及后续多步提纯而得到的海参肽具有一定的保湿作用，但也不清楚其具体组成。明确海参中何种多肽具备何种作用，并据此将特定多肽分离并提取出来，成为需要解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种海参肽及其生产方法和应用，对海参中特定的多肽进行分离并提取，实现海参的高效充分利用。
本发明采用如下技术方案：
一种海参肽，所述海参肽包括以下两种多肽中的一种或两种混合，多肽一：WQIEATEPFGYG，多肽二：VDEKAADMSP。
优选的，所述多肽一与多肽二的质量比为7:3。
所述海参肽的生产方法包括以下步骤：
S1清洗：将海参去除内脏，只保留海参体壁，清洗海参体壁后使用清水反复浸泡，去除海参体壁内多余的盐分；
S2打浆：将清洗后的海参体壁放入匀浆机内，加入两倍海参质量的纯净水，8000-10000转/分钟，匀浆3-5分钟，得到海参匀浆；
S3酶解：在S2步骤得到的海参匀浆中加入蛋白酶进行酶解，酶解完成后调整pH至中性；
S4过滤：依次使用滤布和超滤膜对酶解后的海参匀浆进行过滤，得到超滤后的滤清液；
S5分离纯化：将S4步骤得到的滤清液利用反相高效液相色谱进行分离纯化，在C18柱反相高效液相色谱、乙腈流动相、210nm波长下检测分离到两个峰值，得到海参肽。
优选的，所述步骤S3酶解的具体过程为：先在步骤S2得到的海参匀浆中同时加入质量百分比为0.3%-0.5%的中性蛋白酶和0.2%-0.3%的胰蛋白酶，在pH为7.0-8.0、温度为50-60℃条件下搅拌酶解3-4小时；加酸将第一步酶解后的海参匀浆pH调至1.5-2.0，加入0.1%-0.3%的胃蛋白酶，在温度为37℃条件下搅拌酶解1-2小时。
优选的，所述步骤S4过滤的具体过程为：先将步骤S3中酶解完成且调节完pH的海参匀浆使用200目的滤布进行真空抽滤，收集抽滤滤饼备用，再将滤液使用孔径为2000Da的超滤膜进行超滤，超滤得到的浓缩液和抽滤滤饼进行混合，得到海参残渣浆，收集超滤得到的含有分子量小于2000Da的滤清液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
通过多种蛋白酶酶解获取海参中特定的两种多肽及其混合物，起到了抗血栓、提高免疫力并降低胆固醇的作用，对海参进行定向利用。
附图说明
图1为本发明多肽一质谱图；
图2为本发明多肽二质谱图；
图3为本发明海参肽色谱图；
图4为本发明血小板凝集实验结果图；
图5为本发明小鼠尾部血栓实验照片；
图6为本发明小鼠尾部血栓实验结果图。
具体实施方式
请参阅图1-6，本发明提供一种海参肽，海参肽包括以下两种多肽中的一种或两种混合，多肽一：WQIEATEPFGYG，多肽二：VDEKAADMSP。通过蛋白酶进行海参酶解会产生很多种不同的肽，采用不同的蛋白酶或者相同蛋白酶按照不同酶解顺序也会产生不同的肽段，本发明采用特定的酶解顺序和分离条件得到以上两种活性成分多肽。其中多肽一为12个氨基酸组成的多肽，分子量为1396Da，其质谱图见图1，多肽二为10个氨基酸组成的多肽，分子量为1061Da，其质谱图见图2。
通过海参肽的酶解，并经过分离纯化和检测后，发现两种多肽质量比为7：3。
一般认为活性多肽的分子量都在1000Da以下，而本发明两种多肽分子量都超过了1000Da，都具有生物活性，且其组合能够发挥更强的作用，可以起到很好的抗血栓、提高免疫力和降低胆固醇的效果。
一种海参肽的生产方法，包括以下步骤：
S1清洗：将海参去除内脏，只保留海参体壁，清洗海参体壁后使用清水反复浸泡，去除海参体壁内多余的盐分；将海参体壁多余的盐分通过反复浸泡排出，防止后续对酶解的影响；
S2打浆：将清洗后的海参体壁放入匀浆机内，加入两倍海参质量的纯净水，8000-10000转/分钟，匀浆3-5分钟，得到海参匀浆；将海参体壁打碎以便于和后续反应酶的充分接触；
S3酶解：在S2步骤得到的海参匀浆中加入蛋白酶进行酶解，酶解完成后调整pH至中性；
S4过滤：依次使用滤布和超滤膜对酶解后的海参匀浆进行过滤，得到超滤后的滤清液；超滤后的滤清液为分子量小于超滤膜孔径的多肽所在处；
S5分离纯化：将S4步骤得到的滤清液利用反相高效液相色谱进行分离纯化，在C18柱反相高效液相色谱、乙腈流动相、210nm波长下检测分离到两个峰值，得到海参肽。通过反相高效液相色谱对滤清液进行分离并检测，在210nm波长下检测得到两个峰值，色谱图见图3，并进行多肽结构和分子量的测定。
海参肽的生产方法，步骤S3酶解的具体过程为：先在步骤S2得到的海参匀浆中同时加入质量百分比为0.3%-0.5%的中性蛋白酶和0.2%-0.3%的胰蛋白酶，在pH为7.0-8.0、温度为50-60℃条件下搅拌酶解3-4小时；加酸将第一步酶解后的海参匀浆pH调至1.5-2.0，加入0.1%-0.3%的胃蛋白酶，在温度为37℃条件下搅拌酶解1-2小时。
先将一定比例的中性蛋白酶和胰蛋白酶一起加入到海参匀浆中进行第一步酶解，由于中性蛋白酶和胰蛋白酶最适酶解pH较为接近，可以同时作用进行酶解以节约生产时间，酶解完成后，再调节pH至1.5-2.0，一方面酸性pH使得前面发挥作用的中性蛋白酶和胰蛋白酶失去酶活，另一方面使其达到胃蛋白酶的最佳反应pH条件。使用胃蛋白酶酶解一方面是产生本发明两种活性肽的必须步骤，另一方面也为确保本发明的活性肽在进入胃部后不会被人体的胃蛋白酶所分解，可以以活性肽形态进入肠道被人体直接吸收而发挥特定功效。
海参肽的生产方法，步骤S4过滤的具体过程为：先将步骤S3中酶解完成且调节完pH的海参匀浆使用200目的滤布进行真空抽滤，收集抽滤滤饼备用，再将滤液使用孔径为2000Da的超滤膜进行超滤，超滤得到的浓缩液和抽滤滤饼进行混合，得到海参残渣浆，收集超滤得到的含有分子量小于2000Da的滤清液。
酶解完成后得到的海参匀浆为了后续利用，先调节pH至中性，使用200目的滤布进行粗过滤，收集滤饼后续备用，滤液再进行2000Da超滤膜的超滤，被截留的浓缩液含有超过2000Da的多肽及其他超过2000Da分子量的物质，而通过的滤清液中则含有本发明的两种目标多肽。
实施例1
海参肽的提取和分离：
将海参去除内脏，只保留海参体壁，清洗干净后使用纯净水反复浸泡3次，每次1小时。将海参放入匀浆机内，加入两倍海参体壁质量的纯净水，在10000转/分钟的转速下进行匀浆，根据海参的不同以及匀浆效果差异，匀浆4分钟后停止。将海参体壁匀浆放入搅拌罐中，加入0.5%的中性蛋白酶和0.2%的胰蛋白酶，此时pH基本为中性不需要调节，升温至55℃搅拌酶解4小时。然后在搅拌罐中添加硫酸调节pH至2.0，待搅拌罐内降温至37℃后，加入0.3%的胃蛋白酶，并维持37℃搅拌酶解2小时，再利用氢氧化钠将酶解液调至pH为中性。此时酶解步骤完成。
采用抽滤装置配合200目的滤布进行过滤，未分解的海参形成滤饼刮下备用。滤液直接采用2000Da的超滤膜进行超滤，超滤浓缩液和上一步过滤产生的滤饼进行混合，得到海参残渣浆，而目标海参肽则存在于超滤后的滤清液中。
将滤清液进行反相高效液相色谱检测，采用C18柱，乙腈流动相，两流动相乙腈浓度分别为5%和80%，上样量为500μL，流速为7mL/min，检测波长为210nm，检测到两个洗脱峰，具体见图3，后续对两个洗脱峰分别进行质谱检测，得到图1和图2所示的质谱图。
实施例2
海参肽片剂的生产：
清洗、打浆、酶解和过滤过程同实施例1，将过滤后得到的滤清液先进行真空旋转蒸发浓缩，然后进行喷雾干燥并过筛后得到海参多肽粉。
再将过滤步骤得到的海参残渣浆按照质量百分比为1%酵母菌和1%乳酸菌进行接入发酵，30℃下在发酵罐内搅拌发酵12小时，然后120℃高温高压灭菌20分钟。离心后将沉淀进行干燥并粉碎，上清液直接进行喷雾干燥，再将两者的粉末进行混合得到“其他有效物质”。
将海参多肽粉与其他有效物质按1:5的比例进行混合，然后添加微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉、糊精、硬脂酸镁混合均匀后，利用乙醇进行造粒，烘干并压片，得到海参肽片剂。
对比例1
利用多肽合成仪，按照多肽一的氨基酸序列进行合成，产生“合成多肽一”，并根据实施例2中生产片剂相同的有效物质比例，即合成多肽一的量等于海参多肽粉的量，而其他有效物质采用等量的淀粉替换，生产得到只含有合成多肽一的对比例1海参片剂。
对比例2
利用多肽合成仪，按照多肽二的氨基酸序列进行合成，产生“合成多肽二”， 并根据实施例2中生产片剂相同的有效物质比例，即合成多肽二的量等于海参多肽粉的量，而其他有效物质采用等量的淀粉替换，生产得到只含有合成多肽二的对比例2海参片剂。
对比例3
使用与对比例1和对比例2同样的方法获得合成多肽一和合成多肽二，并按照质量比为合成多肽一：合成多肽二等于7:3的比例进行混合，得到“混合合成多肽”，并根据实施例2中生产片剂相同的有效物质比例，即混合合成多肽的量等于海参多肽粉的量，而其他有效物质采用等量的淀粉替换，生产得到含有混合合成多肽的对比例3海参片剂。
实验例1
抗血栓实验：
A.血小板凝集实验：
饲育实验用仓鼠，饲育环境控制在22±3℃，湿度在50±20%，并控制光照期为早上六点到晚上六点，黑暗期为晚上六点到翌日早上六点，光照期和黑暗期各十二小时，并且每日都监测环境温度和湿度。将仓鼠分为5组，每组10只，第一组为空白对照组，给与正常鼠饲料，每天投喂两次；第二组将实施例2中的海参多肽片剂粉碎添加进入鼠饲料中，每天投喂两次；第三组将对比例1中的海参片剂粉碎添加进入鼠饲料中，每天投喂两次；第四组将对比例2中的海参片剂粉碎添加进入鼠饲料中，每天投喂两次；第五组将对比例3中的海参片剂粉碎添加进入鼠饲料中，每天投喂两次。饲育周期6-8周，期间仓鼠都可以自由饮水。
饲育周期结束后，制备仓鼠洗涤血小板，将仓鼠麻醉后抽取腹部主动脉血液，柠檬酸钠溶液抗凝，血液以200g离心10分钟，分离上清，制得富血小板血浆。然后加入诱导剂ADP激活血小板，采用血小板聚集仪检测血小板的聚集情况。
结果如图4所示，相比空白对照组，实施例2和对比例1-3都有一定的抗凝作用，可见本发明公开的海参肽具有抗凝作用。而对比例1和对比例2抗凝作用差异不明显，但其混合的对比例3抗凝效果明显提高，可见对于抗凝效果，多肽一和多肽二具有较强的协同作用。其中实施例2的抗凝效果最好，这是因为除了本发明公开的海参肽具有很好的抗凝效果之外，酶解后经过发酵提取的其他有效物质以及菌体混合物也有一定的辅助抗凝作用，可见本发明公开的海参肽片剂具有很好的抗凝、抗血栓效果。
B.小鼠尾部血栓实验：
采用同血小板凝集实验相同的饲育方法，饲育五组仓鼠，另外饲育第六组仓鼠作为生理盐水对照组使用，饲育周期结束后进行血栓模型的制备，对第1至5组的仓鼠腹腔注射50mg/kg 的0.5%的角叉菜胶，第6组注射等量的生理盐水，注射完成后将仓鼠继续放置在饲育环境中，并正常给予饮食，观察血栓造模后72小时内仓鼠尾部血栓的形成，测量并记录注射后72小时仓鼠的黑尾长度和黑尾率。黑尾率等于仓鼠黑尾长度/仓鼠全尾长度*100%。
结果如图5和图6所示，图5为仓鼠尾部照片、图6为黑尾率柱状图，其中空白对照组黑尾率最高、生理盐水对照组未产生黑尾情况，而对比例1-3和实施例2的黑尾情况都较空白对照组低，可见本发明公开的多肽一和多肽二都有抗血栓的功效，并且对比例3的仓鼠黑尾情况较对比例1和对比例2低，可见两种多肽具有协同作用，并且实施例2的黑尾情况最小，说明海参其他未被酶解的部分进行发酵也有一定的辅助作用。
实验例2
提高免疫力实验：
采用同血小板凝集实验相同的饲育方法，饲育五组仓鼠，通过测定仓鼠的SOD、GSH-Px以及MDA，作为仓鼠免疫力高低的评价指标，SOD是体内清除自由基的关键酶，GSH-Px是机体内催化分解过氧化氢的酶，MDA是脂质过氧化物，能够反应机体产生自由基的损伤情况。以上三个参数中，SOD和GSH-Px越高说明仓鼠免疫力越强，相反的MDA越低说明仓鼠免疫力越强。
饲育结束后，将小鼠脱臼法处死，分离其肝脏和大脑组织并获取其血液，分别检测各自的SOD、GSH-Px活性以及MDA含量，结果见表1-表3。由数据可见多肽一和多肽二都各自具有提高免疫力的效果，对比例3的效果更好也说明了两者的协同作用，实施例2提高免疫力的效果最好，说明本发明公开的海参多肽片剂具有很好的应用前景。
表1仓鼠SOD活性测试表（U/mL）：
| 组织 | 空白对照 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 实施例2 |
| 血液 | 158.65 | 162.68 | 161.28 | 165.98 | 175.23 |
| 大脑 | 70.64 | 73.14 | 73.56 | 77.68 | 78.32 |
| 肝脏 | 148.36 | 150.37 | 151.24 | 154.45 | 154.93 |
表2仓鼠GSH-Px活性测试表（U/mL）：
| 组织 | 空白对照 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 实施例2 |
| 血液 | 82.52 | 84.63 | 85.12 | 85.92 | 87.54 |
| 大脑 | 14.28 | 15.01 | 15.56 | 16.12 | 16.71 |
| 肝脏 | 108.25 | 110.05 | 111.56 | 111.58 | 112.98 |
表3仓鼠MDA含量测试表（mmol/mL）：
| 组织 | 空白对照 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 实施例2 |
| 血液 | 4.96 | 4.85 | 4.70 | 4.62 | 4.56 |
| 大脑 | 2.27 | 2.01 | 2.12 | 2.00 | 1.79 |
| 肝脏 | 1.68 | 1.68 | 1.62 | 1.51 | 1.51 |
实验例3
降低胆固醇实验：
采用血小板凝集实验相同的饲育方法，不同的是将仓鼠的正常饮食都替换为高油脂类食物投喂，并且增加第六组仓鼠，采用单纯的普通饲料投喂。
饲育周期结束后，从仓鼠眼眶静脉丛进行采血，使用酶法定量检测血液中总胆固醇的含量，结果见表4。
表4仓鼠总胆固醇含量表（mg/dL）：
可见高油脂类食物投喂组的仓鼠较正常普通饲料投喂组有明显较高的总胆固醇水平，而在投喂高油脂类食物的同时伴随摄入多肽一和多肽二以及两者混合的对比例1-3，其总胆固醇水平虽然较正常组为高，但相对比只投喂高油脂类食物对照组已经有很明显的降低，特别是对比例3降低最为明显，可见多肽一和多肽二之间有协同降低胆固醇的作用。实施例2海参多肽片剂投喂组也有很好的降低胆固醇效果，但并未比对比例3有明显的降低，说明本发明公开的海参肽片剂中降低胆固醇的成分主要是海参两种多肽的组合物。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的保护范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.一种海参肽，其特征在于：所述海参肽包括以下两种多肽中的一种或两种混合，多肽一：WQIEATEPFGYG，多肽二：VDEKAADMSP。
2.根据权利要求1所述的一种海参肽，其特征在于：所述多肽一与多肽二的质量比为7:3。
3.如权利要求1或2所述的一种海参肽的生产方法，其特征在于：所述生产方法包括以下步骤：
S1清洗：将海参去除内脏，只保留海参体壁，清洗海参体壁后使用清水反复浸泡，去除海参体壁内多余的盐分；
S2打浆：将清洗后的海参体壁放入匀浆机内，加入两倍海参质量的纯净水，8000-10000转/分钟，匀浆3-5分钟，得到海参匀浆；
S3酶解：在S2步骤得到的海参匀浆中加入蛋白酶进行酶解，酶解完成后调整pH至中性；
S4过滤：依次使用滤布和超滤膜对酶解后的海参匀浆进行过滤，得到超滤后的滤清液；
S5分离纯化：将S4步骤得到的滤清液利用反相高效液相色谱进行分离纯化，在C18柱反相高效液相色谱、乙腈流动相、210nm波长下检测分离到两个峰值，得到海参肽；
所述步骤S3酶解的具体过程为：先在步骤S2得到的海参匀浆中同时加入质量百分比为0.3%-0.5%的中性蛋白酶和0.2%-0.3%的胰蛋白酶，在pH为7.0-8.0、温度为50-60℃条件下搅拌酶解3-4小时；加酸将第一步酶解后的海参匀浆pH调至1.5-2.0，加入0.1%-0.3%的胃蛋白酶，在温度为37℃条件下搅拌酶解1-2小时；
所述步骤S4过滤的具体过程为：先将步骤S3中酶解完成且调节完pH的海参匀浆使用200目的滤布进行真空抽滤，收集抽滤滤饼备用，再将滤液使用孔径为2000Da的超滤膜进行超滤，超滤得到的浓缩液和抽滤滤饼进行混合，得到海参残渣浆，收集超滤得到的含有分子量小于2000Da的滤清液。
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